Agrobiotecnología

Curso 2011

Clonación y transgénesis animal
Lino Barañao

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario
Clonación

Clonación en distintas especies

Animales transgénicos

Recombinación homóloga

Aplicaciones
Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Referencias

Clonación

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

La clonación consiste en la producción de individuos genéticamente idénticos

• En los animales, la clonación se basa en el uso de la técnica de transplante nuclear. • Mediante esta técnica, una célula donante . del individuo a clonar se transfiere a un . ovocito previamente enucleado.
célula donante ovocito embrión sintético

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Enucleación

Electrofusión

TRANSPLANTE NUCLEAR

Células embrionarias (totipotenciales) Nuevo individuo

X

Células diferenciadas La diferenciación es un proceso irreversible asociado a la pérdida de La diferenciación es un proceso irreversible asociado a la pérdida de totipotencialidad. Sólamente las células embrionarias tienen la totipotencialidad. Sólamente las células embrionarias tienen la potencialidad de generar un organismo completo. De ahí el estatus potencialidad de generar un organismo completo. De ahí el estatus único del embrión. único del embrión.

Dolly fue clonada a partir de una célula de glándula mamaria, Dolly fue clonada a partir de una célula de glándula mamaria, demostrando que aún las células somáticas diferenciadas demostrando que aún las células somáticas diferenciadas pueden ser totipotenciales. pueden ser totipotenciales.

La diferenciación celular sería la consecuencia de la unión reversible de factores de transcripción tejidoespecíficos que regulan la expresión de un grupo particular de genes.

Embrión

Célula somática

Corolario: La “potencialidad” para dar un nuevo Corolario: La “potencialidad” para dar un nuevo individuo no es privativa del núcleo de las células individuo no es privativa del núcleo de las células embrionarias embrionarias

Reprogramación: Los factores de transcripción originalmente presentes en la célula donante se diluyen y son reemplazados por aquellos presentes en el oocito

• ¿Cuáles son las aplicaciones de la clonación animal?

Clonación reproductiva de bovinos
Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para consumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.

Células donantes
• Células adultas • Células fetales

- La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en menor proporción.

- La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulación genética. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en mayor proporción.

cortar el tejido

explanto

Ovocito recipiente

24 hs

Expansión de las células del cúmulus

OVOCITOS INMADUROS
Primer cuerpo polar

OVOCITOS MADUROS • Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. • La maduración consiste en el avance de la división meiótica hasta la metafase II. • En este estadío se observa la extrusión del primer cuerpo polar.

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Transplante nuclear

Para implementar la técnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia.

Agrobiotecnología
Animales transgénicos
Gentileza de Biosidus S.A.

Transplante nuclear
Gentileza de Biosidus S.A.

Ovocito en MII

Enucleación

Célula donante

Transplante nuclear

Fusión celular

Gentileza de Biosidus S.A.

Activación

Post-fusión

Post-activación

Desarrollo embrionario y preñez

Aplicaciones de la clonación
• La clonación reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnología animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoológicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genéticas • La clonación terapéutica se aplica en medicina humana.

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Clonación en distintas especies

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Clonación en ovinos
El primer mamífero clonado a partir de una célula somática fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly.

Tomado de: http://www.roslin.ac.uk/imagelibrary/

Clonación de bovinos
Uno de los primeros bovinos clonados fue “Second chance”

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Animales transgénicos
Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.

Clonación en la Argentina
(De cómo una sucesión de fracasos puede conducir al éxito)

Clonación de bovinos

“Pampa” fue la primera ternera nacida por clonación a partir de fibroblastos fetales en Argentina

Agrobiotecnología
Animales transgénicos
Gentileza de Biosidus S.A.

Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de células somáticas de un animal adulto

El clonado de cerdos requirió modificar la técnica habitual de transplante nuclear.

Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.

Clonación de mascotas

A pesar de que su dueño invirtió más de 3 millones de dólares en ello, “Missy” murió en 2002 sin haber sido clonada.

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Animales transgénicos
http://www.missyplicity.com

Clonación de mascotas

Clon de Little Gizmo

Clon de Rainbow

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Animales transgénicos
http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html

Clonación de primates

”Neti” y “Ditto”

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Animales transgénicos
Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.

¿Clonación de humanos?

• La clonación reproductiva carece de justificación médica. • Su aplicación masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Clonación terapéutica
• La denominada clonación terapéutica permite generar tejidos de reemplazo a partir de células del paciente.

Autotransplante

Tejido normal (ej. fibroblastos)

Transplante nuclear

Factores de crecimiento Matriz extracelular

Embrión (?) sintético Células precursoras del Ovocito (donado) Células embrionarias (pluri o totipotenciales) tejido dañado

Animales transgénicos

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Animales transgénicos

Animales transgénicos

• Un animal transgénico es aquel que tiene una porción de ADN foráneo en su genoma.
- Los primeros animales transgénicos producidos fueron . ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas

Macho fértil
X

Hembra superovulada

Colecta de embriones

Inyección con ADN foráneo Promotor

Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas

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Animales transgénicos
Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen

Crías

Elementos requeridos en una construcción genética

Promotor original del gen a expresar exones

ADN genómico
intrones

ARN mensajero

ADN copia

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Animales transgénicos

Gen recombinante
Promotor regulable o tejido específico intrón

La técnica de microinyección de cigotas resulta muy poco eficiente en bovinos

Microinyección de cigotas bovinos

Eficiencia en la producción de animales Eficiencia en la producción de animales Transgénicos por microinyección Transgénicos por microinyección
Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyección
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Animales transgénicos

2.800 2.500 250 50 1

Embriones transferidos a receptoras Preñeces Terneros transgénicos

Clonación y transgénesis

La introducción de genes por transfección y posterior selección de células totipotenciales permite producir animales transgénicos con muy alta eficiencia.

Agrobiotecnología
Animales transgénicos

Gentileza de Biosidus S.A.

70

60

50

hGH g / day

40

30

20

10

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Day of milking after lactogenesis

Res non verba
25 profesionales, 2 empresas, 3 instituciones


High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow (J. Biotechnology, 2006)
Daniel Salamone1,2, Lino Barañao3 Claudio Santos,1Jorge Artuso1, Carlos Werning1, Leonardo Bussmann6 Aida Prync1Cesar Carbonetto1, , Susana Dabsys1, , Carlos Munar5 Guillermo Berra4, Ignacio Berra, Roberto Salaberry1, Nahuel Fernández1, Mariana Papouchado, Marcelo Foti1, Norberto Judewicz1, Ignacio Mujica5, , Luciana Muñoz, Silvana Mannocci 1, Silvina Fenández Alvarez1, Eliseo González, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo1, Carlos Melo1.

• • • • • • •

1. Biosidus S.A. 2. Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires 3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires 4. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria 5. Munar y Asociados 6. Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET

•PAMPA August 6, 2002 •PAMPA MANSA September 24, 2002

•PAMPA MANSA II & III January 5, 2004

PAMPERO • December 7, 2004

Recombinación homóloga

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Animales transgénicos

Recombinación homóloga
contrucción conteniendo un gen de resistencia a antibiótico flanqueado por secuencias homólogas al exón a eliminar secuencias homólogas
Neo

gen endógeno promotor exones

intrones

gen de resistencia a antibiotico

recombinación
Neo

Neo

el alelo en el que se ha producido la recombinación homologa no produce proteína activa

Recombinación homóloga
• La recombinación homóloga elimina un alelo por vez. • Los animales resultantes son heterocigotas.
linea celular de partida

recombinación homóloga
Neo

se ha eliminado uno de los alelos del gen

transferencia nuclear

el animal resultante posee todavía una copia activa del gen

Recombinación homóloga
Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados.

Neo

X
Neo

Neo Neo

Neo Neo

Homocigota

Recombinación homóloga
“Cupido” y “Diana”, primeros corderos producidos por la técnica de “gene targeting”

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Animales transgénicos

Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000.

Estrategias alternativas para la supresión de una proteína
Silenciamiento por RNAi

Proteína a suprimir Traducción

X
Recombinación homóloga
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Animales transgénicos

ARNm

Transcripción

X

ADN

Silenciamiento génico

La introducción de secuencias cortas (22pb) de ARNs homólogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresión de la proteína respectiva

Degradación del ARNm ARN doble cadena

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Animales transgénicos

Transcripción

ADN

Características de los métodos usados para suprimir proteínas

Recombinación homóloga
- Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresión es total - Proteínas candidatas: PrP, lactoglobulina

Silenciamiento por ARNi
- Afecta al ARN (suprime al mensajero) - El fenotipo deseado se obtiene en la primera generación - Pueden obtenerse niveles intermedios - Proteínas candidatas: lactoglobulina, proteínas de la leche, miostatina

Aplicaciones

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Animales transgénicos

Aplicaciones
• • • •
-- Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces -- Introducción de genes de resistencia a enfermedades Introducción de genes de resistencia a enfermedades -- Producción proteínas humanas que bloquean la acción del complemento en cerdos Producción proteínas humanas que bloquean la acción del complemento en cerdos (ejemplo, CD59) (ejemplo, CD59) -- Transplantes temporaríos de corazón o hígado hasta la obtener donantes compatibles Transplantes temporaríos de corazón o hígado hasta la obtener donantes compatibles -- Peces que expresan proteinas fluorescentes Peces que expresan proteinas fluorescentes -- Producción de proteínas recombinantes humanas en leche y suero Producción de proteínas recombinantes humanas en leche y suero -- Efectos de sobreexpresión de genes Efectos de sobreexpresión de genes -- Eliminación de genes (“knock out”) Eliminación de genes (“knock out”)

Producción de alimentos: Producción de alimentos:

Producción de órganos para xenotransplante: Producción de órganos para xenotransplante:

• • • • • •

Fines ornamentales: Fines ornamentales:

Producción de fármacos (“molecular pharming”) Producción de fármacos (“molecular pharming”) Modelos animales para patologías humanas Modelos animales para patologías humanas

Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos

• Cambios cualitativos en la producción de leche: • Cambios cualitativos en la producción de leche:
- Producción de lactoferrina en leche bovina - Producción de lactoferrina en leche bovina - Producción de leches “humanizadas” - Producción de leches “humanizadas” - Modificación de las caseínas para la producción de - Modificación de las caseínas para la producción de .. quesos especiales quesos especiales

• Cambios cualitativos en la producción de carne: • Cambios cualitativos en la producción de carne:
- Producción de carne bovina libre de riesgo - Producción de carne bovina libre de riesgo de BSE de BSE - Modificaciones cualitativas - Modificaciones cualitativas

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Animales transgénicos

Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos

Bovinos genéticamente modificados para mejorar la producción láctea

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Animales transgénicos

Transgénesis en peces. Producción de alimentos
La introducción de copias extra del gen de hormona de crecimiento aumenta notablemente la velocidad de desarrollo de truchas y salmones.
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Animales transgénicos
Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.

www.aquabounty.com

Transgénesis en peces. Fines ornamentales

Expresión de proteínas fluorescentes en peces cebra

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Animales transgénicos
http://www.glofish.com/photos.asp

Transgénesis en peces. Modelos experimentales

El uso de promotores específicos permite detectar patrones de expresión durante el desarrollo

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Animales transgénicos
Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.

Transgénesis en insectos: transformación de gusanos de seda

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Animales transgénicos
Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.

Transgénesis en insectos: mosquitos

• Se está intentando producir mosquitos resistentes al parásito de la malaria.

Tomado de: Catteruccia et al., Nature, 2000.

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Animales transgénicos

Larvas de mosquitos transgénicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca

Transgénesis en aves

• La expresión de proteínas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. • La transgénesis en aves se enfrenta todavía con notables dificultades técnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. • Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja.

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Animales transgénicos

Transgénesis en cabras
La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras que expresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su leche.

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Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.

Animales transgénicos

Transgénesis en cerdos

• Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfección de células somáticas en cultivo y posterior clonado. • Xenotransplante:
- La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo.

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Animales transgénicos
Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc

ENVIROPIG University of Guelph

Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal

Capacidad de producción de proteínas Capacidad de producción de proteínas recombinantes en la leche en distintas especies recombinantes en la leche en distintas especies Litros/año Cerdo Cabra Oveja Vaca 250 400 500 10.000 Proteína 250 400 500 10.000

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Animales transgénicos

Aplicaciones. Producción de fármacos

Volumen del mercado mundial en proteínas humanas: Volumen del mercado mundial en proteínas humanas: - U$S 20.000 millones - U$S 20.000 millones Ejemplos: Ejemplos: - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Albúmina sérica: U$S 1.500 millones - Albúmina sérica: U$S 1.500 millones

Requerimientos mundiales de proteínas humanas y número de animales transgénicos necesarios para satisfacerlo
Factor VIII Alfa-1-antitripsina Factor IX 120 g 5.000 kg 2 kg 1000 kg 75 kg 2 vacas 10-25 ovejas 33.000 ovejas 42.000 cabras 13 ovejas 22 cerdos 300 vacas 8.300 cabras 600 cabras

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Animales transgénicos

Albúmina sérica Activador tisular del plasminógeno

Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal

1 huevo de oro (1,3 kg) por día
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Animales transgénicos

Vaca transgénica 2 g/L hTPA 10.000 U$S/g 30 L por día U$S 600.000/día

U$S 15.000/día

Aplicaciones
• El uso de animales transgénicos como bioreactores permitiría suplir la demanda de proteínas recombinantes, en particular de aquellas que requieren producción masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial)

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Animales transgénicos

Aplicaciones
• Producción de proteínas recombinantes en leche de animales transgénicos: Productividad de 1 animal transgénico: 1,5 kg de proteína terapéutica/año = equivalente a 200.000 L de fermentación o sea 1 animal transgénico = 4 fermentadores de 500 L
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Animales transgénicos

• Demanda anual de hormona de crecimiento (hGH):
- Mercado latinoamericano: producción de 2 animales transgénicos - Mercado mundial: producción de 40 animales transgénicos

ANDi

Referencias

1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303:1669-74, 2004. 3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005. 4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, 1998. 5. Sitios relacionados con clonación animal: http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/ http://www.infigen.com/ http://www.advancedcell.com/ http://www.emtran.com/ http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone

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