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Evaluación de la calidad y cantidad de ácidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de osteíctios
Rodríguez Castillo, Emanuel

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Resumen:
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios en biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Los métodos de extracción nos permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de cuantificación, calidad entre otros. Se hicieron dos estudios de evaluación, el primero para ADN donde se usaron 3 tipos de muestras: pejerrey fresco y fijado y enlatado de caballa y el segundo para ARN con el uso de tilapia la cual estuvo expuesta a dieta variable. Una previa extracción a base de separadores químicos y físicos y una posterior medición por espectrometría nos permitió determinar la cantidad de g por gramos de tejido en cada caso, un análisis electroforético en gel de agarosa nos permitió comprobar la calidad de nuestra muestra y de los protocolos usados en cada caso. Key Words: extracción DNA, RNA, muestras enlatadas, muestras frescas buffer CTAB

Materiales y Métodos:
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos celulares. En nuestro caso se realizaron 2 experiencias cuantificación y cualificación de ácidos nucleicos, la primera era para cuantificar y cualificar DNA a partir de 3 muestras diferentes siendo estas pejerrey fresco, pejerrey fijado en alcohol 70o y conserva de caballa; en la cual se obtuvieron pequeñas porciones de tejido (30~50 mg) que fueron pesados, separados en tubos autoclavados y rotuladas (ver Anexo). Posteriormente se agregó 300 L CTAB, se disgrego mecánicamente por trituración y

se incubo por 30 min a 60 oC. Luego se adiciona 600 L de un solvente orgánico cloroformo: alcohol isoamilico en proporción 24:1 invirtiendo el tubo varias veces por 5min. Centrifugar en frio (4o C) a 10000 RPMx 5min. Luego se retiró 400L de la fase superior y colocarlo en un tubo conteniendo 30L acetato de sodio: 600L etanol absoluto frio, homogenizar y reposara temperatura ambiente x30min. Centrifugar en frio a 10000 RPMx20min. Decantar el sobrenadante y al precipitado (DNA) lavar con 500L de etanol absoluto frio y centrifugar en frio a 10000 RPMx 2min. Se retira el etanol y se deja secar el pellet para luego

Laboratorio de Genética Molecular

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resuspenderlo con 100L de buffer TE y almacenarlo a 70oC. En la segunda experiencia, se usó RNA de tilapia, la cual ha estado sometida a una dieta de 3 tipos de alimento, del cual se obtuvieron porciones de tejido de aproximadamente 50mg a los cuales fueron pesados, separadas en tubos autoclavados conteniendo Trizol y rotuladas (ver Anexo). Después se disgrego mecánicamente e incubó a temperatura ambiente por 10min. Se le añadió 200L de cloroformo, se agito por inversión y se dejó reposar por 5min. Centrifugar en frio a 10000 RPM x 15min. Luego se tomó 200L de la fase acuosa y transfirió a un tubo con 500 L de alcohol isopropílico donde se homogenizó por inversión y se dejó reposar x 10min. Centrifugar a 10000 RPM x10 min. Se retiró el sobrenadante y el lavado se hizo con 1 mL de etanol 80o y se centrifugo a 10000 RPM x5min. La resuspension del pellet es similar a con DNA con la diferencia que se usó agua bidestilada. Se procesaron 24 tubos para DNA y 23 tubos para RNA, de los cuales se procedió a cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos por medio de análisis espectrofotométrico en un espectrofotómetro UNICO-2100UV tomando datos de Absorbancia 230nm, 260nm y 280nm para determinar la pureza de la muestra y su posible contaminación. La evaluación de calidad e integridad del proceso de extracción tanto de RNA como DNA se hizo mediante una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1% en una cámara electroforética conteniendo buffer de carga (glicerol y azul de bromofenol y cinanocenol) y buffer TBE 1x a pH 8,3 a 100 voltios por 30 minutos. La visualización del gel se hizo tiñendo con bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y fluoresce con luz UV, y un transiluminador con lámpara de luz UV, las imágenes fotografiadas pueden verse en la zona de anexos.

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Resultados y Discusión:
Para una exitosa extracción de ácidos nucleicos, estos deben separarse de cualquier otro compuesto proveniente de las células o del ambiente al que estuvo expuesta la muestra. El espectro de absorción característico para los ácidos nucleicos presenta un máximo en ~260nm; así también es posible obtener mediante reglas empíricas que el valor para una unidad de absorbancia a 260 nm es aproximadamente 50g/mL de dsDNA. Del mismo modo estas reglas también nos permiten proporcionar un valor a las impurezas de naturaleza proteica mediante el cociente A260/A280, dado que el máximo de absorbancia de proteínas se encuentra en ~280nm. La presencia de proteínas hará que este cociente sea mentor que el valor esperado para ácidos nucleicos puros (valor esperado<2). Ocasionalmente también se pueden obtener otros contaminantes de naturaleza orgánica como carbohidratos, residuos de solventes y compuestos fenólicos producto de los reactivos usados durante el proceso de extracción. Estos absorben a 230 nm; por lo que se estima que la relación A260/A230 deba tener un valor optimo superior a 2 para garantizar Laboratorio de Genética Molecular

En la figura #01 para las muestras de DNA podemos darnos cuenta que solo 12 carriles dieron un resultado fluorométrico positivo. Como se puede ver el material aislado mediante este protocolo para extracción de DNA nos indica inicialmente que no es viable para los 3 tipos de muestreo (muestras frescas. muestras enlatadas) o que incluso el DNA posiblemente este demasiado fragmentado (valores muy superiores a 2.[Escriba el título del documento] la pureza de la muestra (Sambrook y Russel. La Figura #01 y Figura #02 muestra una comparación de los rendimientos de las extracciones de todas las muestras juntas. El análisis espectrofotométrico de la tabla #01 nos indica mediante las lecturas de Absorbancia 230nm e índices de A260nm/A230nm que las muestras de extracción de DNA no están aptas para un posterior estudio con PCR al tener valores que no se ajustan a los valores matemáticos mínimos permitidos (A260nm/A230nm>2.0) debido posiblemente a una alta tasa de contaminación producto del proceso de trabajo y/o el protocolo. 2007). Por ultimo también se necesita resaltar que los datos de los índices de Laboratorio de Genética Molecular 3 . Así también. Los resultados obtenidos por el espectrofotómetro pueden verse en el cuadro #01 para DNA y #02 para RNA. En los carriles 22-24 se puede evidenciar unas bandas ubicadas al final lo que posiblemente estaría indicando una contaminación con fragmentos pequeños de DNA e incluso con sustancias aromáticas y/o proteínas posiblemente producto del proceso de extracción y del origen de la muestra. Falcón y Valera. Ahora si se tiene en cuenta los índices de A260/A280. 23-24. Así solamente las muestras fijadas en alcohol muestran ligeramente una respuesta a este método de extracción usado como puede verse a partir de que 3 de los 4 carriles que respondieron al método pertenecen a las muestras fijadas en alcohol. 12. 14. estos no estarían indicando que la cantidad de DNA presente en las diferentes tubos estaría posiblemente contaminado con una cantidad considerable de RNA (como por ejemplo muestras 20-22. podemos añadir que la mayor cantidad de “nucleótidos/gramos de tejido” obtenidos por el protocolo usado ha sido justamente en las muestras en alcohol (Promedio: 389. 2001.946g/g de tejido) lo que estaría confirmando que el protocolo es más productivo al ser usado en muestras previamente fijadas en alcohol. por ejemplo muestras 1-6) ya que una mayor concentración de nucleótido libres y fragmentos pequeños estará enturbiando el medio y la lectura de absorbancia estaría muy elevada. de los cuales solo 4 (carril 8. Cuando los valores no cumplen los estándares estipulados se considera que no entran en el intervalo de aceptabilidad. Se hizo la corrida electroforética para 22 muestras de DNA (muestra 7 fue excluida) y 23 para RNA. fijadas en alcohol y enlatados) ya que la cantidad de material purificado detectado electroforéticamente es bajo. 15) dieron un resultado parcialmente positivo a la presencia de bandas de DNA de alto peso molecular las cuales se usan como indicador de DNA en buen estado (no degradado) para usos posteriores en PCR.

Los resultados de las muestras provenientes de caballa enlatada (muestras 21-24) nos permiten sugerir que durante el proceso de enlatado y/o por los aditivos empleados para este fin. 4 Laboratorio de Genética Molecular . ya que sus índices de A260/A280 no están disparados hacia los extremos (exceptuando la muestra 20 que posiblemente sea producto de un mal manejo del material) sino más bien fluctúan cerca de 2 aun y se puede ver en el gel su fluorescencia (carriles 12.14. como se dijo líneas arriba. 35 y 42 se esperarían que tuviesen la mayor cantidad de RNA puro y los otros carriles con muestras tuviesen en menor cantidad o no presentasen por estar contaminados con DNA u solventes orgánicos producto de protocolo. 22. Así con esta consideración se sugiere que se debería hacer una corrida más pero con un patrón para poder determinar el grado de degradación de los ácidos nucleicos presentes en los tejidos de la caballa destinada al consumo y determinar su verdadero potencial alimenticio. 24. Así las muestras frescas (carriles 1-10) son las que presentan un índice elevado sobre las otras indicando una alta presencia de DNA fragmentado y RNA como puede verse en la Fig#01 donde solamente el carril 8 presente respuesta fluorescente apreciable aun así es posible que sea un falso positivo ya que su valor de absorbancia a 260nm es muy bajo (0. sus índices de A260nm/A280nm deben estar alrededor 1. el material genético del producto alimenticio ha sufrido algún proceso de degradación previa. lo que se podría deducir que el material también estaría degradado. Ahora teniendo en cuenta lo anterior.[Escriba el título del documento] A260/A280 para los 3 muestreos presentan un amplio rango yendo desde el 1 hasta más de 3.084) y su nivel de absorbancia a 230nm es más elevado (0. el análisis espectrofotométrico de la tabla #02 nos indica que los carriles 17. Así podemos ver en las Figuras #01 (parte inferior) y #02 en los carriles anteriormente mencionados (excepto 25) que se corrobora lo anteriormente predicho corroborándose con la visualización en la zona media inferior de los carriles un par de bandas coloreadas que hacen referencia a las bandas ribosomales (señalados con una flecha rojo en Figura #01 y negra en Figura#02). son las que mejor han respondido al protocolo usado. 25.205). Las muestras fijadas en alcohol. Sin embargo es posible que no se haya tenido el cuidado respectivo durante el protocolo de extracción de DNA para estas muestras ya que no todas respondieron como se esperaba según sus índices de Absorbancia (cuadro #01) y las que lo hicieron son visibles levemente.15) donde muestran muy levemente bandas pertenecientes s dsDNA. Para determinar el grado de pureza del RNA. En el carril 25 no se cumple lo predicho y esto es fácilmente explicable si se ve en la tabla #02 el dato de absorbancia de dicha muestra donde su Absorbancia a 230nm es alta respecto a la Absorbancia a 260nm para ácidos nucleicos dando un falso positivo.80~2.

ula.com/technolo gies/RNA-isolation. estas pueden filtrar en el tejido heterogenizando el producto llevando aún bajo rendimiento en el aislamiento de los ácidos nucleicos.firp. 5 Bibliografía:  Bibliografía virtual Conclusiones: Si bien el protocolo de extracción de DNA utilizado para los 3 tipos de muestreo no ofreció los resultados esperados.ws/pedrojroc ha/pr/rocha23_3. el primero es posible que haya ocurrido una contaminación por RNAasas en los carriles 30-34 por eso que prácticamente no se evidencia nada ya que todo se difuminado al medio al estar tan degradado. el protocolo estuvo acertado sin embargo como para DNA. Para la extracción de RNA. lo cual es posiblemente producido por una mala colecta de la fase acuosa durante la extracción de RNA.evrogen.pdf http://www. en alcohol o en aceite y persevantes afecta el procesamiento posterior para estudios.pdf http://www. y además puede dificultar la correcta identificación de la materia prima.ve/archivos/cua dernos/S201A. lo cual es explicable por 2 sucesos.[Escriba el título del documento] En aquellas muestras cuyo índice de A260/A280 es muy elevado (sobre 3) como en los carriles 30-34 y 39-41 y cuyos índices de A260nm para nucleótidos es alto indicaría presencia de RNA pero esto no se evidencia en el gel. se espera que el protocolo se pueda ajustar según a cada muestreo ya que tener las muestra colectadas en agua. instrumentos al realizar el protocolo ya que esto afecto mucho en los datos. así también no se descarta que se debería mejorar la manipulación de los     http://www. Esta posibilidad debe confirmarse.geocities. la mala manipulación y trabajo sobre la muestra afectan demasiado el obtener un análisis valido así como una posterior utilización de la muestra para un estudio más avanzado.shtml http://openwetware. al tomar pipetear seguramente las otras fases (fase orgánica con DNA y fase no soluble) junto a la de la muestra (fase acuosa) y se puede evidenciar en la figura #02 ya que todo el carril está teñido intensamente por la corrida uniforme del DNA contaminante.org/wiki/Main_ Page   Bibliografía escrita RNA Laboratorio de Genética Molecular . El otro suceso es lo que ocurre en la Figura #02 en los carriles 39-14 donde se ve muy fluorescente el carril pero no se puede evidenciar las bandas ribosomales claramente y es que si se ve sus valores de Absorbancia a 230nm y a 260nm están elevados. Considerando que los productos enlatados atraviesan diferentes mecanismos de procesamiento como calentamiento y/o adición de diversas sustancias no siempre indicadas en la etiqueta del producto. ya que podría sugerir algún tipo de engaño a nivel comercial. ya que se altera la calidad del material que se está comercializando.

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24 parte inferior.[Escriba el título del documento] Anexos: 8 Figura#01: Gel conteniendo corridas electroforéticas de DNA y RNA (DNA parte superior y posillos 22. RNA parte inferior) DNA 22 23 24 16 17 18 19 20 muestras de RNA 21 22 23 24 25 26 27 28 30 32 33 34 Laboratorio de Genética Molecular .

[Escriba el título del documento] 9 Muestras de RNA 35 39 40 41 Muestras de DNA 42 1 2 3 4 12 13 14 15 21 5 6 8 9 10 11 16 17 18 19 20 Figura#02: Gel conteniendo la continuación de la corrida electroforética de RNA(nótese que solo los posillos 35 y 42 señalan bandas risómicas. flechas negras) Laboratorio de Genética Molecular .

5 427.048 0.145 0.031 0.023 0.239 2.043 0.205 0.5 308.138 0.614 3.176 55.336 0.163 0.019 244.084 0. 0.655 0.197 0.701 3.461 1.188 0.041 0.060 0.762 277.276 1.136 207 345.506 2.031 0.500 0.188 0.039 0.032 0.478 120 235.5 42.034 0.946 346.765 0.294 0.261 0.5 528.307 0.097 0.033 0.190 0.125 0.158 61.876 Laboratorio de Genética Molecular .761 3.023 0.317 0.113 0.057 0.5 523.846 108 327.273 0.140 138 265.818 46.118 389.044 0.060 0.000 19.649 3.5 103.867 84 365.019 0.226 0.034 0.030 0.615 0.016 0.5 895.080 0.797 3.400 126 307.044 0.251 0.073 0.182 0.045 0.057 0.154 0.037 0.013 0.169 0.054 0.310 2.203 0.308 2.217 0.133 1.197 0.257 2.023 0.737 0.013 0.027 0.5 192.[Escriba el título del documento] Tabla #01 .073 0.391 0.053 DATOS dilución A230 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 0.070 0.068 0.841 253.045 0.054 0.538 198 733.033 0.017 0.119 0.519 3.052 0.5 362.585 339.092 0.130 0.986 217.052 0.5 444.000 0.144 0.965 253.781 195 286.180 0.537 124.261 2.700 1.035 0.083 0.045 0.098 0.026 0.192 0.324 169.348 1.830 1.455 0.522 0.207 0.184 0.813 67.212 0.033 0.014 0.132 0.500 0.333 0.046 0.169 0.500 0.041 0.5 214.333 0.333 0.684 1.061 0.214 46.-datos de Extraccion de Dna # # muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ENLATADO ENLATADO ENLATADO ENLATADO 10 peso tejido (g) 0.121 105 456.179 2.316 1.051 0.5 259.299 0.941 0.590 145.214 2.207 0.020 0.054 0.5 277.173 0.020 0.259 0.223 ABSORBANCIAS A260 0.058 0.410 2.072 0.503 2.105 RESULTADOS INDICES CONCENTRACION A260/A230 A260/A280 ug/mL ug/g Tej.185 A280 0.5 232.056 0.055 0.5 543.385 0.648 295.011 0.

541 0.195 0.0411 0.147 0.0306 0.2 852.0500 0.6 1614.6 928.272 0.176 0.041 0.789 3.8 1897.980 1.8 856.121 0.017 438 1089.2 1722.291 0.0630 0.8 1699.0497 0.603 0.713 193.094 RESULTADOS INDICES CONCENTRACION A260/A230 A260/A280 ug/mL ug/g Tej.500 663.702 3.269 0.677 0.8 1615.701 0.567 2.201 0.135 0.568 723.0423 0.138 3.419 0.430 0.330 0.365 0.0457 0.4 694.332 1.879 Laboratorio de Genética Molecular .352 0.915 0.250 0.0409 0.135 0.161 A280 0.487 0.8 250.0388 0.553 0.971 241.635 1.2 487.000 1.327 0.104 0.168 ABSORBANCIAS A260 0.550 1.135 0.0374 0.2 598.920 1.4840 0. 0.260 282 567.990 3.102 3.824 0.298 0.397 1.158 0.109 3.0402 0.599 1.015 326.561 2.0396 DATOS dilución A230 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 0.802 0.133 988.326 0.064 0.933 417.0370 0.328 0.038 3.000 230.404 0.553 0.348 0.6 1148.0363 0.[Escriba el título del documento] 11 Tabla #02.574 0.571 0.0333 0.218 391.565 718.547 0.483 0.311 0.311 4.453 787.288 1.120 0.263 0.619 3.464 0.898 2.656 0.235 0.509 0.553 0.686 1.538 0.169 0.958 1.300 516 1549.8 115.400 0.0450 0.233 0.206 0.6 2045.100 0..192 0.194 0.190 0.839 3.044 331.4 622.600 76.907 3.468 1.552 1065.8 1801.839 3.988 2.0612 0.100 446.064 0.2 644.4 1150.0521 0.521 1.0553 0.276 0.180 0.614 0.322 0.781 322.888 0.Datos de Extraccion de Rna # # muestra 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 32 33 34 35 39 40 41 42 PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY peso tejido (g) 0.0459 0.372 0.599 0.168 0.193 0.0470 0.515 0.280 688.675 2.437 556.772 3.824 1.548 0.175 0.0377 0.102 0.552 2.040 0.244 0.489 736.303 0.774 649.151 0.703 0.2 1298.467 0.

0 y 9. El Tris tiene un pKa de 8. Es una amina primaria.Conocido también como Bromuro de hexadeciltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br).24 g/mol y de formula global C10H16N208 y usada como agente quelante en biología molecular debido a su capacidad de crear complejos con iones de metales pesados en solución que tengan una estructura de coordinación octaédrica.conocido también como “bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB)”.. de fórmula (HOCH2)3CNH2. haciendo que las proteínas y polisacáridos Laboratorio de Genética Molecular . es una sal cuaternaria. el cadmio y el níquel.. lo que le aporta capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 7. También tienen importancia farmacológica debido a que el EDTA y sus sales sódicas derivadas se utilizan para precipitar metales pesados tóxicos de manera que puedan ser excretados por la orina. radica en su capacidad de precipitar ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración catiónica..es una sustancia comercializada en forma de polvo blanco. Cabe resaltar que pare que tenga una óptima función quelante debe actuar bajo un estrecho margen de pH alcalino. Explicar los principios de los reactivos utilizados para la extracción de DNA  Bromuro de etidio.[Escriba el título del documento] Actividades Complementarias: Extraccion de DNA 1.  TRIS (Hidroximetil amino metano). Emite fluorescencia cuando es irradiado con luz UV. soluble en agua de 12 peso molecular 292. con un grupo alquilo de gran longitud con actividad surfactante catiónica. dentro del cual está la sangre y los líquidos tisulares. por ejemplo la condensación con aldehídos y el establecimiento de un equilibrio ácido-base (responsable de su capacidad tamponante). es una sal de amonio cuaternario cuya fórmula es ((C16H33)N(CH3)3Br).. con la reactividad típica.2. Su uso en los diversos protocolos de extracción en biología molecular.06.Tris es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como tris(hidroximetil)aminometano.  EDTA ó Acido etilendiaminotetraacético. Es conocido también por ser un agente altamente mutaren al contacto con la piel o el tracto respiratorio. Se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular en particular para preparar disoluciones tampón. formando complejos coordinados cíclicos no iónicos virtualmente no disociable y solubles en agua. que es ampliamente usada en técnicas de biología molecular en los laboratorios debido a su propiedad de agente intercalaste entre las hebras del ADN.  Buffer CTAB. así tenemos que forman fuertes quelatos con el plomo.

es una solución buffer comúnmente usada en biología molecular. es un tioglicol liquido incoloro.El cloroformo es más denso que el agua. Es por esta razón que su uso es ampliamente adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales. Su uso en bioquímica así como en biología molecular está muy extendido debido a su habilidad de disociar puentes de disulfuro. se dio a ver que los rangos de pH podían ajustarse a diferentes aplicaciones.  Mercaptoetanol. sin embargo en soluciones de con alta concentración iónica. 13 Laboratorio de Genética Molecular . derivados de estas y de bacterias que producen grandes cantidades de polisacáridos y compuestos fenólicos (Murray y Thompson.1 g/mol y de formulación C2H6OS/HSCH2CH2OH. especialmente para procedimientos que envuelven a DNA o RNA. es aquí donde el mercaptetanol desestabiliza la estructura terciaria de las ribonucleasas por ruptura de puentes S-S previniendo la digestión del RNA durante su extracción. pero la utilización de ambos juntos permite la agregación de los complejos proteína-polisacárido. mientras lo protege de la degradación. Estudios realizados con nucleasas en los años 80’s. por ejemplo a pH 8 el DNA puede guardarse para reducir la depurinizacion la cual es catalizada en medios ácidos.[Escriba el título del documento] permanezcan neutros. donde se busca eliminar las ribonucleasas liberadas durante la lisis celular. que.. de otro modo. una molécula que quela cationes como el Mg+2. “TE” es la abreviatura de sus componente Tris. y EDTA. de masa molecular 78. 1980). un tampón de pH común. y una fase superior en la cual se mantiene el DNA. mientras el RNA guardado a pH 7. el CTAB forma complejos con las proteínas y los polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos. una característica muy apreciada cuando se emplea en protocolos de aislamiento de RNA. El propósito de este buffer es solubilizar el DNA o el RNA. la inferior en donde se encuentra el cloroformo-alcohol isoamílico con las proteínas y los polisacáridos.5 debido a la catalización degradativa de las bases del RNA. ya que por separado cada uno se utiliza para separar proteínas y polisacáridos de los ácidos nucleicos. alterarían la pureza del ADN y por lo tanto. su calidad. por lo que luego de una centrifugación se forman dos fases. Cabe añadir que las nucleasas se ven inactivadas por el EDTA debido a que este secuestra los cationes divalentes necesarios como cofactores para el funcionamiento de las nucleasas.  Cloroformo: alcohol isoamílico..la adición de cloroformo – alcohol isoamílico (24: 1) durante la extracción tiene como fin una combinación de efectos obtenidos por ambos compuestos..llamado también “-mercaptoetanol o 2-HGidroxietanol”.  Buffer TE.

Según el tipo e disociación del grupo hidrofílico en fase acuosa los detergentes pueden ser aniónicos. generalmente en medio básico son aniónicos y en medio ácido catiónicos. Los tensioactivos anfóteros son sustancias en las que los grupos hidrofílicos pueden tener una carga positiva. los detergentes catiónicos actúan de igual forma sólo que en este caso es el ión cargado positivamente el que aporta las propiedades de actividad superficial. que es en general un grupo oxigenado. Función y principio del Chelex. Determinar la diferencias entre los detergentes aniónicos. dependiendo del pH. como los derivados de compuestos cuaternarios de amonio como el Hexadecil trimetil bromuro de amonio (CTAB). como por ejemplo los derivados del ion sulfato o de sulfonados como el dodecil sulfato de sodio o dodecil bencensulfonato de sodio. así tenemos que se necesitan detergentes de origen aniónico para retirar proteínas o membranas como el SDS (dodecil sulfato de sodio) o el Sarkosyl (lauril sarcosina). En algunos casos los tensioactivos no iónicos no poseen una cola claramente definible como hidrofóbica. o detergentes catiónicos para solubilizar polisacáridos como el CTAB. Investigar otros protocolos. Aplicaciones Laboratorio de Genética Molecular .[Escriba el título del documento] 2. catiónicos y no iónicos. pero aun así. negativa o ambas en disolución acuosa. no iónicos o anfóteros. las propiedades tensioactivas continuarán dependiendo del balance de las características hidrofóbicas e hidrofílicas de los diferentes grupos en la molécula. catiónicos.  Sin embargo a pesar de la amplia gama de detergentes que se pueden aplicar a los protocolos de extracciones estos están limitados al tipo de adsorción que tiene las moléculas del surfactante con la macromolécula a querer retirar. su aplicación en las 14 extracciones  Los detergentes conocidos también como surfactantes o sustancias anfifílicas son básicamente moléculas con una parte lipofilica (L) que generalmente es un radical hidrocarbonado y otra parte hidrofílica (H) o polar de la molecular. pero son solubilizados en agua debido a la presencia de grupos polares. Los tensioactivos no iónicos no pueden disociarse en iones. 3.  Así tenemos que los detergentes aniónicos al disociarse en fase acuosas un ión cargado negativamente aporta las propiedades de actividad superficial. así tenemos a los alcoholes grasos o fenoles.

Am J Clin Pathol. ph 8. o La solución se incuba a temperatura ambiente x 30min. EDTA 0. y se calienta a 100 oC durante 10 min para inactivar la proteinasa K. o Se trató con 200L de proteína K 5mg/mL a 55 ºC por toda una noche en agitación constante.2M) empleando el Mixer Homogenizer (Omni Internacional).2M.  Metodología de extracción de DNA de tejidos embebidos en parafina o Se lava cortes el tejido con xilol. 1(8599): 1356-8 (**) Ghossein RA. se recentrifuga a 13000 RPM x 30min.2M. se precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto. 1994. Salomon RN. Ross DG. o A la mañana siguiente se incuba x30min en hielo y se centrifuga a 13400 x g/1 min. EDTA 1mM) con 5 L de proteinasa K y 5. o El sobrenadante se trató 2 veces con un volumen igual de fenol/cloroformo (1: 1). A search for mycobacterial DNA in sarcoidosis using the polymerase chain reaction. (**) o La solución se incuba a 55 oC durante 4 horas.3. Stainer P. pH 8. NaCl 0. y luego 2 veces con etanol de manera similar a lo estipulado por Lench y col. centrifugando a 13400 x g/5 min en cada tratamiento. o Se precipitan los ácidos nucleicos con 2 volúmenes de etanol puro y centrifugando a 13400 x g/10 min.(*) o Los cortes de tejido se resuspenden en 300L de solución amortiguadora TEN (Tris-HCl 0.1M. Simple non-invasive method to obtain DNA for gene analysis. o Se resuspende el sedimento en 100L de agua destilada estéril. – Universidad Central de Venezuela 2011) o Se homogeniza 2g de tejido muscular en 5mL de buffer 1 (tris-HCL 50mM. como reportan Ghossein y col. y el precipitado se resuspende en 40 L de agua destilada estéril. en presencia d NaCL 0. 101:733-7 15  Metodología aplicada a técnicas de muestreo no invasivas en mamíferos: heces Laboratorio de Genética Molecular .[Escriba el título del documento]  Metodología a usar en caso de muestras enlatadas (modificación hecha por Amarys Aguilar et al.   (*) Lench N. Williamson R. para Thunnus sp.04M. Lancet 1988.25 L de SDS al 20%. pH 8. o El sobrenadante tras la centrifugación a 13000 g x10min. Rabson AR. SDS al 1% y NaCl 0.0.

New York.[Escriba el título del documento] o Las heces se resuspenden en solución 1 : 2 de etanol absoluto y buffer CTAB (Tris-HCl 0. El sobrenadante se somete a extracción por fenol.4M.  (*) Sambrook J. La eliminación de proteínas se sigue según lo propuesto por Anderson et al (2006)* y se implementa a esto al extracción por fenol-cloroformo (Sambrook et al. (2006) por Maximiliano Nardelli y col. se las deja enfriar a temperatura ambiente y se las centrifuga 14000 RPM x10 min.65-77 (**)Sambrook J. incubándolos una noche a 55oC en 50L de buffer TNES (Tris-HCl 50mM pH 8. se resuspende en 50-100L de agua destilada estéril.1M pH8.5 cm del extremo proximal de unos 10-20 pelos. Non-invasive genetic sampling of Eurasian otter (Lutra lutra) using hairs-2006.EEUU 1989. CTAB 2%) teniendo en cuenta que el volumen de heces a resuspender debe contener el suficiente material para una extracción exitosa de DNA.  (*)Anderson HM. 16 o o o  Metodología aplicada a técnicas de muestreo no invasivas en mamíferos: pelos – modificación del protocolo de (*)Anderson et al. Mamin 17. Nonidet P-40 1%) y proteinasa K 2mg/ml. Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press.EEUU 1989.Maniatis T . McCluskie AE.Maniatis T . El pellet obtenido se resuspende en 180L de buffer ATL (Qiagen). Hystrix It. 1989).02M. o Se calienta la mescla a 94oC para desnaturalizar la enzima. Universidad Nacional de Lujan 2011 o Se toma 0. 1989)**. J. completándose la extracción con el kit de Qiagen “DNeasy Blood and Trissue Kit” siguiendo las especificaciones del fabricante. Las muestras se incuban x 2horas a 70oC. NaCl 1. NaCl 100mM. o El ADN se resuspende en 50-100L de agua destilada estéril y se puede almacenar a -20oC. Fritsch EF. New York. McCAfferty DJ.cloroformo (*Sambrook et al. pudiéndose guardar a -20oC. Fritsch EF.  Laboratorio de Genética Molecular . El DNA obtenido se seca a temperatura ambiente. Sacchers IJ. Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press. EDTA 0. EDTA 2mM.

Japan). Extraccion de ADN de tejidos embebidos en parafina por Chelex100.  Una aplicación práctica es por ejemplo para extraer DNA a partir de muestras embebidas en parafina (TEP). http://conganat.[Escriba el título del documento]  Metodología aplicada a la extracción de DNA por uñas recortadas en humano o Se obtienen las uñas (utilizando un cortaúñas ordinario) y se las sumerge en alcohol.urjc. Función y Principio del Chelex:  El Chelex ( Chelex-100 nombre comercial) es una resina preferentemente capturadora de iones metálicos polivalentes en soluciones. siguiendo las instrucciones del fabricante. detección molecular de diferente especies de bacterias y estudios virológicos. sección Patología molecular. o Se incuban las uñas (150mg aproximadamente) a 55oC x72horas en solución lisis conteniendo EDTA 2mL (0.5M.Octubre 2006. a continuación se detalla el protocolo donde se trabaja con Chelex-100 para extraer DNA de Mycobacterium tuberculosis de tejidos en TEP: o (*)…El procesamiento de extracción de ADN del corte histológico del bloque de parafina fue llevado a cabo utilizando 150uL de una solucion de Chelex-100 al 5% y calentando a 100oC por 30 minutos. Germany) y 200mL de SDS al 10% (Valley Biomedical Inc. EEUU). muy usada en el campo de la genética molecular. de 70%. o Se extrae el DNA del sobrenadante por medio de columnas conteniendo una matriz de fibra de vidrio de GFX Genomic Blood Purification Kit.cs. El efecto del Chelex es de prevenir a través de su acción quelante la ruptura del DNA a altas temperaturas catalizada por iones involucrados en las muestras de trabajo. dada la simplicidad y rapidez con la que permite trabajar las muestras. ciencias forenses. 200mL de proteína K (20mg/mL-Boehringer Mannheim. VIII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica.  (*)tomado de: Yaxsier de Armas y col. sin tomar la resina quelante para evitar inhibición de la RCP (reacción en cadena de la polimerasa). Luego se centrifugo a 13000 rpm por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo estéril de 0.5 mL limpio.0. pH8.Nacalai tesque Inc.es 17 Actividades Complementarias: Extracción de RNA 1. Explicar los principios de los reactivos usados para extracción de RNA Laboratorio de Genética Molecular .

inflamable. 18 2.es un alcohol incoloro.es una solución química usada en la extracción de RNA.. urea  DEPC..  Cloroformo.este compuesto es ampliamente usado en genética molecular por ser un excelente agente caotrópico. El Trizol o Tri-reagent es el nombre comercial que se le da a una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina que se le adiciona a la muestra durante la homogenización mecánica (lisis celular) para una lisis rápida. no es necesario que el isopropanol este frio.[Escriba el título del documento]  Trizol. el DNA se queda en una interfase  Alcohol isopropilico. solubilización de los componentes celulares... se tiene que autoclavar la misma (120oC x30min) para eliminar cualquier traza el DEPC ya que produce modificaciones químicas a los residuos de purinas (A+G) en el RNA por carboxymetilacion. Función del DEPC. Es típicamente usado para tratar agua y soluciones donde es necesario trabajar con RNA no degradado.  Tiocinato de guanidina. de olor intenso y miscible en agua. inactivación de las RNAasas. Tiocinato de guanidina. desestabilizante de proteínas en general. sin embargo a diferencia del etanol.el dietil pirocarbonato (DEPC). hidroxy y tiol de las proteínas con actividad enzimática como las RNAasas. Este alcohol secundario es usado ampliamente en técnicas de extracción de ácidos nucleicos ya que ayuda a precipitar estos ya que no son solubles frente a alcoholes.. Laboratorio de Genética Molecular . El DEPC reacciona con los grupos amino. Cuando se va a trabajar con agua con DEPC. es un eficiente inhibidor no especifico de las RNAasas.la adición de cloroformo al proceso de extracción es para poder limpiar la muestra de cualquier resto lipídico aun presente y a la vez generar las fases diferenciadores: fase acuosa con el RNA y una fase orgánica (donde se encuentran las proteínas desnaturalizadas). Su uso durante los protocolos de extracción de ácidos nucleicos incluye una función de lisador celular así como de prevenir la digestión por RNAasas y DNAasas mediante la denaturación de las mismas. separar el RNA ribosomal de los ribosomas y a la vez mantener la integridad del RNA durante el proceso.

y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol absoluto frio o isopropanol. Recuperar el sobrenadante en otro tubo eppendorf y agregar 500L de isopropanol y mezclar suavemente por inversión. o Las muestras deben estar almacenadas a 4oC.. 100L de Cloroformo: alcohol isoamílico (49: 1). o Centrifugar a 13000 rpm x15min a 4oC. 330L de Fenol acido. mezclar en vortex y dejar 10min a -20oC. para las extracciones de ácidos nucleicos. El tubo que contiene RNA. mezclando por inversión. junto a cloruro de litio dando lugar a la inactivación de las RNAasas y permitiendo la desnaturalización con proteinasa K.  Agregar 200L de agua destilada estéril y dejar a temperatura ambiente hasta que se disuelva el DNA. Investigar otros protocolos y aplicaciones  Metodología aplicada a la extracción de RNA y DNA simultáneamente a partir de medula ósea en humanos por el kit UMSagen  Protocolo.  Laboratorio de Genética Molecular . Extraccion de RNA  Dejar a -20oC x60min. 19 3. Después de esto se les suele eliminar en una sola extracción. Almacenar a 4oC. desechar el sobrenadante y secar el sedimento a temperatura ambiente.[Escriba el título del documento]  Urea.  Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4oC y decantar el sobrenadante.  Agregar 500L de etanol frio 70%. o Descongelar la muestra y agitar en vortex y agregar 30L de acetato de sodio.  Extraccion de DNA  Sacar el DNA precipitado con la punta de la micropipeta en un tubo eppendorf que contenga 500L de etanol frio 70%.  Centrifugar a 13000 RPMx5min.usualmente se le suele acompañar. usado para extraer RNA y DNA aprovechando las diferentes características de solubilidad en fase orgánica y acuosa.

Secar totalmente el sedimento a temperatura ambiente y resuspender el sedimento con 30L de agua DEPC. mezclar por inversión y dejar a -20oC por una noche. luego centrifugar a máxima velocidad por 5min a temperatura ambiente.alcohol isoamílico (24: 1). citrato de sodio 25mM pH 7. 1mM EDTA. Reposar la muestra x7min a temperatura ambiente. Sarcosyl 0. Moler 200 mg del tejido. Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4oC y decantar el sobrenadante. 100L de etanol absoluto frio. Centrifugar al máximo x10min. 20   Metodología de extracción de RNA aplicada a plantas – Capsicum annuum L. Añadir 3.[Escriba el título del documento]  Centrifugar a 13000 RPM x5min a 4oC. Disolver el pellet en 200L de TESAR (10mM Tris-HCl ph7. Añadir 200L de aq/CTAB y 200L de bu/CTAB. o o El tejido vegetal elegido debe haber estado previamente fijado en nitrógeno líquido a -70oC Colocar 500L del buffer de extracción (tiocinato de guanidina 4M. Añadir 200L de cloroformo. Agitar 2 min en el vortex. Preservar a -20oC. Centrifugar al máximo por 15min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Resuspender el sedimento con 50L de agua DEPC fría. Descartar el sobrenadante. Re-extraer la capa inferior con 200L de bu/CTAB. Dejar secar el pellet x10min a temperatura ambiente.5%solución preparada con agua trata con DEPC y pH ajustado a 8) y 500L de fenol saturado con TE en un tubo microcentrífuga. llevarlo al vortex x1min y dejar reposar por 12min a temperatura ambiente. y transferirlos al tubo preparado anteriormente. 5L de acetato de sodio. Centrifugar al máximo por 5min a 4oC. 1% Sarcosyl todo preparado con agua tratada con DEPC). Lavar el pellet con 1mL de etanol 75%. o o o o o o o o o Laboratorio de Genética Molecular . remover la fase superior que contiene bu/CTAB y reservar en un tubo nuevo. Agitar en vortex la muestra e incubar a temperatura ambiente x5min. Descartar el sobrenadante. Se observaran fases.6.5L de 2-mercaptoetanol y 50L de acetato de sodio 3M. Adicionar 500L de isopropanol y mezclar por inversión.

Secar el pellet a temperatura ambiente y resuspenderlo con agua tratada con DEPC. Reservar la fase acuosa. Centrifugar a velocidad máxima a 4oC x5min. 21  Metodología usada para extracción de RNA en la hipófisis de huesos o o o o Tomar muestras de aproximadamente 250mg y homogenizar con 3mL de solución a pH7 (isotiocinato de guanidina 4M. Transferir la capa superior conteniendo butanol a un tubo nuevo. Añadir 150L de 0.1M. Sarcosil 0. Observar fases.1M (600L) y extraer (3x 600L) con cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1).5 vol) Lavar el RNA separado con etanol 79% (2x 100L) y disolver en agua el pellet en agua tratada con DEPC (160L). El RNA ahora esta con la sal de CTAB y es soluble en butanol. transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. o o o Laboratorio de Genética Molecular .5mL.2M NaCl para combinar las fases.1M) por 2min.2M de NaCl. Colectar la capa inferior y combinar con la fase acuosa reservada anteriormente.5%-mercaptoetanol 0.5 volúmenes de etanol a la fase acuosa para precipitar el RNA. Añadir 1/10 volúmenes de acetato de sodio y 2. Agitar en vortex x30 segundos y centrifugar x5min. Precipitar el RNA con acetato de sodio 3M(57L) y etanol absoluto frio (1. Añadir 300L de cloroformo para combinar las fases.7M en EDTA 0. Incubar la muestra a -20oC por al menos 1 hora. Re-extraer la capa de butanol con 150L y 0.[Escriba el título del documento] o o o o o o o o o Remover la capa superior y combinarla con el bu/CTAB reservado. Agitar en vortex por 30 segundos.5% y mercaptoetanol 0. Calentar el sobrenadante a 65oC por 2 min. citrato de sodio 5mM. observar fases. Centrifugar a máxima velocidad a 4oC x5min. Adicionar CsCl solido hasta alcanzar una concentración de 0. Ahora el RNA es una sal de sodio y esta soluble en la fase acuosa (fase inferior).1mg/mL Transferir a un tubo de ultracentrífuga junto a 3mL de solución a pH7 compuesta por CsCl 5. Centrifugar a 60000 g x 12h a 22oC. retirar el sobrenadante y el precipitado lavarlo con etanol 70% (3x300L) Redisolver en un buffer EDTA 5mM-Sarcosil 0. 2. Centrifugar a 12000 g x10min a 12oC.

[Escriba el título del documento] 22 Laboratorio de Genética Molecular .