FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAÇATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE DIFERENTES ANTIBIÓTICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENÇÃO DO ETANOL

ARAÇATUBA 2010

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAÇATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE DIFERENTES ANTIBIÓTICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENÇÃO DO ETANOL

Trabalho de Graduação apresentado à Faculdade de Tecnologia de Araçatuba, do Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza, como requisito parcial para conclusão do curso de Tecnologia em Biocombustíveis sob a orientação da Profa. Dra. Valéria Garcia Pereira.

ARAÇATUBA 2010

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAÇATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE DIFERENTES ANTIBIÓTICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENÇÃO DO ETANOL
Trabalho de Graduação apresentado à Faculdade de Tecnologia de Araçatuba, do Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza, como requisito parcial para conclusão do curso de Tecnologia em Biocombustíveis examinado pela banca examinadora composta pelos professores

_________________________________ Profa. Dra. Valéria Garcia Pereira Orientadora- Fatec-Araçatuba

Profa. Ms. Márcia Maria de Souza Moretti

Profa. Dra. Cláudia Dorta Fatec- Marília

Araçatuba 2010

“Dedico este trabalho a Deus por me dar o privilégio de viver, sonhar e sempre acreditar nos meus sonhos. Por me ensinar a arte da vida. Aos meus queridos e amados pais, pela dedicação, estímulo e apoio em todos os momentos”.

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus por Tua doce presença que me impulsiona a viver a cada dia. À minha amada família pelo amor, apoio e sensibilidade, que tornaram meus passos possíveis. À minha avó Sudaria pela força em todas as suas orações. Ao Vinicius, futuro esposo e companheiro de todas as horas, por sempre acreditar em mim. Aos meus pastores Lígia e Jorge Sabino, educadores presentes que me permitiram acreditar que a transformação é possível. À minha querida professora Valéria, pela dedicação e pelo convite a aprender. À usina Alcoazul S/A, por ter cedido os materiais para as análises, pela disponibilidade em nos receber e permitir assim que este trabalho fosse realizado. À empresa Reibrand, por contribuir com as fichas técnicas, pela disponibilidade e atenção, contribuindo para que este trabalho se tornasse completo. À professora Márcia, que em tão pouco tempo me ensinou a acreditar que posso ir além. À diretora Daniela, pelo entusiasmo e abertura a tantas mudanças e descobertas. À minha prima Joice, pelo brilho no olhar em nossas deliciosas conversas. Às minhas amigas sempre presentes Natália, Letícia e Andréia, por estarem presentes quando mais precisei com conselhos e carinho. À minha turma por estes breves anos de convivência e aprendizado, em especial ao Teruo, Osmar e Jonathan que me ensinaram o que as palavras não dizem e é invisível aos olhos. À Verinha, amiga de sala, pela contribuição que ajudou muito toda turma nestes quase três anos de graduação.

“O único lugar em que sucesso vem antes de trabalho é no dicionário” Albert Einstein .

e a clindamicina HLC+tetraciclina apresentou o maior valor médio (20. criando poços de cerca de 5milímetros de diâmetro. Os microrganismos foram inoculados em meio de cultivo Ágar Padrão de Contagem de Placas (ACP) e submetidos à dosagem recomendada de antibióticos. contaminação bacteriana. Para realização destes testes foram utilizados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo isolados do processo fermentativo industrial. porém para ambos os microrganismos.RESUMO O processo fermentativo para a produção de etanol pode sofrer contaminações por microrganismos indesejáveis. Os halos de inibição para cada um dos antibióticos foram avaliados. o que prejudica o desempenho da levedura utilizada. inibição. fermentação alcoólica. Este trabalho avaliou o efeito da ação inibitória de alguns antibióticos utilizados na fermentação alcoólica industrial através do uso de um antibiograma. por meio de perfurações no Ágar. e dentre eles o uso de antibióticos é bastante difundido. onde foram adicionados 25µL das substâncias inibidoras. Palavras-chave: antibiótico. . Vários são os métodos preconizados para tratamento e inibição dos microrganismos indesejáveis. Para o bacilo a penicilina apresentou o maior valor médio de inibição (14.5 mm). a análise estatística não demonstrou diferença significativa na comparação dos resultados.5 mm) na inibição do coco.

which were added with 25µL of the inhibitory substances. isolated from fermentation industrial process. and among them the use of antibiotics is widespread. which impairs the performance of yeast used.ABSTRACT The fermentation process for ethanol production can suffer from contamination by undesirable microorganisms. creating pools of approximately 5milímetros in diameter. statistical analysis showed no significant difference between results. This study evaluated the effect of the inhibitory action of some antibiotics used in ethanol fermentation through the use of an agar diffusion test. inhibition. Several methods are recommended for treatment and inhibition of undesirable microorganisms. To conduct these tests we used one Gram-positive cocci and one Gram-positive rod. . Key-words: antibiotic. through perfurations in the agar. For the rod inhibition penicilin showed the greater average (14. The inhibition zones of each antibiotic were evaluated and clindamicin HLC+tetraciclin showed the higher average (20. The microorganisms were inoculated in agar Ágar Standard Plate Count (ACP) and submitted to the dosage of antibiotics.5 mm) for cocci inhibition. bacterial contamination. alcoholic fermentation. but for both microorganisms.5 mm).

...........42 Figura 4................................................................Atividade inibidora da Penicilina sobre o bacilo Gram-positivo..............................Atividade inibidora da clindamicina HCL + tetraciclina sobre o coco Gram-positivo ............................................41 Figura 3 .............44 ................LISTA DE FIGURAS Figura 1 ......Atividade inibidora da oxitetraciclina sobre o coco Gram-positivo ...........Atividade inibidora da Penicilina sobre o coco Gram-positivo........................................40 Figura 2 .

........ ................................ por diferentes antibióticos usados comercialmente...........................................................39 Tabela 3 ..........LISTA DE TABELAS Tabela 1 ............... por diferentes antibióticos usados comercialmente................Inibição (halo em mm) do coco Gram-positivo contaminante.............................42 ....................Inibição (halo em mm) do bacilo Gram-positivo contaminante.36 Tabela 2 ..............Fabricante e princípio ativo dos agentes inibidores utilizados.............

Potencial de Hidrogeniônico ppm .Dióxido de Carbono DNA .Programa Nacional do Álcool SO2 .Ácido Sulfúrico K+ .Íons H+ H2SO4 .Latic acid bacteria (Bactéria Ácido Lática) mL .Concentração de Íons K+( Potássio) LAB .Ácido Desoxirribonucléico Dy .Potencial Elétrico H+ .Dióxido de Enxofre .Parte por Milhão Proálcool .LISTA DE ABREVIATURAS ATP .Mililitros mm .Milímetros pH .Adenosina Trifosfato CO2 .

.44 ..42 Gráfico 2 ..............................................Visualização dos valores das médias e do desvio padrão dos halos de inibição(mm) descritos na Tabela 2 para o bacilo Gram-positivo............................LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 ....Visualização dos valores das médias e do desvio padrão dos halos de inibição(mm) descritos na Tabela 1 para o coco Gram-positivo..........

.......1 Materiais ......................................................3 Principais Microrganismos Contaminantes ..................................43 ...............................................................................1 Microrganismos contaminantes.............31 2.............................21 1.......................... .....................................3 Ensaios de inibição .........................................................6 Antibióticos Usados no Controle da Contaminação na Fermentação Alcoólica.................2 Processo Fermentativo para Obtenção de Etanol .4 Distúrbios Operacionais Decorrentes da Contaminação na Fermentação.....2 Métodos ...................................31 2................................................................13 1 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................31 2................................................28 2..................31 2.............................................................2 Antibióticos utilizados.................SUMÁRIO INTRODUÇÃO...........................................42 REFERÊNCIAS .................................2........................................................................................................32 2..............26 1......................................................1 Importância do Etanol Brasileiro..............................................................................................................1 Microrganismos contaminantes...........................................................1 Isolamento dos Microrganismos contaminantes........................................................................................................................................................1............2.....................4 Análise Estatística ..........................................34 3...................................34 4... RESULTADOS ...........................................................5 Principais Métodos Usados no Controle da Contaminação na Fermentação ..........................32 2....2 Atividade inibidora dos antibióticos testados.........................................................40 CONSIDERAÇÕES FINAIS .....2.....................................................32 2.........................18 1.................................................................34 3..........................................2..................................................................33 3.................................................24 1.............................................................1.............................. METODOLOGIA.2 Ativação dos Microrganismos contaminantes......................................................15 1.................................................15 1.... DISCUSSÃO .....................................32 2.......

inibição e queda da viabilidade das leveduras devido às toxinas e ácidos orgânicos excretados no meio. Eles podem ocasionar perda de açúcar significativa e intoxicação das leveduras (OLIVA NETO e YOKOYA. 2003). Programa Nacional do Álcool. por ter sua produção economicamente viável. Por conseqüência. A maior diferença ambiental do álcool está em sua origem renovável (FILHO. a produção de etanol brasileiro cresceu de 556 milhões de litros em 1975/76 para 17. passando pelos trocadores de calor.13 INTRODUÇÃO Como fontes alternativas de energia. formação de goma. com ação seletiva sobre as principais bactérias contaminantes . que surgiu devido à crise internacional do petróleo (SOUZA. Mesmo o Brasil sendo um grande produtor de etanol. A infecção bacteriana na fermentação pode causar danos ao processo tais como: consumo de açúcar. A indústria sucroalcooleira faz uso de métodos tradicionais para o tratamento do caldo de cana-de-açúcar fermentado. seja por motivos tecnológicos ou pelo rendimento apresentado. ocorre redução no rendimento e na produtividade da fermentação (AMORIM e OLIVEIRA. 2007). visto que são energias renováveis. Através da implantação do Proálcool. já que toda a produção do álcool ocorre por esta via. em 14 de novembro de 1975. com a criação do programa Proálcool. o etanol é o que ocupa maior destaque na atualidade. mesmo após o tratamento térmico do caldo. estes podem sobreviver durante o processo industrial de produção do etanol. 1982). floculação do fermento. 1995). 2001). preconizando o uso de antibióticos e de ácido sulfúrico concentrado. o Brasil conquistou uma tecnologia única no mundo para utilização em larga escala de um combustível renovável que não depende do petróleo. o que não ocorre com os demais. 2007). onde existe um expressivo aumento da população bacteriana (ALCARDE. neste processo ainda existem problemas que diminuem o rendimento etanólicocom a contaminação da fermentação por microrganismos. com o objetivo de reduzir sua carga microbiana contaminante. até a chegada às dornas de fermentação.8 bilhões de litros na safra de 2006/07 (UNICA. Dentre os biocombustíveis existentes. Com a implantação do programa. os biocombustíveis são utilizados com a finalidade de diminuir o uso dos combustíveis fósseis. A degradação de sacarose e a formação de ácido lático e acético são os maiores prejuízos causados pela contaminação bacteriana. O conhecimento do processo fermentativo é fundamental na busca por aprimoramento. Os antibióticos microbiocidas são específicos. A utilização de etanol no Brasil como biocombustível encontrou seu ápice na década de 70.

existe a necessidade de se avaliar o princípio ativo destes produtos bem como identificar os contaminantes principais. Os antibióticos são agentes quimioterapêuticos especiais. sendo que o grau de pureza de cada molécula depende do refinamento do processo seqüencial de purificação. e avaliar o efeito inibitório de alguns antibióticos de uso comercial. 2003).14 da fermentação. sobre tais microrganismos isolados. . 2007). A identificação dos contaminantes principais facilitaria a aquisição do antibiótico mais específico possível. enquanto que avaliar o desempenho dos principais produtos utilizados nas destilarias poderia contribuir com a eliminação de custos (SOUZA. A maioria dos princípios ativos empregados na indústria do etanol é obtida do metabolismo de microrganismos selecionados. coletado de processo real de usina sucroalcooleira. A sensibilidade das bactérias contaminantes frente a novos agentes antimicrobianos tem sido largamente estudada (CHERUBIN. Os antibióticos englobam uma grande diversidade de substâncias que podem ser classificadas segundo o mecanismo de ação (EGUCHI. geralmente obtidos a partir de metabólitos de microrganismos que. 1989). identificando qual deles apresentou o melhor efeito inibidor. Considerando o conceito de que há gastos elevados com a aquisição destes produtos pelas destilarias. para isolar microrganismos responsáveis pela contaminação. podem matar ou inibir outros microrganismos. em quantidades muito pequenas. O presente trabalho tem como objetivo analisar o mosto contaminado.

o conceito de etanol foi mudado por meio da busca por fontes alternativas de combustíveis. Essa troca mostrou ser conveniente e satisfatória com relação à operação e eficiência na conversão de açúcares em álcool. México. com o lançamento do programa houve um crescimento progressivo na produção de álcool de 500 milhões de litros em 1975 até 12. Este programa ajudou o Brasil a conquistar uma tecnologia única no mundo para o uso em larga escala de um combustível renovável que não depende do mercado internacional do petróleo (CAVALCANTI.15 1 REVISÃO DE LITERATURA 1. O álcool é utilizado em mistura com gasolina no Brasil. no Japão. . A utilização exclusiva do álcool como combustível está concentrada no Brasil. mais recentemente. 2007). a fermentação alcoólica contínua mostrou ser um processo atrativo. União Européia. batelada simples. Segundo Bertelli (1992). O álcool pode ser obtido de diversas formas de biomassa. A criação do Programa Nacional do Álcool – Proálcool em 1975 foi um grande momento deste período e visava estimular a produção do álcool pelos empresários do setor. Argentina. segundo Zaperlon e Andrietta (1992). O Brasil responde por 15 milhões de litros de álcool de um total de quase 40 bilhões de litros da produção mundial. Colômbia e. O estímulo foi estabelecido até a implementação do parque industrial e do alcance da produtividade a níveis consideráveis.1 Importância do Etanol Brasileiro Após a crise do Petróleo na década de 70. todas as novas destilarias foram montadas baseando-se no processo MelleBoinot (batelada alimentada com reciclo de células). pela oferta de empréstimos a juros favorecidos e a garantia de altos preços de vendas. sendo a cana-de-açúcar a realidade econômica atual. O impulso foi dado após o governo retomar as pesquisas e os investimentos para o desenvolvimento do álcool como combustível (BERTELLI. Índia. A partir da implantação do Proálcool. Já visando a redução dos custos de produção e aumento da produtividade.7 bilhões de litros na safra de 1991/1992.1992). O etanol no Brasil era produzido por processo de fermentação descontínua. Estados Unidos. Presume-se que até 25 bilhões de litros sejam usados para fins energéticos.

em 2020. cujas vendas projetadas são de 467 mil unidades. vodka. A . whisky. para o desenvolvimento de enzimas que permitam extrair a celulose do bagaço da cana . 2005). sendo estimado que. que possivelmente será utilizado para atender parte da demanda mundial por etanol. A tendência de aumento da produção de álcool no Brasil ocorre por vários fatores. o álcool contido em bebidas originais como cachaça. renovável e cujo emprego como alternativa para a matriz energética mundial está em fase de crescimento. conhaque e outras.3 bilhões. entretanto. cerca de 30 bilhões de litros de álcool poderiam ser obtidos desta fonte nos EUA. mais que o dobro da produção de 2006. neste sentido. como aumento da frota de carros bi-combustível (demanda interna).O benefício ambiental associado ao uso de álcool é enorme. inclusive na produção de bebidas industrializadas. 2009). quase o dobro a mais que os automóveis a gasolina. é composta pelo álcool anidro e álcool hidratado. há um potencial de crescimento nas vendas externas do álcool. Sendo considerado pelos especialistas como álcool etílico de biomassa. principalmente. A produção de etanol no Brasil tem como matéria-prima a cana de açúcar. como o SO2 (MOREIRA. A Secretaria de Produção e Agroenergia do MAPA projetam para 2010. Devido especialmente ao crescimento do consumo interno e as exportações de etanol. Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preço do petróleo. vendas de automóveis flex de 1. O consumo interno para 2017 está projetado em 28. sendo produzido nas regiões Centro-Sul e Norte-Nordeste. rum. gerado pela retomada do aumento do consumo doméstico em conseqüência do preço competitivo do combustível em relação à gasolina. O setor sucroalcooleiro tem demonstrado dinamismo considerável e participa com parcela relevante da atividade agrícola paulista e brasileira. A produção de etanol estimada para 2017 é de 38.3t de CO2 deixam de ser emitidas para cada tonelada de álcool combustível utilizado.4 bilhões de litros e as exportações em 10.16 Investimentos estão sendo realizados para viabilizar a produção de álcool a partir de celulose. bourbon. pois cerca de 2. refletem grande dinamismo desse produto.0 milhão de veículos. A expansão do álcool está acontecendo por se tratar de um combustível ainda barato. O mercado interno do álcool vem se destacando no segmento agroindustrial brasileiro. embora os Estados Unidos extraiam esse produto do milho. A produção de etanol. o etanol é para uso combustível ou industrial. excluindo. Por outro lado. as pesquisas se voltam. No Brasil. O Brasil e os Estados Unidos são atualmente os maiores produtores de etanol. suas projeções referentes a produção. consumo e exportação. sem considerar outras emissões.6 bilhões de litros. entre outras coisas (TORQUATO. e não da cana-de-açúcar como acontece no Brasil.

considerando-se o álcool combustível e a cogeração de eletricidade.na segunda quinzena de março 74 empresas estavam em operação. Na primeira quinzena de abril. tanto na forma pura como misturado à gasolina. 2009). também traz benefícios com respeito à qualidade do ar urbano e do clima global. Segundo relatório divulgado pela União da Indústria de Cana-de-Açúcar (Única) a moagem de cana-de-açúcar no Centro-Sul do país totalizou 19. Em relação a outros países.17 expansão do setor automobilístico e o uso crescente dos carros flex é atualmente o principal fator responsável pelo crescimento da produção de etanol no Brasil (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO.70 mil toneladas e a de etanol 710. sendo 92. Dos 6 milhões de hectares plantados de canade-açúcar no Brasil.50 milhões de etanol hidratado (ÚNICA.20% superior ao volume processado no mesmo período do ano anterior.23 milhões de toneladas. com 60% da produção) e os 15% restantes na Região Norte-Nordeste (MOREIRA. 2010). a moagem na safra 2010/2011 atingiu 26. alcançou 984. a partir do bagaço.29 milhões de toneladas na primeira quinzena de abril. a cana-de-açúcar tem participação na matriz energética atual com 12. A produção de etanol. No acumulado. No acumulado desde o início da safra.20 de etanol anidro e 853. O país possui uma área extensa de terra propícia ao plantio dessa cultura e também mão-de-obra disponível. número que cresceu para 207 unidades nesta quinzena. 2005). O custo de produção por litro em comparação a outros países é menor (MICHELLON et al.70 milhões de litros. pois possui total domínio da produção desse combustível. Novas tecnologias para conversão de materiais lignocelulósicos em etanol estão sendo estudadas e disponibilizadas. mas o custo ainda não é muito competitivo com o preço da gasolina no mercado mundial (LIMA. sendo 131.40 milhões de etanol anidro e 617.00 milhões de litros.6%. 2008). Existem também outras fontes que podem servir como matéria-prima barata e renovável. por sua vez. et al. o Brasil possui várias vantagens na produção de etanol. 2002). A vantagem . Esse crescimento reflete a antecipação do início da safra em um número considerável de empresas.. A grande diferença ambiental do álcool está em sua origem renovável.. O etanol é produzido atualmente a partir da cana-de-açúcar no Brasil e a partir do milho e de outros amiláceos nos Estados Unidos. a produção de açúcar chegou a 972. Além de possuir propriedades desejáveis como combustível. que foi de 17. cerca de 85% estão na Região Centro-Sul (concentrada em São Paulo.90 mil toneladas. a produção de açúcar totalizou 756. existe um grande interesse no seu uso. Com essas vantagens.60 milhões de hidratado.22 milhões de toneladas. reflexo do aumento no número de usinas em operação . Por ser a segunda maior fonte de energia renovável do Brasil. 52.

Este processo é desencadeado geralmente por leveduras. as bactérias Zymomonas mobilis causam um grande interesse no mundo cientifico. onde açúcares como sacarose.. Por gerarem ATP. garantido por suas máquinas que são movimentadas por energia que é gerada pela queima do próprio bagaço de cana. presença de inibidores. concentração de açúcar e etanol) o rendimento fermentativo diminui quando se utiliza sacarose como carboidrato para a fermentação. Mesmo com as vantagens apresentadas por Zymomonas mobilis perante as leveduras (fermentações mais rápidas com maior rendimento em etanol. pela regularidade do índice pluviométrico e pelo nível de insolação (ANDRADE. alcoóis e outros produtos (WARD. a bactéria Zymomonas mobilis vem despertando muito interesse pelo seu potencial na produção de etanol. entre outros. à formação de subprodutos como levana e sorbitol (ERNANDES et al. produzindo cerca de 1. Isto proporciona independência quanto aos combustíveis fósseis e aumenta a relação custobenefício. maior taxa específica de produção de álcool e consumo de substrato. Trata-se de uma . O processo fermentativo pode ser afetado pela ação de diversos fatores sofridos por estas enzimas glicolíticas. glicose e frutose são transformados em etanol. Por apresentarem atributos tecnológicos que favorecem seu uso na fermentação alcoólica em escala industrial. conhecida como via glicolítica. segundo alguns autores.2 Processo Fermentativo para Obtenção de Etanol A fermentação alcoólica é um processo químico de transformação dos açúcares em álcool. Nesta via. temperatura. O ácido pirúvico. com velocidade três a quatro vezes maior que Saccharomyces cereviseae. Nos últimos 15 anos.9 mol de etanol por mol de glicose.18 principal do etanol brasileiro é o custo de sua produção. vitaminas. A utilização de bactérias na fermentação vem sendo estudada em busca de reduzir o tempo da fermentação alcoólica. 1. Para que o açúcar (glicose) seja transformado em etanol e gás carbônico são necessárias 11 reações em seqüência ordenada. Isto se deve. 2009). 1991). pH. como quantidade de nutrientes. um produto final importante em todas as rotas. as rotas produtoras de energia necessitam de diversas coenzimas para realização das diferentes reações de biossíntese. cada reação é catalisada por uma enzima específica. 2009). maior tolerância a elevadas temperaturas. em anaerobiose é precursor dos ácidos. condições de crescimento mais simples. biotecnológico e industrial.

2002). sendo estes os principais critérios tecnológicos para sua escolha. ovais ou elípticas. Este microrganismo possui a capacidade de fermentar com eficiência uma grande variedade de açúcares que fazem parte da biomassa lignocelulósica. produzindo etanol com eficiência.. Nos últimos anos. (SOUZA. 2002). 2007). são unicelulares.. mas podem variar em suas dimensões com limites desde 1 a 5 comprimento (PELCZAR et al. pois promove um alto rendimento e elevada produtividade. 2002).. eucarióticos e heterotróficos. 1998). A rota tecnológica no Brasil. mas produz uma mistura de produtos de fermentação de pequeno valor (LIMA et al. possuem formas arredondadas quase sempre. As leveduras fornecem um “pólo enzimático” para o processo. São geralmente maiores que as bactérias. Na obtenção de etanol por via fermentativa. sendo o etanol apenas um subproduto deste processo. Elas fazem parte do grupo de ascomicetos denominados fungos superiores.. adotada na época do Proálcool para a produção de etanol a partir de cana-de-açúcar prevê a utilização de leveduras como sendo os microrganismos responsáveis pela fermentação. 2007). 2009). A levedura realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir energia química necessária para sua sobrevivência. Para o processo de fermentação do mosto de caldo de cana-de-açúcar e melaço para produção de açúcar e etanol são empregadas cepas selecionadas da levedura Saccharomyces cerevisiae (SOUZA. as leveduras são os microrganismos mais importantes. µm de largura e 5 a 12 µm de . 1980). O alto rendimento e a elevada produtividade estão relacionados com a rápida conversão de açúcar em álcool com baixa produção de componentes secundários (PATARO et al. A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais usada nessa tecnologia mas não é capaz de fermentar pentoses. Outro microrganismo potencialmente interessante tanto do ponto de vista genético como fisiológico para ser usado em processos industriais é a Escherichia coli. Para que o homem consiga se beneficiar dessa habilidade é preciso conferir às leveduras condições ideais para que as mesmas trabalhem à seu favor.19 bactéria que possui habilidades de transformar açúcares em etanol e gás carbônico em condições comparáveis às exigidas pelas leveduras (GUERESCHI et al. estudos estão sendo realizados na busca de microrganismos fermentadores de uma variedade de açúcares já que um dos objetivos é aumentar a produção etanólica a partir do bagaço da cana hidrolisado (LIMA. sendo responsável pelo desdobramento dos açúcares em álcool. Este microrganismo é usado comercialmente na fermentação alcoólica. A fermentação alcoólica ocorre no citoplasma da célula da levedura enquanto que a oxidação total do açúcar (respiração) ocorre na mitocôndria (TOSETTO.

mas são consideradas contaminações por não apresentarem características boas para fermentação (ANDRIETTA. Na maioria das usinas de açúcar e álcool usa-se o processo Melle-Boinot para produzir etanol. Rápida fermentação e alto nível de etanol são desejáveis para o processo ser economicamente viável (ANDRADE. 1982). 2) exploração da matéria prima. as destilarias brasileiras são consideradas abertas do ponto de vista microbiológico. A cana-de-açúcar contaminada. com especial consideração ao pré-tratamento e desintegração e 3) sistema apropriado do biorreator para a fermentação. em alguns casos. A cana-de-açúcar é lavada para remoção de impurezas neste processo antes de iniciar a extração do caldo que é tratado por métodos químicos e térmicos. Já as linhagens selvagens são aquelas que podem estar presentes nos processos. entre os quais. 2007). Os açúcares do mosto são convertidos em álcool. As linhagens podem ser selecionadas. aquelas que são adquiridas de forma pura para serem usadas como inóculo nas partidas do processo. O vinho que é rico em álcool segue para a destilação e o leite rico em leveduras é comumente tratado com ácido sulfúrico para reaproveitamento (LIMA. Elas utilizam diferentes cepas comerciais com populações mistas. ou seja. sendo que nas destilarias brasileiras. a levedura pode ser recuperada ao final do ciclo e reaproveitada na fermentação seguinte. ou seja. 1982). a contaminação bacteriana se destaca. 1997). Existem também as leveduras nativas. apresentam boas condições fermentativas. A composição básica do mosto é de caldo tratado e de melaço e nutrientes. a fermentação alcoólica. e os problemas de eficiência no tratamento do caldo. O início da contaminação bacteriana na fermentação é na lavoura com a matéria-prima. várias linhagens de leveduras presentes. dióxido de carbono e outros subprodutos após a adição do inóculo de leveduras. Em escala industrial o processo de fermentação pode ser conduzido de maneira contínua ou em bateladas.20 Para ser econômico. Mesmo sendo considerado um processo teoricamente simples. mas são diferentes das selecionadas. levam um grande número de bactérias e produtos de seu metabolismo para o processo fermentativo (AMORIM e OLIVEIRA. que são encontradas no processo. Por não possuírem unidades de esterilização. pode ser drasticamente afetada em seu rendimento por diversos fatores. o processo biotecnológico de obtenção do etanol depende de três fatores principais: 1) eficiência do microrganismo. . Na centrifugação do mosto fermentado é obtido o vinho e o leite. Ele é baseado na alimentação semi-contínua de uma série de dornas de fermentação onde é adicionado o inóculo de leveduras obtido em um ciclo anterior.

3 Principais Microrganismos Contaminantes O processo fermentativo etanólico industrial é muitas vezes. Entre os principais merece destaque a contaminação bacteriana. transporte. mostos ricos em impurezas minerais. O corte da cana também tem grande influência sobre a contaminação. as leveduras convertem os açúcares presentes no substrato em etanol e gás carbônico. sendo que no corte manual há uma área exposta bem menor para penetração de microrganismos. A planta da cana-de-açúcar possui uma microflora distribuída tanto no sistema vascular como em sua camada periférica. processado em condições tecnicamente adversas. bombas e tubulações que entram em contato direto com o referido material (ALQUATI. Segundo Mutton (1998) é comum encontrar canas cortadas há muitos dias. Na etapa do processo de produção de álcool. álcool e cachaça (CHERUBIN. 2003). A presença destes microrganismos tem origem no campo e atingem os colmos através de infestações de pragas. facilitando assim a infecção. Amorim e Oliveira (1982) . mas poucas são aquelas que já foram caracterizadas quanto ao seu perfil metabólico e seus efeitos sobre a fermentação (BASSO. Nesta fase podem ocorrer vários problemas. Os pátios normalmente encontrados nas unidades industriais para receber as entregas de matéria-prima devem ter seu estoque renovado em até 24 (vinte e quatro) horas. 2007).21 1. enquanto que no mecanizado há um aumento dessa área. O número total de bactérias presentes no caldo bruto de cana-de-açúcar pode ser aumentado sensivelmente tanto por períodos prolongados entre o corte e a moagem da planta como pela falta de assepsia na moenda. a fermentação alcoólica. predominando as bactérias láticas. Leveduras e bactérias láticas são freqüentemente encontradas juntas nos ecossistemas naturais e podem competir pelos mesmos nutrientes (ALEXANDER. canas contaminadas com diversos tipos de microrganismos. Essa intensa preocupação com os contaminantes encontrados nos processos de fermentação está relacionada aos transtornos que estes microrganismos podem provocar. danos por operações de corte. Um tempo maior que esse acentuaria a deterioração da cana. 1971). carregamento. bem como o uso de antissépticos pode ajudar na diminuição desses microrganismos (MUTTON. 1990). secas. Assepsia nas operações de moagem. 2008). peneiragem. A biodiversidade bacteriana nas dornas de fermentação é grande. que consiste em uma das principais preocupações das agroindústrias de açúcar. filtros. Ela é levada junto com o caldo bruto no momento de sua obtenção através da moagem das plantas.

Doze cepas diferentes de bactérias foram coletadas e utilizou-se o seqüenciamento genético para identificar as mesmas. Bastonetes Gram-positivos identificados como Lactobacillus e Bacillus foram encontrados por Gallo (1989) em mosto resfriado e vinho final durante um estudo da contaminação bacteriana em leite com leveduras antes e após ser adicionado o ácido sulfúrico. por exemplo. Foram encontrados também Leuconostoc. o intervalo de temperatura de fermentação típico é o ideal e as LAB são etanol tolerante. o que gera um comprometimento no rendimento alcoólico e altera a viabilidade celular das leveduras. Leuconostoc e Weissella. em função da temperatura. o que os levará a se desenvolver com maior ou menor intensidade. Em sua pesquisa Warren e Heist (2005) utilizaram bactérias que foram isoladas de fermentações em indústrias de etanol combustível. todos esses . Acetobacter. Weissella. Ao contrário do fermento. Os gêneros Bacillus e Lactobacillus são os de maior ocorrência (ROSALES. imita as condições ideais para o crescimento das LAB. durante a propagação do fermento. Ao contrário das LAB. pH. 1989). O ambiente ácido anaeróbio de uma reação de fermentação combinado com abundantes açúcares fermentáveis. Os organismos Gram-negativos. Assim. Esforços nesta área poderão contribuir significativamente para uma imagem mais clara para o setor e manter uma alta prioridade para a investigação. as bactérias mais problemáticas na indústria do etanol combustível são as bactérias Gram-positivas produtoras de ácido lático (LAB). De acordo com Warren e Heist (2005). entretanto. Pediococcus. e desta forma os autores sugeriram que essas bactérias também são muito comuns. 1984). Além disso. incluindo espécies de Acetobacter e Gluconobacter também contaminam as reações de fermentação. dependendo da espécie. este segundo grupo requer condições aeróbias e prolifera onde o oxigênio está disponível. que converte os açúcares em etanol. concentração de açúcar e inibidores. é que independentemente da fase em que se encontram. Clostridium. dos gêneros Lactobacillus. as LAB convertem açúcares em ácido lático e/ou ácido acético. Pediococcus e Acetobacter. Outros autores descrevem na literatura que os gêneros de microrganismos comumente encontrados em caldos do processo são: Bacillus. O que se observa. Bacillus. foram identificados sete lactobacilos de quatro espécies diferentes. das doze cepas isoladas. Lactobacillus. Lactobacillus. Aerobacter.22 destacaram Acetobacter. Clostridium e Leuconostoc (ALTHERTHUM et al.. Esses gêneros podem ser distribuídos de acordo com a fase do processo em que se encontram. Streptococcus e Leuconostoc como sendo as bactérias mais comumente encontradas na fermentação alcoólica. Outras pesquisas realizadas na área de fermentação também destacam que bactérias do grupo Gram-positivo predominam na fermentação alcoólica como microrganismo contaminante.

23 microrganismos produzem quantidades significativas de ácidos orgânicos (butírico. Segundo Purchase (2001. como também álcool e CO2 (AMORIM e OLIVEIRA 1982). temperatura e pH favoráveis para o desenvolvimento de microrganismos contaminantes (GALLO e CANHOS. mas por focos de contaminação das esteiras. Acetobacter (7. Enterobacter (6. estão sempre presentes em trabalhos que se propõem a isolar microrganismos habitantes dos processos de produção de açúcar e álcool. o gênero Leuconostoc tem um papel importante como contaminante. O caldo de cana apresenta altos teores de nutrientes orgânicos e inorgânicos. acético. a cana-deaçúcar. moendas e outros equipamentos.95%) As LAB. de bastonetes (87. esses microrganismos podem se multiplicar e causar problemas ao processo da usina (YOKOYA. principalmente na produção do açúcar. entre outros. por . 2006) “a presença da goma no processo além de contribuir para a queda do rendimento provoca problemas na etapa da cristalização da sacarose. Em uma amostragem dos microrganismos presentes nas etapas de fermentação. além de dificultar a recuperação da sacarose.04%). Em um estudo de caracterização da microbiota bacteriana em amostras de leite de levedura diluído antes e após o tratamento ácido. Quando há condições favoráveis. por estarem mais relacionadas com o substrato da cana-de-açúcar. e o tipo de microrganismos presentes. Leuconostoc (14.60%). 1991). altos teores de açúcar. A contaminação pode ser concebida não somente pela cana. 1989). 2006). vai depender das condições de cada etapa do processo de fermentação. 1989). embora seja um meio propício. Bacillus (9. o gênero Bacillus pode ser transportado para os equipamentos de extração do caldo pelo solo aderido na própria matéria-prima. A presença de Leuconostoc mesenteroides promove o aumento da viscosidade o que. citado por Andrietta.52%). Sendo natural do solo. As bactérias láticas. Essa bactéria utiliza o açúcar do caldo para a produção de goma (ANDRIETTA.46%). Entre elas. Não são todos os microrganismos que são capazes de crescer no caldo de cana.76%) e de não esporulados (73. aumenta a presença desse açúcar no melaço”. fórmico.75%) e Sporolactobacillus (3. os gêneros que predominaram no processo foram Lactobacillus (45. lático).21%). GALLO (1989) constatou a predominância de bactérias Gram-positivas (98. Inúmeros microrganismos infectantes na fermentação alcoólica são provenientes da flora e do solo que ficam aderidos a cana-de-açúcar e são transportados até as destilarias onde se multiplicam. realizada por Rosales (1989). de mosto de alimentação e de vinho final. A quantidade.41%). Outros microrganismos como Klesbsiella e Acetobacter formam goma sendo também citados como habitantes das linhas de caldo (YOKOYA.

1. que propiciam a seleção de determinadas espécies ou linhagens de microrganismos. 2003). como Bacillus subtilis. Essas bactérias competem diretamente com o fermento de açúcares fermentáveis e convertem os açúcares em ácidos orgânicos em vez de etanol. 1996). os quais podem favorecer o controle dos contaminantes. ocorrerá uma limitação ao crescimento microbiano. o controle da contaminação bacteriana é uma preocupação séria (WARREN. que é uma mistura de caldos de diferentes estágios da moenda. sabe-se também que leveduras selvagens podem chegar a dominar o processo caso sejam mais resistentes às condições do processo do que as leveduras inoculadas. 1971). Mesmo a contaminação da matéria-prima sendo proveniente do campo. perdas significativas de etanol são inevitáveis. os processos para obtenção do álcool e açúcar devem ser cercados de cuidados na assepsia. Por isso. Em outras ocasiões. existem condições nas etapas do processo de cada usina.24 exemplo. são altamente adaptadas a se desenvolverem no caldo misto. desde a moagem. mas poderá favorecer o desenvolvimento de bactérias termófilas esporuladas. 2005). reduzindo o rendimento em etanol (BASSO et al. Conhecer e combater os microrganismos contaminantes do processo de produção de álcool vem sendo uma das principais preocupações da indústria sucroalcooleira devido aos prejuízos provocados por elas. Além dos inúmeros problemas gerados pelos contaminantes como o comprometimento na viabilidade da célula da levedura por meio de excreções de toxinas no meio. quando o meio apresentar pH ácido. . evitando alguns problemas. floculação do fermento e formação de gomas. Os problemas gerados pela contaminação bacteriana nas reações de fermentação são multifatoriais..4 Distúrbios Operacionais Decorrentes da Contaminação na Fermentação Por ser bastante favorável ao desenvolvimento de microrganismos. para não haver contaminação com microrganismos indesejáveis à fermentação (ANDRADE. Se as bactérias alcançarem um número crítico. 1997). Geobacillus e espécies de Clostridium (BEVAN e BOND. por exemplo. As leveduras da fermentação alcoólica competem pelo substrato com bactérias que normalmente habitam as dornas (CHERUBIN.

25 A falta de assepsia da sala de fermentação falta de limpeza das dornas e canalizações. A floculação também provoca dificuldades no tratamento ácido do creme de levedura e reduz também a eficiência dos antibióticos e centrífugas normalmente usados (CHERUBIN. De fato ocorre a redução no rendimento fermentativo pelas bactérias láticas. ausência de controle da acidez e nutrientes do mosto. podendo gerar certos problemas como aumento de fundo de dorna. o gênero Lactobacillus que é resistente ao etanol (YOKOYA. Vários fatores podem levar à formação de floculação. 2003). No setor de fermentação e destilação as bactérias lácticas são as principais promotoras de fermentações indesejáveis. ou pelo contato entre bactérias indutoras da floculação e leveduras. Os autores fizeram uma associação às bactérias contaminantes com perdas a níveis de até 55% do valor teórico. quando a contaminação bacteriana atinge níveis superiores a 1. quando uma molécula de glicose é convertida em duas de ácido lático e resultam em duas moléculas de etanol que deixaram de serem produzidas pelas leveduras. entupimento nas tubulações e dificuldade de operação das centrífugas por causa do entupimento dos bicos (SERRA et al. De acordo com um estudo realizado por Amorim et al. especialmente. As bactérias provocam prejuízos à fermentação e inibem o crescimento de levedura pela produção de ácido lático e de outros ácidos orgânicos (AMORIM e OLIVEIRA. 1979). (1981). qualidade da matéria-prima. quando em cultura mista com bactérias contaminantes da fermentação alcoólica (FREDERICK. 1991). 1991).0 x 107 células/mL de mosto. dentre eles destacam-se: contato com gomas sintetizadas pelas bactérias. 1984). causando uma queda significativa no rendimento alcoólico e também na viabilidade das leveduras (ALTHERTUM. variações nas formas de colheita. 2003). refrigeração insuficiente das dornas de fermentação. Apesar dos transtornos gerados pela floculação das leveduras devido a bactérias indutoras da floculação na indústria . e condições climáticas são alguns dos fatores que contribuem para o aumento significativo da população de microrganismos (GALLO e CANHOS. dornas abertas e expostas ao ambiente. Com o aumento da floculação há um aumento da acidez do “vinho” (mosto fermentado e centrifugado). pode ocorrer uma significativa queda no rendimento alcoólico. pois são desviados para a multiplicação bacteriana (CHERUBIN.. Diversos autores verificaram influência dos ácidos acético e lático na inibição do crescimento e na queda da viabilidade celular de Saccharomyces cerevisiae. Elas ocasionam uma redução na velocidade da fermentação. 1982). 1979). Muitos nutrientes também deixam de ser aproveitados pela levedura. ou ainda devido à contaminação por leveduras floculantes (SERRA. 1994).

o controle microbiológico é considerado um instrumento de extrema importância (CASTRO. Há muitos estudos relacionados à sensibilidade das bactérias frente a novos agentes antimicrobianos (ALCARDE.. e ácido sulfúrico concentrado. bactérias contaminantes da produção de etanol podem formar biofilmes sob condições de laboratório. 2001). Segundo Skinner-Nemec et al. A crescente demanda por esse insumo. O ácido sulfúrico é um ácido forte de fórmula H2SO4. possui alto poder corrosivo.. adotado em praticamente todas as unidades produtoras de etanol no Brasil. (2007). Para o controle da infecção bacteriana e de suas conseqüências no processo de obtenção de etanol visando uma fermentação sadia. 2001). é necessário manter o equilíbrio entre as populações microbianas em meio favorável às leveduras. geralmente. é fundamental a busca de soluções práticas e viáveis para atenuar ou eliminar a floculação do fermento nas destilarias. sendo de uso sistemático no processo de fermentação Melle-Boinot. 1995). Embora tenha papel fundamental na acidificação do meio. o ácido sulfúrico é um dos maiores responsáveis pela inibição e morte de células de S. existem outros locais para sua formação. Nas indústrias sucroalcooleiras são normalmente empregados antibióticos.26 sucroalcooleira. de modo a tornar o meio desfavorável às bactérias contaminantes. Neste sentido. tem obrigado o setor sucroalcooleiro a se abastecer de produtos de origens . 1. Os biofilmes são considerados. para reduzir a carga microbiana contaminante. reduzindo assim o custo do etanol (LUDWIG et al. não existem ainda métodos de controle industrial para caracterizar e monitorar estes agentes (LUDWIG et al. 2000). resistentes à limpeza e aos antibióticos e. de ampla utilização na indústria química e de fertilizantes. a produtividade e a flexibilidade do processo de fermentação. Resultados de seus estudos explicam porque a contaminação é persistente e de difícil controle em plantas de produção comercial. incluindo tubulações e trocadores de calor. rápida e eficiente.5 Principais Métodos Usados no Controle da Contaminação na Fermentação Para maximizar o rendimento. cerevisiae. além da superfície imediata do tanque fermentador.

Entretanto. essa classe de produtos tem sido alvo de monitoramento e regulamentação em levedura seca por parte das autoridades regulatórias dos países compradores. Para fins de esterilização industrial as fontes de raios beta e gama são as utilizadas (CAPELLAZO e QUELHAS. Outra alternativa para eliminar estes contaminantes é a utilização de um antibiótico produzido a partir da extração de CO2 contido na flor feminina do lúpulo. Os antibióticos são microbiocidas específicos. são naturalmente radioativos. como o rádio e o urânio. de onde carregam resíduos tóxicos. sendo fornecido na forma líquida. chumbo. 2009). 2003). Por esta razão. não raro obtidos como subprodutos de outros processos. Este produto contém predominantemente a fração β-ácidos naturais de extrato de lúpulos dissolvidos em Propileno Glicol de grau alimentício. 1986). sendo que o grau de pureza de cada molécula depende do refinamento do processo seqüencial de purificação. A irradiação pode mudar o DNA celular.. outros são produzidos artificialmente. como por exemplo. De acordo com Wallerstein (representante da Hopsteiner. Segundo Alcard et al. em especial metais pesados. fenóis halogenados e antibióticos. pois possuem seus núcleos instáveis. 1997). O alto custo. não sendo economicamente viável o ato de reduzir o nível (ALCARDE et al. como o cobalto 60 e césio 137. Certos átomos possuem a propriedade de emitirem ondas ou partículas de acordo com a instabilidade de seus núcleos. em número de 105 UFC/mL é um limite aceitável para as unidades de álcool de funcionamento. A radiação pode ser uma alternativa de descontaminação do mosto de cana-de-açúcar. Recentemente. compostos quaternários. A maioria dos princípios ativos empregados na indústria do etanol é obtida do metabolismo de microrganismos selecionados. não é rara a utilização de produtos proibidos para uso em alimentação animal. Quando é feita a adição de ácido sulfúrico. Biocidas são por vezes obrigados a ser adicionados ao caldo de cana. empresa norte-americana que produz o Extrato de Lúpulo Beta Ácido 45%) que realizou em parceria com a consultoria brasileira Fermentec . esta propriedade é chamada de radioatividade. (2003) houve uma eficiência na redução microbiológica contaminante do mosto de cana-de-açúcar por radiação gama. afetando as funções celulares e induzir a morte das células (URBAIN. (VENTURA. em função da detecção de residual de monensina acima do esperado em lotes exportados (VENTURA. 2009). Alguns elementos. as células de levedura são lavadas após a fermentação. são os principais pontos fracos sobre a utilização destes biocidas. a contaminação bacteriana.27 diversas. tais como carbamatos. a necessidade de aplicação periódica e seleção de microrganismos resistentes a antibióticos. com ação seletiva sobre as principais bactérias contaminantes da fermentação. ou que contenham coadjuvantes inertes prejudiciais à levedura.

na maioria das vezes. 2009).28 estudos e testes com o produto na fermentação alcoólica de usinas do Brasil. não é raro o uso de produtos proibidos para uso de alimentação animal. simulações industriais e fermentações reais dentro das usinas. 2007). Os resultados mostraram que o Beta Ácido possui propriedades antimicrobianas e são particularmente ativos contra bactérias Gram-positivas. Há restrições quanto ao uso excessivo de antibióticos no tratamento de leveduras secas destinadas a alimentação animal. entre eles os de contato direto com a levedura na fermentação alcoólica: ácido sulfúrico. O efeito da aplicação foi analisado em diferentes bactérias com diversas dosagens. Essa situação aliada à falta de boas práticas e procedimentos de fabricação. são obtidos do metabolismo de microrganismos selecionados. 2009). podem resultar na produção de levedura seca com resíduos de antibióticos que não são permitidos e assim causar embargos a lotes específicos de produto exportados pelo Brasil (VENTURA. O uso contínuo de antibióticos na indústria acaba provocando a seletividade das bactérias. biocidas e os antibióticos (VENTURA. suplementos minerais. formulações anti-espumantes. Estes estudos serão divididos em testes de laboratório. o produto chegará ao mercado após quatro anos de estudos. em sua maioria. provocando um desequilíbrio natural da microbiota . Outra descoberta indica que o produto não produz nenhum efeito maléfico na levedura (WALLERSTEIN. Os princípios ativos empregados na indústria de etanol. Eles promovem o aceleramento do processo e incrementam o rendimento. isso promove liberdade para uso de produtos não permitidos na Europa. sendo uma de suas sérias limitações. Os antibióticos são microbiocidas específicos que possuem ação seletiva sobre as bactérias principais que causam contaminação na fermentação. Com isso. Todavia.6 Antibióticos Usados no Controle da Contaminação na Fermentação Alcoólica O ritmo de produção das destilarias de etanol e a exigência de alta produtividade requerem a aplicação de uma série de insumos de origem química. Como não há uma regulamentação no Brasil para uso dos produtos específicos na fermentação alcoólica. Muitos são os produtos usados. As pesquisas também revelaram que a atividade contra bactérias Gram-negativas é insignificante. 1. as bactérias se tornam cada vez menos sensíveis à ação dos antibióticos.

concentrações de K+ muito altas. que pode ser utilizada para importar solutos para dentro da membrana (QUIMICA REAL. responsável pela ligação entre as cadeias de tetrapeptídeos do . As concentrações internas altas de K+ são necessárias não só para a síntese de proteína. Algumas bactérias mantêm a concentração de K+ interna cerca de 70 vezes maior que a externa. Tem como princípio ativo a molécula Monensina Sódica Cristalina. maiores produtoras de hidrogênio. pois as bactérias Gram-negativas. Hoje a dosagem é de 4 ppm. As bactérias mantêm. Segundo Oliveira et al. Delta pH e Dy são responsáveis pela formação da força motriz de prótons. No caso da penicilina. interferindo na absorção de soluto pela célula e promovendo maior gasto energético para a manutenção do balanço osmótico. do que contra as Gram-negativas (MORAIS et al 2006). é criado também um potencial elétrico (Dy). o que sugere a resistência dos contaminantes a este agente ao longo dos anos. são os mais utilizados. Esse gradiente de pH (delta pH) cria um gradiente químico de prótons. Ele é produzido através da fermentação da bactéria Streptomyces cinnamonensis. As bactérias presentes nas dornas de fermentação expelem prótons ativamente (via ATPase) através da membrana celular. Os antibióticos beta-lactâmicos (penicilinas e cefalospirinas) interferem na síntese da parede celular bacteriana. O Kamoran WP® é um antibiótico que age seletivamente como bactericida e bacteriostático. maiores que no meio externo. através de sua ligação com a proteína PBP. 2009). ocorre uma inibição da biossíntese de constituintes essenciais da membrana. sendo que a concentração industrialmente utilizada de Kamoran WP® na época dos estudos era de 1 a 3 ppm.29 contaminante. tendem a se romper e desaparecer. em geral. A monensina é considerada mais eficiente na ação contra bactérias Gram-positivas. como também o gradiente de K+ que se forma é importante para tamponar o pH intracelular por meio do mecanismo de troca de K+/ H+. precursor de metano. A penicilina acopla em um receptor presente na membrana interna bacteriana PBP ( Penicillin Binding Protein) inibindo a enzima envolvida na transpeptidação. 1998). que atua no controle de bactérias Gram-positivas. Como essas bactérias dependem da fosforilação do substrato para formação de ATP. 1989). e mantém o interior mais alcalino. (1996) os antibióticos Kamoran WP® e Penicilina. essa molécula desorganiza o transporte de cátions na membrana das bactérias Gram-positivas. interferindo no transporte ativo da mesma (EGUCHI. o primeiro à base de monensina. como o interior da membrana é mais negativo que o exterior. internamente. É necessário que o excesso de prótons H+ seja expulso da bactéria para que o pH interno se estabilize. De acordo com Química Real (2009). não são afetadas (STROPPA.

impedindo a formação da ligação peptídica. sendo a penicilina V a mais utilizada pois ela é absorvida muito mais rápido pelo organismo e não provoca efeitos secundários (WIKIPÉDIA. 2004). que são enzimas que degradam a penicilina e impedem sua ação. melhorando sua absorção e atingindo níveis sangüíneos mais elevados (DES-FAR LABORATÓRIOS LTDA.. por meio da diminuição da formação de quelatos da oxitetraciclina com o cálcio e o magnésio presentes na dieta dos animais. Ela vem sendo usada por um longo período na avicultura no combate às doenças dos tratos respiratório e digestivo. no entanto pode ser bactericida em altas concentrações. virginiamicina. Sendo um antibiótico de largo espectro. A resistência pelas bactérias à penicilina baseia-se na produção de penicilinases. tem a função de potencializar a ação do produto. há o impedimento da formação das ligações entre tetrapeptídeos de cadeias adjacentes de peptidioglicano. 2010). resultando na degradação da parede. A clindamicina é um antibacteriano do grupo das lincosamidas. Como o interior desta é hiperosmótico. pode controlar cepas resistentes com um simples ajuste de dosagem. Ela tem ação quase que exclusivamente sobre bactérias Gram-positivas (IAFIGLIOLA. derivado da lincomicina e produzido por uma cepa de Streptomyces lincolnensis. e englobam compostos muito relacionados como pristinamicina. Tem ação comprovada contra Clostridium spp. Estreptograminas formam um grupo relativamente pequeno e homogêneo. 2006). Um outro sistema de ação da penicilina é a inativação de enzimas autolíticas na parede celular. a penicilina V e G. Sua atividade sistêmica é dada pela inibição da síntese protéica do microrganismo suscetível. O ácido cítrico. Como todo antibiótico do grupo das tetraciclinas. o que não acontece com os outros antibióticos comumente utilizados. através da ligação à subunidade 50S ribossômica bacteriana. 2001). A virginiamicina é um antibiótico que vem sendo usado na produção animal desde a década de 50. Geralmente a clindomicina é considerada bacteriostática. 2000).30 peptideoglicano. inibindo a síntese de proteína (NICODEMO. micamicina e vernamicina. Estes compostos atuam por meio de ligação com os ribossomos. quando utilizado. ocasionando uma perda na rigidez da parede celular. ou contra organismos altamente suscetíveis (PHARMACOTÉCNICA. . Com isso. sem a existência de uma parede rígida há o afluxo de água do exterior e a bactéria lisa. Há dois tipos de penicilina. a oxitetraciclina atua contra bactérias Gramnegativas e Gram-positivas.

1 Microrganismos contaminantes Os microrganismos utilizados como contaminantes foram isolados a partir de amostra de mosto contaminado. 2.2 Antibióticos utilizados O Quadro 1 a seguir.31 2. a serem identificados posteriormente. FABRICANTE PRINCÍPIO ATIVO Buckman Phibro Química Real Buckman Buckman Reibrand Comercial Reibrand Comercial Buckman oxitetraciclina virginiamicina A monensina A monensina B monensina C penicilina clindamicina HCL + tetraciclina virginiamicina B .1 Materiais Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Tecnologia de Araçatuba “Prof. mostra a relação dos antibióticos utilizados nos experimentos.1. gentilmente cedido pela usina Alcoazul S/A .Fabricante e princípio ativo dos agentes inibidores utilizados. 2.1. Fernando Amaral de Almeida Prado”. de autoria própria. As amostras dos agentes inibidores foram gentilmente cedidas por um dos fabricantes e também pela usina Alcoazul S/A. METODOLOGIA 2. Tabela 1 . retirado da dorna de fermentação. Foram utilizados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo.

para posterior utilização nos ensaios de inibição. foi transferido para tubo de ensaio contendo 12 mL de Ágar de Contagem de Placas (ACP) fundido. previamente esterilizados em autoclave sob vapor fervente. foi passada uma alçada da cultura estoque em Ágar nutriente para 5 mL de leite desnatado a 10%. 2. pelos métodos de Semeadura em Superfície e Pour Plate.2. Decorrido o período de incubação.1%. previamente esterilizado. até crescimento das colônias. Para o coco Gram positivo foi passada uma alçada da cultura estoque em Ágar nutriente para 5 mL de Água peptonada 1%.32 2. 1mL da diluição 10-3 do inóculo do coco Grampositivo em água peptonada 1% ou 1 mL do inóculo em leite estéril do bacilo Gram positivo.2 Métodos 2. e mantidos em refrigeração para posterior utilização. Ambos foram incubados a 35 ± 1°C por 24 horas. As placas de Petri foram incubadas em estufa bacteriológica a 35ºC por 24-48 horas. para posterior adição dos antibióticos. Os microrganismos selecionados foram repicados em tubo de ensaio contendo Ágar nutriente. .2 Ativação dos Microrganismos contaminantes Inóculos do coco e do bacilo foram preparados com 24 horas de antecedência. 2.2. foram perfurados 2 poços de cerca de 5 milímetros de diâmetro cada. respectivamente. Para o bacilo Gram positivo. Após a solidificação e com auxílio de alça de platina previamente flambada. Imediatamente o Ágar foi vertido para as placas de Petri descartáveis e deixado sobre a bancada para solidificação.2. e a partir destas diluições foram feitos plaqueamentos em meios de cultivo Ágar Sabouraud e Agar Padrão para Contagem de Placas.3 Ensaios de inibição Decorrido o período de incubação.1 Isolamento dos Microrganismos contaminantes O mosto retirado da dorna de fermentação foi diluído decimalmente com Água peptonada estéril a 0. foi realizada a contagem dos microrganismos e isolamento de colônias selecionadas para identificação pelo método de coloração de Gram.

a eficiência das substâncias testadas foi avaliada. Os halos de inibição foram medidos em mm com auxílio de uma régua. Transcorrido o período de incubação. considerando um diâmetro de cerca de 5 milímetros do poço perfurado no Ágar.33 Os antibióticos utilizados foram preparados seguindo as instruções dos fabricantes. e foram utilizados também nas concentrações recomendadas pelos fabricantes: 5ppm. 2. separadamente para o coco Gram positivo e para o bacilo Gram positivo. para crescimento dos microrganismos teste (bacilo e coco) e atuação dos antibióticos. Os antibióticos foram adicionados na quantidade de 25µL (micro litro) em cada pocinho. com a tampa para cima. pelos antibióticos comerciais testados. As placas foram deixadas em estufa a 32-34°C por 2 horas. . Posteriormente. elas foram invertidas para finalizar o tempo de incubação. por meio da inibição do crescimento dos microrganismos. Comparou-se as médias dos resultados dos halos de inibição dos microrganismos contaminantes.05. para que os antibióticos pudessem penetrar e serem absorvidos pelo Ágar.4 Análise Estatística Utilizou-se um delineamento inteiramente ao acaso e teste de Tukey (Programa InStat) para p < 0. verificada pela formação de halos de inibição do crescimento em volta do poço onde o antibiótico foi adicionado.2.

RESULTADOS 3.75 20. foi verificada uma . Diâmetro inicial do poço (orifício) no Ágar = 5 mm. quando se comparou a média dos resultados do antibiótico clindamicina HCL+tetraciclina (20.10 0 0 * Média (n=4) do diâmetro do halo de inibição.2 Atividade inibidora dos antibióticos testados A Tabela 1 a seguir.Inibição (halo em mm) do coco Gram-positivo contaminante.00 11. P < 0.05. por diferentes antibióticos usados comercialmente.05) na comparação entre a maioria dos antibióticos testados quanto à inibição do coco contaminante. a serem identificados posteriormente.5 mm) com a média dos resultados do antibiótico virginiamicina B (11 mm).00** Desvio Padrão 3.34 3. Os demais antibióticos avaliados que não se encontram listados. Mesmo assim a análise estatística de todos os dados demonstrou que não houve diferença significativa (p<0.5 mm) quando comparada com as obtidas pelos outros antibióticos.1 Microrganismos contaminantes Foram isolados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo. Antibiótico Penicilina Clindamicina HLC+tetraciclina Oxitetraciclina Virginiamicina B Inibição* 15.50 15. apresenta os resultados dos testes de inibição do coco Grampositivo pelos antibióticos testados. Diâmetro inicial do poço (orifício) no Ágar = 5 mm. Tabela 2 . ** Média (n=2) do diâmetro do halo de inibição. não demonstraram nenhum halo de inibição.77 3. 3.05. O princípio ativo clindamicina HLC+tetraciclina apresentou o maior halo de inibição (25 mm) em uma das repetições e também a maior média (20. Porém. P < 0.

A partir destes resultados é possível concluir que o antibiótico clindamicina HLC+tetraciclina não foi o melhor entre os demais antibióticos utilizados. clindamicina HCL + tetraciclina e penicilina. porém considerando p<0. mas foi melhor que o antibiótico virginiamicina B.01. demonstrando maior efeito inibitório da clindamicina HLC+tetraciclina.35 diferença significativa. As figuras 1 a 3 apresentam a visualização dos halos de inibição verificados após incubação do coco Gram-positivo contaminante em ACP (Ágar de contagem de placas) e adição dos antibióticos oxitetraciclina. Oxitetraciclina Sem inibição Figura 1 .Atividade inibidora da oxitetraciclina sobre o coco Gram-positivo .

36 Sem inibição Clinda + Tetra Figura 2 . .Atividade inibidora da Penicilina sobre o coco Gram-positivo .Atividade inibidora da clindamicina HCL + tetraciclina sobre o coco Gram-positivo Sem inibição Figura 3 .

O gráfico 1 a seguir. permite visualizar melhor os resultados obtidos.00 Desvio Padrão 2. sendo que este último apresentou o maior valor do desvio padrão (3. Porém.75 14. mostra os resultados dos testes de inibição do bacilo Gram-positivo pelos antibióticos testados. Inibição (halo em mm) do bacilo Gram-positivo contaminante. não demonstraram nenhum halo de inibição.16 * Média (n=4) do diâmetro do halo de inibição. quando comparados com a clindamicina HLC+tetraciclina e com a penicilina. Os demais antibióticos avaliados que não se encontram listados.87 4.51 2. A Tabela 3 a seguir.775 mm). P < 0.05. Tabela 3. Visualização dos valores das médias e do desvio padrão dos halos de inibição(mm) descritos na Tabela 1 para o coco Gram-positivo. . Diâmetro inicial do poço (orifício) no ágar = 5 mm. Figura 1. por diferentes antibióticos usados comercialmente.37 Em uma análise dos desvios padrões calculados é possível perceber que os antibióticos oxitetraciclina e virginiamicina B apresentaram uma maior repetibilidade dos resultados. é importante frisar que a virginiamicina B somente apresentou inibição da bactéria em duas das quatro repetições realizadas. Antibiótico Penicilina Clindamicina HCL+tetraciclina Oxitetraciclina Inibição* 14.50 12.

05) na comparação entre os resultados de inibição dos 3 (três) antibióticos avaliados. apresenta a visualização do halo de inibição verificado após incubação do bacilo Gram-positivo contaminante em ACP (Ágar de contagem de placas) e adição do antibiótico penicilina. com um desvio padrão de 2. Atividade inibidora da Penicilina sobre o bacilo Gram-positivo A penicilina também foi o antibiótico avaliado onde se verificou maior repetibilidade dos resultados.163 mm).38 Ficou demonstrado através da análise estatística que mesmo a penicilina apresentando o maior valor médio de inibição (14.5 mm) ou a oxitetraciclina apresentando o maior valor isolado (19 mm). seguido pela clindamicina HCL+tetraciclina (2.872 mm) e pela oxitetraciclina (4. .517 mm. O gráfico 2 a seguir. Sem inibição Figura 4. não houve diferença significativa (p<0. A figura 4 a seguir. permite visualizar melhor os resultados obtidos.

respectivamente). e por isso estes resultados não foram analisados em conjunto com os demais. . ou seja. Visualização dos valores das médias e do desvio padrão dos halos de inibição(mm) descritos na Tabela 2 para o bacilo Gram-positivo.39 Figura 2. Os antibióticos monensina A e monensina C apresentaram resultados isolados de inibição do bacilo Gram positivo (7 mm e 13 mm. somente em uma das quatro repetições.

Acinetobacter cresceu com concentrações de até 400ppm de penicilina e 100ppm de pentaclorofenol. as paredes de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas apresentam diferenças marcantes. conseqüentemente é mais complexa que a parede das Gram-positivas que. (1968) o emprego de penicilina como desinfetante em processo Melle Boinot resultou num maior rendimento em álcool. em nossos estudos. Resultados bastante próximos aos encontrados neste estudo. Segundo Aquarone et al. mostrou que o Biopen reduziu a população das bactérias estudadas em um menor período de tempo. Estes valores são muito maiores dos que os utilizados neste estudo. antibiótico a base de penicilina V potássica. DISCUSSÃO Mesmo não sendo estatisticamente significativos. As bactérias dos 3 últimos gêneros testados mostraram-se resistentes a 400ppm de penicilina e foram eliminadas a 40ppm de pentaclorofenol. apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula. O autor destaca o baixo custo e a produção local de penicilina como vantagens. Em outro estudo realizado por Stroppa (1998) na utilização de Biopen. o produto Kamoran foi mais eficiente ao final de quarenta e oito horas. respectivamente. os resultados obtidos a partir do uso dos antibióticos clindamicina HCL+tetraciclina e penicilina demonstraram os maiores valores médios de inibição para o coco e para o bacilo. Por outro lado. Bactérias Gram-negativas possuem uma parede composta de fina camada de peptidioglicana e uma membrana externa que diferem na sua composição química e. que são mais susceptíveis ao rompimento mecânico. pelo fato deste antibiótico impedir a formação do peptidioglicano.40 4. o produto Kamoran não demonstrou nenhuma inibição dos microrganismos contaminantes. comparando sua ação com a do antibiótico Kamoran que tem como princípio ativo a monensina. Rodini (1989) verificou a ação de penicilina e pentaclorofenol sobre bactérias dos gêneros Acinetobacter. Em sua pesquisa. vinho de menor acidez e ainda um menor tempo de fermentação. Segundo a empresa que fabrica o antibiótico à base de clindamicina HCL+tetraciclina. Micrococcus. apesar de mais espessa. este princípio ativo é indicado para o controle das principais bactérias do gênero Gram (+) e . Pediococcus e Leuconostoc. mostrando uma maior eficiência em nossos ensaios de inibição. Bacillus. Esta é a razão pela qual as bactérias Gram-positivas são mais sensíveis à penicilina do que as bactérias Gram-negativas. Diferentemente dos resultados do pesquisador citado. De acordo com Mota (2008).

Oliva-Neto e Yokoya (2001) analisaram o efeito antimicrobiano de vários produtos. Escherichia coli. fructosus. Uma limpeza rigorosa. Em sua pesquisa. usando contaminantes naturais como Lactobacillus fermentum e Leuconostoc mesenteroides. sendo elas: Bacillus subtilis. vaccimostercus. L. seguida de uma devida sanitização. Lactobacillus plantarum. Pseudomonas e Streptomyces. É válido ressaltar que o controle da contaminação bacteriana nos processos fermentativos necessita de muito mais do que métodos corretivos. L. L. Os resultados encontrados no presente estudo também demonstraram a importância de se avaliar o efeito de diferentes substâncias na inibição dos microrganismos contaminantes. L. B. coagulans. L. demonstrando resultados que poderiam ser comparados aos de nosso presente trabalho. a penicilina V Ácida e a clindamicina foram os mais efetivos contra o crescimento bacteriano em vinte e quatro horas. faz-se necessária a identificação dos microrganismos isolados a fim de comprovar a eficiência e utilidade dos antibióticos testados. . yamanashiensis. L. pois tal prática pode levar ao surgimento da resistência bacteriana e ineficiência quanto ao efeito desejado. dextranicum. coryniformis. B.41 Gram (-). Salmonella. cereus. De acordo com os autores. Sabendo-se que os gêneros de bactérias mais freqüentemente encontrados na contaminação do processo fermentativo são as LAB Gram-positivas. L. A revisão das principais fontes de contaminação bacteriana poderia auxiliar da mesma forma na prevenção e economia com gastos futuros desnecessários. Xanthomonas. l. megaterium. Klebsiella. mutants. podem ser instituídas e contribuírem no controle destes microrganismos. por meio do Teste da Concentração Mínima Inibitória (CMI). e outras como Bacillus. B. a partir da identificação do bacilo e do coco Gram positivos testados. Leuconostoc mesenteroides. incluindo formulações comerciais usualmente utilizadas em usinas de açúcar e álcool. como Lactobacillus. S. Leuconostoc. B. contaminantes dos processos de fermentações alcoólicas. Clostridium. para evitar o uso indevido dos antibióticos. brevis. acidilactici. L. Pediococcus. acidophilus. Candida. L. confusus. Aerobacter. Enterobacter. fermentum. buchneri. Streptococcus faecalis.

Atualmente. a forma mais fácil e mais custo-efetiva para controlar a contaminação bacteriana é através do uso de antibióticos. O controle da contaminação bacteriana nos processos fermentativos necessita de muito mais do que métodos corretivos para não se tornar um problema fora de controle. . O fato é que devido a resistência bacteriana. demonstrando que alguns dos antibióticos não apresentaram nenhum efeito nos microrganismos isolados. possibilitando a condução eficaz do processo ferementativo dentro dos parâmetros que visam a otimização do rendimento industrial da destilaria. há trocas aleatórias de antibióticos no local. com relação a cada antibiótico testado. Isso demonstra que os microrganismos isolados podem ser os causadores da contaminação no processo de fermentação alcoólica. O uso indevido desses produtos está relacionado a uma das causas da resistência bacteriana e conseqüentemente gera altos custos ao estabelecimento. A repetição de valores aproximados por alguns dos antibióticos demonstrou que a ação destes seguiu um mesmo patamar e não foi tão alterado. A utilização de antibióticos nas dosagens recomendadas podem maximizar o controle dos microrganismos não desejáveis. Leuconostoc e Weissella. Os antibióticos foram coletados de uma usina sucroalcooleira que estava passando por problemas reais de contaminação bacteriana. Uma limpeza rigorosa e saneamento podem ser instituídos e contribuírem no controle da contaminação. Fazer uma revisão das principais fontes de contaminação bacteriana também pode auxiliar através da prevenção e posteriormente uma economia em gastos futuros desnecessários. Sabe-se que as bactérias mais problemáticas na indústria do etanol combustível são as Gram-positivas bactérias do ácido lático (LAB) da Lactobacillus gêneros Pediococcus. mas elas não foram estatisticamente significativas.42 CONSIDERAÇÕES FINAIS Houve diferenças quanto à inibição das bactérias contaminantes testadas. O caldo de cana-de-açúcar fermentado foi coletado da mesma usina sucroalcooleira no dia em que a contaminação bacteriana ocorreu.

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