Facultad de Ingeniería Química

Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos

METODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentación. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rápida multiplicación de estas diminutas criaturas constituve también una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo día, Es más, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cuítivarlos en el laboratorio. Obtención de un cultivo puro o axénico Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muv raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. En lo que resta de este capítulo, estudiaremos los métodos para obtener y propagar los cultivos axénicos. Estos métodos se desarrollan para bacterias y hongos, pero con unas pequeñas modificaciones, también pueden ser aplicados a algas y protozoos. Los métodos para obtener cultivos axénicos de virus se describirán en el Capítulo 13. La obtención de un cultivo axénico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes. La esterilización A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. La eliminación de todos los microorganismos se denomina esterilización. Los fundamentos de la esterilización y su aplicación en medicina clínica y en la industria se estudiarán en el Capítulo 9. En este capítulo describiremos solamente su relación con el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Todos los aparatos y todo el material utilizado para obtener un cultivo axénico ha de esterilizarse. Esto incluye el medio, las sustancias líquidas o sólidas que se añadan como nutrientes al cultivo, los matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Como medios usuales de esterilización en el laboratorio se utilizan el calor, la filtración y los compuestos químicos. Esterilización por calorEl calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material depende de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo. El calor húmedo mata los microorganismos más rápidamente que el calor seco. Cuando se utiliza calor húmedo, una temperatura de 121 oC durante 20 minutos proporciona condiciones fiables para esterilizar la mayor parte del material de laboratorio. El material voluminoso o los grandes volúmenes de líquido requieren un tiempo mayor para que la temperatura letal alcance el centro de los mismos. Por ejemplo, se tarda sólo 15 minutos en esterilizar 10 ml de líquido en un tubo de ensayo, pero aproximadamente una hora y l0 minutos en esterilizar un matraz de 10 litros de capacidad que esté lleno en sus dos terceras partes con líquido. Los objetos no pueden esterilizarse hirviéndolos en contenedores ahiertos, porque la esterilización requiere una temperatura superior a la de ebullición del agua (100 oC, al nivel del mar). Por este motivo, la esterilización por calor húmedo se realiza en camaras presurizadas. A una presión de 1 atmósfera, se puede calentar el agua a 121oC, sin que llegue a hervir. Cuando la cámara alcanza esta temperatura y presión, su con tenido puede ser esterilizado en 20 minutos, a condición de que todo el aire de la misma haya sido reemplazado por vapor de agua.

Mg. Blga. María Teresa Valderrama Rojas

Mg. Blgo. Edgar Zárate Sarapura

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La llama de un mechero también se utiliza para esterilizar. Cada vez que un matraz o un tubo de ensayo se abre para añadir o sacar material.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos La cámara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave (Figura 3. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos. Blga. Una autoclave utiliza vapor de agua a presión para esterilizar objetos mediante calor. y el aire no quede atrapado en su interior. La mayoría de los autoclaves están diseñadas de manera que el mismo vapor hace salir el aire de la cámara. Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. a fin de destruir cualquier microorganismo que pueda haberse depositado allí. los objetos que quedaran en las bolsas de aire no se esterilizarían. El cristal y los instrumentos de metal también se pueden esterilizar por calor seco. incluyendo pipetas de vidrio.18). donde la esterilización no será efectiva. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Los materiales que se esterilizan en la autoclave quedan húmedos. En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presión casera. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor. Los medios de cultivo y los materiales textiles. Este procedimiento disminuve Mg. Edgar Zárate Sarapura Página2 . También otros materiales secos que resisten las temperaturas altas. Las prendas textiles no pueden esterilizarse mediante esta técnica debido a que la elevada temperatura las carboniza. Blgo. También están equipados con indicadores que comprueban que se alcanza la temperatura precisa y se mantiene durante el tiempo necesario para la esterilización. En caso contrario. tales como toallas y batas de laboratorio. De hecho. matraces vacíos o tubos de ensayo. Se colocan en hornos de aire caliente y se calientan a 170 o C durante 90 minutos. en algunos pequeños laboratorios de microbiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. se esterilizan en la autoclave. especialmente si la autoclave posee secado automático. se pasa la boca del mismo a través de la llama de un mechero.

109 células individuales. El hipoclorito sódico (lejía doméstica) se utiliza para destruir los cultivos de la mayoria de los microorganismos patógenos. Por ejemplo. con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petrí (a las placas Petri Mg. Filtración Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Página3 El método de siembra por estría en placa Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. casi tantos individuos como personas pueblan la Tierra. Las asas e hilos de siembra. que tambien se utiliza como explosivo. antibióticos v otros compuestos termolábiles. si previamente se disuelven en unl íquido. El diámetro de poro es aproximadamente 0. esterilizado previamente. De esta manera. Compuestos químicos La mayoría de los compuestos químicos no se pueden utilizar para esterilizar medios de cultivo. Para aislar células individuales. AISLAMIENTO DE BACTERIAS: CULTIVO BACTERIANO El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir. se utiliza sólo para los líquidos termolábiles. La filtración es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez). las sales de amonio cuaternario se utilizan en la desinfección de mesas. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Estas membranas están compuestas de nitrocelulosa. La utilización de un pequeño horno para esterilizar las asas evita este riesgo. Este gas se aplica en cámaras presurizadas especiales. Blga. vertido en placa y extensión en placa. Para ello. este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos. Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. etc. son de uso común una vez que el experimento ha finalizado. también se esterilizan flameándolos en la llama de un mechero Bunsen hasta la incandescencia. sin embargo. Tecnicamente. El calentamiento repentino en una llama puede formar un aerosol (suspensión de pequeñas gotas de liquido) que contenga celulas microbianas y que puede ser inhalado por la persona que esté trabajando en el laboratorio. Edgar Zárate Sarapura . por uno de los siguientes sistemas: siembra por estría en placa. con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas. que los microbiólogos utilizan para tomar microorganismos de un medio y llevarlos a otro. También se utiliza para esterilizar la superficie de ciertos materiales biológicos. como las semillas y los tejidos vegetales. bancos. pues permanecen en ellos y son tóxicos para los microorganismos que luego se han de cultivar. debido al gran numero en que normalmente están presentes. con un poro de diámetro constante. Los compuestos químicos también se usan para desinfectar los laboratorios. Este metodo de esterilización es rápido y cómodo. por esta razón. Blgo. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración. aproximadamente. que son añadidos a los medios. tales como ropas y contenedores de plástico. la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros. una sola célula de un microorganismo en un medio solido o liquido. normalmente. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. parecidas a la autoclave. aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables.45 µm. que no se pueden esterilizar en el autoclave. Una colonia de bacterias de tamaño medio contiene. para que no contaminen el medio ambiente. La dilución se realiza. los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. En las grandes instituciones se usa el gas tóxico óxido de etileno para esterilizar materiales termolábiles. los microorganismos han de ser diluidos. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos la probabilidad de que las celulas microbianas caigan en el recipiente y contaminen su contenido. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. pero peligroso cuando se trabaja con microorganismos causantes de enfermedad.

Para realizar diluciones de diez en diez. selectivos-diferenciales y de enriquecimiento.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos también se les denomina simplemente placas). Blgo. no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. diferenciales. se puede proceder de dos maneras diferentes. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos. Por tanto. los medios se clasifican en definidos. líquido o sólido. pero a veces de cien en cien. dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. se ha de preparar un medio de cultivo. Por tanto. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). A continuación. Los medios sólidos se hacen generalmente. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Tipos de medios de cultivo El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. La suspensión se absorbe en el agar. Blga. las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar. A continuación. Quizás. conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Edgar Zárate Sarapura Página4 . que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. En el segundo método (extensión en placa). por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Los métodos de vertido en placa y extensión en placa En estos métodos. Por ejemplo. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula. Para cultivar microorganismos en el laboratorio. en la superficie de medio sin sembrar aún. con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. el investigador deseará obtener más células para poder trabajar con ellas. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. no podemos asegurarlo. dependiendo de su composición y uso. una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro. para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico. se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica. extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa. se realizan diluciones seriadas (en varias etapas). cultivos axenicos. A continuación. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. El crecimiento de los cultivos axénicos Una vez que se obtiene un cultivo puro. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. La colonias que se desarrollen la segunda vez. En el método de vertido en placa. selectivos. se flamea el asa. igualmente estéril. normalmente de diez en diez. las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. dejando las células microbianas sobre la superficie. complejos o indefinidos. cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. casi con toda seguridad. Seguramente. las placas se incuban en un lugar adecuado. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. serán. Mg. Como en el método de siembra por estría. permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Por tanto. para recordar las propiedades especiales del agar). Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras creceran en la superficie. añadiendo agar a los líquidos (ver cl recuadro "La despensa de Frau Hesse" en el Capítulo 1.

ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne.J. En cambio. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo. Así. Wolfe lo intentó durante todo un año y tampoco tuvo éxito. Este microorganismo es anaerobio estricto. Generalmente se prefiere la utilizacion de los medios complejos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido. designada cepa M. M. Blga. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular. Pero incluso los microbiólogos más experimentados han cometido errores alguna vez. El procedimiento estaba claro.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos Medios definidos Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta. designada cepa S. Edgar Zárate Sarapura Página5 . omelianskií producía gas metano a partir de etanol y anhídrido carbónico. se denomina agar nutritivo. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original. Por ejemplo. pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. probablemente el medio complejo que más se utiliza. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos. Mg. levaduras o soja. en un tubo de ensayo. pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhídrido carbónico no crecieron. aunque suena bastante simple. glucosa). convertía el hidrógeno gas y el anhídrido carbónico en metano. capaz de producir metano (gas natural). por tanto. se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. hasta que un colega se preguntó si el cultivo era axénico. se trataba de una mezcla de dos bacterias. convertía el etanol en hidrógeno gas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosapeptona. se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Esto. añadió hidrógeno y anhídrido carbónico. no siempre pueden utilizarse. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Cuando este medio se solidifica con agar. porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Blgo. Wolfe decidió volver a aislar el culfivo. Además. De repente lo consiguió: una solución de enzima. otros organismos. pero en vez de añadir etanol y anhídrido carbónico al mismo. sangre. Aunque M. de composición bastante sencilla. no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y. Esto le sucedió a Ralph Wolfe. La otra. Uno de estos medios es el caldo nutritivo. caseína (la proteína de la leche). Un medio líquido complejo se denomina caldo. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido. LA IMPORTANCIA DE SER PURO Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos (puros) para que sus experimentos sean significativos. requieren medios químicamente muy complejos. En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. &iquest. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. uno de los microbiólogos americanos más distinguidos. más fáciles de utilizar nutricionalmente. había sido intentado previamente por otros investigadores y todos habían fracasado. la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. aunque son tan básicos que se explican en los textos introductorios. Ninguna de las dos podía crecer sola con etanol y anhídrido carbónico. pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. Wolfe quería conocer de qué manera M. para hacerlas más solubles y. Todos los experimentos de Wolfe se habían realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qué enzimas pertenecían a la cepa S y cuáles a la cepa M.Qué había sucedido? Un colega. que los problemas técnicos (tales como obtener un cultivo axénico). Medios complejos Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Wolin. por tanto. la triptona y la triptosa. Una. tenía que lisar la bacteria y aislar las enzimas que catalizan la reacción. ¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero. denominados exigentes. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína. En el nuevo medio se desarrollaron colonias.

Ingredientes de un medio definido para el cultivo de Escherichia coli. Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos. Segundo. en este caso la lactosa. mientras que las restantes no lo seran. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial. Por tanto. Por ejemplo.6 g Actúa como fuente de fosfato y como tampón (NH4)2S04 2. pero inhibe el de otras especies de Clostridium. María Teresa Valderrama Rojas Mg. agente causal de una grave intoxicación alimentaria. Por ejemplo.01 g Fuente de calcio. el componente diferencial del medio. el telurito potásico o el cristal violeta. Medios diferenciales Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado mieroorganismo. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico. para identificar Streptococcus pyogenes. que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. mientras suprime el crecimiento de otros. A partir de aquí. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa. que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.02 g Fuente de magnesio. no se requiere cloruro FeSO · 7 H2O 0. Edgar Zárate Sarapura Página6 . se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio está plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies.0 g Fuente de nitrógeno y azufre CaCl2 0. Blga. comienza a ser importante. bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías (Capítulo 23). a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja.0005 g Fuente de hierro MgSO4 ·7 H2O 0. se utiliza un medio selectivo. que incluso un buen microbiólogo puede equivocarse. Ingrediente Cantidad Comentarios KH2PO4 3. como la azida sódíca.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos son reales e importunan a los más prestigiosos investigadores. las colonias de estas dos bacterias serán rojas. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemolisis (muerte y lisis de los hematíes). El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum. MEDOS DE CULTIVO Medios selectivos Un medio selectivo favorece el crecímiento de ciertos microorganismos. pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Blgo. Como este compuesto es relativamente impuro también sirve como fuente de elementos traza Glucosa 1. para aislar Salmonella typhi. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella. agente causal de la fiebre tifoidea. Algunas especies pueden crecer juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axénico cuando realmente no lo son. Mg. la bacteria que causa la escarlatina (Capítulo 22).0 g Fuente de carbono Agua destilada 1000 ml Agar 15 g Se añade si se desea solidificar el medio Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo.

o estufas. María Teresa Valderrama Rojas Mg. los microorganismos crecen mas rápidamente cuando se aumenta la temperatura. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia. Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo (Capítulo 8).5 a 7. Sin embargo. Edgar Zárate Sarapura . Pero. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadoras o en baños de agua. ambos controlados termostáticamente. en el intervalo de 6. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación (Capítulo 5). un medio complejo adecuado para el cultivo de muchas especies de bacterias Ingrediente Peptona Extracto de carne NaCl Agua destilada Cantidad 5g 3g 8g 1000 mL Comentarios Caseína parcialmente ludrolizada por tripaina Concentrado desecado de un extracto de carne en agua caliente Aliadido como osmorregulador Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer. en general.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos Ingredientes del caldo nutritivo.5 y 6. Los incubadoras. en la misma mesa de trabajo. será aportado o eliminado. también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Este microorganismo crece óptimamente a 37 oC. Streptococcos pyogenes se diferencia de otras bacterias porque en agar sangre lisa los hematíes creando una zona clara alrededor de cada colonia. o matraces. pero esto no es suficiente. también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. y que suele ser la de su medio natural. se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien. la temperatura del cuerpo humano. Los medios líquidos. con respecto al oxigeno. distribuidos en tubos o matraces. según el caso. son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos. incluyendo placas Petrí. pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Blga. tubos de ensayo. Página7 pH El pH óptimo depende de la especie bacteriana. Blgo. sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas (Capitulo 2). En el laboratorio.0. para favorecer un crecimiento rápido. Así pues. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado. Medio diferencial. Aunque el pH de un Mg. los hongos crecen mejor entre 4.5. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad. preparados en cualquier recipiente.

Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno. dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar. no pueden vivir en presencia de oxígeno. si estas se incuban dentro de unos contenedores. o que crecen más rápidamente en su presencia. o bien. que mueren incluso con una breve exposición al aire. se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profunditíad deben oxigenarse. Para ello. Algunos microorganismos. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petrí. aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. es un desafio para la ingeniería. También ha sido utilizada para microacrófilos. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno. Otros microorganismos. restringir o eliminar el oxígeno. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar. Los microorganismos anaerobios estrictos. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros. no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. como las bacterias del ácido láctico. a los cuales se denomina aerobios estrictos. como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes. sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo. Cuando se abren estos contenedores para Página8 Mg. En los medios complejos no suele ser esencial. como el tioglicalato. el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente. para ellos es un agente tóxico. como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer. Otros tipos de organismos. llamados anaerobios estrictos. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él. mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire. La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. pero tampoco les afecta negativamente. se tendrá que suministrar. que mezclan el aire con el cultivo. que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores. la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno. el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador. como los que se utilizan para producir antibióticos. Edgar Zárate Sarapura . Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más dificil. que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos. las altas tensiones. pero también pueden crecer sin él. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. la reaccion consume el oxígeno produciendo agua. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio). para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén. obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes. a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones (Capítulo 2). representa una dificultad técnica. Oxígeno La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano (Capítulo 8). Un método muy sencillo para dismínuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhidrido carbónico.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo. pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Blgo. Por tanto. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. en los cuales se hava eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores. Blga. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio. porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base.

o el dimetilsulfóxido (DMSO). Microorganismos que no pueden ser cultivados en el laboratorio Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en un medio artificial. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros. en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. pueden cultivarse en el laboratorio. pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Blga. A veces. Edgar Zárate Sarapura Página9 . se mezcla con sustancias protectoras. como la leche descremada. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos añadir medio o tomar muestras. que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas. Para los microaerófilos (que requieren bajas tensiones de oxígeno) y para los anaerobios aerotolerantes (que pueden crecer en presencia de oxígeno o en su ausencia) se utilizan recipientes cerrados con una vela en su interior. independientemente de la técnica que se utilice. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno. se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. Mg. Si posteriormente se cultivan esas muestras. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno. mensualmente o con otra periodicidad. El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco. Se pueden tomar muestras de suelo y contar el número de microorganismos con la ayuda de un microscopio.50oC. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Conservación de los cultivos axénicos Una vez que se obtiene un cultivo axénico. se cree que sólo una mínima cantidad de las especies que existen en la naturaleza. Posteriormente se procede al sellado de los viales. De hecho. María Teresa Valderrama Rojas Mg. capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. mientras aún se mantiene el vacío. el glicerol. eliminado o restringido dependiendo de los requerimientos de los microorganismos. Blgo. crecerán menos de la mitad de los organismos observados. Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vacio para su sublimación (eliminación del agua congelada). Muchos laboratorios poseen una colección dc cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo. Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los . en nitrógeno líquido o en un ultracongelador. El oxígeno debe ser suministrado. se requieren técnicas más elaboradas.

No sabemos cuántos de estos misteriosos seres existen o qué importancia puedan tener. también pueden utilizarse cultivos de tejidos. Mg. enfermedad de transmisión sexual. Micobacterium leprae. causante de la sífilis. Cuando esto suceda. Edgar Zárate Sarapura Página10 .Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos Algunas de las bacterias que causan enfermedades extremadamente serias no han podido cultivarse en medios de laboratorio pero puede hacerse en animales de experimentación. no han sido identificados. se inocula en armadillos (Capitulo 26). cultivos de células animales. agente causal de la enfermedad de Hansen (lepra). se cultiva en conejos (Capítulo 24). Es de esperar. seamos capaces de identificar e incluso clasificar estos microorganismos en especies simplemente obteniendo pequeños fragmentos de sus genes. que con los modernos avances de la ingeniería genética. los microorganismos que no han podido cultivarse en el laboratorio. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Además de animales vivos. será posible el estudio de los microorganismos sin necesidad de cultivarlos. Las riquetsias y clamidias y todos los virus requieren ser cultivados en sus células hospedadoras vivas. Blga. ya que son parásitos intracelulares obligados. Treponema pallidum. sin embargo. Con muy pocas excepciones. Por ejemplo. Blgo.

éstos son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacteria en cultivo puro. Una de sus limitaciones es que sólo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas sobre la superficie del medio del cultivo.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos TÉCNICAS DE CULTIVO TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Y TÉCNICA DE SIEMBRA POR DIFUSIÓN EN PLACA. En las especies donde las células se agrupan de forma característica. por tanto. Edgar Zárate Sarapura Página11 . las células bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas áreas de la placa lo que permite estar seguro que las colonias que se desarrollan a partir de una célula no se junte con la que se está desarrollándose a partir de otra célula. Cuando se raya adecuadamente agar con el asa de siembras. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez. repetir el proceso entero. (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri. Para sembrar por difusión en placa. Las técnicas de siembra en placa por estrías o por difusión se puede hacer convencionalmente y con equipo mínimo. María Teresa Valderrama Rojas Mg. TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Para obtener un cultivo axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero. Blgo. Mg. se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho basado en agar y se siembra en el medio ya sea por estría o por difusión. y (d) volver a esterilizar el asa. Una porción de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. (e) Después de la incubación. tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Para estar seguro de que el cultivo es puro. por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. (b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra. hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. se desarrollan colonias aisladas. la colonia se desarrolla a partir de un grupo de células del mismo tipo e igualmente representa un cultivo puro. Con un asa bacteriológica. Cada colonia aislada es la descendencia de una sola célula y. un cultivo puro. Blga.

Edgar Zárate Sarapura Página12 Medio de cultivo:………………………………………………………………… Lectura de colonia: color. superficie.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos RESULTADOS Mg. Blgo. . María Teresa Valderrama Rojas Mg. elevación. diámetro (mm). Blga. borde.

Para obtener un cultivo axénico mediante este método. RESULTADOS 1ra dilución 2da dilución 3ra dilución Nº colonias………………………… Nº colonias………………………… Nº colonias………………………… Página13 Mg.Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA. Edgar Zárate Sarapura Numeración final:……………………………………………. María Teresa Valderrama Rojas . Mg. Blgo.. Blga. mezclar y verter el contenido en una placa Petri. se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más grandes). (c) Después de la incubación. (a) hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias. (b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión.

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