UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA - DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA ASIGNATURA INMUNOLOGA CODIGO 2023105

Tcnicas de diagnstico inmunolgico AGLUTINACIN: Se basa en la interaccin antgenoanticuerpo, que permite establecer si hay presencia de un antgeno determinado, al visualizarse por la formacin de agregados o grumos macroscpicamente. Este fenmeno de aglutinacin se da cuando el antgeno (Aglutingeno) se encuentra en la superficie de las clulas o en membranas de microorganismos, donde al contacto con el anticuerpo (Aglutinina) produce agregacin. La reaccin es ms visible cuando el anticuerpo es de tipo IgM que IgG. Esta reaccin es la usada para la clasificacin de los grupos de sangre ABO y el sistema Rh. Tambin se emplea la aglutinacin en ltex, en la cual se usan partculas de este material cubiertas con el antgeno especfico para el anticuerpo del cual se quiere comprobar su presencia en un suero. La prueba de Coombs es otra prueba de hemaglutinacin que detecta anticuerpos contra los glbulos rojos, importante en diagnstico de enfermedades como anemias hemolticas autoinmunes, y en la prevencin de la anemia hemoltica del recin nacido. La aglutinacin en ltex tambin se emplea en la deteccin de Protena A de S. aureus y de Ag capsular de H. influenza. Hemaglutinacin: Segn la clasificacin de Landsteiner, que es la universal hay 4 grupos sanguneos A, B, AB, O. La determinacin de estos grupos se da enfrentando los hemates con antisueros: Anti-A, Anti-B. Si el antgeno se encuentra en las clulas se producen agregados visibles. Para la clasificacin del Rh. Se utiliza el mismo fundamento, exponiendo a las clulas a suero anti-D ( D es el antgeno ms importante en el sistema Rh.), si hay aglutinacin es Rh. Positivo, si no se presenta es Rh. Negativo. Esta tcnica es bsica para clasificar el tipo de sangre para transfusiones.

Protena C reactiva (PCR): Es una lectina producida por el hgado, descrita por primera vez en 1930 por Tillet y Francis, que normalmente se encuentra en concentraciones pequeas en el plasma, pero que aumenta considerablemente en las primeras 24-48 horas de procesos inflamatorios, debido a que se liga a los polisacridos de las bacterias y activa el complemento (se une a C1q), para cumplir su actividad bactericida. Tambin acta como opsonina para facilitar su fagocitosis, por medio de los receptores para C1q en

los fagocitos. Por esta razn su cuantificacin resulta til para el diagnstico de una enfermedad infecciosa, proceso inflamatorio o para evaluacin teraputica porque disminuye rpidamente con la recuperacin. Cuando se hace examen directo de PCR se basa en la aglutinacin entre la PCR y un anticuerpo unido a la superficie de partculas de ltex. Valores menores a 6 mg/L se consideran normales. Tcnica Materiales y procedimiento: Ltex recubierto por anticuerpos anti-PCR Control positivo y negativo Sueros de pacientes Cartn visualizador Palillos Agitador de Manzzinni a 100 rpm u hoja de papel con un crculo de 16 cm

50 l Control (+) + 20 l ltex 50 l suero + 20 l ltex

50 l Control (-) + 20 l ltex

Ctrl + Mx 1

Ctrl 50 l suero + 20 l ltex

Mx 2

1) Servir las muestras, controles y reactivo de ltex como se indica en la figura 2) Homogenizar con ayuda de un palillo desechable procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del circulo 3) Agitar la tarjeta a 100 rpm durante 2 min. 4) Leer e informar los resultados Factor reumatoideo: Es un anticuerpo, de clase IgG, IgM, IgA, IgE o IgD (ms comn IgM o IgG) dirigida contra la fraccin Fc de la IgG propia. Se encuentra elevado principalmente en artritis reumatoidea en un 80% de los casos y por eso es un factor diagnstico de esta enfermedad, aunque tambin se puede encontrar en otras enfermedades autoinmunes como el Sndrome de Sjgren en el que casi todos los pacientes lo tienen elevado, Lupus Eritematoso Sistmico, Escleroderma etc., neoplasias, infecciones crnicas, incluso en personas sanas. Las tcnicas ms comunes para su deteccin son la utilizacin de glbulos rojos de carnero recubiertos con IgG humana y la aglutinacin con partculas de ltex de poliestireno recubiertas con IgG humana. Si al poner en contacto estas partculas con el suero del paciente en estudio se presenta aglutinacin quiere decir que hay presencia de Factor reumatoideo.

PRECIPITACIN: Es el tipo bsico de reaccin antgeno-anticuerpo. Los antgenos estn en solucin. Se realiza con antgenos solubles que reaccionan con anticuerpos homlogos, produciendo una precipitacin visible. Esto ocurre cuando los antgenos reaccionan con los anticuerpos para formar red Ag-Ac (ambos deben ser al menos divalentes aunque la mayora son multivalentes) y los anticuerpos actan como puentes para unir a los antgenos, el resultado es un agregado grande e insoluble de Ag-Ac, que se ven en forma de banda o anillo, que por su peso va hacia el fondo del tubo.

(Tomado de http://web.educastur.princast.es/proyectos/biogeo_ov/2BCH/B5_MICRO_INM/T52_INMUNOLOGIA/informacion.htm).

VDRL/RPR: La prueba de oro para el diagnstico serolgico de la Sfilis, es el VDRL; el antgeno utilizado para la bsqueda de los anticuerpos es una preparacin artificial de colesterol-cardiolipina lecitina, preparada en alcohol absoluto y desarrollada por el Laboratorio de Enfermedades de Transmisin Sexual de Estados Unidos (Venereal Diseases Research Latoratories), de donde la prueba toma la sigla VDRL. La prueba se realiza en suero calentado a 56C, para destruir factores que puedan

interferir con la reaccin. Derivadas de esta prueba, est Rapid Protein Reagine (RPR) en la cual el antgeno viene listo para usarse, no requiere el calentamiento del suero ni el uso del microscopio para la visualizacin de la reaccin debido a que el antgeno incorpora partculas de carbn, que facilitan la observacin del fenmeno cuando la prueba es reactiva. Otra prueba derivada del VDRL es la Uniheated Serum Reagin (USR) que utiliza el mismo antgeno que el VDRL, pero suspendido en Clorhidrato de colina, que hace innecesario el calentamiento del suero y viene listo para usarse. Todas las pruebas: VDRL, RPR y USR, tienen la misma especificidad, sensibilidad e interpretacin. VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) y RPR (Reagina Plasmtica Rpida), son las pruebas no treponmicas para el diagnstico rpido de la sfilis y son las que se usan comnmente para descartar la enfermedad. Debido a que no utilizan anticuerpos especficos no tienen cien por ciento de confianza. Estas pruebas determinan los anticuerpos de tipo IgM o IgG (llamados tambin Anticuerpos reagnicos), contra los lpidos que se liberan de las clulas daadas durante la enfermedad y estn presentes en la superficie celular de los treponemas. El antgeno es la cardiolipina, obtenida del corazn de las vacas. Ambas pruebas miden la floculacin del antgeno cardiolipnico con el suero del paciente. Se debe inactivar el complemento 30 minutos antes de la prueba. Tcnica Materiales y procedimiento: Antgeno VDRL o RPR Sueros a procesar Suero Control Positivo Suero Control Negativo Lminas planas con anillo de cermica de 14 mm de dimetro Agitador de Manzzinni a 180 rpm u hoja de papel con un crculo de 18 cm Microscopio (objetivo de 10X) 1) Colocar 50 l del suero control positivo en el primer crculo de la lmina, 50 l del suero control negativo en el segundo crculo y 50 l del suero del paciente en el tercer crculo 2) Mezclar fuertemente el antgeno de VDRL durante 10 segundos, con movimientos de rotacin e inversin 3) Adicionar 16 l del antgeno mezclado (una gota con el dispensador) a cada uno de los crculos y mezclar con un palillo cada muestra 4) Colocar las lminas en el agitador durante 4 minutos, a 180 rpm (manualmente dibujar un crculo de 18 centmetros de dimetro) y sobre l, tomar cuidadosamente la lmina, durante 4 minutos, con movimientos suaves y constantes. 5) Colocar la lmina en el microscopio y leer en 10X la prueba de VDRL y la de RPR se lee directamente.

Suero No Reactivo

Suero Reactivo

La ausencia de grumos se interpreta como una prueba NO REACTIVA (negativa), es decir, ausencia de anticuerpos anti Treponema pallidum. La presencia de grumos se lee como REACTIVA (positiva). Si los grumos son muy tenues, la reaccin se interpreta como REACTIVA DEBIL. Cuando la reaccin es REACTIVA O REACTIVA DEBIL, debe hacerse una prueba cuantitativa. Para ello se hacen diluciones dobles del suero (1:2,1:4,1:8,....) hasta la dilucin en que la reaccin se haga dbil. Esta ltima dilucin, indica el ttulo de reactividad y si por ejemplo corresponde a la dilucin 1:32, entonces se informa como REACTIVA 32 DILS. Si el suero sin diluir es dbil reactivo y en la dilucin siguiente es NO REACTIVO, la prueba se informa como REACTIVA O DILS. Una prueba REACTIVA indica que hay anticuerpos anti-Treponema pallidum, es decir, que el paciente ha estado infectado. Estos anticuerpos se negativizan con el tratamiento y por lo tanto para el mdico constituyen un gran indicador de la efectividad o no del tratamiento. La prueba aunque altamente sensible, no lo es tanto en especificidad y bien puede ocurrir que en ciertas circunstancias la prueba sea REACTIVA en ausencia de infeccin sifiltica, estas pruebas se denominan Falsas Reactivas y debern aclararse con pruebas confirmatorias especficas.

TCNICA DE PRECIPITACIN EN GELES 1. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony 2. Tcnica de difusin radial simple de Mancini 3. Tcnica de inmunoelectroforesis El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 1 se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un antisuero. La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reaccin no es muy utilizado, al requerirse grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado. Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo, preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difundan, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente, que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado. La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas.

Tcnica de Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo AgAc, visible en forma de lneas de precipitacin que pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar (Figura 3). En Inmunologa clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de mieloma. Estas reacciones de precipitacin son las que ocurren dentro del organismo entre AgAc, y en donde estos complejos inmunes son fagocitados o destruidos por el sistema reticuloendotelial. Estas reacciones de precipitacin se pueden hacer por medio de diluciones si hay necesidad de cuantificacin, con diluciones crecientes del Ag a estudiar, en los primeros tubos se encontrar exceso de Ag, y en los ltimos exceso de Ac. En los tubos del medio habrn concentraciones parecidas por lo que se precipitan formando inmunocomplejos.

Inmunodifusin Radial Simple (IDRS) - Tcnica de Mancini

Es una prueba que permite la identificacin de proteinas plasmticas. El antgeno (la protena), se deposita en los pozos en distintas diluciones, se incuba a 4 C durante 24-48 horas donde se difunde radialmente en el gel de agarosa que contiene un Ac especfico, formando inmunocomplejos visibles como anillos. El dimetro del anillo es directamente proporcional a la concentracin de la protena en la muestra. Esta prueba es de gran utilidad para medir protenas de complemento, que son una parte integral de la respuesta inmune no especfica. El componente C3 del complemento es vital para cualquiera de las vas, y el C4 para la va clsica. La activacin del complemento se asocia al consumo de estas protenas y a su correspondiente descenso en los niveles plasmticos, por lo tanto una reduccin en sus valores puede llevar a diagnsticos muy importantes. En enfermedades como Lupus Eritematoso Sistmico, glomerulonefritis postestreptocccica, inmunodeficiencias primarias y otras enfermedades autoinmunes como anemias hemolticas se ven niveles bajos de complemento. Tcnica Materiales y procedimiento: Placas de inmunodifusin radial para C3 C4 Calibradores Control positivo Sueros humanos problema

Micropipetas de 2-10l Puntas Cmara hmeda Nevera 4C 1) Remover la placa de su embalaje hermtico y dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos 2) Abrir la tapa 3) Servir 5 l de los calibradores, control positivo y sueros problema sin diluir en cada pozo, comenzando en el No.1 y terminando en el No.12 4) Cerrar la placa y llevar a incubar durante 24-48 h en cmara hmeda a 4C 5) Hacer la lectura midiendo el dimetro de los anillos 6) Informar los resultados con base en la tabla de referencia ELISA La prueba de ELISA est basada en la habilidad del antgeno o anticuerpo de: 1) Adsorberse a un soporte - fase slida, manteniendo su actividad inmunolgica. 2) Unirse a una enzima y que el complejo antgeno o anticuerpo - enzima conserven tanto su actividad inmunolgica como su actividad enzimtica. Este mtodo es empleado para la determinacin de antgenos o anticuerpos a partir de diferentes muestras. Para realizar el ensayo es preciso disponer de una preparacin pura de un antgeno (Ag) o un anticuerpo (Ac) o de ambos. El componente (Ag o Ac) se acopla a un soporte slido como por ejemplo a placas de poliestireno, papel, perlas, etc., que absorber una cierta cantidad de la protena; a uno de los componentes de la reaccin, sea Ag o Ac, se le marca o conjuga con una enzima y luego se escoge el substrato adecuado para la enzima utilizada. La reaccin enzima-sustrato es detenida mediante el uso de una solucin de parada despus del tiempo estandarizado para la reaccin. Componentes de la ELISA - Fase slida: Se puede utilizar para la fase slida: plstico, nitrocelulosa, vidrio, celulosa, poliacrilamida, papel o dextrn. - Conjugado: Enzima + Ag o Ac: Se conjuga o marca el Ag o Ac con una enzima. La enzima utilizada debe ser estable, fcil de conjugar, fcil de detectar y de bajo costo. Las enzimas ms utilizadas para las pruebas de ELISA son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la b-D-galactosidasa. - Substrato: El substrato utilizado debe producir una reaccin con un producto coloreado fcilmente medible, tambin debe ser estable y de bajo costo. Para la enzima peroxidasa se utiliza el substrato o-fenilendiamina (OPD) y para la enzima fosfatasa alcalina, el substrato ms utilizado es el pnitrofenilfosfato (pNPP). - Solucin frenadora: Se utiliza para detener la reaccin, los ms utilizados son HCl, H2SO4, NaOH, H2O, dependiendo del tipo de enzima utilizada en el conjugado. Mtodos no competitivos 1- Placa cubierta con antgeno Se conoce tambin como ELISA Indirecta para determinacin de anticuerpos. Esta tcnica mide los niveles de anticuerpos del paciente contra un antgeno especifico. El antgeno especifico de la prueba es fijado en el soporte-fase slida. Se agrega la muestra del paciente, si el paciente tiene anticuerpos especficos para dicho antgeno se forma un complejo Ag-Ac que es detectado por un segundo anticuerpo que es una anti-gammaglobulina marcada con una enzima. Luego es adicionado el substrato especfico para la

enzima, observndose el desarrollo del color el cual puede ser medido en un espectofotmetro. La intensidad del color es proporcional a la concentracin de Acs en la muestra del paciente. Ensayo inmunoenzimtico para la deteccin cuantitativa y/o cualitativa de anticuerpos IgG contra antgeno de superficie de hepatitis B (HBs) La determinacin de anticuerpos anti-HBs es el ltimo marcador en aparecer durante la seroconversin, es un importante factor en la evaluacin de recuperacin de la infeccin por el HBV y tambin en el screening de los programas de inmunizacin. Este ensayo est basado sobre un ensayo inmunoenzimtico (IEMA), donde las muestras de los pacientes son incubadas junto con antgeno HBsAg conjugado con peroxidasa (HRPO) en los pozos que contienen HBsAg. Durante la incubacin los anticuerpos forman un sndwich con el antgeno marcado y el no marcado con la enzima. Se lava para retirar el material no unido. La enzima residual es activada en la fase slida. Se agrega la solucin buffer sustrato-cromgeno (Buffer fosfato-citrato en Tetrametilbenzidina-TMB) y se detiene la reaccin con solucin de parada (H2SO4 1N). La intensidad del color desarrollada es medida usando un espectofotmetro a 450 nm o 405 nm. Tcnica Materiales y procedimiento: Micropozos fijados con HBsAg subtipos ad y ay Calibradores Controles positivo y negativo Sueros de pacientes Conjugado (HbSAg subtipos ad y ay conjugados con peroxidasa (HRPO)) Diluyente de muestra Solucin de lavado (PBS-Tween 20 concentrada): diluir 1:10 en agua destilada antes de usar TMB cromgeno Buffer sustrato-citrato Solucin de parada (H2SO4 1N) Micropipetas Puntas Incubadora 37C Cmara hmeda 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Llevar todo los reactivos a temperatura ambiente Preparar el nmero de pozos requeridos, incluyendo blanco, controles y calibradores Diluir los sueros de los pacientes 1:10 (50l de suero en 450l de diluyente) Pipetear 50l de cada muestra diluda 1:10, controles positivo y negativo y calibradores sin diluir en cada pozo Agregar 200l del conjugado (HBsAg conjugado con HRPO) a cada pozo excepto el pozo del blanco Tapar e incubar la placa 3 horas a 37C en cmara hmeda Lavar 6 con solucin de lavado (350l por pozo) Secar la placa y agregar 200l por pozo de solucin sustrato-cromgeno preparada inmediatamente antes de servir, as: v/v cromgeno/buffer sustrato en oscuridad 9) Incubar 20 minutos a 37C en cmara hmeda 10) Servir 100l de solucin de parada por pozo 11) Leer la absorbancia a 450 nm e informar los resultados

Esquema IEMA Anticuerpos IgG anti-HBsAg

Ensayo inmunoenzimtico para la deteccin de IgG anti Rubeola

La rubeola es una infeccin viral contagiosa de carcter leve que afecta principalmente a nios y adultos jvenes. Se caracteriza por un exantema eritematoso maculopapuloso de 2-3 das de duracin. Puede presentarse asintomtico. Es importante la deteccin de anticuerpos especficos durante el embarazo porque una primo infeccin podra causar aborto o mortinato o en el feto puede producir daos congnitos. Esta prueba est diseada para la deteccin de anticuerpos de la clase IgG anti rubeola en suero humano. Los pocillos estn cubiertos con antgenos del virus de rubeola, luego se agrega el suero humano diluido donde ocurre la reaccin especfica antgeno-anticuerpo. Se agrega anti-IgG humana (anti-cadena gamma) producida en cabra y marcada con peroxidasa (HRPO). La reaccin se revela por la adicin de buffer sustrato-cromgeno (Tetrametilbenzidina-TMB) y se detiene la reaccin con solucin de parada (H2SO4 1N). La intensidad del color desarrollada es medida usando un espectofotmetro a 450 nm o 405 nm. Tcnica Materiales y procedimiento: Micropozos fijados con antgeno inactivado de virus de rubeola Calibradores Controles positivo y negativo Sueros de pacientes Conjugado (Anti-IgG humana (anti cadena gamma) conjugada con peroxidasa (HRPO)) Diluyente de muestra Solucin de lavado (PBS-Tween 20 concentrada): diluir 1:10 en agua destilada antes de usar

TMB cromgeno Solucin de parada (H2SO4 1N) Micropipetas Puntas Incubadora 37C Cmara hmeda

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13)

Llevar todo los reactivos a temperatura ambiente Preparar el nmero de pozos requeridos, incluyendo blanco, controles y calibradores Diluir los sueros, control positivo y negativo 1:10 (10l de suero en 200l de diluyente) Servir en cada pozo 100l de las muestras diluidas y 100 l del diluyente como blanco de la prueba Incubar la placa a 37C durante 25 minutos en cmara hmeda Lavar con solucin de lavado 5 veces y secar la placa Servir 100l de conjugado por pozo Incubar 25 minutos a 37C en cmara hmeda Lavar son solucin de lavado 5 veces y secar la placa Servir 100l de TMB cromgeno por pozo Incubar 15 minutos a 37C en cmara hmeda Servir 50l de solucin de parada Leer la absorbancia a 450 nm e informar los resultados

IMMUNOCOMB: Es un ensayo inmunoenzimtico indirecto en fase slida. La fase slida es un peine con 12 proyecciones (dientes), cada diente tiene 2 sitios: arriba se encuentra inmunoglobulina humana y abajo el antgeno especfico de la prueba. En un plato se encuentran 6 filas con 12 pozos cada una (para cada diente). Se debe mover el peine de fila a fila esperando un tiempo definido en cada una. El plasma/suero del paciente se pone en la fila A, donde se inserta primero el peine. Si hay

anticuerpos presentes se van a adherir a los antgenos del peine de la parte de abajo y de la mitad. Los componentes que no se unieron son lavados en la fila B. en la fila C se encuentran anticuerpos marcados con una enzima contra anticuerpos humanos, los cuales se van a pegar a los anticuerpos de la parte de abajo y a la inmunoglobulina humana que sirve de control en la parte de arriba. En las siguientes 2 filas los componentes son de nuevo lavados, y en la fila F la enzima reacciona con su sustrato cromgeno. Se observa entonces color azul en los dientes del peine. Esta prueba es muy til en el diagnstico rpido de patologas como hepatitis B. Immunocomb para la deteccin de anticuerpos anti-HBs

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8)

Servir 100l de cada muestra, control positivo y control negativo en la Fila A Diluyente Insertar el peine Incubar 2 horas a 37C en cmara hmeda Lavar Fila B Insertar peine en Fila C: HBsAg biotilinado incubar 30 minutos a 37C Insertar peine en Fila D: Estreptoavivinda unida a fosfatasa alcalina incubar 20 minutos a 37C Lavar Fila E - 2 minutos Insertar peine en Fila F: Sustrato cromognico BCIP (5-bromo-4cloro-3-indol fosfato) en NTB (Nitro azul de tetrazolium) incubar 10 minutos a 37C 9) Detener la reaccin Fila E 1 minuto 10) Leer e informar resultados

Immunocomb para la deteccin de antgeno de superficie de Hepatitis B (HBs) 90 minutos

Etapa Captura de antgeno Lavado Unin con biotilinado

Fila A B anti-Hbs C

Procedimiento Servir 100l de cada muestra, control positivo y control negativo Diluyente Incubar 60 minutos a 37C Mezclar e incubar 2 minutos Incubar 10 minutos a 37C Incubar 10 minutos a 37C Mezclar e incubar 2 minutos Incubar 10 minutos a 37C Mezclar e incubar 2 minutos Leer e informar resultados

Unin de avidina- D fosfatasa alcalina Lavado Reaccin de color Detener la reaccin E F E

INMUNOFLUORESCENCIA: Es una tcnica muy sensible que permite detectar pequeas cantidades de anticuerpos que estn fijados a clulas o tejidos o en suero o plasma. Gracias a esta tcnica se ha logrado descubrir por ejemplo que las clulas plasmticas son las que producen los anticuerpos y ha permitido agilizar diagnsticos para implementar una terapia adecuada ms rpida. Se usa un anti-Ac marcado con una fluorescena, que en el momento de la reaccin se fijar a su Ag que es la inmunoglobulina de la muestra que se desea detectar. Puede ser directa o indirecta, es directa cuando el antgeno se localiza por el Ac que ha sido marcado previamente con fluorescena. En la indirecta es necesario un anticuerpo que reaccione con el antgeno pero adems un anti-Ac marcado que reaccione contra el anticuerpo anterior. Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta.

Inmunofluorescencia Indirecta para deteccin de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii o anti-Trypanosoma cruzi

Aplicacin: esta prueba se utiliza como ayuda para el diagnstico del lupus sistmico eritematoso y el lupus inducido por frmacos. Sin embargo, tambin puede ser positivo en casos de escleroderma, enfermedad de Raynaud, sndrome de Sjgren, artritis reumatoide, sndrome de los anticuerpos antifosfollpidos y otras enfermedades autoinmunes. Por este motivo, el lupus sistmico eritematoso es difcil de diagnosticar y la prueba de los anticuerpos antinucleares se debe completar con otras pruebas con objeto de descartar otras enfermedades autoinmunes. Interpretacin: un resultado positivo de este test sugiere la presencia de una enfermedad autoinmune, aunque en algunas personas mayores, los resultados pueden ser positivos en ausencia de enfermedad autoinmune. Aproximadamente el 95% de los pacientes con lupus sistmico eritematoso dan positivo a la prueba de los anticuerpos antinucleares. Si adems, el paciente presenta sntomas de artritis, rash o trombocitopenia, el diagnstico del lupus es muy probable. La confirmacin se puede conseguir mediante dos pruebas adicionales, los anticuerpos anti-DNA de doble cadena, y los anticuerpos anti-SM Otras condiciones que pueden producir un resultado positivo de la prueba de los anticuerpos antinucleares son:

Sndrome de Sjgren: entre el 40 y el 70% de los pacientes con este sndrome tienen un resultado positivo en la prueba de los anticuerpos antinucleares. Sin embargo, el diagnstico de este sndrome debe ser confirmado mediante pruebas adicionales como las pruebas de los anticuerpos a las ribonucleoprotenas SSA y SSB. En particular la prueba de los autoanticuerpos a SSA es positiva en el 90% o ms de los pacientes con sndrome de Sjgren si esta prueba se realiza por enzimainmunoensayo Escleroderma: entre el 60 y 90% de los pacientes con escleroderma dan positivo a la prueba de los anticuerpos antinucleares. En los pacientes con esta condicin, algunas pruebas adicionales pueden ayudar a distinguir entre las dos formas de escleroderma Tambin puede dar positivo el test de los anticuerpos antinucleares en la enfermedad de Raynaud, la artritis juvenil crnica y el sndrome de los anticuerpos antifosfolpido. Otras enfermedades en las que se encuentran ttulos elevados de anticuerpos antinucleares son la hepatitis crnica, la enfermedad vascular del colgeno y muy ocasionalmente, en algunas enfermedades del tiroides

Un resultado negativo descarta prcticamente el diagnstico del lupus sistmico eritematoso

QUIMIOLUMINISCENCIA: La quimioluminiscencia consiste en la produccin qumica de luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de istopos radiactivos en el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. Tipos de quimioluminiscencia: Quimioluminiscencia directa: marcaje de sustancias slidas con ster de acridina (quimioluminiscente) recubiertas los Acs especficos contra la sustancia a analizar. Quimioluminiscencia indirecta: emplea como marcaje una enzima y produce una fuerte emisin de luz.

SEPARACION DE LT Y LB A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA HUMANA: Los linfocitos son semejantes morfolgicamente, pero son heterogneos en cuanto a densidad, su movilidad electrofortica, vida media y respuesta a mitgenos. A nivel funcional existen varias subpoblaciones que participan por separado o en conjunto en la respuesta inmune. Los linfocitos se pueden identificar de acuerdo con una serie de marcadores caractersticos que se expresan con un gran nmero de molculas de superficie diferentes. En la actualidad, muchos de estos marcadores celulares pueden ser detectados mediante anticuerpos monoclonales especficos. Los LT se pueden distinguir segn sus diferentes receptores de antgeno (TCR) que caracterizan a las subpoblaciones de las clulas T, aunque tambin existen ciertas molculas de superficie que se expresan en todas las clulas T (marcadores panT) y en algunos casos en otras lneas celulares (por ejemplo NKC), un buen ejemplo de los mismos es CD2 como receptor para glbulos rojos de carnero, permitindoles que in vitro formen rosetas espontneas, in vivo y en circunstancias normales, esta molcula junto con el complejo TCR-CD3 y otras glucoprotenas de membrana, colabora con la activacin de las clulas T. Los LB presentan inmunoglobulinas de membrana que son sintetizadas por la misma clula y se encuentran insertadas en la membrana celular en donde actan como receptores de antgeno especficos. Estos receptores pueden ser detectados en la superficie de las clulas maduras mediante anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes y especficos de la inmunoglobulina en cuestin. Cuando las clulas se tien en fro, se observa sobre la clula B una fluorescencia con aspecto anular. Los anticuerpos divalentes frente a las inmunoglobulinas de superficie se unen a los receptores de superficie y los entrelazan, dando lugar a parches de inmunoglobulinas distribuidos por la superficie celular. Cuando las clulas son sometidas a calentamiento, la mayora de estos complejos se desplaza a lo largo de la superficie celular y se acumula en un extremo de la clula, observndose entonces una especie de caperuza. Una vez formada esta caperuza, la inmunoglobulina penetra en el interior de la clula donde es degradada. De la poblacin linfoide perifrica humana, 50-80% forman rosetas espontneas, 15-20% exhiben Ig de superficie de la clase IgM e IgD y 2-10% no tienen marcadores ni para T ni para B, esta poblacin corresponde a los linfocitos "nulos" que podran comprender la poblacin celular implicada en linfocitotoxicidad y/o clulas precursoras de LT y/o LB.

Separacin de clulas mononucleares (linfocitos y monocitos) a partir de sangre perifrica a travs de un medio de alta densidad (Ficoll-Hypaque densidad 1.077 mg/dL) por centrifugacin a baja velocidad
Plasma y plaquetas Clulas mononucleares Ficoll-Hypaque Polimorfonucleares y glbulos rojos

Bibliografa 1. Arce Mendoza, A.Y., Rosas Taraco, A.G. y Rodrguez Tovar, L.E. Prcticas de Inmunologa General Aplicada y Veterinaria. Ed. Manuela Moderno. Mxico. 2007. 2. Kindt TJ., Goldsby R., and Osborne B. Inmunologa de Kuby. 6. Edicin. Editorial McGraw Hill. 2007. 3. Rojas, W. Inmunologa. 16. Edicin. Universidad de Antioquia. 2012. 4. Guzmn MA. Sfilis Manual de Procedimientos Diagnsticos. Serie de Publicaciones Cientficas No. 8. Instituto Nacional de Salud.