第一章 流式细胞仪的结构和原理

第1节 流式细胞术发展史

纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同
科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，
每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医
学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是
由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床
医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋
势可归纳为：① 流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高
分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；② 对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单
色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测 15 种荧光信号；③ 从检测参数的相
对定量发展为绝对定量；④ 从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤
所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细
胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地
将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。

流式细胞术的发展简史：
1930 年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数；
1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一
根毛细管的细胞数量；
1936 年 Caspersson 等引入显微光度术；
1940 年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；
1947 年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；
1949 年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；
1950 年 Caspersson 用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：
1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；
1953 年 Parker 和 Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；
1954 年 Beirne 和 Hutcheon 发明光电粒子计数器；
1959 年 B 型 Coulter 计数器问世；
1965 年 Kamemtsky 等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对
细胞分类；
1967 年 Kamemtsky 和 Melamed 在 Moldaven 的方法基础上提出细胞分选的方法；
1969 年 Van Dilla，Fulwyler 及其同事们在 Los Alamos，NM(即现在的 National Flow
Cytometry Resource Labs),发明第一台荧光检测细胞计；
1972 年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的
细胞的较弱的荧光信号；
1975 年 Kochler 和 Milstein 提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂
的应用奠定了基础。
从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞
速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、
细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入 21 世纪，流式细胞术作为一门生

1
物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。

第2节 流式细胞仪结构和工作原理

流式细胞仪（Flow cytometry ,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、

电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，
流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分
析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各
项相关技术的迅速发展，FCM 技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。
流式细胞仪分为三大类：
一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简
便，易学易掌握，见图 1-2-1。

图 1-2-1 临床型台式流式细胞仪
（左：BD FACSCalibur—2L，4F； 右：Coulter EPICS XL/XL-MCL—1L，4F
中：Partec，cyFlow—1L,3F）

第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并
可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和
类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图 1-2-2、1-2-3。

2
 图 1-2-2 大型科研型流式细胞仪
（左：BD，FACSDiVa—14F，four-sorting； 右：Coulter EPICS ALTRA—4L,8F；
中：Partec，CyFlow SPACE―2L，6F）

第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用 2-4 根激光管，最多检

测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到 15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，
速度达到 50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。

图 1-2-3 目前最新型流式细胞仪

（左上：partec，CyFlow ML―FSC,2xSSC,FL1~FL13；右上：Coulter，CytomicsTM FC 500

左下：FACSAria，FSC，SSC，FL1-FL13； 右下：BD，BD LSR，4L，10F）

3
（一） 流式细胞仪的结构
FCM 的结构一般分为 5 部分：①流动室及液流驱动系统；② 激光光源及光束成形系统；
③ 光学系统；④ 信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤ 细胞分选系统。见图 1-2-4。

图 1-2-4 流式细胞仪的光路结构
1、流动室与液流驱动系统
流动室（Flow Chamber 或 Flow Cell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流
动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为 430×180µm 的长方形孔，供细胞
单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时
间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精
度。
流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员
无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离
液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光
信息，见图 1-2-5。

图 1-2-5 FCM 的流动室和液流系统

细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从 Bernoulli 方程，

即 P=(1/2)PV（勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而
可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。
从图 1-2-5 可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定
的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流
速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样

4
本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流
经光照射区的细胞数就增加。
这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图 1-2-5）
，
中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（Hi）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒，
受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当
在测量分辨率要求高时（如 DNA 分析）应选取用低速（Low）。

2、激光光源与光束成形系统
目前台式机 FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（light amplification by stimulated
emission of radiation , Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，
是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的
时间仅为 1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间
和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。
激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为 22×66μm 即短
轴稍大于细胞直径的光斑（见图 1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证
样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，
台式机 FCM 的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作
任何调节，所以使用者操作十分方便。
3、光学系统
FCM 的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信
号送入到不同的电子探测器（见图 1-2-6）。
在 FCM 的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成 3 类：长通滤片
（long-pass filter, LP）、短通滤片（short-pass filtr, SP）及带通滤片（band-pass filter, BP）。
（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如 LP500
滤片，将允许 500μm 以上的光通过，而 500μm 以下的光吸收或返回。
（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或
返回。如 SP500 滤片，将允许 500μm 以下的光通过，而 500μm 以上的光吸收或返回。
（3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，
一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如 BP500 表示其允许通过
波长范围为 475μm-525μm。

图 1-2-6 流式细胞仪的光学系统

5
4、信号检测与分析系统
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、
不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360 度立体角发射，产生散射光和荧
光信号。
（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（side
scatter,SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理
参数或称固有参数（见图 1-2-7）。
① 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相
关，通常在 FCM 应用中，选取 FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，
以避免对被测细胞的干扰。
② 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交 90o 方向的散射光信号，侧向散射光对
细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数
组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞
群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

激光 前向角散射

侧向角散射

图 1-2-7 流式细胞仪的散射光图

（2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在
激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，
受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞
参数的存在与定量(图 1-2-8)。

激光
Freq

Fl
图 1-2-8 激光的作用原理

6
 荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也
各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机 FCM
常配置的激光器波长为 488nm，通常可采用的染料有碘化丙锭 (propidium iodide，PI)、藻红
蛋白 (phycoerythrin，PE)、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、PE-CY5 等。
① 荧光信号的线性测量与对数测量
荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正
交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管
（PMT），PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用 PMT，而采用线性放大光电转换
器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降
低，最高速度不可能超过 3 300 个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此
高档仪器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。
线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞 DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含
量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，
如果原来输出是 1，当输入增大到原来的十倍时，输出为 2；当输入增大到原来的 100 倍时，
输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如
用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。
② 荧光信号的面积和宽度
所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对 DNA 含量测量时，采
用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA 的含量，
当形状差异较大，而 DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧
光信号积分后，所得到的信号值就相等。
荧光信号的宽度（如 FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于 DNA 样本极易聚集，当两
个 G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的 DNA 荧光信号（FL2-A）与 G2M 期细胞相等，这
样得到的测量数据 G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将
双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个 G2M 细
胞大，因此设”门”后才能得到真正的 DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的
高度峰和面积峰也可做同样分析。
③ 光谱重叠的校正
当细胞携带两种荧光素（如 PE 和 FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，
理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于
目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射
谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品
或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种
荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其
它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第 1 激光（488nm）激发出
的 FL1、FL2、FL3 和第 2 激光（635nm）激发出的 FL4 间的补偿。当然，FL1、FL2 和 FL3
是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。

5、FCM 测量数据的存贮、显示和分析
目前 FCM 数据的存贮的方式均采用列表排队（list mode）方式。因为目前 FCM 所采用
的都是多参数指标，荧光参数标记物如是 4 个，采用 list mode 方式可大量地节约内存和磁
盘容量。当一个细胞被测 4 个参数，那么获取 10000 个细胞，所占容量为 4×10000 个（字
或双字）。同时当只检测 1 个参数时（如 DNA），可灵活的关闭其它 3 个参数，节省 3/4 的
空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直

7
方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
（1）单参数直方图：
细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram）
来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标
可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图 1-2-9。

图 1-2-9 DNA 含量直方图和抗原表达直方图

左图较低道数处细胞峰为 G1 期细胞，道数为 G1 期细胞两倍的是 G2M 期细胞，二者之

间是 S 期细胞。右图 100-101（M1）为阴性细胞，而 101 以上（M2）为阳性细胞。
（2）双参数数据的显示
双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方
法有二维点图（dot plot）,等高线图（contour plot）,二维密度图（density plot）。在二维图中，
X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而 Y 坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中
可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为 FSC 和 SSC 组成
的点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可
以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设‘门’分析（gating analysis）得到的
FL1 和 FL2 散点图，设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设”门”
可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图 1-2-10(左)
就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体，
再调出免疫荧光的散点图图 1-2-10（右）。

散射光图 双色标记荧光图
图 1-2-10 双参数免疫荧光点阵图

（二）流式细胞仪的主要技术指标

8
 1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以
能检测到单个微球上最少标有 FITC 或 PE 荧光分子数目来表示，一般现在 FCM 均可达到
600 个荧光分子。
2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数 CV（coeffeient
of variation）值来表示：
CV=d/m×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值)
如果一群含量完全相等样本，用 FCM 来测量，理想的情况下，CV=0，用 FCM 测量曲
线表示为图 1-2-11（左） ，但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的
误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线
为图 1-2-11（右）。

图 1-2-11 仪器分辨率的显示—CV 值

CV 值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的 FCM 在最佳状态时 CV

值<2%。CD 值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在
峰高一半的地方量得的峰宽，m 代表峰顶部的荧光道数；它们与 CV 值的的关系式如下：
CV=半高峰宽/m×0.4236×100%
上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，
故采用半高峰宽所计算得到的 CV 值要明显小于前公式得到的 CV 值，这在实际工作中应引
起注意。
3、前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，
一般目前商品化的 FCM 可以测量到 0.2-0.5μm 左右。
4、FCM 分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超
过 FCM 仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间
（dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达 3 000 个/s-6 000 个/s，
大型机已达每秒几万个细胞。
5、FCM 分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度
指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为 300 个/s，大型机
的 FCM 最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比，
一般台式机和大型机的分选纯度均可达到 99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液
中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；
反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。
因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或
舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图 1-2-12 为两种细胞分选原理示
意图。

9
 图 1-2-12 细胞分选示意图

（左：通道式分选； 右：电荷式分选）

(三) 流式细胞仪补偿设置

众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将 488nm
或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算
机统计处理变为可读数据。

现在流式细胞上常用的荧光素有：
激发波长 发射波长
FITC 488nm 525nm
PE 488nm 575nm
PE-TR 488nm 615nm
PE-Cy5.5 488nm 667nm
PE-Cy7 488nm 767nm
（以上五种荧光染料可在 Coulter XL 或 BD Calibur 或 Partec,PAS,Cyflow，Cytomation,Moflo
机型上使用）
APC 633nm 660nm
APC-Cy 633nm 767nm
(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如 Coulter,Altra 或 BD Calibur 或 Partec
Cyflow ML 或 Cytomation, Moflow)
以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是
正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为 FTIC，PE 的发射波长，可以看到两者的发
射波长均为偏态分布，FITC 受激后多数将光源转变为 525nm 左右的光；PE 多数将其转变
为 575nm 左右的光。故在流式细胞仪中对 FITC 检测 525nm 附近的光，对 PE 则检测 575nm

10
左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。

图 1-2-13 受激光照射后 FITC 和 PE 分子发射光谱互相干扰图

根据上图中 FITC 和 PE 发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE 荧光探

测器便会误检由 FITC 发射的 575 左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入 PE 荧光
信号中，从而引起错误。同样 PE 受激后也会发出小部分 525nm 左右的光，进入 FITC 荧光
探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。
现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的 FITC、PE 等荧光分子性状十分相近，其发射
光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探
测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以
百分比后的数值。如图：

图 1-2-14 FITC 无 PE 荧光检测补偿调节示意图

图 1-2-15 PE 无 FITC 荧光检测补偿调节示意图

11
 其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做 FITC、PE、PE-Cy5 三色荧光分析原则上需要
调节的补偿有：FITC-%PE，PE-%FITC，PE-Cy5-%FITC，PE-Cy5-%PE，FITC-% PE-Cy5，
PE-% PE-Cy5 六组补偿，即有 23 种组合。
由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以 525nm 或其他波长的光信号
可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百
分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达
到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号 x N%=0。由此补偿的百分比数值
将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。
要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。
如现进行 FITC、PE 双色分析，先准备该试剂的阴性对照管：
A：IgGFITC/IgGPE，通过调节电压，使阴性群体落在 FTIC 及 PE 双阴性区。（注：在
进行调补偿时，必须将原补偿全部归零）

图 1-2-16 PE 和 FITC 分子的阴性对照

阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实
际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之
间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧
光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号），和
特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其
归入统计范围。
B： FITC 标记抗体/IgG-PE

12
 图 1-2-17 未调补偿的双参数直方图

上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只
含有 PE 标记的 IgG 阴性对照（如同 A 管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况
并不如此，在 PE 坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于 FITC 荧光漏入 PE 探测器中而
引起的。此时就要取一合适百分比与 FITC 信号相乘后去抵消 PE 中的信号。 （此时电压已通
过阴性对照设定，绝对不可变动！）
通过调节补偿参数如下图：

图 1-2-18 A 管 FITC 荧光信号补偿的调节

打个比方，通过 A 管已将 FITC、PE 的荧光信号设为零；此时检测 FITC 标记抗体与 PE

阴性对照，FITC 信号假设为 1000，漏入 PE 的信号为 200。在补偿调节 1 号位时，补偿数
字为 5%，通过计算得出 PE 信号：200-1000x5%=150；此时 1 号位的补偿不足。同理 2 号位
的补为 15%，此时 PE 信号为：200-1000x15%=50；补偿仍显不足。3 号位的补偿为 20%，
PE 信 号 为 ： 200-1000x20%=0 ， 补 偿 调 节 良 好 。 4 号 位 补 偿 为 30% ， PE 信 号 为 ：
200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头，PE 的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或
过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。
当将 FITC 漏入 PE 的信号恰好全部减除时，即 PE 信号与原来本底相同时，此时的补偿
便是正确的；即 FITC 单阳性细胞的 PE 的平均荧光强度与双阴性细胞 PE 荧光强度一致。

图 1-2-19 FITC/PE 双阴和 FITC 单阳荧光示意图

对于 FITC 阳性细胞，通过调节补偿需将 PE 中的信号恢复至与其本底一至。由上图可

知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过 A 管调节电压确定阴性范围。其
次，在检测 FITC 标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将 PE

13
的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。
同理，如检测 C 管：FITC 阴性对照/PE 标记抗体，可将 PE 漏入 FITC 中荧光去除。但
前提条件是在 C 管中要存在 FITC/PE 双阴性细胞和 PE 单阳性细胞。

图 1-2-20 FITC/PE 双阴和 PE 单阳荧光示意图

在流式细胞上，当 PE 单阳性细胞的 FITC 平均荧光强度与双阴性细胞的 FITC 平均荧光

强度一致时，补偿便调节完毕。
在做多色分析时，必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照，
调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调
节特异性荧光对每个荧光的补偿。
在日常工作中，我们可以用 CD4/CD8，或 CD3/CD4/CD8 多色抗体来调节荧光补偿。现
将其原理及方法解释如下。
在人外周血中，存在有 T、B、NK 等白细胞。当加入 CD3-PE-Cy5/CD4-FITC/CD8-PE
三色荧光抗体时，会出现以下几种情况：
CD3-/CD4-/CD8-细胞群：如 B 细胞
CD3+/CD4-/CD8-细胞群：如 NK 细胞
CD3+/CD4+/CD8-细胞群：如辅助型 T 细胞
CD3+/CD4-/CD8+细胞群：如杀伤型 T 细胞
由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调
节补偿的基本要求。已知不存在 CD3-/CD4+和 CD3-/CD8+阳性细胞，又已知 PE-Cy5 对于
PE 和 FITC 的干扰很小，所以不用考虑 CD3-PE-Cy5 荧光对 CD4-FITC、CD8-PE 荧光的干
扰（不会有假阳性存在） 。补偿调节如下：

图 1-2-21 CD3-PE-CY5、CD4-FITC 和 CD8-PE 荧光相互干扰的补偿

14
 在许多实验中，会用到某一标记物进行设”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双
参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清
楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设”门”的实验
方案。

15
 第二章 流式细胞术样品制备及分析技术

第1节 样本单细胞悬液的制备方法

一、新鲜实体组织样本的制备

FCM 对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特
点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已
形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细
胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，
在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样
本制备仪（见图 2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的
方法有如下 3 种。

图 2-1-1 流式细胞术自动细胞分离器（BD，Medmachine）

（一） 酶消化法

1、作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有 3 方面：① 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维
等；② 可以水解组织间的粘多糖等物质；③ 可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质
物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋
白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽
的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞
间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2、注意事项：
① 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；② 要注意酶的使
用浓度和消化时间；③ 要注意酶活性的 pH 值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋
白酶在中性溶剂中活性不佳等；④ 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3、方法学程序
（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；

16
 （2）将选好的酶溶液 1-2ml 加入盛有被消化组织的试管中；
（3）一般消化 20-30 min（恒温 37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（4）终止消化，收集细胞悬液，以 300 目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去
细胞碎片；
（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。

（二） 机械法
机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成
组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用 300 目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获
得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1、剪碎法：
（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；
（3）加入 10ml 生理盐水；
（4）用吸管吸取组织匀浆，先以 100 目尼龙网过滤到试管中；
（5）离心沉淀 1000 rpm,3-5min，再用生理盐水洗 3 遍，每次以低速（500-800 rpm）短时
离心沉淀去除细胞碎片；
（6）以 300 目尼龙网滤去细胞团块；
（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。
2、网搓法
（1）将 100 目，300 目尼龙网扎在小烧杯上；
（2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直
到将组织搓完；
（3）收集细胞悬液，500-800 rpm 离心沉淀 2min；
（4）固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
（1）先将组织剪成 1-2 mm3 大小组织块；
（2）放入组织研磨器中加入 1-2 ml 生理盐水；
（3）转动研棒，研至匀浆；
（4）加入 10ml 生理盐水，冲洗研磨器；
（5）收集细胞悬液，并经 300 目尼龙网过滤，离心沉淀 500-800 rpm，1-2 min，再以生
理盐水洗 3 遍，离心沉淀；
（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。

（三） 化学处理法
1、作用原理
化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
2、试剂的配制
（1） 0.2%EDTA 配制：称 EDTA 0.2g，加入 Hankˊs 液 100ml，封装高压消毒。置 0℃-4
℃保存；
（2） 胰酶加 EDTA 配制：胰酶 0.25g 加 PBS（pH7.0）200ml，浓度 0.125%，EDTA 0.2g
加 PBS（pH7.0）100ml，浓度 0.2%。各取 40ml 混合，分装置冰箱保存，用时过滤即
可使用。
3、实验方法

17
（1）将组织切成薄片，置入试管中；
（2）首先加入 EDTA 液 5ml，室温下 0.5h，离心弃之；
（3）再加入胰酶-EDTA 液 5ml。在 37℃恒温水浴振荡器内 30min；
（4）用 300 目尼龙网过滤，离心沉淀 1000 rpm，5min。再以生理盐水洗 2-3 次；
（5）细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试
剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试
剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；
酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据
实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的 FCM 检测结果。

（四）注意事项
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织
坏死以及细胞自溶，影响 FCM 测定结果；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成 FCM 检测结果的
不稳定；
3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方
面对酶消化法的影响。
4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞
瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；
往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺
癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在 Ca2+、Mg2+存在或在血清状态下
不发生活性降低的特性。

二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备

正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于
材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。
1、取材后立即放入盛少许 PBS 液青霉素小瓶中；
2、另取一只小烧杯，杯口用 300 目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用 PBS 液湿润；取新
鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取 3 块以上；
3、在操作前，先将剪刀用 PBS 液浸润一下，然后开始剪碎组织；
4、先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的 PBS 液，冲洗细
胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该 PBS
液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；
5、细胞加固定液或低温保存，备用。

三、石蜡包埋组织样本的制备
石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访
资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡
包埋组织制备单细胞方法介绍如下。

1、实验方法：

18
（1）把石蜡包埋组织切成 40-50um 厚的组织片 3-5 片，或用乳钵研成 0.5mm 直径大小颗粒
状，放入 10ml 的试管中；
（2）加入二甲苯 5-8ml, 在室温下脱蜡 1-2 天，视石蜡脱净与否，更换 1-2 次二甲苯，石
蜡脱净后，弃去二甲苯；
（3）水化：依次加入 100%、95%、70%、50%梯度乙醇 5ml，每步为 10 min，去乙醇，加
入蒸馏水 3-5 ml，10 min 后弃之；
（4）消化：加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置 37℃恒温水浴中消化 30 min，
在消化期间，每隔 10min 用振荡器振荡 1 次；
（5）消化 30 min 后，立即加生理盐水终止消化；
（6）经 300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第 2 次消化；
（7） 收集细胞悬液，离心沉淀 1500 rpm ,再以生理盐水漂洗 1-2 次，离心沉淀 500-800 rpm
去碎片；
（8）保存细胞备用。

2、注意事项
（1） 一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第 1 遍应在 12 小时左右，第 2 遍为 30min 左
右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮
起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净；
（2） 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；
（3） 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
（4） 消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用
尖吸管吹打成悬液状；
（5） 消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在 300 目尼
龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用 PBS 液冲洗一下；如此反复，就能得到较多
的单细胞悬液。

四、外周血单个核细胞样本的制备

血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是
流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细
胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多
见。
1、外周血细胞样本制备方法的选择
一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋
巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细
胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细
胞表面标志检测可采用溶红细胞法。
2、单个核细胞样品制备程序
（1） 取外周血 2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成 4 ml ,混匀；
（2） 将稀释后血液沿试管壁徐徐加入 4ml 淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免
造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；
（3） 离心 2000rpm,30min,室温 18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为 4 层，上
层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为
红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；

19
（4） 用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另 1 试管中，用生理盐水洗 2 遍，
每次均以 1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；
（5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。

五、骨髓细胞单细胞悬液的制备

1、制备方法
（1） 无菌抽取骨髓液 0.5 ml；
（2） 将骨髓标本滴入 1000u/ml 肝素抗凝的 1 ml PBS 液中；
（3） 再加入 PBS 液稀释至 10ml；
（4） 用吸管吸取 5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有 4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；
（5） 在以上条件下，骨髓有核细胞分层在 PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；
（6） 吸取有核细胞层，加入到 10 ml PBS 液中，混匀；
（7） 以 1000 rpm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。

2、注意事项
（1） 抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；
（2） 在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在 300 ul 左右，这样有利于洗去多
余的分层液；
（3） 溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，
立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。

六、培养细胞的单细胞悬液的制备

1、培养细胞的特征
一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细
胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响 FCM 结果，
进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。
2、培养细胞样品的制备程序：
（1）将培养细胞用 0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或 0.29%胰酶消化 3-7min， （根
据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加
PBS 液；
（2） 用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；
（3） 短时低速离心，即 800-1000 rpm，5 min；
（4） 弃上清，加 pH 7.4 的 PBS 液 5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复
2- 3 次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；
（5） 加少许 PBS 液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。

七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备

在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为
较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷
检细胞等。

20
1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备
(1) 将食管拉网器上的细胞洗脱到 20 ml PBS 液中，以 1500 rpm 离心后，再用 PBS 液洗
2 次，离心 500-800 rpm, 1-2 min，弃上清；
(2) 再加入 PBS 液 5 ml ，以 300 目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
(3) 加少许 PBS 液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。
2、尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备
（1） 用一清洁器皿收集 24 小时尿液，置 4℃ 冰箱中自然沉淀 2 小时，轻轻倒去上清液，
留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至 10-20 ml 离心管中；
（2） 500 rpm 离心 10min ，去上清；
（3） 加 PBS 液 8-10 ml，以 1000 rpm 离心 10 min ，去上清；重复再洗 1 次；
（4） 再加 5 ml PBS 液混匀，用 300 目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（5） 再加少许 PBS 液，混匀。加固定液或低温保存，备用。
3、胸、腹水脱落细胞的制备
（1） 抽取胸、腹水 50-100 ml ，加入 1000 IU/ml 肝素液 1 ml ，放盐水瓶中置于 4℃冰箱
中静置 6-12 h，弃去上清；
（2） 将底部 10-20ml 用长吸管移入试管中，用 PBS 液洗 3 次，以 1500 rpm 离心沉淀 5
min ；
（3） 再加 5 ml PBS 液混匀，用 300 目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4） 加少许 PBS 液，混匀；加固定液或低温保存，备用。
4、冲洗液细胞样品的制备
（1）用 300-500 ml 生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱
内置 6-12 h；
（2） 取沉淀液 20-40 ml ,离心沉淀并以生理盐水洗 2 次, 吸上清；
（3） 加 10 mlPBS 液，混匀；以 300 目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4） 过滤后 1000 rpm,10 min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。

第2 节 样品的荧光标记和检测分析

一、荧光标记原理
定量细胞荧光染色，要求细胞成分染色的均匀性，保证染色做到染料分子数与被染的某
种参量成一定的量效关系。在流式定量分析中，掌握好荧光染色液的浓度非常重要。为了更
好地说明这个问题，可以用下式表示：
F=Q(I-eεCL)
式中 F 表示荧光强度， Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，ε表示消光系数，C 表示染
色浓度，L 表示浓度厚度。当激发光增强时，荧光强度相应按比例增加；当荧光强度达到
1.0 时，继续增强光密度，荧光不仅不会增加，还会造成结合到细胞上的荧光素发生猝灭现
象。一个荧光分子发射的荧光，有可能被邻近的分子吸收淬灭。由于这种淬灭现象，如果再
增加荧光染料浓度也不会使荧光强度增大。

1、荧光染料与细胞参量结合的方式
（1）共价键结合：DNA 链的连结之间被打开，形成与荧光染料分子共价键结合，这种结合
方式不十分稳固，冲洗过多易造成荧光分子丢失。例如异硫氢酸盐荧光素(fluorescein
isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）等这些荧光染料。

21
（2）嵌入性结合：荧光染料分子直接嵌入到核酸分子的碱基对之间。这种方式结合紧密、
稳固，不易造成荧光分子的丢失。如碘化丙啶（Propidium iodide, PI）、溴化乙啶（Ethidium
bromide, EB）等。
（3）结构亲合结合：以静电力结合，带正电核的荧光分子与带有负电核的核酸结构中的磷
酸基相互吸引而结合。这种方式结合极弱，易造成荧光分子丢失。例如吖啶橙与核酸单链结
合时，派若宁 Y 与单链核酸结合均系静电力结合方式。

2、荧光素发射荧光的基本原理
当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，各种荧光素也
是必不可少的。它包括：单标记抗体荧光素、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素，……
等。荧光素发射荧光基本原理是：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子
核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，
然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。
不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发,所以要选择正确的激光器。例如，ascade blu
需用紫外线激光器，FITC 和 PE 等的激发波长均为 488nm，所以可用产生可见光的氩离子
激光器，而 APC 和 PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射 630nm 波长红光的氦-氖激
光器。
另外，各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质。
如 FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即 PMT1）；PE 则发射
橙色光，需用第二光电倍增管（即 PMT2）；PC5 和 PerCP 等，发射的是深红色光，这时需
选择第三甚至第四光电倍增管（即 PMT3 或 PMT4）,等等。

3、常用荧光素的基本生物学特性：
主要荧光素包括：PI、EB、FITC、PE、PC5、PerCP、Cy5、Cy7、APC 等。单色或双
色分析时，最常用的荧光素是 FITC 和 PE。
(1) PI 和 EB：都具有嵌入到双链 DNA 和 RNA 的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。
为了获得特异的 DNA 分布，染色前必须用 RNA 酶处理细胞，排除双链 RNA 的干扰。PI
和 EB 不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死活细胞。PI 和 EB 各种理化性质相似，
但 PI 比 EB 的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在作 DNA 和蛋白质双参数测量时，PI
的红色荧光和 FITC 的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI 比 EB 测得的 DNA 分布的变
异系数（CV 值）低，所以 PI 得到更广泛的应用。
（2） FITC ：为一种小分子荧光素，其效率，即荧光强度，取决于溶液的 pH 值，因此在
使用 FITC 时，应注意溶液的酸碱度。
（3） PE：其分子量较大，为 240KD，故可能会对其它大探针产生空间位阻。但 PE 的化
学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。这里需要注意的是 PE 作为天
然染料，因来源程序不同，可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。因此
用不同公司生产的 PE 可能会得到不同的结果。
（4） 其他荧光素 单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发
射光波长应该有所不同。除 FITC（发射绿光），PE（发射橙光）外还应选择发射红光或深
红光的藻红蛋白-花青素（phycoerythin and Texes Red tandem，PC5）、叶绿素蛋白（Peridinin
Chorophyll protein，PerCP）或藻红蛋白-德克萨斯红（Phycoerythin and Texes Red tandem，
ECD）。因为这些荧光素在受到 488nm 的蓝光激发后，均发射出红色光或深红色的发射光。
① PC5 和 ECD 是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成，组成一个荧
光分子。PC5 由 PE 和 Cyanin 5 组成，ECD 由 PE 和 Texes Red 组成。它们前一个分子的发

22
射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合，这样当前一个分子受激光激发后，产生的发射
光可直接激发后一个分子，最后由后一个分子的发射光体现出整个组合的荧光特性。因此，
从组成上说是两个分子，但表现为一个分子的物理性质。② PerCp 是一种生活于深海区域
的鞭毛虫中发现的色素，其功能为将可渗透入深海的蓝光传递至鞭毛虫的叶绿素发色集团，
进而发出红光。需注意的是 PerCP 为一单个分子。③ 别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）
和花青素 5（cyanin，Cy5）这两种荧光素的激发光波长要求在 630nm 左右，需第二激光束
来激发。各种荧光标记的抗体与细胞结合的的原理模式见图 2-2-1,常用染料的激发光及发射
光波长见表 2-2-1：

APC

图 2-2-1 荧光标记抗体与细胞结合原理模式图

23
 表 2-2-1 常用荧光染料的激发光和发射光波长分布

荧光染料 激发光. 发射光. 应 用

Indo-1 (unbound) 335 490 Calcium Flux
Indo-1 (Bound to Calcium) 335 405 Calcium Flux
Hoechst 33342 350 470 DNA analysis
DAPI 359 462 DNA analysis
Alexa350 350 442 Phenotyping
PerCP 470 670 Phenotyping
R-Phycoerythrin 480 578 Phenotyping
Green Fluorescent Protein (GFP) 488 510 Reporter molecule
YO-PRO-1 488 510 Apoptosis analysis
FITC 488 525 Phenotyping
Fluorescein diacetate 488 530 Cell viability
Alexa488 488 530 Phenotyping
Sytox Green 488 530 DNA analysis
SNARF-1 488 530-640 pH measurement
Fluo-3 488 530 Calcium flux
dsRED 488 588 Reporter molecule
PE-Cy5 (TriColor, Cychrome) 488 670 Phenotyping
PE-Cy7 488 770 Phenotyping
ECD 488 620 Phenotyping
Propidium Iodide 495 637 DNA analysis
Rhodamine 123 515 525 Membrane potential
Yellow Fluorescent Protein (YFP) 519 534 Reporter molecule
LDS-751 543 712 Nucleated cell detection
7-Aminoactinomycin D 546 655 DNA analysis
Alexa 546 546 573 Phenotyping
Cy3 550 565 Phenotyping
CMXRos (Mitotracker Red) 560 610 Mitochondrial membrane potential
Texas Red 596 615 Phenotyping
TO-PRO-3 643 661 DNA analysis
Alexa 647 647 667 Phenotyping
APC-Cy7 647 774 Phenotyping
Allophycocyanin (APC) 650 660 Phenotyping

24
4、定量荧光染色的评价标准
⑴ 特异性，荧光染料是否和所研究的细胞成分为特异性结合；
⑵ 在相同实验条件下，荧光强度与检测的细胞成分呈严格的正相关关系；
⑶ 使用荧光显微镜检查，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否一致，并
可看到一个粗大的荧光颗粒
⑷ 用 FCM 分析评价，以 DNA 含量分析为例，在组方图上第一个峰（G0/1 细胞峰）与第
二个峰（G2M 期细胞）是否成倍数关系。

5、影响样品荧光标记的因素：定量细胞学的荧光染色易受多种因素影响，以至导致不正确
的实验结果。其主要因素如下：
⑴ 温度的影响：在一般情况下，荧光染色的环境温度对结果有明显影响。因为温度升高，
可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子动力加大，使荧光猝灭（随荧光染料浓度增加，
荧光分子被邻近分子所吸收而荧光量子产额降低的一种现象）的可能性也随之加大，这就使
荧光分子和其它分子之间相互碰撞机率明显增加；因此影响了荧光分子发光量子的产额。温
度升高时，荧光量减弱。一般在 20℃以下，荧光分子发光产额的变化不明显，基本保持恒
定。
⑵ pH 值的影响：荧光分子在溶剂中基本上处于离子化状态。因此，溶剂中的氢离子浓
度对荧光强度的影响是极大的。荧光染料发光最好条件是在溶剂中处于离子化或极化状态。
每一种荧光染料分子发光量的产额最高时均有最适 pH 值，以保持荧光分子与溶剂间的电离
平衡。如果 pH 值发生改变，可能造成荧光光谱的改变。也可造成荧光强度的降低。
⑶ 荧光染料浓度的影响：在荧光染色过程中，必须保证使用的荧光染料浓度与荧光强度
呈严格的正相关关系。但是，每种荧光染料在溶液中随浓度增加，其发光功能都存在一种猝
灭现象。这主要是缔合分子的形成，缔合分子本身具有猝灭作用，是因为缔合分子中的电子
共振作用，而消耗了激发分子的能量而参与猝灭作用。所以，当溶剂稀释荧光染料分子之间
的相互作用完全消失时，荧光量子的产额最大，发射的荧光强度最强；当溶液浓度增加时，
荧光分子之间就发生碰撞效应，缩短了电子处于激发状态的时间，使得非辐射跃迁几率增加，
从而引起荧光量子产额下降。同时，荧光染料分子浓度过高，也容易产生内滤光效应。所以。
选择合适的荧光染料浓度，对于荧光定量检测技术是十分重要的。
⑷ 杂质对细胞荧光染色的影响：杂质对荧光的猝灭作用，是由于溶剂中含一些不发光
物质。这些物质存在，使荧光分子受光激发后与其它分子相互作用，使荧光分了光量子产额
减少而造成猝灭现象；还有些杂质可以与荧光分子结合形成新的化合物，使吸收光谱发生改
变，使荧光量子产额降低。
⑸ 细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：一些插入性荧光染料在应用中需要使用一些固
定剂时，有些固定剂与细胞某些物质结合，干扰了插入性荧光染料与细胞成分的结合，造成
荧光发射强度的改变。如染色细胞 DNA 时应用醛类（戊二醛、甲醛等）固定剂，可使荧光
强度降低 50%左右；而醇类固定剂则相对影响较小。因此，对荧光定量检测中，细胞固定
剂的选择也是十分重要的。
⑹ 其它影响因素：溶剂的性质、浓度对荧光的猝灭也有一定的影响。例如，光神霉素在
盐水溶剂中，NaCl 1.9%以上时，对荧光强度有明显影响，0.9-1.8%浓度时，荧光强度相似；
<0.9%浓度时，荧光强度减弱。
因此在利用荧光染色技术检测细胞某种成分含量时，为了得到正确的测量值，就必须对
能影响荧光强度的众多因素进行严格控制，才能得到满意的结果。

二、细胞破膜剂的应用

25
1、细胞破膜剂应用的意义：用流式细胞仪检测细胞 DNA、内抗原，如与细胞凋亡有关的
p53 蛋白、Bcl-2 蛋白、及细胞内因子 IL-4、IFN-r 等，均需要首先使流动的、完整的细胞膜
产生可通透抗体的小孔，即所谓的破膜过程。破膜的好坏直接影响荧光染色的效果和结果的
分析，特别是在细胞内外抗原同时检测时，尤其重要。
2、细胞破膜剂的种类：
（1）选择破膜剂的原则：① 能保持细胞的形态，在用前向角(FSC)/侧向角(SSC)分析时，
能准确定位不同细胞种类；② 细胞膜表面抗原的抗体结合能力保持良好，细胞表面抗原检
测可靠性高；③ 能同时准确地检测细胞内外的抗原。
（2）几种常见的细胞破膜剂：① 0.05% 皂角素（saponin）,② 0.1%曲拉通（triton X-100），
③ 70%乙醇（ethanol）。
3、几种破膜剂对细胞形态的影响的对比：① 经 3 种破膜剂处理后，外周血细胞的散射光
图对比发现，用皂角素破膜，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞 3 群细胞可清晰分辨，其相对百
分比与未处理的血细胞相似；而用 triton X-100 和乙醇处理者，淋巴细胞和单核细胞群很难
分开，尤其是乙醇处理时，单核细胞与粒细胞已完全重合在一起，这主要是皂角素可较好的
保持细胞形态，而其它两种破膜剂会使细胞皱缩的结果；② 破膜剂影响抗原的表达：以
CD8 抗体标记为例，比较 CD8 标记后再破膜和破膜后再标记 CD8，结果发现：表面抗原标
记后，细胞再破膜，几种破膜剂对 CD8 表面抗原的表达均无明显影响；如果先破膜，后标
记，triton X 100 和乙醇破膜则使表达 CD8 抗原细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降；
而皂角素对这两个指标均无明显影响。对 CD45RO 和 Fas 的研究还发现，triton X-100 和乙
醇对其表达有显著影响，使其表达率下降；这三种破膜剂对细胞内 IL-2 检测结果影响不大；
检测 IFN-r 时，皂角素与乙醇相似，而用 tirton X-100，则其表达率显著降低；检测 TNF-α
时，皂角素的敏感性显著高于另外两种。总之，皂角素是比 Triton X 100 及乙醇更理想细胞
破膜剂。

三、溶血剂的应用

溶血，裂解红细胞是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好
分开。所以，溶血好坏直接影响检测结果。为此，必须对溶红细胞过程进行全面了解并严格
控制溶解红细胞的条件。
1、溶解红细胞的基本原理：首先，使溶血剂进入血细胞，包括红细胞和白细胞；然后，加
入比溶血剂渗透压低的溶液，这样使细胞内外渗透压不等，使渗透压低的溶液能充分进入细
胞内。又因为白细胞膜抗性较好，能保持细胞完整形态；而红细胞膜抗性较差，当低渗透溶
液进入红细胞后，最后将红细胞膜涨破，从而达到溶解红细胞的目的。
2、使用溶血剂的注意问题：① 溶血剂与血细胞充分混匀；② 溶血时间不宜过短或过长,
一般 5-15 min，见血液完全透明后方可；③ 采用不同厂家溶红细胞液，严格按各厂家说明
书上步骤进行操作。

3、溶红细胞液制备方法
红细胞溶解液主要用于 有核细胞表面标志性蛋白抗原的检测。它是目前应用最广泛的
制备单个核血细胞悬液的重要方法之一。各厂家均有商品上市，如联科生物公司生产的
caltagcal-lyse 溶血剂。同时，各实验室也自行配制，具体配制方法如下。
碳酸氢钾（KHCO3）1.0g
氯化铵（NH4 CL） 8.3g

26
 EDTA-Na2 0.037g
加双水至 1000ml，即为工作液。

第三节 免疫细胞的样品制备和分析

一、基本原理：
机体免疫状态是机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免
疫状态，其中最重要的指标是 T、B 和 NK 淋巴细胞的水平。其中 T 细胞又主要包括 Th 和
Ts 细胞亚群。CD3 细胞代表外周血中总的成熟 T 细胞，理论上应约等于 CD4+细胞和 CD8+
细胞的总和。 但我们检测患者 T 细胞及其亚群时， 往往出现 CD4+加 CD8+细胞之和大于 CD3
的情况。这是因为 CD4+细胞其实包括两面部分：CD3+/CD4+细胞（真正的 Th 细胞）和
CD3-/CD4+细胞（非 Th 细胞）；CD8 细胞也包括两部分细胞：CD3+/CD8+细胞（真正 Ts 细
胞）和 CD3-/CD8+细胞（非 Ts 细胞）而后者又可以分为两组：一组为 CD3-/CD8+/CD（16+56）
+细胞（即 NK 细胞的一部分）；另一组为 CD3-/CD8+/CD（16+56）-（一群未知细胞） 。由
此可见，真正的 Th 细胞是 CD3+/CD4+细胞，真正 Ts 细胞是 CD3+/CD8+细胞若使用 CD4
或 CD8 单标单抗或 CD4 与 CD8 双标抗体来检测 Th 和 Ts，而不用 CD3 抗体进行限定，测
出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者 NK 细胞明显增加时，会使 CD4 细胞和 CD8 细胞
的总和远大于 CD3+细胞因此，一定用三色荧光标记才能分析真正的辅助性 T 细胞和抑制性
T 细胞。首先在淋巴细胞中识别出 CD3 细胞，然后在 CD3 细胞中再区分 CD4+和 CD8+细胞。
自然杀伤细胞（NK），又称裸细胞，因其表面没有类似 T 细胞和 B 细胞的表面标志，后来
随着免疫力学的发展，发现 NK 细胞的一些表面标志，如 CD16、CD56 等，但单用 C 在先 和
CD56 的抗体无法正确鉴定出 NK 细胞，因此必须使用 CD（16+56）抗体。这里还有一点必
须引起足够重视，即 NK 细胞一定是 CD3 阴性表达细胞。所以 CD3-/CD（16+56）+细胞才
是真正的 NK 细胞。根据是否表达 CD8 ，又可将 NK 细胞分为 CD3+/C 左+/C 在先+56）+
细胞（前面已提及，这部分细胞在 NK 细胞中所占比例较小，因此一般不会影响 CD8 的比
例）和 CD3-/CD8-？参政+56）+细胞（这 NK 细胞的主要成分） 。B 细胞的表面标志是 CD19，
理论上 CD3-/CD19+细胞才是真正的 B 淋巴细胞。但实际检测中，CD3+/CD19+细胞很少，
可以忽略不计。所以 CD19+细胞就是 B 淋巴细胞。`
利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记
（荧光探针），而这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合；当细胞被激光器发射的激光照射
后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发荧光，带荧光探针的
单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号，这就代表了细胞表面的
抗原量；这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨，从而实现对细胞表面抗原的定量检测。细
胞免疫反应一般分两种：直接免疫反应，即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结
合的免疫反应；间接免疫反应，细胞表面的抗原与单克隆抗体结合，带荧光的第二抗体又与
抗体结合，也使这个抗原-抗体复合物也带上荧光探针。

27
 图 2-3-1 同型对照用于设定十字门的位置。

要求：双参数直方图左下区域， 即 R3 区的细胞需为总细胞数的 98%-99%。因此，图

2-7-1 之 1a 的 R3 区中包含的细胞过多(99.95%)，而图 1b 则细胞过少(97.52%)。图 1c 的十字
门位置适当。有时在右上区域(R2 区)的对角线位置处会出现额外的细胞群，即通常所说的
“火箭峰”，这时，十字门的交叉点应该设在 R3 区中接近阴性细胞群的位置(如图 1d)。只有
在这种情况下，才允许 R3 区中的细胞群比例低于 98%.

二、淋巴细胞亚群分析：

1、双色分析方案：见表 2-3-1
CD45-FITC/CD14-PE
CD3-TC-CD4-PE- CD8-FITC
CD3-FITC/ CD16+56-PE
CD19-TC
Cal-Lyse
Control IgG2a-FPT

表 2-3-1 双色法检测外周血 T、B、NK 细胞试剂组合

Tube Number FITC PE Use

1 CD45 CD14 光散射坐标设门
2 CD3 CD19 总 T 和 B 淋巴细胞
3 CD3 CD4 总 T 和 CD4 阳性 T 淋巴细胞
4 CD3 CD8 总 T 和 CD8 阳性 T 淋巴细胞
5 CD3 CD16 and CD56 总 T 和 NK 细胞

2、三色分析方案：见表 2-3-2
管 A：CD45/CD14 确定 FS Cvs SSC 中淋巴细胞门位置 （详见下），此管对于自配溶
血剂用户必做此质控管。
管 B：阴性对照管，用来设置各 PMT 电压和阴性区域。
管 C：CD3/CD4/CD8 三色检测管，监调节荧光补偿之用。
管 D：CD3/CD16+56/CD19 三色检测管。

28
 表 2-3-2 三色法检测外周血 T、B、NK 细胞的试剂组合

Tube
Number FITC PE PE-Cy5 Use
1 CD45 CD14 X 光散射坐标设门
2 CD8 CD4 CD3 T 细胞及其亚群
3 CD3 CD16 and CD56 CD19 NK 细胞及 B 细胞

CD45 和 CD14 在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散射坐标上区分淋巴细

胞群体或其他细胞。一个适当的分型方案应能够提供最精确地、明确地区分出各类细胞亚群。
方案中所选抗体应能够最大限度地反应出整个标本中细胞的信息，提供样本管之间的对比质
控来保证各个测定管之间的结果的一致性。方案设计中不仅要检测阳性标本，还要包括阴性
群体来作阳性标本荧光强度的对照。美国疾病控制中心制定了一套检测 T 淋巴细胞亚群的
方案，可作为参照来检测样本。

3、用 CD3/CD19 区分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞

在多色免疫分型分型中，阴性细胞群体不仅用来区分阳性细胞群体，它还可以从双阳性
细胞中区分出单阳性细胞。鉴于此，简单的同型对照细胞并不能完全作为设定荧光阳性界线
的参考细胞群。在 CDC 推荐的淋巴细胞分型方案中，对照细胞群体运用的是相互没有交叉
的 T、B 淋巴细胞。
① CD3 是 T 细胞特异性抗原，CD19 则可用来识别 B 细胞。如运用 CD3/CD19 双标试剂，
应没有 CD3 和 CD19 双阳性细胞群体存在。因此当运用 CD3/CD19 双染色时，只会出现单
阳性细胞，通过此管可设定机器设制，为后续要观察双阳性细胞的检测管作对照。
② CD3、CD19 阳性表达为独立的阳性细胞群体。如出现双阳性细胞均视为假象。这样就
可不用同型对照来设定阴性或阳性界线。其中单阳性细胞群体提供了设定阳性界线的标准。
此外在 CD3/CD19 检测时，还会有双阳性细胞群体的存在，这些是 NK 细胞。这些细胞又提
供双阴性群体的对照。 （有时检测时会出现双阳性细胞，这是由于 T 细胞和 B 细胞粘附时同
时通过仪器的检测区而造成的双阳性结果）
③ CD3/CD19 不仅可用来设定标本的荧光的阴性和阳性界线，它还可用来检查仪器的补
偿设置和非特异性结合。在用这个组合进行检测时，会出现三群彼此独立的细胞群，如细胞
分群不清或位置发生偏差则要对样本进行仔细分析。

4、运用 CD3/CD4 来鉴定 CD4+T 淋巴细胞

如同其他许多单克隆抗体一样，抗 CD4 抗体并不是完全只与辅助/诱导性 T 细胞发生反
应，它还会与单核细胞结合。因此如要鉴别 CD4+的辅助/诱导性 T 细胞则需要加入第二种
抗体来区分辅助/诱导性 T 细胞与单核细胞。
(1) 首先用 CD3 来区分全部 T 细胞。CD3/CD4 双阳性的为真正的辅助/诱导性 T 细胞。这
此细胞主要是 HIV 病毒感染对象。在 HIV 感染后，随着疾病的发展出现免疫抑制后，这群
细胞会明显下降；在临床中，对 HIV 的鉴测主要依靠检测这群细胞的数量。
(2) CD3-/CD4+细胞群体是由单核细胞组成的。这些细胞相对于 CD4+和 T 细胞来说弱表
达 CD4，在光散射参数的位置分布也较广。CD3/CD4 抗体组合能完全区分将 CD4 阳性辅助
/诱导性 T 细胞与 CD4 阳性的单核细胞相区分开来。因为 CD4+T 细胞能与单核细胞完全分
离，固在光散射坐标上设淋巴细胞”门”时，”门”可设得大一些，即使包含了单核细胞或其他
细胞都不会影响检测值。

29
 (3) 此管也可检测补偿及非特异性结合情况。CD3+/CD4-细胞群体应明显地与 CD3/CD19
中 CD3+细胞群位置相重合。

5、运用 CD3/CD8 鉴定 CD8+T 淋巴细胞

CD8 的表达不只限于 T-细胞毒性/抑制细胞，这种抗原在部分 NK 细胞上也能检测到，
故 CD8 必须与 CD3 一起来鉴定 T-细胞毒性/抑制细胞。
（1） 同时表达 CD3/CD8 的细胞群才是真正的 CD8+T 淋巴细胞，CD8 的表达
包括弱阳性和强阳性部分。CD8 的表达经常与阴性细胞群体相延续。因此 CD8 阳性细胞检
测群依赖于仪器灵敏度，正确补偿的建立，以及恰当地设定阴性细胞群体。
CD3-/CD8+细胞包括一部分 NK 细胞和少数粒细胞。这些细胞弱表达 CD8+，由于
缺少 CD3，易于从 CD3+/CD8+ T 淋巴细胞相区别。
（2）双标试剂可以用来检查补偿设制和非特异性结合情况。双阴性细胞可视作内部的阴
性对照。CD3 阳性群体应与 CD3/CD19、CD3/CD4 中的 CD3 阳性群体处于同一位置。

6、NK 细胞
（1） CD16(FcRIII)表达于大多 NK 细胞上,但也表达于中性粒细胞上.这种抗原在 NK 细胞
的表达比较弱并在 NK 细胞活化时丢失,。
（2） CD56 表达于大多数的（但并不是全部）NK 细胞上, 也表达于一些 T 淋巴细胞上。
与 CD3 联合使用,可以区分 CD3+/CD56+ T 淋巴细胞和 CD3-/CD56+NK 细胞。
（3）联合使用三种单抗能最完全的鉴定所有的 NK 细胞. NK 细胞或表达 CD16, 或表达
CD56,但它们不表达 CD3。CD16 和 CD56 联合使用,根据荧光强度可将 NK 从双阴性细胞
中区分出来。这样运用该组试剂，NK 细胞可形成独立的群体与其他细胞相区分。

7、样本检测中的内部质控：CD3 的检测数量
如选用 CDC 推荐的方案来检测淋巴细胞亚群，这个方案中的检测管能够提供很好批间
质控：
（1） 因为所有测定管中都含的 CD3，所每管中的 CD3 数量的差异不应超出实验室中可
接受 CV 值范围。如去除实验室 CV 影响，测定管中 CD3 的最高值与最低值不应相差 3%以
上。如差值大于 3%则要对数据作进一步分析，找出原因。
（2）一般来说，每个测定管中 CD3 的数量是极为相近的。如出现偏差，要着重检查形态
学”门”（FSC vs SSC）中的位置，其中细胞数量或形态是否一致；极有可能偏差是由于”门”
的位置不一致造成的。此外，要确保所加试剂量前后一致，阴性对照界线设置要正确。
（3） 如在排除上述原因后，差异仍大于 3%，则标本要弃用。

8、淋巴细胞亚群数据分析及质量控制
使用以上试剂可供区别出 T、B、NK 细胞：
（1）T 细胞 B 细胞和 NK 细胞百分比总和应等于 100%的淋巴细胞，但在实际中由于在
FSCvs SSC 中淋巴细胞设”门”中，会混入细胞碎片及单核和粒细胞，所以很难达到 100%的
比例。
（2） 如运用 CD14/CD45 设门来确定淋巴细胞”门”，则 CD3 细胞百分比+CD19 细胞百分
比+CD3-/（CD16+56+）细胞百分比应等于 CD45/CD14 中淋巴细胞百分比±5%，最大不得
超过±10%。

9、外周血免疫细胞检测的实验程序

30
 （1） 取 100μl 1000u/ml 肝素抗凝静脉全血，置于 FCM 测量管中；
（2） 直接标记法：加入带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂 10μl，充分混匀，在
4℃冰箱中反应 30 min；
间接标记法：加入不带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂 10μl，充分混匀，
反应 30 min；再加入带荧光标记的羊抗鼠抗体，反应 30 min；
（3） 再加入 2 ml 溶红细胞液，充分混匀，在 4℃冰箱中反应 5-10 min；
（4） 以 1500prm 离心 5min，去上清；
（5） 用生理盐水洗 1 遍，收集细胞，上机检测。

10、外周血免疫细胞检测的注意事项
人体免疫细胞的检测，主要通过细胞表面标志——血细胞表面分化抗原的免疫分析来实
现的。在分析免疫细胞时注意以下几点：
（1）细胞分化抗原——细胞表面标志的表达方式：可以采用两种方式来表达，即细胞荧光
强度和阳性细胞百分比；① 细胞荧光强度表达，即在细胞分布的直方图上，细胞巅峰所处
荧光道数；② 阳性细胞百分比表达，即在检测细胞中，所有标记阳性细胞占检测细胞的百
分比。
（2）样品检测的同型对照和正常对照：只有设同型对照和正常对照，才能增加样品检测结
果的准确性和客观性。同型对照是指：所应用的单克隆荧光标记抗体(染色试剂)——即携带
特异性单克隆荧光抗体的免疫球蛋白的空白对照，即只带荧光标记相同的免疫球蛋白，以此
作为对照并在分析样品时，减去同型对照的阳性结果。样品正常对照是指：未加任何处理的
正常组织细胞,作为实验对照样品,在分析细胞时，只有与正常对照相比，才能得出检测细胞
的异常程度或处理后样品的变化趋势。

第四节 DNA 含量检测样品的染色和分析

DNA 含量检测是流式细胞仪最早，且目前仍然是其最为广泛的应用指标之一。恶变肿瘤
细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明 DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。
DNA 含量分析还可提供细胞周期信息，所以它也可作为细胞生物学的一种有用工具。尤其对
细胞毒性药物的研究很有价值。DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞
处于某一特定周期阶段。
使用一些核酸染料和 DNA 结合可对 DNA 进行定量分析，但这只能反映细胞周期中的某一
静态情况，而用 BrdUrd 脉冲标记（pulse-labelling）细胞及其抗体的使用或结合连续标记
BrdUrd 和 Hoechst33258 染料则可以观察细胞循环过程中的一动态变化过程。
在生物细胞中，DNA 含量是比较恒定的参量，但 DNA 含量随着细胞增殖周期各时相的不
同而发生明显的变化。G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，
其细胞 DNA 含量为较恒定的 2C 值，G1 期细胞与 G0 期细胞 DNA 值相同，均为二倍体 DNA
含量，当细胞 DNA 倍增结束，进入 G2 期，最终进入 M 期，在 M 期分裂为两个子细胞之
前，G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的 4C 值，即为四倍体细胞群。

一、DNA 含量样品的制备：
PI 或 EB 荧光染色方法，目前市场已有试剂盒出售，十分方便；但也可以自行配制试剂。
用 PI 综合染液做细胞 DNA 含量一步法染色程序如下：① PI 综合染液的配制：（100ml）
PI 5mg、RNAas 2mg、1.0% Triton X 100 0.5ml 、生理盐水 5 ml、枸橼酸钠 100mg、加
蒸馏水至 100ml，调 pH 7.2～7.6， 置 4℃冰箱中避光保存备用。② 将单细胞悬液或加固

31
定液细胞悬液离心沉淀弃之，用 PBS 洗涤 2 次，调细胞浓度为 1×106，加 2 ml PI 综合染
液；③ 置 4℃冰箱，染色 30 min；④ 离心洗去 PI 染液，加少许 PBS 液，上机检测。

二、细胞 DNA 含量的分析(ModiFit LT 2.0)细胞周期分析软件)

1、DNA 倍体分析的理论依据：
在生物细胞中，DNA 含量是比较恒定的参量，DNA 含量随着细胞增殖周期各时相不同
而发生变化。G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的 1 群细胞，即为静止细胞，其细胞
为恒定的二倍体 DNA 含量（2C）；G1 期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环，G1 期细胞
与 G0 期细胞 DNA 含量相同，均为 2C；当细胞进入 S 期后，DNA 含量逐渐增加，从 2C→
4C，一直到细胞 DNA 倍增结束，进入 G2 期，最终进入 M 期。在 M 期分裂为 2 个子细胞
之前，G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的 4C，即为四倍体细胞。
荧光染料和细胞 DNA 分子具有特异性结合，且有一定的量效关系：① DNA 含量多少与
荧光染料的结合成正比；② 荧光强度与 DNA 分子结合荧光素多少成正比；③ 荧光脉冲与直
方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析 1 个细胞增殖群时，可将二倍体 DNA 含量分
布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1 和 G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可
以认为是一个加宽的正态分布。
癌组织都应该含有一定比例的正常二倍体细胞：① 癌组织源于正常组织，可能残存一
些同源组织正常细胞；② 癌组织的血液供应和支持组织往往是从正常组织延伸过来的，存
在一些纤维母细胞、血管内皮细胞及血细胞等；③ 机体免疫监视功能，大量浸润的淋巴细
胞、巨噬细胞等。且在癌组织 DNA 直方图上（见图 2-4-1） ，异倍体峰前总可以见到 1 个或
大或小的二倍体峰位的 G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做倍体检测时，都采用组织中淋
巴细胞做对照。

图 2-4-1 肿瘤组织细胞 DNA 直方图

（DNA 异倍体 G0/1 细胞峰前有 1 个小的 DNA 二倍体细胞峰）

2、DNA 倍体的命名原则：
流式细胞术分析肿瘤细胞 DNA 倍体时，应根据 DNA 直方图、G0/1 峰峰位和 DNA 指数
（DNA index, DI）来确定 DNA 倍体类型。DNA 倍体分为单干系和多干系，来自单个细胞
突变后的肿瘤，发展为 DNA 单干系肿瘤，可能为二倍体或者是单异倍体肿瘤；来自多个细
胞突变后形成的肿瘤或者肿瘤在发展过程中出现多克隆 DNA 干系细胞的肿瘤为多克隆肿
瘤。另外，在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、
或经治疗的肿瘤灶，其 DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为 DNA 倍体异
质性。

32
3、DNA 倍体分类的分析参数：
① DNA 指数（DNA index，DI）

被分析细胞 G0/1 期细胞峰顶荧光道数

DI=
正常二倍体 G0/1 期细胞峰顶荧光道数

② 细胞周期各时相细胞比例：静止期/DNA 合成前期（G0/1 期）、DNA 合成期（S 期）、

DNA 合成后期/有丝分裂期（G2M 期） ；
③ 增殖活性：包括 S 期细胞比例（S-phase fraction，SPF）和增殖指数（proliferous index,
PI）：
S
SPF = ×100 %
G0/1+S+G2M
S+G2M
PI = ×100 %
G0/1+S+G2M

④ 细胞凋亡指数(Apoptosis Index, AI)：DNA 二倍体细胞 G0/1 峰前亚二倍体峰细胞占

分析细胞的百分比（%） 。

4、 细胞 DNA 倍体具体分类方法：
用 FCM 检测肿瘤细胞 DNA 含量时，是以肿瘤组织中 DNA 二倍体细胞作内部参考细胞
来计算肿瘤细胞 DNA 指数（DI）；以 DI 值和 DNA 干系数量不同对肿瘤组织 DNA 倍体分
类如下：

二倍体

DNA 倍体 近二倍体 单克隆

单异倍体 四倍体 肿瘤起源学说
异倍体 非整倍体
多异倍体 多克隆

图 2-4-2 DNA 倍体分类与肿瘤克隆起源

（1） 二倍体（diploid, D）：在组织细胞中只有 1 个 DNA 干系细胞，DI=1.00；

（2） 近二倍体(near-diploid, ND)：在组织细胞中有 2 个 DNA 干系细胞，其中 1 个干系细
胞 G0/1 峰峰位在 DNA 二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个 DNA 干系细胞，DI≠1.00，
但在 0.90-1.10 之间，该细胞峰为近二倍体细胞。
（3） 四倍体(tetraploid, T)：在组织细胞中有 2 个 DNA 干系细胞，其中 1 个 DNA 干系细
胞 G0/1 峰峰位在 DNA 二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个 DNA 干系细胞，DI 值在
1.90-2.10 之间，该细胞峰为四倍体细胞。
（4） 非整倍体(aneuploid, AN)：在组织细胞中有 2 个 DNA 干系细胞，其中 1 个干系细胞
G0/1 峰峰位在 DNA 二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个 DNA 干系细胞的 DI 为 <0.90
或 >1.10，但除外 T 细胞，该细胞峰为非整倍体细胞。
（5） 多异倍体(multiploid, M)：在组织细胞中有 3 个或 3 个以上 DNA 干系细胞，除有 1

33
个 DNA 干系细胞 G0/1 峰峰位在 DNA 二倍体细胞峰位上，DI=1.00 外；还有 2 个或 2 个以上
DNA 异倍体干系细胞，这些细胞群被称为多异倍体细胞。

5、DNA 倍体异质性分析
（1） 基本概念：肿瘤 DNA 倍体异质性，是指在恶性肿瘤的不同部位组织中，DNA 克隆
干系分布明显不同者，存在 DNA 倍体异质性，该肿瘤为 DNA 异质体肿瘤；肿瘤不同部位
组织的 DNA 克隆干系相同者，则为 DNA 同质体肿瘤。当然，DNA 倍体异质性分析也适用
于对肿瘤原发灶和浸润灶、肿瘤原发灶和转移灶、肿瘤原发灶和复发灶之间 DNA 倍体的关
系分析，即 DNA 倍体异质性分析。
（2） DNA 倍体克隆干系的判断标准：在不同肿瘤组织中，在细胞 DNA 直方图上，原则
上其异倍体 G0/1 期细胞 DI 值之差≧0.2 以上时，或 DI 值之差虽然不大于 0.2,但可分为明显
2 个细胞峰者,均为不同克隆细胞；其 DI 值之差小于 0.2 时，则为同一克隆细胞。DNA 倍体
同质体包括：DNA 二倍体同质体肿瘤，DNA 近二倍体同质体肿瘤，DNA 四倍体同质体肿
瘤，DNA 非整倍体肿瘤和 DNA 多异倍体同质体肿瘤。而 DNA 异质体肿瘤则包括：DNA
二倍体与各种 DNA 异倍体的组合或各种异倍体类型之间的组合。
（3） DNA 倍体异质性分析的临床意义：DNA 倍体异质性是恶性肿瘤的的重要生物学特性
之一。如果患者是 DNA 异质性肿瘤，这表明它是多克隆起源的、肿瘤恶性度更高；而且在
肿瘤治疗时，增加了治疗的难度和复杂性；在肿瘤预后上，增加了肿瘤的危险性。

6、细胞动力学分析方法进展
（1） 第 1 代细胞周期分析方法：DNA 合成与有丝分裂来确定细胞周期的时相和细胞动力
学——采用同步化细胞氚标记胸腺嘧啶核苷掺入法，通过放射自显影技术，分析 DNA 合成
期及各时相时间。
（2） 第 2 代细胞周期分析方法：利用细胞 G0/1、S 和 G2M 期细胞核糖核酸含量（DNA 和
RNA）分布不同的的特征性差异，检测非同步化的活性大分子含量的变化——以 DNA 或
DNA/RNA 荧光探针染色，用流式细胞术检测细胞周期各时相细胞比例。后来以 BrdU、
PCNA、Ki67 等方法标记进入细胞增殖细胞的方法——便于细胞复制与分期分析。
（3） 第 3 代细胞周期分析方法：细胞周期分子调控制机理 （细胞周期检测点等） 、多元
化的细胞周期归宿（如静止、分化、凋亡、增殖）联系在一起。近年，一些细胞周期调控基
因产物的发现（包括：CDKs、Cyclins、CKls,等） 。细胞周期的新理论与新技术包括：
① 突破经典的以 DNA 合成、有丝分裂为标志的细胞周期分析模式，转向以时相性驱
动分子机制为基础的细胞周期分析（Cyclin E+A 技术）；
② 细胞周期检测点的分析（Cyclin 域值技术）；
③ 真正意义上的细胞增殖分析（双 Cyclins 技术）；
④ 细胞周期时相性细胞凋亡的分析（PA 技术）；
⑤ 细胞增殖与细胞凋亡同步分析（即调亡/增殖比率分析）（Cyclin/Sub-G1 技术）
⑥ 非时相性 Cyclins 分析
（双光源三参数 Cyclin 分析技术，分选后 Westerm Blot 技术 ）。
新一代细胞周期分析理论与方法为细胞生物学、肿瘤细胞生物学、新药研究提供新技
术平台；又揭示了生物学里更深的科学问题。

34
 第五节 细胞凋亡的检测和分析

细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（programmed cell death ,PCD），是

指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主
动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程（见图 2-5-1）。细胞凋亡是生物体中
一种普遍存在的现象。胚胎形成、衰老和损伤细胞细胞的清除、自身反应性 T 淋巴细胞的
清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。另外在干细胞最终分化成成熟的血
细胞的一系列过程中，并非每个细胞都能够走到终点，相当一部分细胞甚至绝大部分细胞都
会在中途凋亡；胸腺的 T 细胞 95％存活不到成熟 T 细胞阶段；相当数量的原始和幼稚红细
胞在骨髓中发生“原位溶血”；这些生理或病理过程都与细胞凋亡密切相关。

在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化

在细胞坏死过程中细胞形态学的变化

图 4-8-55 细胞坏死和细胞凋亡的形态学比较

细胞凋亡在形态和生化上有其明显的特征。在形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在
核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折、卷
曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。最明显的特征是 Ca2+与 Mg2+依赖的骨源性核酸酶
的激活，使细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约为 180～200bp 或其多聚体组成的寡
核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳上形成特征性的“梯状带”。 凋亡细胞形态上的改变影响它们
的光散射特性。在流式细胞仪上，前向角散射光与细胞大小有关，而侧向角散射光反映的是

35
光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，
故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

图 2-5-1 细胞凋亡调控示意图

此外，细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧
向角散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前向角散射光增大；侧向角散射光在细
胞坏死时也增大，因此可根据前向角散射光和侧向角散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需
要注意的是，根据前向角散射光和侧向角散射光判断凋亡细胞的可靠性,将受被检测细胞形
态上的均一性和核胞浆比率影响较大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡
的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主
要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处
理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
检测细胞凋亡的方法很多，常见的有电镜或光镜下的形态观察、细胞 DNA 提取物的
DNA Ladder 电泳实验、细胞核小体相关 DNA 片段的检测等。根据细胞凋亡过程中的时相
变化，流式细胞术用于细胞凋亡检测的方法主要有如下几种：

1、早早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶 3（caspases-3）
Caspases-3 又称半胱氨酸蛋白酶 3，是细胞凋亡信号传导通路中的 ICE 蛋白酶家族的重

36
要成员，在细胞凋亡发生的早期被激活。ICE 家族主要通过两种途径来引起细胞凋亡的发生：
① 细胞毒 T 细胞（CTL）活化后大量表达 Fas 配体(Fas L)，Fas L 和靶细胞表面的 Fas 结合，
通过 Fas 分子胞内段的死亡结构域，激活 Caspase 8，再激活一系列 Caspases，引起死亡信
号的逐级转导，最终激活内源性 DNA 内切酶，使核小体断裂，并导致细胞结构毁损，细胞
凋亡。② CTL 细胞颗粒胞吐释放颗粒酶，可借助穿孔素构筑的小孔穿越细胞膜，激活另一
个 caspases10, 引起 caspases 级联反应，使靶细胞凋亡。不管是由 Caspase 8 还是由 caspase 10
启动的 caspases 级联反应，都要经过 caspase 3 而向下逐级级联。因此，临床常用 caspase 3
来检测早早期的细胞凋亡。

图 4-8-16 细胞凋亡信号传递系统示意图

2、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：Annexin V-FITC/PI 法：
正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，
PS），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞

37
膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外层表面，巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面
细胞的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症
反应。 Annexin V 是一种对 Ca2+依赖，对 PS 有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针
识别细胞膜表面是否有 PS，从而识别凋亡细胞。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷
脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。凋亡细胞对
所有用于细胞活性鉴定的染料（如 PI）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞
DNA 可被 PI 着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，
在细胞凋亡的早期 PI 不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术
双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-） ；右上象限是非活细胞，即坏死
细胞，为 Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现 Annexin V +/PI-。

图 2-5-2 细胞凋亡的 Annexin V-FITC/PI 检测法

3、晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：TUNEL 法
TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记法（TdT mediated X-dUP nick ending end labeling,
TUNEL）是 1992 年 Gavricli 等首先报道，它实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方
法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生
物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞和从组织中分离的
细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定
法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链 DNA 会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列
3'-OH 的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranferase,
TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的 dUTP 连接到 DNA 的 3'-OH 末端，用流式细胞术
检测。该方法首先采用蛋白酶 K 消化法或渗透法对标本细胞进行打孔，后将标本与 TdT 和
FITC 及 Biotin 标记的 dUTP 一起温育，在温育过程中，TdT 将荧光素或生物素标记的 dUTP
连接到 DNA 片断的自由 3’-末端上，采用生物素标记时可在荧光显微镜下直接对荧光素标
记的 DNA 片断进行观察；采用生物素标记时，需以亲合素/生物素-辣根过氧化物酶或亲合
素/碱性磷酸酶系统显色后分析。亦可采用偶联于碱性磷酸酶分子的抗荧光素抗体或连接于
过氧化物酶分子的抗荧光素抗体作为检测试剂。
近来的研究证实，Br-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更
容易掺入到凋亡细胞的DNA中（图2-5-3）。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光

38
素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。未凋亡的细胞因为没有
暴露的3’未端，所以不会被检测。

图 2-5-3 TUNEL 法检测细胞凋亡原理图

4、晚晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：
细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生一系列特征性改变，包括细胞核的改变、
细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等。1991 年许多实验室独立报道了，
由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞的 DNA 可染性发生改变。
细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致 DNA 广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表现，也
为 FCM 鉴别细胞凋亡奠定了物质基础。目前检测凋亡细胞 DNA 断裂的方法中，最常用、
最简便的就是 DNA 含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，
或者用沉淀固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的 DNA 不
能完全封闭于细胞中，在细胞洗染过程中 DNA 碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞 DNA
含量减少；加之由于 DNA 的降解，与荧光染料的结合减少，故细胞 DNA 荧光强度降低；
DNA 直方图上显示在 G0/1 峰前出现一个 DNA 含量减少的亚二倍体或称亚 G0/1 峰，又称凋
亡细胞峰（见图 2-5-4）
。

图 2-5-4 细胞周期法检测细胞凋亡原理图

通过 FCM 测定 DNA 的含量，亦可同时分析凋亡细胞的周期位置，故 FCM 测定 DNA

含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。Andreff 等用 FCM 研究细胞凋亡与细胞周期的关系
后提出凋亡分两个阶段：早期凋亡（early apoptosis）即发生于药物作用于特定的周期时相的
细胞凋亡（homo-phase apoptosis）多在作用后 3～8 小时内。而延迟凋亡（delayed apoptosis）

39
是指发生于同一周期的细胞凋亡（homocycle apoptosis），或发生在分裂期后即子代细胞或称
为分裂后细胞凋亡（post mitotic apoptosis）。他们指出：化疗药物对细胞作用是药物浓度和
作用时间依赖性的，可分为四个阶段：（1）亚细胞阻滞阶段时 DNA 迅速修复，细胞存活，
并具克隆性，随后可发生细胞分化，子代细胞的基因突变； （2）DNA 损伤，干扰细胞周期
阶段或者 DNA 损伤后再修复，可导致子代细胞的突变或发生延迟凋亡； （3）药物浓度的进
一步加大则可导致早期凋亡和延迟凋亡；（4）更大剂量则造成细胞坏死。另外，应用 FCM
方法，通过对 DNA 和 RNA 的联合检测，可以鉴别出 G0 期细胞。因此，可分析细胞凋亡与
G1 或 G0 期细胞的关系。FCM 对 DNA 含量的测定直观、简便、迅速、实用，是 FCM 判断
细胞凋亡的基本方法。
DNA 降解的程度取决于细胞凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因素的特性。另外，
染色过程中 DNA 逸出量的变化也影响 FCM 检测结果。据研究，将高浓度的磷酸-枸橼酸缓
冲液（phosphate-citrate buffer，PCB）较 Hank`s 平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，
HBSS）更易使凋亡小体析出，即将 PCB 加入漂洗液中，可增高降解 DNA 的逸出量，使亚
峰 G0/1 峰更为清晰，从而提高 FCM 区别凋亡细胞与正常细胞的能力。
DNA 含量测定在检测的细胞凋亡过程中的局限性在于其特异性不很高，因为：（1）亚
G0/1 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目，并不代表凋亡细胞的细胞数目； （2）亚 G0/1 峰并
非凋亡细胞所特有，非整倍体细胞、机械损伤细胞均可造成亚 G0/1 峰。因此，FCM DNA 含
量检测方法进行凋亡细胞分析时应注意结合其它形态学、免疫学或生物学方法或死活细胞计
数、标准二倍体、免疫标志等参数进行综合分析，以更为准确地分析凋亡细胞状态。凋亡细
胞 DNA 被降解，小分子 DNA 可以经通透细胞膜逸出细胞外，凋亡小体可带走一部分 DNA，
因而凋亡细胞 DNA 含量下降，由此导致 DNA 染料的染色能力下降，在 G0/1 峰前呈现亚二
倍体细胞峰，称为 Apo 峰。

5、细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测：
（1）Fas/FasL(Fas 配体)：Fas 抗原与 Fas 配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径，
它们的异常与免疫相关疾病、肿瘤、移植排斥、病毒性肝炎、肾小球肾炎等多种疾病高
度相关。
（2）p53：p53 是细胞周期中的‘检查点’分子，其控制着细胞在 DNA 损伤无法修复时启
动细胞的‘自杀’进程。p53 的缺失或突变已被证明是多种肿瘤（如：乳腺癌、胃肠道
肿瘤 及肝细胞癌等）发生的重要原因。其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标。
（3）Bcl-2：Bcl-2 是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切关系。
其表达上调是肿瘤诊断的指标和预后的参考。

第六节 血小板及血小板活化的 FCM 分析

流式细胞术是血小板分析研究最好的方法，该法可提高检测灵敏度、并减少人为因素的
干扰，该法可以精确地检测病人血小板生成方面的情况，即使血小板计数很低时也可检测表
面标记。
一、血小板表面标记检测方法
全血法荧光单标记可检测血小板 CD62p、CD63、CD42b、CD41、CD61 等指标。具体
染色方法步骤如下：
1、 采血用枸橼酸盐或 EDTA 抗凝；
2、10μl 荧光标记抗体，加 100μl PBS，再加 5μl 全血（样品管）；
10μl 抗体同型对照，加 100μl PBS，再加 5μl 全血（对照管）；

40
 轻轻混匀，室温孵育 15min；
3、加 2-3ml PBS（1% PFA）终止反应，上机检测分析。

二、流式细胞术计数网织血小板(RP)：
血小板 RNA 含量与血小板生成状态相关，他可以区分是因为骨髓抑制或外周破坏增加引
起的血小板减少。在化疗后或移植后，网织血小板可以监测巨核细胞和血小板生成状态。
（1）网织血小板检测原理：
噻唑橙（thiazol orange，TO）是一种亲脂性的荧光染料，能迅速通过活细胞膜，与
RNA 结合后，荧光强度提高 3000 倍，利用 TO 这一性质很多学者建立了流式细胞仪检测网织
血小板百分率的方法，但尚无统一的标准方法。
（2）网织血小板检测方法：
① 制备富含血小板血浆：将 EDTA 抗凝全血 500 rpm 离心 8min，取出上层含血小板血
浆，2000 rpm 离心 10min，弃上清液，底层血小板用柠檬酸钠葡萄糖 EDTA 缓冲液（pH7.4）
再悬浮，并洗一次，再用 Tyrode's 缓冲液（含牛血清白蛋白和 EDTA）洗两次，再悬浮在 Tyrode's
缓冲液中，调整血小板浓度为 100×109/L 作为样品。
② 醛化固定:向标本加入 1%甲醛，在 4℃放置 2h 以上，以固定血小板。检测前用 Tyrode's
缓冲液洗一次。
③ 染色计数：向 50μl 经过醛化固定的血小板悬液加 450μl 噻唑橙染液，放室温暗处
1～2h，用流式细胞仪测定 525nm 波长处的荧光强度，代表 RP 数量。同时计数血小板总数，
计算得知 RP 的比值。这即 RP 的半自动计数法。因为该法采用噻唑橙染色，被染色的血小
板又称为噻唑橙阳性血小板（TO+血小板）。
（3）网织血小板检测的临床意义
① 用 RP 的相对百分率反映外周血中血小板的更新状态
② 血小板减少症时的 RP 百分率均明显增加： ITP、肝脏疾病、
③ 健康新生儿的 RP 与孕龄有关，孕龄<30 周的新生儿 RP 明显高于>36 周新生儿 RP
和 30～36 周的新生儿 RP。
④ 作为骨髓抑制后血小板的恢复和造血促进因子使用后血小板造血的监控指标，网织
血小板可以作为临床应用血小板生成素效果的评价指标。
⑤ 用于造血干细胞移植和化疗后造血功能恢复的估计，可作为骨髓造血重建和使用血
小板生成素的指征。

三、流式细胞术检测血小板相关抗体（PA-IgG） ：
是由一种能够通过胎盘、存在于血小板表面的免疫球蛋白，称为血小板相关抗体
（PA-IgG）。PA-IgG 包括 3 种成分：（1）真正的抗血小板抗体。 （2）循环免疫复合物。（3）
非特异性吸附于血小板表面的血浆免疫球蛋白。已经确认，PA-IgG 和原发性血小板减少性
紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）及其它免疫性血小板破坏疾病相关。与血
小板结合的 PA-IgG 数量检测结果，可以作为临床诊断依据，比其它单一检测方法更有价值。
（1）试剂
洗涤缓冲液（PBS/EDTA/BSA）：PBS 缓冲液，含 10mM EDTA 和 0.5% BSA。
抗体：Goat F（ab\）2Anti-Human IgG（Fc Sp.）—R-PE （H10104，Caltag. 为多克隆抗体）
阴性对照：Goat F（ab\）2IgG—PE（11304，Caltag）
（2）样本
① 正常人血样:1 个，血小板数值在正常范围，具体数目不详。
② 病人血样：2 个，为一月龄的双胞胎（患者 1 和患者 2），均为贫血血小板，具体数目

41
不详。
（3）步骤
① 用含 EDTA 抗凝剂的血液收集管采血，三个血样均取 2ml 分别加到三只流式标准管中。
② 离心 500 rpm 15min，将上清（富血小板血浆）转到另外三只流式标准管中。
③ 离心 2500 rpm 3min。吸去血浆，用与血浆等体积的洗涤缓冲液重悬血小板。如果必
要，可用旋涡混合器混匀。
④ 洗涤缓冲液洗涤血小板三次，每次离心 2500 rpm 3min。
⑤ 适量洗涤缓冲液重悬血小板，用血球计数仪测定血小板的浓度，其中正常血样血小板
数为 2000/µl，患者 1 的血小板数为 6000/µl，患者 2 的血小板数为 7000/µl（稀释浓度）。
⑥ 每个含重悬血小板的流式标准管分成两管，A 管为检测管，B 管为阴性对照管，共 6
只管。正常人血样分别取 250µl 于两只流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为 5
5
×10 。 患者 1 血样分别取 80µl 于两只流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为
5
4.8×10 。患者 2 血样分别取 70µl 于两只流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为
5
4.9×10 。
\
⑦ 将上述六只流式标准管，于 A 管均加 5µl Goat F（ab ）: Anti-Human IgG（Fc Sp.），
\
B 管均加 5µl Goat F（ab ）2IgG。
⑧ 室温，避光孵育 15min。用洗涤缓冲液再洗一次，方法同步骤 4。
⑨去上清，加 0.5ml 洗涤缓冲液重悬，上机分析。结果见图 2-2-4。

阴性对照样品

正常人样品

42
 患者样品

图 2-6-1 血小板抗体的检测结果
（患者样品散点图的细胞群和直方图的峰均显著右移）

四、全血中活化血小板检测：
活化血小板表面会出现一些新的标记。主要的有两个：PAC-1 （活化的 IIb/IIIa）和
CD62P （P-selectin）， 它们是对临床有用的活化血小板标记。此外还有 CD31 （PECAM）
和 CD63 （a lysosomal antigen）两个活化标记，并已在临床应用。血小板活化研究的全
血标本收集要求使用 19 号（或更大）针头，开始吸出的 2ml 血注入试管（或弃用），然后
将后续血液轻轻注入另 1 个试管。
（1）血小板特异性膜糖蛋白检测 先对全血中的血小板膜糖蛋白进行免疫荧光标记，将血
小板与血中其他细胞分开。根据血小板特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地
识别血小板。
（2）活化血小板的标志物检测 活化血小板与静止血小板相比，膜上某些糖蛋白常发生显
著变化，成为活化血小板的检测标志物，如 CD62P 和 PAC-1 等。应用这些特异性糖蛋白制
备的荧光单抗，便能在全血中特异性地识别活化的血小板，血小板膜糖蛋白已被深入研究，
表 2-6-1 显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面
表达主要有 GPIb，GPIIb，GPIIIa 等有限的几种。

表 2-6-1 活化血小板 CD 单抗简介

CD 单抗 代表性单抗 识别的膜糖蛋白
CD36 5F1，CIMeg1，ESIVC7 GPIV
CD41 PAC1，7E3，PBM6.4 GPIIb/IIIa 和 GPIIb
CD42a FMC25，BL-H6，GR-P GPI
CD42b PHN89，AN51，GN287 GPI
CD61 Y215，CLB-thromb/1 GPIIIa
CD62 CLB-thromb/6，RUU-SP1.18.1 P-selectin 或 GMP140
CD63 RUU-SP2.28，CLB-gran/12 GP53

（3）全血法双标记检测活化血小板的染色方法：如 CD62p-FITC/CD42b-PE
① 采血枸橼酸盐或水蛭素抗凝；
② 10μl CD62p-FITC 加 10μl CD42b-PE,再加 5μl 全血（样本管）；
10μl IgG1-FITC 加 10μl IgG1-PE,再加 5μl 全血（对照管）；
轻轻混匀，室温孵育 15min；
③加 2-3 ml PBS（1% PFA）终止反应，上机以 SSC-LOG/CD42b-PE 圈定血小板检测分
析

五、流式细胞术检测血小板的注意事项：
（1） 抗体的选择：选择 CD workshop 中的单克隆抗体。因为单克隆抗体反应特异性高，
非特异性结合少。但由于血小板富含 Fc RⅡ(CD32,FcⅡ受体)，而 Fc 受体对不同抗体亚类具
有不同亲合力，所以在亚类选择上，对于人的抗体以选择 IgG1 为好。
（2） 抗凝剂的选择：肝素尽量避免用；EDTA 在室温 20-25℃时其抗凝效果与枸椽酸盐无
差别，但在 37℃时，EDTA 就会影响蛋白结构及剌激血小板活化。

43
 （3） 标本的采集：一般采少量外周血，收集在玻璃容器或塑料容器中，采血中避免组织
液流入血液中；防止气泡产生；并使用大号针头（如 18 号）。尽量减少化学、物理的激活因
素对血小板的活化作用。标本的放置温度以 15-25℃为宜，4-10℃以下血小板的外形发生改
变。
（4） 抗体标记物的选择：我们知道，FITC 和 PE 标记是最常用的在 488nm 激发下作为
双标记使用的试剂，PE 的荧光强度比 FITC 强。因为在用单色测定中 CD62p 和 CD63 在静
止血小板上均为弱表达，检测这两个抗原时用 PE 标记为宜。而当 CD62P 和 CD63 配合一个
高强度表达的抗原 CD41、CD61 或 CD42b 作为双标记时，CD62p 和 CD63 却宜使用 FITC
标记。
（5）样品固定：先固定样品可减少血小板的体外活化，但先固定可能破坏一些蛋白质结
构，增加非特异染色；因此，除作体外剌激血小板活化研究和不能及时处理标本外，均应先
标记后固定。固定剂使用 0.5-1.0%的多聚甲醛。
（6） 缓冲液：PBS（0.01M,pH7.2）+BSA 在孵育和洗涤过程中为首选。但当在分析血小
板活化过程中洗涤时，宜用 Tyrodes 缓冲液，因为该缓冲液中含有 Mg++和葡萄糖，可能减
少血小板的体外活化。
（7）仪器的设置：首先利用微球进行仪器光路和光电信号的控制，使仪器保持一个稳定、
灵敏的状态。数据采集后，散射光和荧光均使用对数放大，调节散射光电压，使细胞群分布
在中央。调节荧光电压，使样品继发荧光强度落在对数值 1 内，荧光补尝可用荧光微球或用
双色标记单抗做（如 CD4-FITC/CD8-PE）。标本至少分析 5000 个细胞，而且最大流速不宜
超过 1000-1500 个细胞/s。
（8）数据分析：在活化血小板（CD62p、CD63）等少量表达抗原的检测中，阈值的设定
一般是使非特异性染色的比例控制在 1-2%的范围内，但要对非特异性染色进行正确的设定
依靠仪器的敏感度及试剂的质量。当测定的抗原本身为高表达时，要判断抗原表达的高低度
时，需要依据平均荧光强度为宜。

第七节 造血干细胞（CD34+细胞）的检测

外周血现已广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建所需血
干细胞（Hemotopoietic Progenitor Cells HPC）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用自体
移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来
源有着以下优点：易采集、对供者无需全身麻醉、减少了采集后并发症的发生、受者造血系
统重建快、费用低及住院时间缩短或可部分或全部在门诊完成操作等。发现 CD34 抗体可鉴
别造血干细胞，并成功地应用流式细胞仪定量检测造血干细胞。正常人外周血中干细胞数量
只占所有有核细胞的 0.1%。自从发现、纯化、标记抗 CD34 单克隆抗体开始，使流式细胞
定量检测在外周血或骨髓中的 CD34 阳性造血干细胞成为了可能。CD34 抗原存在于各种祖
细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮细胞上也有表达。CD34 阳
性细胞运用 SSC 与 CD34 双参数流式散点图来检测。证实 CD34+细胞计数是决定干细胞采
集时间的有效方法。使流式细胞仪定量检测 CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中
造血干细胞数量的有效和精确的工具。有工作发现 CD34+/CD33+双阳性细胞数量与早期移
植成功有相关性。同时又注意到骨髓中提取的 CD34+/CD38-阴性的细胞在 IL-3，IL-6 和
GM-CSF 刺激下能够形成最原始的集落；随着 CD38 抗原的增加，CD34 阳性细胞形成这种
原始集落的能力下降。在 CD34+细胞中，CD34+/CD38-表型的细胞占 1.0%左右。随后又发
现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数
CD34+细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。

44
 计数 CD34+细胞主要有 Milan 方案、ISHAGE 方案及 ProCOUNT 方案，前两者均为双平台，
后者为单平台。所谓双平台法是指先用流式细胞术检测待测样本中 CD34+细胞的百分比，再
用血细胞计数仪测定样本白细胞总数，两者乘积为样本中 CD34+细胞总数，这样的方法结果
可能来源的误差有两个，即流式细胞仪的误差和血细胞计数仪的误差。单平台法是指同时测
得 CD34+细胞的百分比及绝对数的方法。ProCOUNT 方案是用事先加入已知数量的荧光微球，
以此作为内参，换算出 CD34+细胞的绝对数，这样能对 CD34+细胞进行精确计数，缺点是成
本较高。流式细胞仪计数 CD34+细胞百分比和绝对数量的方法存在较大的变异性,其原因在
于:(1) 不同的分析方法导致结果误差。一些小组已经尝试把方法标准化,如单色分析的
Milan 方案和双色分析的 ISHAGE 方案。但这些方法亦非尽善尽美。Milan 方案由于只使用
CD34-PE 单色分析,不能有效排除非特异染色造成的干扰；而 ISHAGE 方案的数据处理中忽略
了 CD45dim/-的造血干细胞。ProCOUNT 方法结果均低于以往 ISHAGE 等方案的测定数值,主要
是因为采用了核酸染料、CD34-PE 和 CD45-PreCP 三种试剂染色并进行多色分析,精确确认了
造血干细胞,充分排除了非特异染色、细胞碎片及血小板的干扰。(2) 传统的流式细胞仪造
血干细胞计数采用的是双平台方法，研究表明双平台绝对计数法在不同实验室间的变异性很
大,这种变异可能是由于不同血细胞计数仪的误差所致。(3) 在造血干细胞计数时,多采用溶
血洗涤法,常导致样本处理过程中细胞损失,也在一定程度上影响了实验结果的准确性。

图 2-7-1 健康中国成年人外周血 CD34+造血干细胞绝对计数参考范围

一、CD34 检测方案标准化

1、“米兰”方案
第一个广泛应用的干细胞计数方案是由 Istituto Nazionale Tumori in Milan 的 Siena 等人
创立的米兰方案（Milan Protocol）。在此方案中，需准备 3 管 50 ul 的血样或 leukapheresis
样本（如白细胞计数小于 150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中 1 管留出不
作染色，1 管加入 15ul 的抗 CD34 和 CD33 抗体，第 3 管则加入 15ul 的抗 CD2/CD19 抗体
（计数 T、B 细胞）。细胞在 4℃下避光孵育 25 分钟，之后加入红细胞溶解液。孵育 15 分
钟后加入不含钙、镁离子的 PBS 洗液，1500 rpm 离心 7 分钟洗涤，如果红细胞溶解不彻底
则可重复溶解过程。弃上清后细胞可在 4℃保存并于一小时内上机检测。在光散射参数中分
析所有细胞，设“门”选定所有白细胞（排除碎片），并设立一“门”C 信号和 CD34 阳性
表达加以区分。CD34 弱阳性细胞一般不分析。见图 2-7-1。
目前有很多“米兰”方案的改进版，分别从：运用不同的 CD34 抗体、不同的溶血技术、
加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用 CD45 抗体或其他核酸染料来更方便地鉴
别白细胞等方面进行改进。

45
 散射光图 同型对照 CD34+细胞检测

图 2-7-1 米兰方案检测外周血的 CD34+细胞

2、ISHAGE 方案
Sutherland 于 1994 年在它的研究使用与以方案相似的手段分析，随后此方案被 ISHAGE
收录作为推荐方案使用，旨在确立一个普遍通用的、可排除实验室中或实验室间差异的方案。
这个方法是由“门”不断累加来完成的。第一个“门”是基于 CD45/SSC 双参数图上的；通
过对其设“门”可去除红细胞、碎片、和聚集物，这些干扰在造血细胞样本中尤为多见，特
别是在样本使用溶血-免洗法处理后。通过此步骤也为以后计算 CD34 阳性细胞比例提供了
可靠的分母（总白细胞数量）。在 R1“门”中，最少要包括 75 000 个细胞，并在 R4“门”
要计数超过 100 个 CD34 阳性细胞。

图 2-2-8 CD34+细胞的检测（D、E、F、G 为实验样品；H、I、J 为对照样品）

（D、E、F、G 为实验管；H、I、J 为同型对照）

46
 （ ）

图 2-7-2 ISHAGE 方案 CD34+细胞检测结果

将通过 R1“门”获取的细胞显示在 CD34/SSC 双参数散点图，在此图中设立 R2“门”

并调节其位置包含所有 CD34 强阳性或弱阳性的并 SSC 信号弱及中等的细胞。建立一
CD45/SSC 双参数散点图，将以上 CD34+细胞显示于其中；在其中设 R3“门”去除 CD34+
颗粒中的聚集血小板、淋巴细胞和单核细胞。将 R3“门”中圈定的细胞显示在 FSC/SSC 图
中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞“门”R4 中，通过 R4 要去除比淋巴细胞小的
颗粒。（注：如何确定 R4“门“的位置呢？方法如下：在 CD45/SSC 双参数散点图中设立
R5“门”圈定 CD45 强阳性且 SSC 低信号的淋巴细胞群体，将 R5“门”中的细胞显示在
R4“门”所在的 FSC/SSC 双参数直方图中，根据其中的淋巴细胞的位置调节 R4“门”，确
定 R4“门”在 FSC 和 SSC 轴上最小值的最低范围。）在脐血标本中，会出现 CD45/CD34
双阳性的血小板集聚颗粒，但它们的侧向角散射光弱于真正的 CD34+细胞，可被处于幼稚
淋巴细胞位置的 R4“门”排除。最终在 R4“门”中读取 CD34+干细胞计数的数值。此时
如检测 CD45/ISOTYPE 双染的阴性对照，在 ISHAGE 方案设门分析，在 R4“门”中几乎不
见非特异性染色颗粒存在。如在某些情况下 R4 出现非特异性染色颗粒，则在样本计数时要
从 R4“门”减去非特异性染色的细胞数。
对于此方案有一争论，是否所有 CD34 特异性染色的颗粒 CD45 都是弱表达。为了解决
此疑问，在仪器调节和设“门”方面又作了改进，两个独立的直方图被加入上述的四图型方
案中。在第 1 个直方图中增设 R5“门”来精确圈定淋巴细胞：CD45 强阳性且 SSC 低信号。
并将这些细胞显示在第 6 个 FSC/SSC 双参数直方图中。据此可确定 R4“门”的圈定幼稚淋
巴细胞最小范围（第 4 个直方图为第 6 张的拷贝）。这样就能最大限度地去除血小板、未溶
解的红细胞、和其他碎片。这张直方图还可以确定 FSC 的预值设置是否适当，FSC 和 SSC
的电压设置是否足够。因为在此图中要确保 CD45 阳性的最小淋巴细胞能够适当地在
FSC/SSC 图中显示出来。建议最小淋巴细胞的 FSC 参数强度在 1024 线性坐标上，位于 200
左右的位置上。当 FSC/SSC 的电压及阈值都设置完毕后，调整第 1 直方图中 R1“门”的位
置，使其包括所有 CD45 弱阳性和阳性颗粒。R1“门”在 CD45 坐标的下限，则根据以下直
方图来确认：建立第 5 张 CD45/CD34 双参数直方图，根据 CD34 阳性颗粒的 CD45 表达的
最小值建立十字门，确保所有 CD34 阳性 CD45 极弱表达的细胞全部在 CD45 设定界线的左
侧；然后根据此图的 CD45 界线位置确定 R1“门”的最小值。
CD34+细胞百分比检测可通过对白细胞决对计数转换成 CD34+细胞绝对计数。在原有
的 ISHAGE 方案基础上，在第三或第四荧光通道中检测已知数量的标准微球便能达成以上
目的。这样就能使无法定量的单平台流式细胞仪变为能直接绝对计数干细胞的精确仪器。
ISHAGE 方案完全兼容使用 7-AAD 荧光染料进行样品活性检测，这样就能在样本中绝对定
量计数有活性的 CD34+阳性细胞。这一点对临床上在检测抽取时间过长的样本时十分有意
义。

47
三、ProCOUNT 分析 CD34 细胞的方法
ProCOUNT 是 三 色 直接荧 光 标 记快速 计 数 CD34+ 细胞 的 自动 计 数 系统， 它 包 括
ProCOUNT 试剂盒与 ProCOUNT 自动获取分析软件。

1、ProCOUNT 原理及方法：
软件先获取 5μΙ样本，用此数据在 FL1（核酸染料）-SSC 设一个实时的“门”，去
除碎片，并在此界限设定阈值，此“门”亦用于对照管，故对照管在实验报告图上无显示。
然后软件获取 1000 个微球，再按选定的收获界限收获细胞。
由于 CD34+细胞相对含量较低，流式细胞学上的特征与其它细胞群体亦有相似之外 ，
所以需要一个利用已知祖细胞特征的多参数设“门”策略，通过“门”的集合或逻辑“门”
来有效地除外如粒细胞、单核细胞、碎片等不需要的细胞群体。这种分析方法利用细胞颗粒
度（SSC）、核酸染料表达（FL1）、CD45 表达（FL3）和 CD34 抗原表达（FL2）的特点
帮助区分祖细胞与其它细胞群体。图 2-7-3 为 ProCOUNT 试剂盒所有的多参数设“门”方法。
首先确认微球群体，因为 CD34 细胞太少，需依与其它细胞群体关系设定 CD45“门”：以
单核细胞群确定“门”SSC 上限，以 10%低 SSC 粒子确定右限。此“门”去除 CD45 强阳
性细胞。单核细胞还用于 FL2-FL3 和 FL1-FL2 散点图辨别 CD34 细胞群的分界。因碎片已
在获取是用全阈值去除，故所有非微球粒子均被认为是有核细胞，CD45 计数不包括 CD45
阴性细胞。前两步（ ）通过核酸染料（FL1）去除细胞碎片，除外所有 CD45（FL3）
染色较强的细胞，从而确定祖细胞的位置。同时，不属于祖细胞的高侧向角散射光（SSC）
细胞群体亦被排除在外。由此可在 FL1（核酸染料）和 FL2（CD34）的双参数散点图中清
楚地看到祖细胞和其它细胞群的区别。围绕祖细胞群体设门，定量微粒可以完成绝对数的后
续步骤。

图 2-7-3 ProCOUNT 方法分析 CD34+细胞

（绿色细胞群：非 CD34 细胞；红色细胞群：CD34+细胞；蓝色细胞群：绝对计数微球

2、ProCOUNT 质控：
（1） CD34 管与对照管有核细胞绝对计数差异≤21%对照管有核细胞绝对计数（主要
是控制加样误差与试剂误差）；
（2）对照管 CD34“门”中最大细胞数（控制非特异染色）；对照管 CD34“门”中最
大细胞数≤10%或≤4/μΙ或≤5%CD34 管 CD34 细胞绝对数；
（3）CD45/SSC“门”中%最低 FSC 的细胞去除后，CD34 绝对数应显著改变；
（4）CD45/SSC 门向下，向左，向右变小 10 道左右，CD34 绝对数不应显著改变（检
验 CD45/SSC 门设定。

48
四、DNA/RNA 染料/CD34-PE/CD45-PC5+定量荧光微球检测
DNA/RNA 染料在 FL1 中检测，用来识别所有有核细胞，在流式细胞仪分析时作为圈定
白细胞的基础。采用标准 ISHAGE 方法进行 CD34-PE/CD45-PC5 染色分析，绝对定量微球
BD 机器在 FL4 通道内检测，Coulter 机器可在 FL3 通道内检测。

1、样本准备
（1） 验证移液枪的准确性。可用去离子水作为标准品（吸取 100ul 的去离子水=1mg），
吸取后放在精确的称量器称量以检测吸取量的准确性。通常新鲜的样本比较容易分析，固建
议样本保存时间要小于 48 小时。冷冻保存的样本不推荐使用。标本需混匀但不可形成涡流。
（2）标本量的准确吸取将关系到整个实验的精确性，因此要使用反向吸取法。使用移
液枪时，将吸样按钮
打二档轻微地吸取微球，后将按钮推至第一档将微球排出，留下残余液体在枪头内弃用。由
于第一次吸样时，Tip 是干的，会导致部分样本粘附在管壁上；固建议在吸样时，先将 Tip
头在样本中吹打几次后再吸取样本。在每个检测试管中加入 100ul 的标本。
（3）在相应的试管中加入单克隆抗体。轻轻混匀后室温下避光孵育10分钟。室温下加
入100ul Cal-LyseTM(Caltag code #’s CAS010 and GAS-010S-100)；混匀后避光室温下孵
育10分钟；加入1ml去离子水（室温下），混匀孵育5分钟。
（4） 在上机检测前，人工仔细将Perfect Count微球混匀30~45秒钟（避免形成涡溜）。
使用相同的移液枪及加样方法在已溶血的样本管中加入100ul的微球（微球量与样本量相同）。
（5）在上流式细胞仪检测前，将待测管附上盖膜充分混匀30秒后上机。
2、仪器设置
（1） 以下的程序是对于多色染色标本来调节仪器各项参数并建立相应的检测方案。
首先检测未染色（含标准微球）的已溶血样本，用来设定前向角散射光（FSC）的阈值或敏
感度。检测微球无须对 FSC 和 SSC 探测器进行额外的调整。Perfect-Count 微球能在 FSC/SSC
双参数散点图及在 FL1，FL2，FL3 和 FL4 中检测到。
（2） 在 FSC/SSC 双参数散点图中设立一“门”，包含所有白细胞亚群和二群微球。
3、数据获取
为了取得精确的数据，至少要收集 1000 个以上微球，同时计数相应的细胞数。
4、结果分析
（1） 在 FSC/SSC 双参数散点图中建立“门”A 或 R1 圈定所有微球（A，B 两种），
如图 2-7-4 之左图。在 FL2/SSC 双参数散点图中显示 A 或 R1“门”中颗粒。如细胞所染荧
光在 FL2 中对微球有干扰则可选用 FL1、FL3 或 FL4 荧光通道。新建“门”B 或 R2 圈定所
有微球，同时确保去除所有碎片。如图 2-7-4 之中图。
（2） 在 FL2/SSC 双参数散点图中显示 B 或 R2“门”中的微球。新建“门”C 或 R3
和 D 或 R4 根据两种微球在 FL2 中不同的荧光强度分别圈定微球 A（FL2 弱荧光）和微球 B
（FL2 强荧光），如图 2-7-4 之右图。
检查仪器的统计数据与微球说明书的参数是否一致。注明微球最后的计数数量。

49
 图 2-7-4 DNA/RNA 染料/CD34-PE/CD45-PC5+定量荧光微球检测造血干细胞

（3）建立新“门”圈定所要分析的细胞群体。注明所有分析细胞最后的计数数量。
（4）计算目标细胞的绝对数量，-可根据以下公式来计算细胞群体的绝对数量：

流式细胞仪细胞计数数量
细胞绝对数量（每微升细胞数）= ×流式细胞仪微球计数数量
已知每微升微球数量

五、CD34 计数的质量控制：
在 CD34 计数检测中有众多因素影响着计数的准确性。这些因素可通过以下操作步骤来
去除这些影响：① 尽量减少对样本处理步骤；② 使用适当标记的抗体；③ 选择适当的阴
性和阳性对照标本；④ 收集足够的细胞数来降低变异系数；⑤ 采用标准设“门”和分析方
案。但以上任何一条都没有国际上通用的标准，很清楚我们需要为 CD34 干细胞计数设立一
个广泛同意的标准来减少其中的变异性。现将一些标准总结如下：

1、样本准备
Ficoll 淋巴细胞提取液来富集单个核细胞，经常会得出不精确的评估数据；单个核细胞
分离操作会导致外周血中 26%的、骨髓中 21%的、采集品中 5%的 CD34+细胞丢失。现改用
对全血进行溶血来去除红细胞。

2、溶血剂
不同溶血剂都能使 CD34 阳性细胞明显地与阴性群体相区分

3、样本问题
血小板可能会与 CD34+或 CD34-细胞结合影响精确计数，因为聚集的血小板可能会与
CD34、CD45 抗体微弱结合，但可通过巧妙的设门方案将其去除

4、CD34 抗体的选择
不同荧光素标记的 CD34 抗体能与 CD34 抗原的 I、II、III 类位点结合，CD34 的不同抗
原位点可根据其对不同的蛋白水解酶的敏感性来区分。使用 III 类位点特异性抗体能最大限
度地提高检测的敏感度。现普遍推广使用与 III 类位点结合的抗体，这些抗体能有效地与多
种荧光素结合如：FITC、PE、PerCP、APC 和 PE-CY5。

5、阴性对照
如何选择一个恰当的阴性对照，一般选用同型免疫球蛋白作为非特异性染色的本底。
但在 CD34 抗体染色的标本中，目标细胞群可能少于总细胞群的 0.1%；而只有目标细胞群
大于 1%时才适合用同型作为阴性对照。另外，采用多参数设“门”技术来区分特异性结合
群体，CD34+细胞同时也表达 CD45；在 CD45/SSC 双参数图中，CD34+细胞与淋巴、单核、
粒细胞相分离独立成群。这个方案要检测样本中的极少数细胞群时显得格外重要。

6、阳性对照
在临床检测中需要检测阳性样本，据此来检查操作过程是否正确，并可作为质控。阳性

50
标本一般使用各种表达 CD34 抗原的细胞株来制备。如能够制备出抗原染色稳定、适用面广、
储存方便、使用效期长的质控品，能减少实验室间与实验室中变异的实验技术。今后或许可
使用流式标准微球来达成此目的。

7、样本获取
进行 CD34 干细胞计数时，由于 CD34+细胞一般只占单个核细胞的 1%，固可将其视作
泊松分布曲线，如要得到一个变异系数为 10%左右值，就要采集 100 个阳性细胞；采集的
细胞数量要根据 CD34 细胞的比例来决定。一般每份样品收集 50000 至 75000 个细胞进行分
析，才能获得一个比较精确的结果。

8、数据分析
要检测阳性细胞需要进行双参数或多参数分析，现有很多分析方案可用于此目的；其中
一些是基于原来米兰方案修改而来，它是通过 CD34/SSC 设“门”去除细胞碎片、红细胞和
聚集物；阳性颗粒需要满足：CD34 阳性表达，SSC 信号较弱，细胞独立成群。有学者使用
7-AAD 染色去除死细胞，用 CD14 去除单核细胞的方法来分析。首先设门选取 7-AAD 阴性
的细胞，并将其显示在 CD34/CD14 双参数图中并从中去除单核细胞；在此方案中，可将
CD34+细胞再次显示在 CD34/SSC 图中分析并与相应的同型对照作比较。随后对于以上方案
又有修改，将 CD45 替代 7-AAD 设立白细胞“门”，然后进行分析。

散射光图 右限：CD14+细胞 R3：CD34+细胞 R3：同型对照

图 2-7-5 用 SIHON 方法分析 CD34+细胞

第八节 白血病细胞免疫分型

国际上白血病的诊断手段发展迅速，从单纯的细胞形态学发展至今已形成了形态学
(Morphology，M) 、免疫学(Immunology，I)、细胞遗传学（Cytogenetics，C）以及分子生
物学(Molecular biology，M)的综合诊断，尤其是各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体的
研制成功使白血病细胞的免疫表型分析成为可能。单克隆抗体与流式细胞仪的结合，更能在
短时间内对大量细胞进行多参数分析，使一些形态学检测难以解决的问题获得满意的答案。
从 70 年代起，由法美英 7 位学者提出的 FAB 白血病分型方案将急性髓系白血病（AML）
分为 7 个亚型，M1-M7。其中 M1 原始细胞型占 10%，M2 原始细胞伴成熟分化型细胞占
40%，M3 早幼粒型占 10%，M4 粒单细胞型占 15%，M5 原始单核细胞型占 10%，M6 红
白血病占 5%，M7 巨核细胞型>5%。急性淋巴细胞白血病（ALL）分为 B –ALL 和 T –ALL，
其中 B 系又分为前 B、普通 B 和成熟 B 细胞型，T-ALL 预后都很差。流式细胞术为白血病
的免疫分型提供了较好的手段，且为临床诊断、治疗和预后观察提供了确切的指标。

51
一、标本的收集、保存和处理：
分型标本可用 EDTA K2 或 K3 或不含防腐剂肝素抗凝后的外周血或骨髓。不同抗凝剂的
选择视实验不同需而定。如选用肝素抗凝的标本适宜用来做遗传学分析，而用 EDTA 抗凝
的标本则可保持细胞较好的形态。胸水或脑积液等标本无须抗凝。对于在中心实验室检测的
标本，同时要对新鲜标本制作涂片。
如标本须送往他处检测，标本需在 24 小时之内在室温条件运送。如怀疑为 Burkitt 淋巴
瘤或白血病和脑脊液标本则需及时处理。对于保存时间超过 24 小时以上的（如 24~72 小时）
标本建议要做细胞活性检查，如胎盼蓝染色。对于做免疫分析的标本，其细胞活性度应在
80%以上。对于长时间保存的标本还要注意可能会出现一些弱表达抗原丢失情况。另对于要
保存 24 小时以的标本，可在其中加入适当细胞培养物（如 RPMI1640） 。
全血或骨髓标本可不用提取单个核细胞，通过溶血步骤便可上流式细胞仪检测；这可简
化实验步骤但同时也增加了免疫分型的危险性， 如有可能受 HIV 感染等。标本可用以 NH4CL
为主低渗溶血试剂来溶解红细胞；该种试剂可最低限度地降低细胞的丢失率。在溶血过程中
要注意过长时间溶血可引起细胞的 FS 和 SS 信号的改变，从而丢失某些细胞群；溶血时间
不够则会导致红细胞溶解不充分而混入一些碎片造成不正确的检测结果。
流式细胞仪不仅可检测细胞表面的抗原，通过运用商业破膜固定剂，还可在流式细胞仪
上检测细胞胞浆或细胞核抗原。但并不是所有的破膜固定剂性能都值得信赖，特别是在检测
胞浆内抗原时。特别要注意确认试剂是不会影响细胞光散射信号；这样就能同时检测细胞表
面膜和胞浆/细胞核抗原。要注意到，有些破膜固定剂只适合检测细胞核抗原,如 TdT，但并
不适合检测胞浆内抗原。有一项专门对比评测了四种商业破膜固定剂的报告指出：FACS
Permeabiliazion solution (Becton Dickinson),Fix and Perm cell permeabilisation kit (Fix and
Perm Caltag), Optilyse B lysing solution (Immunotech)和 Permeafix (Ortho)对细胞光散射信号
影响都很小。Fix and Perm 和 Permeafix 两种试剂对于检测核酶 TdT，胞浆内抗原 CD3、胞
浆内免疫球蛋白所得出结果与荧光显微镜下得出结果相一致。
阴性对照（同型对照）的处理方法与标本处理方法一样。当检测细胞是经分离后的单个
核细胞时，要加入免疫球蛋白阻断 FC 受体，而对于全血样本或骨髓则不需要。检测胞浆内
抗体对于诊断急性白血病和偶见的源于浆细胞的淋巴细胞疾病有着重要的意义。这是因为许
多髓系或淋系的标志性抗原只出现在胞浆内或在细胞分化的前期；如 CD3 是 T 细胞要标志
物，CD79a 是 B 细胞的标志物，MPO 是髓细胞标志物。过去检测细胞内抗原只有通过对载
有固定的单个核细胞载玻片上或将全血、骨髓样本涂片进行免疫荧光染色后，用荧光显微镜
进行检测或通过免疫组化方法。现在可以通过流式细胞进行检测，其简单的样本处理过程、
可最小化人为主观因素，因而可得出一个精确的结果。

二、单克隆抗体的选择：
（1）急性白血病免疫分型单标记抗体的选择
流式细胞检测常用的单克隆抗体均为异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）及 PerCP
标记的直标抗体。B 淋巴系统单抗有 CD10、CD19、CD20、CD22 等；T 淋系单抗有 CD2、
CD3、CD5、CD7 等；髓细胞系统（髓系）单抗有 CD13、CD14、CD15、CD33 等；干细胞
及巨核细胞系单抗有 CD34、CD41、CD61、HLA-DR 等。这些抗体对于各系白血病的诊断
价值的积分见表 2-8-1。

表 2-8-1 各种单抗诊断白血病的积分
分 数 B系 T系 粒单系 巨核系 红系
2 m/cCD22 m/cCD3 MPO CD41 血型糖蛋白 A

52
 cCD79a m/cTCR cCD13 CD61 HbF
1 CD19 CD2 mCD13 CD36 CD71
CD20 CD5 CD33 CD36
CD23 CD8 CDw65
CD10 CD7 CD11b/c
0.5 TdT CD4 CD14
HLA-DR CD1a CD15
CD117

（2）急性白血病已有双标记抗体或自己组合双标记抗体：
CD3/CD19：区分 T 系和 B 系；
CD10/CD33（CD20/CD13）：区分髓系、B 系或诊断混合型白血病；
CD41：巨核系标记
CD34、HLA-DR、CD9：与上述抗体结合使用鉴别未分化型急性白血病；
MPO（髓系过氧酶）：胞浆染色，用于 M0 之诊断；
GPA/CD36：可用于 M6 的诊断（GPA+CD36+为早期红系细胞，GPA+/CD36-
为成熟红细胞）
另 T 系尚应做 CD7、CD4、CD8 等检测；
髓系应作 CD14、CD15（M4 或 M5 时阳性）
巨核系可加作 CD42a、CD42b。

(3) 白血病免疫分型常规抗体使用方法：
① 先 做 四 组 标 志 物 初 筛 ： CD45-PerCP/IgG1-FITC/IgG1-PE ； CD45-PerCP/CD5-FITC/
CD7-PE；CD45-PerCP/CD10-FITC/CD19-PE；CD45-PerCP/CD13-FITC/HLA-DR-PE；
② 当结果确定为髓系白血病时，再加做 CD45-PerCP/CD33-FITC/CD34-PE；CD45- PerCP
/ CD14-FITC/CD15-PE；CD45-PerCP/CD41-FITC/CD61-PE，确定是 M1-M2，M3 还是
M4-M5，M6-M7；
③ 当结果确定为淋系白血病时，再加做 CD45-PerCP/CD20-FITC/CD22-PE 和 CD45-
PerCP/ CD4-FITC/CD8-PE，确定是 T 或 B 淋巴细胞性白血病。

三、免疫表型分析检测程序：

（1）细胞表面抗原检测的染色方案：
① 取 20 单克隆抗体与 100µL 抗凝血，共同混合置室温 20min；
② 加溶血素 1500µL，置室温避光 15min，2500rpm 5 min；
③ 弃上清，加 1500µL PBS，混匀，2500rpm 5 min；
④ 同上操作 1 次，上仪器检测：以 CD45-PerCP/SSC 设门，观察每群细胞的免疫表型；

（2）细胞胞浆内及细胞核内抗原检测的染色方案：

① 在试管加入染膜外抗原单抗或阴性对照，在每一试管中加入大约 1×106 细胞。混匀

后，避光孵育 15 分钟。
② 室温下加入 100ul 的试剂 A,避光孵育 15 分钟。
③ 用 3mlPBS+0.1%NaN3+5%FBS 洗涤 1 次，300~500g 下离心 5 分钟去上清。

53
 ④ 加入 100ul B 液和相应的膜内标记抗体或阴性对照。
⑤ 混匀后，在 2~8 度下孵育 20 分钟。3ml PBS+0.1%NaN3+5%FBS 洗涤 1 次。
⑥ 300~500g 下离心 5 分钟去上清，用 0.5mlPBS+0.1%NaN3+5%FBS 重悬
⑦ 上机分析。

四、仪器分析与结果判断：
标本经 CD45 荧光单抗标记后，在 SSC vs CD45 图中可将白细胞与血小板及红细胞碎片
相区分，此时就可设门选定细胞分析。在分析表达很弱的抗原时如 CD34，为了获得一个准
确的结果，对 CD45 阳性细胞数目是有要求的。然而对 CD45 阳性细胞的具体数目每个实验
室采取的标准各不相同，范围从 10×103 至 10×106。当采取 CD45 设门检测时，要计数 CD45
阳性细胞的比例，以保证有足够的细胞用来分析。以下实验采取 CD45 设门检测很有必要：
CD34 干细胞计数；分析在多发性骨髓瘤中的异常浆细胞或其他浆细胞疾病；检测数量很少
的细胞群体或对于溶血失败的标本。在常规检测中，如 CD3/4/8，NK 则不需要使用 CD45
设门。表达分化的阳性细胞≥20%时为阳性表达，根据各种单抗诊断白血病分型的积分，各
型白血病的诊断标准见表 2-8-2：

表 2-8-2 急性白血病的免疫学系列分型
系 列 积 分
类 型
B系 T系 粒单系 巨核系 红系
1.单表型
纯 B-ALL >2 0 0 0 0
纯 T-ALL 0 >2 0 0 0
纯 AML 0 0 >2 0 0
纯 AML-M6 0 0 ≦2 ≦2 >2
纯 AML-M7 0 0 ≦2 >2 ≦2
2.单表型为主
My+B-ALL >2 0 ≦2 0 0
My+T-ALL 0 >2 ≦2 0 0
Ly+AML ≦2 ≦2 >2 >2 >2
T+B-ALL >2 ≦2 0 0 0
3.双表型/双克隆型
T/B >2 >2 0 0 0
T/M 0 >2 >2 0 0
B/M >2 0 >2 0 0
4.未分化型
AUL ≦2 ≦2 ≦2 ≦2 ≦2
注： My+： 髓系抗原阳性 Ly+：淋系抗原阳性

五、白血病免疫分型的临床应用
流式细胞术进行白血病免疫分型，其抗体组合的多少要根据分析目的和对疾病所表达的
特异性标记来确定。如果检测的目的仅为得出论断结论，则只需要选用的急淋或与慢淋相关
特异性抗体组合便诊断出多数病例。理想状态是在标本管中分别加入二种或三种不同标记的
抗体，另需在每管中加入一不同标记的设门抗体用来衡定分析某一群细胞。

54
1、急性白血病：
只有少数抗体可被认为有系别特异性，且都是胞浆内染色，他们是：髓系胞浆内MPO，
B细胞系胞浆内CD22和T细胞系胞浆内CD3。现在MPO与CD3或CD22双标试剂已商业化，可
直接购买试剂盒。在诊断急白过程中，必须将细胞固定后检测以上指标。实验表明，Fix &
Perm固定破膜剂在检测以上指标（MPO，CD22，CD3，TdT，κ / λ免疫球蛋白轻链，和
µ重链）时所得结果最为可靠。用固定破膜剂检测胞浆内抗原适用于以下情况：
① 不表达细胞系特异性抗原，但细胞表达了通常可确诊的抗原。举例说明，当病例为
MPO阴性的急性白血病时，细胞可同时表达三种髓系抗原，CD33，CD13和CD65s，这些指
标都提示为病例为髓系白血病（AML）。但要注意的是，在一些急淋病例中也会出现CD33，
CD13和CD15但缺失表达CD65s的情况。在MPO阴性病人中表达CD117也支持髓系白血病诊
断，因为急淋伴CD117表达的情况十分罕见。对于MPO阴性的病例还要注意是否伴红细胞
白血病或巨核细胞白血病的可能性，因为这会改变对疾病预后情况。CD34，HLA-DR或TdT
这些标志物不具有系别特异性，它们通常被用来评估细胞的成熟度。在此必须注意的是如运
用破膜剂来检测AML病例的TdT的表达，需使用直接荧光标记的TdT抗体来检测。

②CD11b和CD24在检测髓细胞成熟度方面非常有用。正常人的单核细胞系或单核系的
白血病细胞（通常CD14+）或髓系白血病细胞（CD11b+AML，通常CD14—）一般表达
CD11b+/HLA-DR+。髓系细胞的成熟度，如：骨髓中的中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒
细胞外周血中的成熟粒细胞通常可通过CD11b阳性且HLA-DR阴性情况来加以区分。在早幼
粒细胞白病中，HLA-DR和CD34阳性的肿瘤细胞如不表达CD11b则表明细胞比较幼稚且
CD24也为阴性。CD24表达于绝大多数的正常髓细胞，包括早幼粒细胞而然在急性髓系白血
病细胞或早幼粒细胞白血病细胞上不表达。正常或异常的单核细胞都表达相同的CD24。
③有些病例的标本量有限，这时可采用只有系别特异抗体和其他一些重要标志的精减分
型方案来进行分析。比如对于精减过的B系ALL甚少要包括CD10和胞浆内u这两个具有预后
意义的重要指标；精减过的AML分型方案则要包括CD11a作区分APL（阴性）与NK样AML
的有效指标。
④ KOR-SA3544 抗原检测的临床意义 在正常人外周血中仅表达于粒细胞表面,在淋巴
细胞、红细胞、血小板上不表达。在急性白血病中，KOR-SA3544 单克隆抗体主要与 Ph1 阳
性急淋患者反应，在培养的细胞系中，KOR-SA3544 与 Ph1 阳性 ALL 细胞系反应（5/5），及
时 11q23 易位的白血病细胞系（3/11）。在淋巴细胞白血病中，KOR-SA3544 与所有 Ph1 阳性
急淋患者反应（26/26） ，与部分普通 ALL 反应（5/38），1 例 11q23 易位的早前 B-ALL 反应，
但不与外周血淋巴细胞反应。正常成熟的粒细胞也强表达 KOR-SA3544 抗原。在髓系白血病
中，KOR-SA3544 仅在 FAB-M2 中有部分表达（16/56），和明显的 MDS 转变来的白血病。除此
之外，KOR-SA3544 即不在其它类型白血病中表达，也不在慢粒急变时表达。KOR-SA3544 识
别白血病细胞系膜上 1 个 90Kda 的抗原，KOPN-57bi。在正常骨髓中没有发现 CD19+
KOR-SA3544+细胞，而 Ph1 阳性 ALL 对两种抗体的反应非常强。KOR-SA3544 的应用，不仅用
于诊断 Ph1 阳性 ALL，也可用于检测缓解期微小残留病。

2、慢性白血病：
对于慢性淋巴细胞白血病，分型的主要目的是区分是T系或B系。其次要检测B系细胞是
否表达表面免疫球蛋白轻键，可通过B系特异性抗原CD19与κ和λ轻键抗体来检测；但在
检测中需注意要去除由细胞与血浆的免疫球蛋白结合的非特性染色。
对慢性髓细胞白血病，免疫分型可及时发现处于慢性期的异常细胞。因为大部分幼稚细
胞CD34阳性，固建议对于慢性期病人运用CD34作为设门单抗进行检测。当出现原始细胞危

55
象时，则需运用急性白血病分型方案来分型。
如果要研究新白血病亚型或有预后价值的标志物，可采用更为精细的分型方案来分析样
本，方案可用来研究样本是否有系别混合，是否表达某粘附分子或一些其他的标志物。如果
要检测病人经化疗后的微小残留病灶，则以上检测都需进行。如尽管发现急淋细胞表达髓系
抗原在疾病的预后方面没有意义，但该现象可作监测病人进入临床缓解期后残留的白血病细
胞的有力工具。

六、流式细胞术白血病免疫分型的注意事项：
1、如检测标本内混有正常细胞和异常细胞，结果解释需结合临床指征和细胞形态学检测。
在报告细胞标志物结果时，在考虑到许多免疫标物并非有严格的系别特异性。如 CD7 虽是
T 细胞系的标志物，但它也能在一部分的 AML 病例中表达。
2、 对于不常用的单抗或不常检测的免疫标志物，需要做阴性对照或阳性对照，以此来检验
单抗的效价和溶血步骤。这个过程在起用新的单抗或仪器新校准后或有新的技术被运用必须
被执行。阴阳性对照可使用已知表达或不表达某一标志物的白血病细胞或正常细胞。标本中
的正常细胞也可用作内在对照。在工作量高的实验室和对于意义明确的单抗需要有阳性和阴
性的正常范围值。
3、 在做流式细胞仪检测时，尽量使用直标抗体。每个实验室要制定相应的抗体的浓度和相
应的溶血步骤。抗体滴定可在阴性或阳性标本上进行。当然，如有生产厂商的说明，则可依
据说明书来操作。
4、在进行免疫分型分析之前，操作者要接受相关的培训。
5、 对于某一抗原阳性的标准现还没有统一标准，但通常在急淋细胞中表达超过 20%的白
血病细胞阳性或慢淋中大于 30%的白血病细胞阳性便可报告该抗原阳性。虽然这些标准有
很大的随意性，但在许多实验中运用。在某些情况下，标志物在肿瘤细胞或白血病细胞上表
达的意义大于在总单个核细胞上表达。典型情况是 CD5 在慢淋中的 B 细胞表达和 Kappa
和 Lambda 在小群 B 细胞群体的表达。
6、实验室要经常做质控程序。

七、急性白血病微小残留病的检测
白血病微小残留病(minimal residue diseases,MRD)，是指在白血病经诱导化疗获完全缓
解后或是骨髓移植治疗后，体内仍残留有少量白血病细胞的状态。用一般形态学的方法已难
以检出白血病细胞的存在。这些残存的细胞可能成为白血病复发的根源。故称为白血病微小
残留病。微小残留病变的流式细胞术检测方法包括 DNA 异倍体法和免疫表型分析方法，前
者灵敏度较低，只有三分之一的 B-ALL 和不到 10%的 T-ALL 及 AML 的患儿会出现异倍体白
血病细胞,而后者敏感度可达 10-4 。

1、流式细胞术免疫表型检测 MRD 的原理

白血病免疫表型分析结果表现为白血病相关表型系列抗原交叉表达、抗原表达不同步、
抗原过高过低表达及异常蛋白表达。B-ALL 白血病细胞免疫表型结果：CD19 -100%
CD19+CD10- 88.9% CD34- 94.4% HLA-DR-88.9% CD13- 33.3% CD33- 11.1% CD5 –0%
CD7-0%；ANLL 白血病细胞免疫表型结果：CD19-13.2% CD2-7.7% CD7-22.0% Ly-AML
-57.1%。CD7+AML 主要为 M1、M2、M4、M5，以 M1 为主，46.7%。CD19+AML 主要为
M2、M5，分别为 15.8%及 25.0%。57.1%的 AML 无淋系抗原表达。与治疗前比较表达相同
抗原的细胞占所有细胞的百分率即为 MRD。
2、微小残留病检测的意义：

56
 （1） 早期判断药物治疗效果；
（2） 评估恶性细胞数，预期白血病复发；
（3） 骨髓移植时，评估移植物的质量；
（4） 判断恶性细胞是否侵犯其它器官。
第九节 定量流式细胞术

一、细胞表面分子的定量分析

传统的流式细胞分析方法仅提供了关于细胞表达抗原频率的信息，通过多个细胞表面抗
原的多参数分析，可以将细胞分为各种亚群。阳性群体是指抗体荧光表达高于阴性对照的一
群细胞，通过这种方法，可以很容易地计算不同细胞群的含量，通常报告设门内的阳性或阴
性细胞的百分含量；如使用已知体积和含量的参考微球，还可以报告细胞绝对计数和平均荧
光强度。近来研究显示，除了检测表达抗原的细胞出现频率，还有必要进行细胞抗原表达密
度的检测。尤其是一些细胞抗原表达量不一致时，就需要用一个标准方法来检测细胞标志表
达水平。这一群细胞的荧光表达常常表现为从阴性到强阳性的连续变化，典型表现如活化相
关抗原：CD38、CD69、HLA-DR、CD25、CD122、CD95 的检测，它们的变化常用强阳性、
弱阳性来表示。但是，这种定性表示会随仪器的不同、实验室不同而有所变化。而使用细胞
荧光定量技术，即测定每项个细胞上荧光分子的绝对数量，再换算为细胞抗原表达量，就可
以将细胞荧光强度检测标准化，从而统一不同仪器及不同实验室的检测结果。流式细胞仪最
初即是针对定量特定细胞群的数量而设计的，然而其真正迅猛发展开始于 20 世纪 90 年代，
在短短十几年内，定量流式细胞术已广泛地应用于医学临床实践。
定量流式细胞术（Quantitative FCM,QFCM）即是通过检测标准微球的荧光强度获得标
准曲线，通过标准曲线（或方程式）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反映在
某种生理病理条件下待测细胞出现的微细改变，对临床疾病的研究，诊断、及治疗等有重要
意义。QFCM 可分为两种，一为特定细胞群的绝对计数，如 CD4+T 细胞绝对计数；另一类
为细胞上特定抗原的表达数量，如血小板上 CD62p 抗原的表达量。前一种较为简单，仅另
需已知浓度的荧光微球即可，但仅适合定量在细胞上表达量较一致，且表达量较高，使得阳
性区与阴性区能够明显区分的抗原，如 CD3、CD4、CD8、CD19 等；后一种方法是目前最
常用、最客观，也是最具临床应用价值的定量技术。

10 4

10 3

10 2

10 1

10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD3 FITC

图 2-9-1 CD4 细胞阳性百分比的传统检

测方法

57
 图 2-9-2 CD4 阳性细胞的定量分析原理

1、相关术语：
（1）相对荧光强度(Relative Fluorescence Intensity，RFI)：指荧光强度的相对值，表示为
流式直方图（Histogram）上的荧光道数(Channel)。
（2）等量可溶性荧光素分子（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome，MESF）：指
在荧光分子的标准溶液中，用比重法所测得的荧光分子的绝对数。该标准溶液的环境、如
pH 值、离子强度等均固定，且没有使荧光分子淬灭因素存在。因此，应用 MESF 时，可以
用一种标准参数来衡量各种荧光分子的荧光量。
（3）每个蛋白结合的荧光分子数（Fluorochrome/Protein，F/P）：指每个蛋白分子上所结
合的荧光分子数，在流式细胞术中通常表示每个抗体分子所结合的荧光分子数。如 FITC 的
F/P 一般为 3～10，PE 的 F/P 一般为 1。
（4）抗体结合容量（Antibody Binding Capacity，ABC）：指细胞上结合抗体数量。此值
可通过 MESF 与 F/P 的比值计算得出。
2、染色细胞的荧光分子的选择
每一个标准微球上都标有已知数量的 PE 分子，因此，可以使用流式细胞仪检测 PE 染
色的细胞，灵敏测定细胞荧光强度。PE 荧光非常亮，且不会淬灭，因而它是非常理想的细
胞荧光分子定量试剂。
3、BD 公司推出的——QuantiBRITE 系统：包括
（1）QuantiBRITE PE 微球——一种水溶性小球，内含标记了定量 PE 分子的标准微球，
由四种不同 FL2 荧光水平的群体组成；QuantiBRITE PE 微球：它是一个由 4 种不同 PE
标记水平不同的标准微球组成的水溶性小球。在流式细胞仪上，根据 PE 分子的数量，进行
FL-2 标准曲线测定。已知 PE 分子和抗体结合量，就可以由 PE 分子数量计算出每个细胞上
结合的抗体量 ABC）。
（2）QuantiBRITE——CELLQust 软件（3.1 以后版本）中的定量标准而测定并计算 PE
分子荧光定量的标准曲线；
（3）QuantiCALC——流式细胞仪分析软件，报告每个细胞结合抗体量(ABC)。
4、QuantiBRITE PE 微球的荧光分子含量的确定：
（1）使用一种荧光测定方法来检测每个微球上结合的 PE 分子数：在荧光仪上检测已知
含量的 PE 和 PE 标记的标准微球上的荧光强度，确定标准微球上的 PE 分子数。通过滤光镜
去除光散射的影响，并适当的校正微球对 PE 荧光的影响。
（2）使用碱性磷酸酶：PE 结合物，即酶活性与已知量 PE 的关系来校正荧光方法得到的
微球荧光分子数。这种 PE 结合物与微球结合，通过检测已知数量微球的酶活性，可以计算

58
出每个微球上的 PE 含量。这种方法不受微球的影响。流式细胞仪检测表明，此二种方法检
测结果一致。
另外，通过染色细胞来校正荧光方法得到的微球 PE 荧光分子数。外周血单个核细胞
（PBMC）与 CD4-PE 反应，通过荧光仪直接检测染色细胞，或通过结合曲线的 Scatchard
分析，确定每个淋巴细胞上的 PE 分子量。这两种方法得到的微球荧光分子数结果接近，在
流式细胞仪上测定的结果相差在 10%以内。所以这种方法可以独立、准确地标定荧光分子
定量用的标记 PE 的标准微球。
5、具体检测方法：
QuantiBRITE PE 标准微球由含叠氮钠和 5%BSA 的 PBS 缓冲液配制而成，适用于
Lyse/No Wash 试验。获取设置时，阴性细胞处于最左边，四组标准微球在阳性区域顺序分
布。但是，只要保证所有 4 组微球完全按比例分布，也可以采用其它的获取设置。在流式细
胞仪上进行检测时，QuantiBRITE PE 标准微球和标本应使用同样的仪器获取设置。FSC
与 SSC 因为不影响荧光检测，可以进行更改。
（1）定标：CELLQuest 中的荧光分子定量功能 QuantiQuest，可以通过计算将 FL-2 与 PE
分子数拟合为线性关系 y=mx+c。由直方图分析得到标准微球的线性荧光强度，再与该批
QuantiBRITE PE 标准微球给定的荧光分子含量做对数回归，得到标准曲线。
（2）每个细胞的 PE 荧光分子含量：由测量的细胞 FL-2 线性荧光强度和标准曲线计算，
得到 PE 染色细胞上的 PE 分子数。
例如：若细胞的线性荧光强度为 1034，则 log1034=3.015
标准曲线为 y=1.003x-1.677
解 y=1.003x-1.677,
y=4.678=lg (PE copy number)
PE copy number=47, 598 PE molecules/cell
注意阳性细胞不须扣除细胞空白（阴性细胞），报告的 PE 荧光分子数（PE copy number）
已经扣除了标准微球的自发荧光。由于标准微球本身的荧光与阴性细胞群非常接近。因此，
计算荧光分子数时，不需扣除标准微球或细胞的本底。
（3）每个细胞的抗体和抗原数量：如果已知抗体结合的 PE：mAb 比值，就可以由每个
细胞的 PE 荧光分子数计算出每个细胞的抗体结合量。如果 PE：mAb 比值为 1：1，那么每
个细胞的 PE 荧光分子数就是每个细胞抗体结合量。理论上讲，如果已知抗原与抗体结合的
化学计量，就可以确定每个细胞的抗原表达量。如：CD4-PE（Leu-3a,BDIS），实验证明，
该克隆的抗体与淋巴细胞的 2 个抗原位点结合，因此，每个细胞上 CD4-PE 抗体对应 2 倍的
CD4 抗原分子。通常，抗原与抗体结合的化学计量需要实验证明。在 QuantiBRITE 系统中，
计算报告的单位为 ABC，即每个细胞的抗体结合量，间接反映了每个细胞上的抗原表达。
（4）QuantiQuest：CELLQuest 获取分析软件可以进行荧光分子定量试验的定标，由
QuantiBRITE PE 标准得到的标准曲线。QuantiQuest 功能可以由获取的数据文件自动确定
标准曲线的斜率和截距。QuantiCALCl 软件可以根据标准曲线自动分析结果。CELLQuest
软件中有定量获取文件（Qnantitation Acquisition Document）可用来获取 QuantiBRITE PE
标准微球。在某一特定试验中，获取标准微球与样本的荧光及补偿设置必须一致。每项一个
数据文件的线性拟歙发析信息会被 QuantiCALC 软件自动分析。
（ 5 ） QuantiCALC: 该 软 件 用 于 荧 光 强 度 检 测 的 标 准 化 荧 光 分 子 定 量 ， 分 析 由
CELLQuest 软件中的 QuantiQuest 获取的标准曲线及数据文件。传统荧光强度分析常用弱阳
性、中阳性和强阳性表示；而 QuantiCALC 为定量分析荧光强度提供了标准分析方法。也可
以设定 FL-2 的多个界值，由所选择的界值计算每个细胞 PE 分子数，并确定界值间细胞频
率与分布。

59
6、影响 PE 荧光分子定量的因素
（1） 试剂——PE：mAb 荧光试剂结合比率：使用流式细胞仪，由 QuantiBRITE PE 标
准微球的标准曲线分析，得到每个细胞结合的 PE 分子数。已知 PE：mAb 结合比率，就可
以通每个细胞结合的 PE 分子数，进一步得到每个细胞的抗体结合量（ABC）。如果比例为 1：
1，那么，产品 A-F 的荧光含量若均低于 BDIS 抗体，即荧光抗体结合比率低于纯 1：1 结合
的荧光抗体，或还有其它因素导致以上差异，如分析表明，BDIS CD4 PE 抗体绝大部分为 1：
1 与荧光素结合（约占 90%），而抗体 A-F 几乎有等量的 1：1 和 1：2 的荧光抗体。若荧光
抗体纯度不够，就会影响细胞荧光分子定量分析的结果。还观察到，PE 与抗体结合后，PE
有缓慢的分解。抗体 4℃保存 1 年，信号会下降 5%，37℃条件下，PE 会加速分解。
（2）标本制备——固定后染色降低的控制：细胞固定多采用多聚甲醛固定，固定标本的
荧光信号降 30%。在流式细胞仪上做对数分析时不易发现差异；但在做每个细胞的 PE 含量
的线性分析时，结果就会有显著差异。将会显示了两个不同克隆的 CD4-PE 抗体标本固定后，
荧光强度随时间变化而降低。但是，两种抗体变化不同。说明除了荧光猝灭以外，还有其它
影响因素。① Leu-3a Fab PE 抗体染色的细胞，固定后荧光强度减弱较多，是因为该抗体的
亲和力较低；② 可溶性 Leu-3a PE 抗体染色的细胞，固定后 3h 之内，荧光强度基本无变化；
③ 某些 PE 标记抗体（如 CD64，克隆 10.1）染色的细胞，固定后荧光强度非常稳定。
因此，多聚甲醛可导致 PE 染色细胞的荧光信号快速下降，这可能是由于抗原抗体作用
相互干扰造成的，其它荧光抗体也会有荧光强度下降。所以，需要对 ABC 定量分析进行固
定效应的控制。
（3） 仪器：在不同的仪器上，使用 QuantiBRITE PE 标准微球对淋巴细胞的 CD4-PE 荧光
分子数进行了测定。同一台 FACSCaliburh 上的测定结果误差低于±2%。不同仪器之间的误
差则为±5%（5 台 FACSCalibur）。

在细胞生物学研究中，常常要对细胞膜分子、胞内分子或表达产物进行定量/半定量的
检测和研究。但细胞中某些蛋白（如细胞因子、趋化因子、炎症介质等）表达水平较低。对
细胞裂解液或培养上清进行上述蛋白的定量检测，长期以来，采用精度相对较低的传统方式
（如 ELISA、Western Blotting）。而传统方式受灵敏度或特异性的局限，很难准确地检测这
些蛋白。蛋白的定量检测迫切需要新的技术。集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力
学、细胞生物学、细胞免疫学和单克隆技术为一体的革命性的流式细胞术基于细胞膜分子和
胞内分子实现了快速、准确、灵敏的单细胞分析。但经典的流式细胞术必须依赖于完整的细
胞，因而流式细胞仪的应用目前大多还局限在细胞的定型和分选。近年来，科学家们基于芯
片检测原理，利用流式细胞仪作为检测平台，将 ELISA 技术改进和延伸，建立了 CBA 和
LiquiChip 等针对不同研究需要的液相检测技术。

二、Cytometric Bead Array (CBA)：

近年发展起来的 CBA 则是一种将液相系统中待测物结合于类似细胞大小的颗粒上，并利
用 FCM 进行蛋白定量的液相蛋白检测技术。将芯片的概念和流式细胞仪有机的结合在一起的
想法最初被付诸于实践是在 20 世纪 90 年代中期，研究者们将生物分子标记在带有荧光的微
球体上，用这些微球体在液相系统中完成生物检测反应。当时并没有专用的检测平台，于是
所有的检测工作都是利用流式细胞仪来完成，那一段时间的研究无疑为后续的发展打下了坚
实的基础。BD-Pharmingen 公司推出的 CBA，同样也是一个以微球体为反应载体，在液相中
完成反应和检测的系统。检测的原理与 LabMAP 技术相同。整个系统包括了仪器，控制软件

60
和细胞因子检测试剂盒。这里所使用的检测仪器就是传统的流式细胞仪，为了使上样更为方
便，BD 公司开发了与流式细胞仪配套的自动上样系统，可以更方便的从微孔板中自动连续
上样。从传统意义上讲，流式细胞术通过检测细胞表面或细胞内抗原，对细胞进行计数、分
型或分选。流式细胞仪（FCM）仅能对类似细胞大小的颗粒物和荧光颜色进行分析，而对其
他物质（如液相蛋白等）无能为力。而近年发展起来的 CBA 则是一种将待测物结合于类似细
胞大小的颗粒上，并利用 FCM 进行蛋白定量的液相蛋白检测技术。

1、CBA 的作用原理

图 2-9-3 CBA 反应微球探针复合体结构模式图

CBA 由具有不同荧光强度、包被了特异性捕获单抗（Capture Antibody）的多个捕获微

球（Capture Bead）群组成。CBA 的每一微球提供一个针对某一特定蛋白的捕获表面，就如
同 ELISA 板的各个包被孔。加入待测样本后，微球上的捕获抗体就与相应的液相蛋白结合，
再加入荧光标记的检测单抗（Detection Antibody），形成‘三明治’夹心复合物（见图
2-9-3），在流式细胞仪 FL2 通道检测荧光信号就能定量可溶性被检物。可同时检测多种液相
蛋白物质（见图 2-9-4）

Various

Antibody coupled PE label,

Antibody coupled beads,
emitting at FL2 intensity
emitting at distinct FL3
proportional to analyte conc.
intensities

图 2-9-4 CBA 技术反应原理图

2、CBA 技术与传统的 ELISA 相比有下列优点：

（1）CBA 所需样本体积仅为 ELISA 分析所必需样本量的 1/6；（2）CBA 的灵敏度达到
2-7pg/ml，而 ELISA 通常为 20-100pg/ml；
（3）CBA 一致性和稳定性更好，符合细胞因子检
测的国际标准（经美国 NIBSC 的 gold 标准测试） ；（4）对标准品混合物做一次流式检
测，就可得到样本中各种被分析物相应的标准曲线； （5）能避免由于酶联放大技术使信号失

61
真导致的假象； （6）CBA 实验时间比单次 ELISA 大大缩短，而且能提供需要做 6 次 ELISA
才能得到结果。
3、CBA 的技术的操作（.以 BD-Pharmingen 公司的 Th1/Th2 为例）：Th1/Th2 CBA Kit 包
含了具有不同荧光强度的 6 个微球群，分别包被了针对 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α,
IFN-γ 的特异性捕获抗体。上述的捕获微球和 PE 标记的检测抗体混合后，与重组标准品或
待测样本孵育形成三明治复合物。用 FCM 采集样本数据后，BD CBA 分析软件就以图、表的
形式产生分析结果（见图 2-9-5 和表 2-9-1）。

图 2-9-5 TH1/TH2 细胞因子 CBA 检测结果

由于人 TH1/TH2 细胞因子 CBA 中的各种抗体经过优化及严格测试，因此与传统的 ELISA

技术相比，无论是灵敏度、恢复度、稀释线性度，还是特异性和准确性都有了很大的提高。

CBA 检测的灵敏度如下表。

表 2-9-1 细胞因子的平均荧光强度、标准差和灵敏度分析

此外用人 TH1/TH2 细胞因子 CBA 每次仅对一个重组细胞因子蛋白做分析，结果在其他捕

获微球群未发现交叉反应和背景。这表明 CBA 检测具有极好的特异性。

第 10 节 流式细胞术在其他相关指标中的应用

62
一、RNA 含量样品的制备方法

派若宁 Y（Pyronin Y，PY）荧光染色法：PY 是一种硷性的荧光染料，它可与细胞浆、

核仁中的 RNA 进行特异性结合。RNA 的多核苷酸链多为单链结构，而呈现出红色荧光。是
流式细胞术进行单参数定量 RNA 的一种极好的荧光染料，激发波长与 488nm 相匹配，它发
射的波长为 580nm。然而 PY 也可以与解链的 DNA 单链结合。因此，在用 PY 荧光染色 RNA
时，要避免 DNA 解链效应的干扰。
1、试剂配制：
① PY 试剂的配制：PY 1.0g，以 100ml 蒸馏水溶解，配成母液，置 4℃冰箱保存。PY 工
作液：取 1ml PY 母液，加入 1nol/L pH4.7 的醋酸缓冲液 100ml，稀释为 0.01%的浓度。
② 1.0 mol/L pH4.7 醋酸缓冲液的配制：冰醋酸 11.55ml 加蒸馏水至 1000ml；无水醋酸钠
16.4g 加蒸馏水至 1000ml；分别取上述两种液体 255ml 和 245ml，再加入 200ml 蒸馏水即成。
③ 配制 pH7.2 的磷酸缓冲液；
④ DNA 酶消化液的制备：DNA 酶 0.05mg/ml，0.25mol/L 枸橼酸，2.5mmol/L Tris-HCl,调
pH 为 6.0。
2、染色程序：①制备单细胞悬液，浓度为 1×106/ml；②加入 DNA 酶液 0.5ml，37℃，消
化 20 min，弃去 DNA 酶；③加入 0.01%的 PY 工作液 1.0ml ，室温下染色 30 min ,离心沉淀
（800prm,5min）；④去染色液，以 PBS 液洗 3 次， ，再加入 1.0 ml PBS，上机检测。
3、检测分析：用 Cellquest 软件程序获取 20000 个细胞，用 ModiFit LT 软件分析细胞 RNA
含量。RNA 含量用 RNA 指数（RNA Index，RI）表示。在 RNA 直方图上，RI=（被检测
细胞峰荧光道数/正常细胞峰荧光道数）×10，所得的值则为 RNA 指数。RI 为了与 DI 相区
别，又以×10 来表示。

二、蛋白质总量样品制备

测定细胞总蛋白量能够检测一个细胞群体生长和代谢的状态，也可区别具有不同蛋白质
含量。恶性肿瘤时，肿瘤细胞的蛋白质总量往往增加。
1、检测原理：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）是检测细胞总蛋白量最常
用的荧光探针。它是酸性染料，以共价键方式结合到蛋白的带正电核的基上；当以蓝色激光
激发后，发出明亮的绿色继发荧光。绿色继发荧光的强度，与细胞的蛋白质含量成严格的正
相关关系。
2、染色方法：：取 20 mg 异硫氰基荧光素，加 20ml 无水酒精，使 FITC 充分溶解，即为染
色液的原液，保存于 4℃冰箱待用。具体荧光染色步骤如下：① TITC 贮存液的稀释：用
pH 7.4 的 PBS 液稀释成 50μg /ml 浓度的工作液，备用；② 被染色细胞首先用 70%酒精
破膜，10imn ，使 FITC 染料能进入到细胞中；③ 用离心法以 PBS 液洗去破膜剂，离心收
集细胞；④ 再取 FITC 工作液 2ml 加入样品中，混匀，置 4℃冰箱中反应 30 min； ⑤用
PBS 液以 1500prm 离心 5min，洗去染色液，再离心去上清；⑥再加 0.5 ml PBS，混匀，上
机检测。
3、检测分析：用 Cellquest 软件程序获取 20000 个细胞，用 ModiFit LT 软件分析细胞总蛋白
质含量。用蛋白质指数（protein Index，PI）表示。在蛋白质直方图上，PI=被检测细胞峰荧
光道数/正常细胞峰荧光道数，所得的值。

三、网织红细胞样品的制备

63
1、染色原理
网织红细胞是一种未完全成熟红细胞。在细胞成熟过程中，其胞浆中的 RNA 含量逐渐
被血红蛋白所取代，因此，检测红细胞中 RNA 的含量多少，就代表了红细胞的成熟程度。
从而成为检测网织红细胞的重要方法。网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。
溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达 0.20 或更高。急性失
血后 5-10 天，网织红细胞达高峰。2 周后恢复正常。典型再生障碍性贫血病例。网织红细
胞百分比常 0.005。网织红细胞数低于 5×109/L 为诊断再生障碍性贫血的标准之一。网织红
细胞升高：表示骨髓红细胞增生活跃，多见于各种急慢性失血、溶血和治疗有效的各类增生
性贫血，如缺铁性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞性贫血等等，是贫血治疗中非常有价值的监
测指标。网织红细胞减低：见于各种骨髓增生能力低下的疾病，尤多见于重型再生障碍性贫
血等。

2、样品制备
（1） 抽取全血 0.5ml，注入盛有 0.5ml 的 0.1mol/L EDTA 溶液中；
（2） 用微量取液器取 50μlEDTA 抗凝血，置于另一离心管中，加入 Good¹s 缓冲液 5.0ml,
离沉淀 1000 rpm,5min，连续洗 3 次；
（3） 将沉淀细胞加入 1.0ml 枸椽酸钠缓冲液，轻轻振荡悬浮；
（4） 将悬浮液缓慢注入盛有 4ml 0.1%戊二醛缓冲液中固定 15min；
（5） 上 FCM 之前，用 PBS 洗去固定剂，加入 0.5ml 0.01%的派若宁工作液；染色 30min 离
心沉淀去染液，1500 rpm,5 min；
（6） 用 PBS 洗一次，离心 1500 rpm，5min，去上清，再用 PBS 将细胞悬浮，上机检测。
3、检测和分析
运用对数放大的前向与侧向散射光信号来区分红细胞与血小板。要采集足够数量的细胞
进行分析，一般网织红细胞低于总红细胞的 0.5%,最少要采集 50000 个颗粒进行分析以减小
CV 值。建立 FSC vs SSC 双参数直方图，运用对数放大后可设门圈定红细胞。对于检测样
本或对照，在单参数直方图中分析红细胞门中细胞。注意在分析直方图上，主要细胞群体可
能会偏移，这可能是由于成熟红细胞过度染色造成的。检查强荧光表达区域并去除这些强阳
性颗粒，这些颗粒是标本中的有核红细胞着色后形成的。在成熟红细胞与有核红细胞之间设
立适当的线性“门” （高于成熟红细胞低于有核红细胞）统计网织红细胞的比例。如有必要，
设立不同的线性“门”来统计不同成熟度的网织红细胞的百分比。根据荧光强度，还可将网
织红细胞分成低荧光强度网织红细胞（Low Fluorescent Reticulocyte 简称 LFR）、中荧光强度
网织红细胞（Middle FluorescentReticulocyte 简称 MFR）和高荧光强度网织红细胞（High
Fluorescent Reticu1ocyte 简称 HFR）部分。幼稚的网红显示最强的荧光，反之成熟红细胞极
少或没有荧光。

4、临床典型应用
（1）骨髓移植(BMT)：评估 BMT 后的红细胞生成情况，HFR 计数提供了早期测量依据，
同时也比监测单核细胞水平更为精确和实际。
（2）贫血：可将网织红细计数及其分类作为鉴别诊断的初筛指标。
（3）海洋性贫血：地贫以无效造血和红细胞寿命缩短为特点，网织红细胞计数与 HGB
水平变化相反，轻度贫血或非贫血病人，网织红细胞增长可能非常细微以至手工计数察觉不
到，而使用精确的自动计数技术明显多了。
（4）骨髓增生异常综合征（MDS）
一般说来，MFR 在 HFR 之前进入循环，暗示红细胞生成规律性恢复的开始。L.Kuse

64
认为：少量 MFR 可以作为 MDS 化疗后粒系恢复的早期指标，且比 RET 绝对值更敏感。
（5）放疗与化疗：通过流式法网织红细胞分析可获得骨髓增生特别是红系增生及放、化
疗的细胞毒副作用的信息在造血反应中（如叶酸和 VitB12）治疗后或化疗后造血恢复中可
见网织红细胞短暂迅速的增高。当 HGB 下降、组织氧化受阻时，EPO 生成增多，EPO 促使
干细胞向原始红细胞分化，也加速网织红 细胞释放。因此，EPO 增加，HFR 也增多，并伴
有网织红细胞的增多。化疗后骨髓 EPO 功能恢复早期 HPR 增多比网织红细胞总数恢复早，
这种反应时间的不同体现了 EPO 与 HFR 之间的密切关系。末梢血网织红计数优于白细胞计
数和血小板计数分析骨髓造血状态。
（6）抗贫血药疗效观察：网织红细胞可作为疗效观察指标。凡是骨髓增生功能良好的病
人，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在 1 周左右可百家高峰，贫血严重，网织红细
胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。贫血病有在抗贫血治疗过程中，如果网
织红细胞不见升高，说明该种治疗无效或骨髓造血功能障碍。因此网织红细胞计数是对贫血
病人经常随访检查的项目之一。如缺铁性贫血铁剂治疗有效时，网织红细胞明显增多，随后
红细胞及血红蛋白逐渐增高，网织红细胞下降，这种网织红细胞反应，可被作为抗贫血治疗
的疗效判断。
四、外周血 CD4+细胞 CD45RA/CD45RO 的表达
CD45RO、CD45RA 是白细胞共同抗原 CD45 的两类亚型，由 CD45 肽链胞外区氨基端的三
个外显子发生旁路剪接而导致。缺乏三种外显子的同型称为 CD45RO，仅表达外显子 A 的同
型称为 CD45RA。T 细胞表达不同的 CD45 亚型与其功能差异有一定的关系，通常 CD45RO 阳性
T 细胞为记忆 T 细胞（memory T 细胞），CD45-RA 阳性为童贞 T 细胞（naïve T 细胞）。1、
生物学特性：
① 胸腺内细胞：CD45RA-CD45RO- → RA-RO+ → RA+RO-（脐血 T 细胞占 90%）。胸腺
中淋巴细胞成熟进入血液循环的为 CD45RA+（ naïve T 细胞） 。
② 在外周血中，CD4+CD45RA+T 细胞接触抗原刺激后可转变为 CD4+CD45RO+ T 细胞。
③ CD45RA+和 CD45RO+两类 T 细胞分泌淋巴细胞因子的能力不同 。抗原刺激后，
CD45RA+细胞以增殖为主，CD45RO+细胞以发挥效应为主。

2、临床意义：
① 骨髓移植：骨髓移植病人中 CD45RA、CD45RO 的不平衡可持续 4～10 年。CD34+分选造
血干细胞移植与未分选干细胞移植的受体比较，前者外周血 T、B 细胞恢复延迟。移植后最
先两个月，两组病人循环的 T 细胞主要是 CD45RO+细胞。前组移植后 2～3 月，CD45RA+细胞
逐渐增高。表明成熟的 CD34+造血干细胞产生的是 NaiveT 细胞。
② SLE：临床症状出现后短期内多数 T 细胞表达 CD45RA 为静止 T 细胞或者已接触抗原的
CD45RO 弱阳性的早期 T 细胞。然而，随着疾病活动期的延长，CD45RO 强阳性 T 细胞开始增
加。在活动期 SLE 病人中，静止 T 细胞扩增在疾病中的作用胜于记忆 T 细胞的反应。 ③ 葡
萄膜炎：患者房水中 CD4+淋巴细胞百分比明显较外周血高，而 Naïve T 细胞的百分比显著
低于外周血，记忆 T 细胞高于外周血。房水中 Fas 抗原主要表达在记忆细胞上。Fas+记忆 T
细胞可能涉及到葡萄膜炎的致病机理 。
④ ITP：急性特发性血小板减少性紫癜（ITP）患儿比慢性 ITP 患儿和对照组有更高的
CD45RA 和更低的 CD45RO，但是这些差异也可能与年龄有关。
⑤ CD45RA、CD45RO 随年龄的变化：老年人组 CD4+T 细胞表达 CD45RO 超过 CD45RA，而在
年轻组中正相反。

五、外周血 CD4+细胞 CD40/CD40L 的表达

65
 CD40-CD40L 通路是继 CD28-CD80/86 之后受到重视的又一共刺激分子通路。CD40-CD40L
通路在体液免疫中具有重要作用，CD40-CD40L 间的相互作用促进了 B 淋巴细胞增殖，是产
生免疫球蛋白所必须的。CD40 广泛分布于体内各种细胞，主要表达于 B 淋巴细胞，CD40L
主要表达于活化的 T 淋巴细胞上。
1、生物学特性：
① 共刺激因子，传递第二信号。
② 延长 APC 寿命，其机制是通过 CD40L 通路抑制自发 或活化诱导的细胞死亡（AICD），
体外培养也发现，CD40 信号能增强单核细胞和 DC 细胞的生存能力；
③ 分泌诸如：IL-12，IL-1，TNF-α，IL-6，IL-8 等细胞因子；
④ 增强单核细胞对肿瘤的杀伤活性；
⑤ NO 合成。
2、临床意义：
SLE： 正常情况下，CD40L 仅暂时性的表达于激活的 T 淋巴细胞表面，而 CD40L 的持久表
达可使活化的自身反应性淋巴细胞免于调亡，从而导致自身免疫性疾病的发生。SLE 患者血
清中存在可溶性 CD40L，其滴度明显高于对照组和正常人群，且与疾病严重程度相关，肾炎，
高蛋白血症，有中枢神经系统受累者有更高 sCD40L 滴度。

六、Th1 细胞和 Th2 细胞的检测

1、基本概念：
Th 细胞：辅助性 T 细胞，根据分泌细胞因子能力大小，又分为 Th1 和 Th2。
Th1 细胞和 Th2 细胞所分泌的细胞因子及与抗原递呈细胞的相互作用关系见图 2-10-1、
2-10-2、2-10-3。

Th1细胞： 辅助细胞免疫，并介导迟发型超敏反应。
分类标准：分泌细胞因子IFNγ（标志性细胞因子）、TNFβ、IL-2；
其它标记：CD3、CD2、TCR、CD4（通常）、LAG-3；
细胞功能：活化Ⅰ型免疫效应，细胞毒性T细胞、巨噬细胞、NK和K细胞、嗜中性
粒细胞

图 2-10-1 Th1 细胞与抗原提呈细胞的关系

66
Th2细胞： 辅助B细胞产生抗体,主要介导体液免疫。
分类标准：分泌细胞因子IL-4（标志性细胞因子）、IL-2、IL-10；
其它标记：CD3、CD2、TCR、CD4（通常）、LAG-3；
细胞功能：活化Ⅱ型免疫效应，B细胞（IgG1、IgE、IgA）、嗜酸性粒细胞、柱
状细胞、肥大细胞

图 2-10-2 Th2 细胞与抗原提呈细胞的关系

图 2-10-3 Th1 和 Th2 细胞与 Th0\APC 的相互关系

2、检测原理
活化：未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞术很难检测出来，因此在
检测前需剌激活化。活化剌激素为 PMA（佛波脂）+Ionomycin。
抑制分泌：淋巴细胞在剌激素的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。因为流式细胞仪
只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阴止细胞因子的分泌。
确定 CD4+细胞：Th1/Th2 细胞的先决条件是 CD4+T 细胞，因此存在着用 CD4 凤定细胞群
的问题。我们知道，CD4 不仅在 T 细胞表面上表达，而且还在所有单核细胞表面上表达。
因此，单独用 CD4 设门无法将 CD4T 细胞区分开来。实践证明也不能用 CD3/CD4 双参数设
门，因为佛波脂作用下 CD4 抗原表达迅速下调。只能用 CD3/CD8 设门，因为 CD8 不受佛

67
波脂的影响；而且绝大多数 CD3+/CD8-细胞都是 CD3+/CD4+细胞。所以可用 CD3+/C 左细
胞群来确定 CD4+T 细胞群。
3、 检测试剂：(问陈军浩)
PMA：贮存液：PMA 溶于 DMSO，浓度为 0.1mg/ml,-20℃保存；工作液贮存液 1：100 稀释
于 RPMI 1640 或 PBS（无菌，无 NaN3）中,此时为 1μg/ml；工作浓度为 25ng/ml，（取 25
μg/ml）。
Ionomycin：贮存液：Ionomycin 溶于 DMSO，浓度为 1mg/ml,-20℃保存；工作液：贮存液 1：
20 稀释于 RPMI 1640 或 PBS（无菌，无 NaN3）中，此时为 50μg/ml；工作浓度为 1μg/ml,
（取 20μg/ml）。
Monensin：贮存液：Monensin 溶于甲醇，浓度为 50mg/ml,为加速成溶解，可置于 40-43℃
水浴。4℃只少保存 4 个月；工作液：贮存液 1：50 稀释于 RPMI 1640 或 PBS（无菌，无
NaN3）中，此时为 1mg/ml；工作浓度为 1.7μg/ml（取 17μl/ml）。
RPMI 1640：RPMI 1640 含 10%FCS（胎牛血清） ，2mM glutamin,50μg/ml 青霉素，50μ
g/mlsteptomycin 和 100μg/ml neomycin。
抗体：细胞表面标志抗体：CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC
细胞内因子抗体：IL-4-PE，IFN-γ-PE。
破膜剂：可用品牌：美国 Caltag 公司的 Fix&Perm 破膜剂；美国 BD 公司的 FACS 破膜剂。
法国 Immunotech 公司的 IntraPrep 破膜剂。

4、检测步骤：
（1） 肝素抗凝采血；
（2） 取两只试管，分别作茧自缚为阴性对照管（A 管）和测定管（B 管），于两只试管中
均加入 100μl 血液和 100μl PRPIM 1640。
（3） A 管中加和：3.4μl 1mg/ml 的 Monensin 工作液；B 管中加入：5μl 1μg/ml 的 PMA
工作液+4μl 50μg/ml Ionomycin 工作液+3.4μl 1 mg/ml Monensin 工作液。
（4） 37℃，5% CO2 培养箱培养 4-6h；
（5） 混匀，取出 100μl，加入适量 CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC，孵育一段时间， （参
阅抗体说明书）；
（6） 不着破膜剂固定和破膜；
（7） 加入适量 IL-4-PE，IFN-γ-PE，孵育一段时间，（参阅抗体说明书） ；
（8） PBS 洗一次，去上清；适量 PBS 重悬细胞沉淀，上机检测。
注意：细胞表面和细胞内抗原同时检测时，应先标记细胞表面抗菌素原，破膜后再标记
细胞内抗原。Caltag 公司的破膜剂不同于其它公司，其破膜与抗体标记同时进行，大缩短了
操作时间。

5、结果分析
（1） 用 CD4 设门，选定淋巴细胞；
（2） 用 CD8 分别和 IFN-γ建立双参数直方图对第 1 步所确定的淋巴细胞进行分析；
（3） 得出 CD8-/IL-4+（Th2）和 CD8-/IFN-γ+（Th2）细胞百分含量。

七、外周血白细胞 HLA-B27 的表达

HLA-B27 抗原是人类主要组织相容性复合体（MHC）的表达产物，属Ⅰ型 MHC 基因。在

免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应。单核细胞、粒细胞、淋巴细胞表

68
面均可检测到含量不等的 HLA-B27 抗原，以单核细胞表面含量最为丰富。 HLA-B27 抗原与
共刺激分子 B7（CD80、CD86）有类似的组成结构，因而， HLA-B27 抗原的单克隆抗体常与
B7 分子交叉反应。国外于 1987 年首次报告了用流式细胞术检测 HLA-B27 的表达，随后，开
始应用流式细胞术从细胞水平研究 HLA-B27 的表达状况，并作为相关疾病筛选的指标，迄今
为止检索表明共有相关文献 81 篇。国内最早的综述文献发表于 1994 年，致病机理研究发表
于 1998 年（PCR 方法），使用流式细胞术检测 HLA-B27 表达文献发表于 2000 年。

1、HLA-B27 在强直性脊柱炎（ankylosing spondylistis，AS）中的诊断价值

（1） 敏感性及特异性 对于一个随机选择的患者来说，以 HLA-B27 实验发现 AS 的诊断
价值可以通过实验的敏感性来获得，敏感性的定义是患者中阳性结果的比率，AS 病人为
90%~95%（白种人）。特异性的定义是健康个体中阴性结果的比率。当人群 AS 发病为 0.1%
时，人群 HLA-B27 出现频率为 10%，敏感性为 95%,HLA-B27 的特异性为 90.1%;如果人群
AS 发病率升至 1%时，则特异性为 90.8%。
（2） HLA-B27 实验阳性的预示价值 预示价值系指 HLA-B27 阳性患者占 HLA-B27 阳性
人群的比率，如果人群 HLA-B27 出现频率为 10%，发病率分别为 0.1%和 1%，则预示价值
分别为 0.95%和 9.5%。这些数字与流行病学调查发现恰好吻合，后者算出 1%~6%HLA-B27
阳性者患 AS。
（3） HLA-B27 实验阴性的预示价值 指的是 HLA-B27 阴性健康者所占比率，可以通过计
数得出，HLA-B27 阴性者未患 AS 约为 99.9%。
从上述数据资料可以看出，尽管 HLA-B27 实验具有高度敏感性的特异性，但不可用于
论断随机选择的患者是否患有 AS，阳性结果的预示价值在 0.95~9.5%，提示绝大多数的
HLA-B27 阳性者并未患 AS。因此 HLA-B27 不能作为随机选择人群的 AS 筛选指标。
但不患 AS 者的阴性结果预示价值非常高，因为 AS 患者 HLA-B27 阴性机会是非常少
的，这样 HLA-B27 实验在处理随机选择患者的临床实践中具某此价值，阴性结果可被看做
诊断 AS 的排除标准。但是，这是不现实的，因为不可能的随机选择人群中作 HLA-B27 实
验，只有临床上怀疑其患有血清学阴性脊椎关节病变时才作这个实验。因此，对于那些具有
提示血清学阴性脊柱关节病的症状及体症的病例，本实验具有潜在的使用价值。
流行病学调查发现 HLA-B27 阳性伴背痛及强直，AS 的发病率为 22.5%，这个数字与随
机选择的 B27 阳性者的 AS 发病变幻无常为 1%~6%相差悬殊，因此选择背痛及强直者进行
实验提高了发现 AS 的可能性。有些研究者指出，AS 可表现为炎性背痛的临床症状，但没
有 AS 的典型影像特征。在家族调查中，这个临床特征与 HLA-B27 有显著联系，发现
13%~18% B27 阳性的一级亲属，有炎性临床特征而不伴随影像学改变。
（4）青少年性关节炎 HLA-B27 的意义 与成人的 AS 不同，青少年 AS 在发病初期引起骨
骼病变的症状出现较少，可能有 24%的儿童主诉腰椎痛或强直。但是发病初期末梢关节病
变表现明显，青少年 AS 与 HLA-B27 的关系与成年人 AS 的一样，对于已确诊的青少年慢
性关节炎患者，HLA-B27 实验阳性对于提醒医生诊断即将发生的 AS 起辅助作用。但是，
本实验与诊断成人 AS 一样具有相同的局限性，不可以作为诊断标准。
由于 HLA-B27 以共显性方式遗传，故一级亲属 HLA-B27 出现率因是否为纯合体及配
偶 HLA 状态不同而表现为 25%~100%。AS 先证者的一级亲属 AS 出现率预计为 1.3%~11%。
AS 的诊断依据为背部疼痛或强直并出殃有影像学的骶髂关节炎。这类病例即使 HLA-B27
阴性也不能改变诊断，AS 伴 HLA-B27 阴性的患者提醒医生有同时发生牛皮癣及炎症性小
肠病变的可能。当然，亦有 HLA-B27 阴性不伴发皮肤及肠道病变的纯 AS 病例。
HLA-B27 是脊柱关节病病因及发病机制的关键，这一观点已被广泛认同。但是必须清楚，
只有少数 HLA-B27 阳性者患病。目前 AS 的诊断仍主要依靠临床检查，X 线片示双侧骶髂

69
关节炎和脊柱则是最重要的诊断依据。虽然 HLA-B27 实验应用有限，既不能用于疾病确诊，
也不能预见患者的预后，但它以下几个方面将有助于诊断：BD 公司生产的 B27 检测试剂使
用方便可靠。试剂盒由 FITC 标记标准微球一瓶、B27FITC/CD3PE 双标试剂 1 瓶和 BD 溶血
剂 1 瓶组成。
2、 实验方法
① 取荧光素 PE 标记的 CD3 单抗及 FITC 标记的 HLA-B27 单抗 30 ul、EDTAK2 抗凝的全血 50
ul 混匀后室温染色 15min(或 20min)；
② 加溶血剂 2 ml 溶解红细胞(10min)；
③ 1500rpm 离心洗涤除去细胞碎片，加 1%多聚甲醛固定(15min)；
④ 上机测定。在测完标准微球并调节好 FL1 电压后，不可改变 FL1 的设置。通过 CD3PE vs
SSC 设门圈定 CD3 阳性细胞（T 淋巴细胞），检测其 B27 的平均荧光强度。如标本荧光强度
小于标准微球荧光强度则为阴性，相反为阳性。
⑤ 流式细胞仪检测、发出实验报告。(10min)。

图 2-10-2 HLA-B27 细胞表达的检测原理

3、 临床意义
① 强直性脊椎炎患者中 90%以上 HLA-B27 阳性，正常人群中只有 5%～10%阳性。而强直性脊
椎炎由于其临床症状与许多疾病相似而难以确诊，特别在疾病早期。
② Reiter`s 综合症患者中 HLA-B27 阳性率 70%～90%。
③ 银屑病性关节炎患者中 HLA-B27 阳性率 50%～60%。
④ 葡萄膜炎患者中 HLA-B27 阳性率 40%～50%。

八、PNH 的流式细胞术分析：

阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种获得性

造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、慢性溶血性贫血急性发作。PNH
的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。PNH 的临床表现不一，疾病
进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。最近 15 年，在 PNH 的细胞和分子
生物学研究中取得了重要进展，定义了导致 PNH 异常表现的分子缺陷。而使用流式细胞仪进
行 PNH 诊断分型，是 PNH 研究的又一里程碑。使用单克隆抗体和流式细胞仪技术则是发现诊

70
断 PNH 表型异常的重要手段。
使用流式细胞仪可以发现 Ham 实验阴性的再生障碍性贫血病人中存在的少量 PNH 细胞，
这可以将 PNH 分为两种情况： （1）溶血性 PNH，特征是显性溶血性贫血，同时有血红蛋白尿。
值得注意的是，这组病人中，有 50%发生静脉血栓，这是导致病人死亡的主要原因。 （2）再
生不良性 PNH，可以检出 GPI 缺乏的造血细胞，没有显性溶血，但可能有其它症状，如再生
障碍性贫血、白细胞减少症或血小板减少症。

1、检测方法：通过应用 CD45、CD61、CD64 等单抗分别设定血小板、淋巴、单核、粒、红细

胞 III 区、II 区及 I 区细胞的位置（见图）。
（1）阴性对照管：CD55/CD59 相应同型对照
取 3µl 全血，加入 CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC 和 CD45+CD61FITC /IgG2a PE /
CD64TC
（2）阳性对照管
取正常人外周血 3µl 加入 CD45+CD61FITC /CD55PE / CD64TC, CD45+CD61FITC /CD59PE
/ CD64TC
（3）病人检测管
直接将病人外周血 3µl 用 CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC ，CD45+CD61FITC /IgG2a
PE / CD64TC 染色测定各细胞群体 CD55，CD59 的表达情况。

图 2-10-3 通过 CD61、CD45 和 CD64 识别血小板、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞

2、结果分析：见图 2-2-4 及 2-2-5。

71
 图 2-10-4：正常对照分别为红细胞、单核细胞 CD59 和 CD55 的表达情况

图 2-10-5 PNH 病人红细胞、单核细胞有 II 区细胞存在

九、多药耐药基因蛋白表达的检测

1、基本概念
肿瘤细胞的多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指肿瘤细胞在接触一种抗癌药物
后，不但对该药产生耐药，而且还对其他结构和作用机制不同的药物也产生抗药性。1970
年 Biedler 和 Reihm 最先报道了 MDR 现象，他们发现，对放线菌素 D 耐药的细胞，同时也
对多种抗肿瘤、抗生素和植物碱药物交叉耐药。1976 年 Juliano 等发现在耐药细胞中有一种
与耐药程度成数量相关的高分子量细胞膜蛋白，被命名为 P 糖蛋白，因其分子量为 170 KD，
故又名 P170 糖蛋白。肿瘤细胞的耐药性可分为原发性耐药（intrinsic resistance）和获得性耐
药（acquired resistance），前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中，与药物的使用无关；后者是
由化疗药物诱导产生的，即在药物使用前对药物敏感，而在药物应用后产生的耐药。获得性
耐药根据耐药谱不同可分为原药耐药（primary drug resistance, PDR）和多药耐药（MDR）。
原药耐药只对使用过的药物产生耐药，对其他药物不产生交叉耐药，而多药耐药则是由一种
药物诱发，而同时对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐药，导致一些联合
化疗方案的失败。

2、p170 的多药耐药机制
药物对肿瘤细胞的杀伤作用，依赖于进入细胞内的药物浓度。许多药物通过细胞膜进入
细胞，这是个主动的依赖能量的过程，与药物浓度梯度有关。参与此过程的载体蛋白结构的
改变，可导致细胞对药物吸收的减少，细胞内有效药物浓度降低，其后果就细胞对药物产生
耐药性。对氨甲喋呤（MTX）转运的研究认为，耐药性的产生可由于药物与细胞膜结合载
体蛋白的亲和力下降，或者细胞所表达的载体蛋白的数量下降。
P170 糖蛋白是一种由 MDR-1 基因编码的具有 ATP 酶活性的跨膜泵，当肿瘤细胞与抗
癌药物接触时，脂溶性药物按浓度梯度进入细胞，细胞内部有 2 个药物结合位点和 2 个 ATP
结合位点，当药物与 P 糖蛋白结合后，可同时水解 ATP 获得能量，将药物从细胞内泵出，
细胞内药物浓度不断下降，使药物对细胞的损伤减弱直至消失，最终出现耐药。P 糖蛋白对
药物的特异性很小，因此 MDR 细胞能对许多结构和作用机制不同的药物产生耐药。可诱导
P 糖蛋白过度表达产生耐药的药物有蒽环类、长春新碱、柔红霉素、表鬼臼毒素、放线菌素
D 和紫杉醇等，这些药物一般是天然来源的，化学特性上属于疏水性。当这些药物诱导发生
耐药时，即可同时对其他各类药物产生交叉耐药。P170 糖蛋白将药物泵出细胞的原理见图

72
2-10-6。

图 2-10-6 p170 糖蛋白的作用原理示意图

3、MDR-1 基因在正常组织和肿瘤细胞中的表达
P 糖蛋白存在于许多正常人体组织如肝脏、结肠、胰脏、肾脏、肾上腺以及脑、睾丸、
胎盘中。P 糖蛋白并非是一种异常蛋白，而是具有一定的生理保护功能，在细胞的正常防御
中起着不可忽略的作用。在人类所有类型的肿瘤中几乎都能测到 MDR-1，在肿瘤细胞中，
MDR-1 基因的表达与肿瘤细胞的组织起源有关。如果某些组织细胞本来就有高水平的
MDR-1，这些细胞恶变后往往也有高水平 MDR-1 表达，如结肠癌、肝癌、肾细胞癌等。临
床上这类肿瘤都具有原发性耐药性，对化疗的反应性低。如果组织细胞本来不表达 MDR-1
或 MDR-1 水平很低，恶变后往往也不表达或很少表达 MDR-1，如卵巢癌、头颈部癌、肺癌、
膀胱癌等，这些肿瘤的化疗效果效好，但大多会发生获得性耐药。虽然正常造血细胞只有少
量 MDR-1 表达，但是在几乎各种白血病以及多发性骨髓瘤（MM）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）
中，无论是初治的还是治疗过的病例，MDR-1 水平都有不同程度升高，甚至在一些患者中，
有相当高水平 MDR-1 表达。
一般情况下，肿瘤细胞在治疗前就显示较高水平 P 糖蛋白，往往提示预后不佳。MDR-1
阳性病人的耐药性发生率远远高于 MDR-1 阴性病人。在 AML 病人，MDR-1 表达增加常预
示完全缓解率（CR）低，疾病易复发，生存期短。在 MM 病人，如果病人是用 VAD 方案
治疗，P 糖蛋白表达增加往往也提示预后不良。另外，在肾细胞癌、乳腺癌、食管癌等实体
瘤中，P 糖蛋白的表达也与耐药性相关。

第 11 节 流式细胞术参数的质量控制

流式细胞术标本从组织和细胞的获取，抗体的染色和洗涤，到用流式细胞仪采集、存储
和分析数据，并给出报告，牵涉到诸多步骤。每个步骤中均存在着不稳定和不确定的因素，
流式细胞术的质量控制（质控）即监督控制每个步骤中的这些因素，以确保最终结果的准确
性和可重复性。
引起流式细胞术参数可变性的因素可分为四类：流式细胞仪的可变性，标本的可变性，
操作过程的可变性（包括试剂和方法）和数据分析的可变性。
一、流式细胞仪的可变性

73
 在流式细胞仪使用前，需充分了解其状态，每天必需对流式细胞仪进行监测。
流式细胞仪需质控的部件包括：
激发光路(包括激光器，用于将激光聚焦在流路上的棱镜及透镜)
发射光路(包括用于将不同波长的发射光引导至不同的光检测器的透镜合滤片)
电子线路(包括光检测器，高压供给器，放大器，补偿线路及模数转换器，所有这些线路均
用于将光信号转换为电信号，然后再转换为数字，此数字理想状态下与光强度成比例)
流路系统(包括流动室，样品流，进样针和鞘液流，用于将样本细胞正交于光路)。
第一步为仔细校准激发和发射光路，使得细胞在通过激光光线时能被稳定地激发，激发
出的光散射和荧光信号准确地集中于光检测器。校准不好时会导致信号的 CV(变异系数)值
过大，背景光散射(即噪音)过高，最终的表现为仪器灵敏度下降。
对于大多数的临床型流式细胞仪(如 FACSCalibur 和 EPICS XL 等)，仪器操作者自己不
能调整激发和发射光路。然而流式操作者需知道环境温度波动会导致信号水平的减弱和 CV
值及噪音水平的增高。激光的老化也可能引起输出电压的不稳定，对细胞的激发也就相应地
减弱。因激光的强度对于荧光信号的产生通常是足够的(即处于饱和状态)，所以激光器老化
最敏感的标志是散射光信号的减弱，前向和侧向散射光信号会与激光强度同比下降。当激光
信号降低到一定程度，荧光信号也会下降。
光路的校准需在电子线路稳定的状态下，用散射信号和荧光信号的 CV 值均很小的微球
调准。所有检测器的输出均以信号强度(即道数)和信号宽度(即 CV 值)两组数据记录。过去
的流式细胞仪允许用户自行调整流动室和光路，仪使信号强度达到最大，同时 CV 值最小。
新型流式细胞仪不允许用户干预，应用实验室所能做的仅是用流式细胞仪特有的软件分析质
控微球，在某些参数不能达到 “质控标准”时，联系生产厂家的工程师校准和维修。无论何
种仪器，该实验室均应每天认真记录所有参数的道数和 CV 值，并与仪器处于最佳状态时的
数值进行比较，以了解仪器是否正常工作。
第二步是监控所有检测器的灵敏度。对于散射信号检测器， 其“检测阈值”通常是由调
低仪器的阈值(Thresholds/Discriminators)，观察来自标准微球的信号和来自无微球缓冲液的
信号是否能区分开来确定。虽然此法也可用来评价机器的荧光“检测阈值”，但通常的做法是
用区分带弱荧光的荧光微球与无荧光的微球的能力来表示荧光“检测阈值”，具体方法为分析
含有各种荧光强度的荧光微球及 “空白”微球的混合微球，并根据软件设定或用户自定的
“分离阈值”来判定仪器是否能将各种荧光强度区分开来。如果“空白”微球的背景荧光与细胞
的背景荧光相似，可以得知仪器检测在细胞背景荧光之上的荧光的能力。但因为各种细胞的
自发荧光差别很大，因此在实际操作过程中，用“空白”微球来判定检测细胞的灵敏度有时不
太合适。这种方法的主要问题是即使荧光微球的荧光强度明显高于背景水平，但如果机器的
CV 值很高，则灵敏度的判定能力会显著下降。荧光灵敏度实际上受两个独立因素的影响，
即背景光或仪器噪音水平，和荧光激发和检测效率。因此要获得准确的灵敏度指标，必须同
时监测弱荧光微球的信号 CV 值和仪器噪音水平。
第三步是监控仪器电子线路的稳定性。为了能将某个实验室在某天得到的数字结果与其
他实验室在某天得到的结果相比较，必须设立衡量荧光强度的标准，方法为使用含有若干个
能覆盖所有荧光检测器中的所有通道的荧光微球混合物，其中包含若干个具有确定荧光强度
(以荧光等量单位表示)的荧光微球，且这些荧光强度是不连续的，此时要求荧光微球的峰值
与荧光等量单位成线性关系，即仪器的光电倍增管和放大器保良好的线性状态。通过调节检
测器的电压，使荧光微球的峰值固定在某个荧光通道上，并记录检测器的电压，观察每日在
同等检测器电压条件下，荧光微球的峰值是否会发生改变，如改变，有没有超过允许范围(一
般为 + 2SD)
另一种监控仪器电子线路稳定性的方法是使用标准化的荧光强度，以标准化单位报告结

74
果，而不是上述的荧光通道数或相对荧光强度。这样我们可以对使用不同机器和不同检测器
设置的结果进行比较。 荧光强度标准化的最大问题是荧光微球的制备技术，荧光强度单位
的转换方法也并非最佳。不同厂家所生产的荧光微球上的荧光素量(或可溶性荧光素的分子
等量物，即 MESF)不尽相同，即使均为同一厂家生产，不同批号间也会存在差异。另外一
种标准化的方法是使用带已知数目免疫球蛋白结合位点的无荧光微球，这些微球与细胞同时
被荧光抗体染色，然后将细胞的荧光强度转换为每个细胞上的抗体结合数目。此种微球并不
校准荧光强度，而是校准使用的抗体，即特定抗体染色后所得的荧光强度水平可以表示为每
个细胞上结合抗体的数目。需要特别注意的是：1) 微球的染色是通过免疫球蛋白(即抗体)
与微球上的抗免疫球蛋白(即免疫球蛋白结合位点)的结合而完成，而免疫球蛋白与微球的亲
和力通常有别于免疫球蛋白与细胞上的抗原的亲和力，因此两者的等同会存在一些问题；2)
在不同条件下，免疫球蛋白与抗原或其他免疫球蛋白的结合可以是单价的，也可以是多价的，
因此将免疫球蛋白与微球的结合同免疫球蛋白与细胞的结合等同起来，存在诸多变数；3) 上
述两种微球(即荧光微球和非荧光微球)的不稳定性是非常重要的影响因素，即荧光微球的荧
光可能会减弱，非荧光微球表面的免疫球蛋白结合位点可能会减少，均会导致结果判断的失
误。总而言之，目前还缺乏对荧光强度进行标准化的 “金标准”。
因为信号的道数值可通过调节光电倍增管的电压或改变放大电路的电流来改变，因此下
面的几点考虑可能会使我们认为标准化荧光强度是不必要的。1) 如果电倍增管或放大器并
非完全线性，那么处于两端的荧光道数不与原始荧光信号的强度成正比。2) 由于不同颜色
的荧光间存在着 “颜色重叠”，必须通过调节 “颜色补偿” 来消除这种重叠，如果补偿不准，
会导致每天所测得的荧光绝对值不同。而且荧光间的颜色补偿还会因所处介质的不同而改
变。另外，在使用 “串联(tandem)”荧光染料，如 PE-Cy5, PE-TR 等时，补偿不足是非常值得
注意的问题。因这种 “串联”染料的的两种组成部分(“供体”荧光物质和 “受体” 荧光物质)
间的能量转移效率常会发生变化，也就是说两组成部分间的距离可能增大，荧光信号不能很
好地有传至 “受体”荧光物质，导致“串联”染料漏光到其它检测器中，引起颜色重叠的增大。
这种能量转移效率还会因所结合地抗体的不同而不同，与抗体的保存长短也有关系。
一种常用的校准流式细胞仪线性度和检测流式细胞仪灵敏度的方法：
在该方法中使用 Sphero™ Rainbow Calibration Particles (8-peak) (Spherotech Inc., IL,USA,
目录号为 RCP-30-5A) ，这是一种空白微球和 7 种具有不连续荧光强度(由弱至强覆盖了整
个荧光通道)的荧光微球(其发射波谱为 360-650nm，可覆盖常用流式细胞仪的各个检测通道)
的混合微球，微球直径为 3um。首先关掉仪器的所有补偿设置。通过改变光电倍增管的电压
值将图 1 中各荧光检测通道中的第 6 个峰(即 M6)分别调至表 1 中所示的荧光道数。注意
Beckton Dickinson 流式细胞仪与 Beckman Coulter 流式细胞仪的荧光检测器有所不同，前者
的第三荧光检测器(FL3)等同于后者的第四荧光检测器(FL4)，其它两个荧光检测器相同。

Beckton Dickinson(BD)流式细胞仪 Beckman Coulter 流式细胞仪

荧光检测通道 荧光道数 荧光检测通道 荧光道数

FL1 228 FL1 22.8
FL2 614 FL2 61.4
FL3 368 FL3 36.8

记录此时每个峰在各荧光检测通道中所测得的平均荧光强度(Mean
表 2-11-1 RCP-30-5A 微球中的第 6 个峰在 Beckman Dickinson 和 BeckmanRFI)，并填入
Coulter 流式
Spherotech Inc.所提供的 Excel 计算表格中。以表 2-10-2
细胞仪的各荧光检测通道中所应处的荧光道数 是用于分析 FL2 检测通道的表格，

75
 将峰 M1 至峰 M8 在 FL2 检测通道中的 Mean RFI 填入相应的位置，则此表格自动计算
出后面的数值。软件同时以荧光道数(Channel, 总道数为 256)为横坐标，以 MEPE(molecules
of equivalent PE，等量 PE 分子数)的对数(Log)为纵坐标作图，经过线性回归，得到回归方程
(如图 2-10-1)。

表 2-11-2 Spherotech Inc 线性回归计算表格

PEAK Mean RFI Channel MEPE MEPE LOG CALC. RESIDUAL CALC. MEPE
M1 1.79 16.18 74 1.870 74
M2 9.72 63.21 400 2.602 2.639 8.22% 435
M3 25.21 89.70 1200 3.079 3.072 1.81% 1180
M4 71.93 118.84 3800 3.580 3.548 6.70% 3535
M5 222.93 150.28 12000 4.079 4.062 3.04% 11547
M6 614.31 178.46 34000 4.531 4.523 0.73% 33349
M7 2222.58 214.20 124000 5.093 5.107 0.39% 128072
M8 5157.31 237.60 300000 5.477 5.490 5.21% 309008

从该表中可得出比较重要的参数为：
（1） r2：相关系数(r)的平方，用以衡量线性回归的好坏，此值需大于 0.95；
（2） AvgRes%: 平均残差百分率(Average residual percent)，是衡量微球所处在回归图上
所处位置与回归线的靠近程度的重要参数，此值需<5%。如超过 5%，则表明仪器的对数放
大器为非线性；
（3）Logarithmic Decades:表示对数放大器的总体动态范围，其值应在 4.0+0.2;
（4）Blank Threshold: 表示空白微球的 MEPE 值，反映仪器的灵敏度，此值应小于 200。
因此我们可通过上述检测来评价对数放大器的工作状态，即线性度，同时可了解仪器的
灵敏度。如果上述四个参数中的任何一个不在允许范围内，则说明仪器的状态不好，需工程
师维修。
另外，RCP-30-5A 的 8 种微球必须能在 FL1/FL2 双参数直方图中明显地区分开来，否
则表明仪器的灵敏度不够满意。
电子线路中的 “颜色补偿线路” 可通过下面的两个步骤来校准：
用含有 “空白”微球和不同颜色的荧光微球( 如 FITC, PE, PE-TR, PE-Cy5 等)的混合微球来
测试补偿电路。通过对生物样本进行免疫分型检测来验证补偿设置
某些型号的机器(如 Beckton Dickinson 的 FACS Calibur 和 Beckman Coulter 的 EPICS XL)
已经将第一个步骤软件化，即使用其中的软件可自动进行补偿设置。软件可以准确地调整荧
光微球和 “空白”微球的峰信号位置，客观地补偿设置。但通过微球调节所得的补偿设置通
常不适合于生物样本的免疫分型，原因包括荧光微球中荧光素的掺入不同于荧光素标记抗体
与细胞的结合；每个细胞上的抗原量是不同的；使未染色细胞和使“空白”微球处于较低荧光
道数所需的电压值不同。因此在分析生物样本时，需确认或重新调节补偿。
上述质控步骤所得的结果，包括峰值，CVs, PMT(光电倍增管)电压，增益(Gain)，及补
偿值等均需记录下来，并定期对比，计算平均值和标准差(SD)。正常的标准差可通过在机器
处于最佳状态下连续几天多次分析而确定。如果在某一天出现上述的任何参数值超出用户所
设定的标准差限，所得结果需做特殊标记并校准机器。可喜的是，目前 Beckman Coulter 的
流式细胞仪已经配备了自动质控程序，程序可自动记录使用质控微球时所获得的各种参数，
并能自动绘制 “参数表格”和 Levey-Jennings 质控图(如图 2-10-1)，使用户能方便的观察每日
的参数变化，及早跟踪异常情况。

76
 Levey-Jennings质 控 图 例
1.7
1.6

%(百分率)
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1
1 5 9 13 17 21 25 29
日 期

图 2-11-1 使用荧光校准微球在流式细胞仪的第一荧光通道(FL1)所检测到的峰 CV 值。
横坐标为检测的日期，共检测 30 天，总坐标为 CV 值(以%表示)。可见，CV 值每天均会有
所改变，如果某天 CV 值超出允许范围(用户自定或软件设定)，则表明仪器状态不好，需调
试。

其实，最容易引起质控失败的是流式细胞仪流路的紊乱。当仪器一个或多个参数出现质
控失败，首先应检查仪器的流路是否正常，然后再去调整光路和检测线路。液体管路的部分
堵塞即会严重干扰信号，使得背景噪音水平、散射光和荧光信号的 CV 值均明显升高，这些
因素导致从背景噪音中所能区分出的荧光分子数下降，也就是说仪器的检测灵敏度降低。另
外一个引起流路改变的原因为样本的流速。如果样本细胞被过快地压入并通过流动室，样本
的核心区会变宽，导致细胞上的光散射出现差异，信号的 CV 值则相应增大。此外，当样本
通过流动室时的速度过快，在某一时间点，流式细胞仪会同时检测到两个或多个细胞，引起
信号 CV 值的增加。

二、标本的可变性

1、标本的采集和固定方法的质量控制
标本的采集质量直接影响是否能制备出一个合格样品，单细胞样品制备的良劣，直接影
响流式检测精度和实验结果，标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，(1)手术切
除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织；(2)标本采集后要及时固定可
深低温保存，以免组织发生自溶，DNA 降解，而造成测试结果的误差；(3)固定剂要采用对
组织细胞穿透性强的浓度，例如 70%的乙醇固定比 75%以上的浓度固定效果好，高浓度的
乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良，有作者分析研究了
自溶对 DNA 测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随
时间的延长，DNA 信号呈梯度降低，根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检
测质量也有显著的影响，例如细胞 DNA 的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，
醛类固定剂明显影响细胞 DNA 荧光发射强度，补给证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与
核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的 50%~70%左右，
如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择，在不能及时检测又没有低温保存条
件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为
宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使
细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点，如所测抗原物质在细胞内，可以使

77
用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷条件，在一般冰箱(0~4℃)放置即
可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。

2、单细胞悬液制备的质量控制
流式细胞术定量分析是基于单细胞基础上的，这是流式细胞术带来的特殊要求，在应用
流式细胞术中，制备出合格的单分散细胞悬液对流式分析的成败与否是关键的一环，因此，
对于了解掌握人体各类组织的单分散细胞悬液的制备方法尤为重要。
（1）人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织，是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组
织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞的材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分
散状态，它是流式分析最合适的样品来源，全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某
一群细胞为检测，因此检测前须将所测的某群细胞成分分离出来，例如，以淋巴细胞 DNA
定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核心细胞或红细胞去除，对于血小板
的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集。
（2）新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但
对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作，就目前，国
内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法处理，甚至同样组织，用于不
同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题，因此必须根
据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小
的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来，对于实体组织的分散解聚多采用酶
学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的
不同，可选择不同的方法。
① 选择酶学方法时，应注选择使用酶类型的问题，含有大量结缔组织的组织器官，选
择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或胰酶，并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶
剂，消化时间，pH 值，浓度等方面对酶活性的影响，酶学方法分散组织都有一定的应用限
制，特异用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结
果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以
及生产厂家对酶的污染。
② 化学方法往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更
佳。
③ 机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片
多，细胞团块多，在使用机械方法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多
的制样实践经验技术人员来操作。
④ 低渗方法其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是
一个裸核悬液样品，本方法简便，可以改变样品的变异系数，但要避免脱核时间过长，造成
核膨胀碎裂。
以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方
法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨
流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液，获得更好的流式检
测结果。

（3）石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制
石蜡包埋组织用于流式细胞术的定量研究极大的扩大了流式细胞术应用范围，石蜡包埋
组织单细胞悬液制备技术，对于流式细胞术来说是重要技术的进展之一，它推动了流式分析
DNA 含量的广泛应用，该方法的建立，结束了流式只能对新鲜组织定量分析的时代，尤其

78
是对肿瘤的组织，使大量存档的肿瘤标本得以进行流式定量研究，并能结合肿瘤病人预后资
料进行回顾性研究，使传统病理形态学提高到分子病理学的水平，从肿瘤病理学的定性诊断
推进到定量诊断的新阶段。
① 石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织
对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断。
② 切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取 40~50um 厚度的切片是适宜的，
过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检
测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5，10，20，30，40，
50un)对流式分析 DNA 影响，发现较薄的切片造成碎片较多，噪音增加，组方图基线提高，
影响倍体分析的精度。
③ 在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可影响酶的消化活性；检查是否
将蜡脱净的方法是弃去二甲苯(Hedley 强调用 Histoclear，即组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效
果更好)，加入 100%乙醇，如果无絮状物浮起，视蜡已脱净。
④ 梯度酒精(100% 70% 50%)水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态。
⑤ 消化酶液要掌握适当的浓度、pH 值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间
很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破化，在制备石蜡包埋单细
胞时，常规使用 0.5%胃蛋白酶 pH1.5。
⑥ 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的
应用，但仍在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下。
ⅰ 样品中的碎片较多，所测得的 DNA 组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较
宽 CV 会值偏大。
ⅱ 异倍体率减少，由于组方图细胞峰 CV 值较大，一些近于二倍体的 DNA 异倍体峰
被掩盖。
ⅲ S 期细胞百分比不如新鲜组织的 S 期计算精确，S 期细胞的计算偏高，这仍然与 CV
值较大有关。
ⅳ DNA 二倍体标准不稳定，Schutter 等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他
生物细胞 DNA 含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组织细胞 DNA 含量的标
准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞 DNA 荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定，
解决 DNA 二倍体标准不稳定的办法，可将正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准
参照，可减少 DNA 倍体分析的误差，对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石
蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用有外参二倍体样品和肿瘤样品中加入
标准样品(例如鸡血细胞等)。

（4）脱落细胞样品的采集
脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱
落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，例如胸腹水，内
镜刷检细胞，膀胱冲洗液等，这些材料得到的流式检测结果，要小心谨慎的分析解释结果的
生物学意义，因这些材料获得的结果常出现阴性或假阳性结果，因其中的白细胞常有变性，
且样品细胞数量少，制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在 1×106/ml，其杂质碎
片团块重叠细胞应小于 2%以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞 DNA 异倍体的分析样品中，
至少应有 20%的肿瘤细胞存在，(因占主峰 1/5 以上的异倍体峰才可确认异倍体)。

三、 操作过程的可变性

79
 主要包括试剂和方法。单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要，目前常
使用的荧光染料有 EB.PI.DAPI.AO.FITC.PE 等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效
关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光
染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的
校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。

1、 温度对荧光染色强度的影响
在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响，温度升高可造成溶液粘滞性
增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大，使荧光猝灭的可能性增加，这就使荧光分子和其他
分子之间的相互碰撞几率增加，因此，影响了荧光分子发光量子产额，一般认为，温度升高
时，荧光减弱，荧光减弱的百分比称温度系数，就一般荧光物质而言，温度系数大约为 1%，
如果温度在 20℃时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越
强，以致造成完全猝灭，温度在 20℃以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上
保持恒量，因此在荧光测定时要保持染色后的样品适当低温环境下进行，尽可能减少样品的
照射时间，有条件时，应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果。

2、荧光染色的浓度与荧光发射强度有直接比例关系
在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染
料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减
低，这种因染料浓度增大使荧光量子的的产额下降的现象称为浓度猝灭现象，因此在研究浓
度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度
(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓度)浓度造成荧光猝灭原因，主要是缔合分
子形成，缔合分子中的电子共振作用，而消耗了激发分子的能量而参与猝灭作用，实验表明，
当溶液稀释后，荧光染料分子之间的相互作用完全消失时，荧光量子产额最大，荧光强度发
射最强，当溶液浓度增加时，荧光分子之间发生碰撞下降，另一个主要原因由于荧光染料浓
度增加过大时，造成荧光分子不均匀分布，靠近入射光面的吸光强，而进入溶液深层时，光
吸收越少，发出的荧光分子也越少，称这种内滤光效应(Interfilter Effect)，鉴于荧光染料浓
度对荧光强度的最广泛之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光强度定量检测技术是极其
重要的。

3、pH 值对荧光强度发射强度的影响
荧光分子在溶剂中处于离子状态，因此溶液中的氢离子的浓度对荧光强度影响极大，荧
光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有
听斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子的发光量的产额最高，都
有自己合适的 pH 值。

4、其他一些影响强度的因素
像醛类固定剂(戊二醛，甲醛)，可以干扰荧光染料与核酸分子的结合，像溶剂中的一些
不发光的物质(如溴化物、碘化物，氨基酸，硝基苯，铁，银离子等)均可造成荧光的猝灭现
象。
以上影响荧光染色的因素，在 FCM 技术测量某种物质含量时，需对能够影响荧光染色
的因素作仔细的检查，一旦在荧光实验技术过程中出现误差，必须根据一定的条件进行综合
分析，采取相应的校正措施。

80
四、数据分析的可变性
流式细胞仪的检测结果以一长串简单的二进制数字纪录在计算机的文件中，如何准确
的、客观的分析这些数字是计算机软件所应具备的基本功能。使用这些软件首先应该提出特
定的问题，然后在软件的帮助下解决问题，并以流式所特有的形式表达出来。
如果我们的问题是“表达某种蛋白的细胞所占的百分率?”，那么我们在数据分析时首
先应当选定这群特定的细胞，在流式细胞术中称为 “设门(Gating)”。这个过程也成为流
式数据分析中的第一个可变因素。细胞可以根据其特定的前向散射光和侧向散射光特征来设
定，设定淋巴细胞最常用的方法即是如此。然而根据散射光特性来设门是非常主观的。因为
我们至今仍不十分清楚细胞被激活或浸润组织后，散射光特性的改变模式，同时我们不能象
荧光信号一样对散射光信号进行很好的质控。所以目前比较公认的方法是用一个荧光参数辅
助一个散射光参数来进行设门，通常情况下，这个荧光参数来自荧光标记的 CD45 抗体。因
为 CD45 在不同的白细胞亚群，不同的发育成熟阶段的表达量有差异，因此 “侧向散射光
/CD45” 双参数设门方案已被广泛地应用于 CD4 绝对计数时淋巴细胞群的设定(淋巴细胞的
CD45 强表达，侧向散射光较低)和白血病患者骨髓标本中原始细胞的界定(原始细胞上 CD45
弱表达，侧向散射光与淋巴细胞相近)。
数据分析时的第二个可变因素为如何确定阳性细胞和阴性细胞的分界线。通常的做法是
用一个阴性标本作为参照，这就要求准确、合理的选择阴性标本。阴性标本可以是未染色细
胞，也可以是经同型对照抗体染色的细胞(在实际操作过程中，多选择后者)，因此同型对照
的选择是所有可变因素的根源。然而，要找倒非常匹配于实验中所用的每种抗体的同型对照
通常来说不很容易。另外，如果不同实验室所用的阴性对照不同，则他们所确定的阴性细胞
和阳性细胞的分界线也不同，导致所得到的 “阳性百分率” 结果出现差异。即使所用的阴
性对照非常合适，确定阴性/阳性的分界线也是有所不同。有人认为应该将分界线定在假阳
性率(即在阳性细胞区的阴性细胞百分率)为 1-2%处，而有人则认为应在假阳性率为 5%左右
处。如果要检测的细胞抗原表达量较高(如 CD3, CD4 等)，结合的荧光抗体也相应较多，这
样阳性细胞的荧光强度会明显高于阴性细胞，此时采用上述何种分界原则对结果的影响不
大。但如果要检测的细胞抗原表达量较少或很少(如 CD62p，CD95 等)，染色后阳性细胞区会
阴性细胞区部分或大部分重叠，此时分界原则不同，结果会有较大的差异。事实上，在出现
阳性细胞区会阴性细胞区重叠时，尤其对于白血病/淋巴瘤免疫分型，我们应该考虑使用
“阳性百分率”来分析结果是否合适，在这种情况下，我们经常会采用寻找表达异常抗原组
合和异常抗原量的特殊细胞群，以确定白血病/淋巴瘤的类型，而不关心这些特殊细胞的百
分率，因此将细胞的荧光标记强度与带有标准荧光强度的微球进行比较，在此时显得尤为重
要。此外，用流式进行白血病/淋巴瘤的免疫分型，已经从传统的报告数字结果过渡到基于
二维或轮廓图(contour plot)的 “模式识别”，即人们不再关注表达某种抗原(如 CD19,
CD33, CD34 等)的细胞百分率为多少，而是更注重通过多参数分析来确定是否存在异常细胞
群体。虽然室间质控可以保证不同的实验室对统一标本得到相同的结果。但对于白血病/淋
巴瘤的 “模式识别”，因任意两个患者的表现形式均有差别，也就不存在衡量正确与否的
“金标准”，此时室内质控则非常重要，即要保证机器处于良好的状态、使用标准化的试剂
及客观的分析结果。
数据分析的最终质控步骤在于对数据的检验，即以单参数直方图，点图，轮廓图等多种
形式分析比较数据，以确定结果的可靠性。视觉观察图形经常会使我们发现仪器，标本及标
本处理过程中存在的某些问题。此外，数字结果有时可用 “内部一致性”原则来校验。如
在分析 CD4 时，在保证对淋巴细胞的设门标准(即淋巴细胞回收率>95%，淋巴细胞纯度>90%)
的同时，还要保证 CD3+/4+细胞与 CD3+/CD8+细胞之和约等于 CD3+细胞总数，且 CD3+细胞(总
T 细胞)，CD19+细胞(总 B 细胞)及 CD3-/CD(16+56)+细胞(总 NK 细胞)百分率之和近似于淋巴

81
细胞门中淋巴细胞的纯度。另外，因在 CD4 表型分析或绝对计数时，在每个抗体反应管中均
包含 CD3 抗体，所以分析比较每个管中的 CD3+细胞百分率可以进一步对实验进行 “内部一
致性”的质控。

82
 第三章 人体流式细胞参数的正常参考值

一、外周血中各种流式细胞仪检测指标的正常参考值：

细胞表面标志 细胞名称 均值标准差 范围

T 细胞抗原
CD2 总 T 细胞 76.28±7.68 62.5～89.0
CD3 成熟 T 细胞 69.98±5.79 61.1～77.0
CD4 T 辅助/诱导细胞亚群 35.25±5.16 15.8～41.6
CD5 T 细胞（B 细胞亚群） 77.06±7.34 69.5～8.8
CD8 T 抑制细胞毒细胞亚群 25.08±4.34 18.1～29.6
CD28 T 细胞受体共剌激分子 49.59±9.30 39.5～64.8
CD8+/CD28+ 细胞毒 T 细胞 13.22±4.18 8.6～15.5
CD8+/CD28- T 抑制细胞 15.99±5.13 9.9～24.8
CD3+/HLA-DR- 静止 T 细胞 67.10±11.69 55.3～77.1

B 细胞抗原
CD19 全部 B 细胞 11.56±2.54 7.3～18.2
CD20 全部 B 细胞 12.20±2.92

NK 细胞抗原
CD3-/CD（16+56）+ NK 细胞 14.91±4.87 8.1～25.6

单核巨噬细胞
CD14 单核细胞 5.10±2.00

活化细胞表达抗原
CD3+/HLA-DR+ 活化 T 细胞 3.05±1.34 1.2～5.8
CD3-/HLA-DR+ 活化 B 细胞 7.42±3.22 3.0～11.7
CD3+/CD25+ 活化 T 细胞 15.94±3.67 10.1～2.20
CD5+/CD19+ 活性 B 细胞 4.65±1.51 3.1～6.6
CD69 活化诱导分子（AIM） 2.09±0.87 0.8～3.5
CD38 活化 T 细胞 51.07±5.67 42.4～60.0

免疫调节细胞
CD4+/CD29+ T 辅助细胞诱导亚群 16.92±5.35 9.8～26.0
CD4+/CD45-RA+ T 抑制细胞诱导亚群 20.51±3.64 15.0～25.0

其他细胞
HLA-DR MHC-Ⅱ类分子 DR 抗原 10.93±4.51 6.1～17.0
CD45-RA 白细胞共同抗原 CD45 异型 66.99±5.06 59.8～73.7
CD4/CD8 比值 1.42±0.89 0.98～1.94

83
Ⅰ型变态反应介导分子
CD23 IgE 低亲和力受体（FcεRⅠ） 3.19±0.65 1.9～4.4
IgE 膜结合 IgE 1.95±0.89 0.9～3.7

造血干、祖细胞
CD33 髓细胞前体 25.90±33.20 21.3～30.4
CD34 多能干细胞 <0.5 0.1～0.5

粘附分子
CD18 整合素β2 链 53.42±13.35 34.5～75.7
CD29 整合素β1 链 57.63±8.87 40.8～69.0
CD44 细胞外基质受体Ⅲ 98.33±2.39 93.8～99.9
CD49b 整合素α2 链，VLA-2 95.22±6.39 92.6～97.8
CD49c 整合素α3 链，VLA-3 3.80±0.48 3.3～4.7
CD49d 整合素α4 链，VLA-4 84.42±7.89 72.6～93.8
CD49e 整合素α5 链，VLA-5 342.0±4.47 20.8～53.5
CD49f 整合素α6 链，VLA-6 37.50±2.48 32.6～40.9
CD50 细胞间粘附分子-3（ICAM—3） 89.9±5.49 80.1～96.9
CD54 细胞间粘附分子-1（ICAM—1）14.49±2.47 9.2～20.2
CD56 神经细胞粘附分子（NCAM-1）10.84±1.84 7.4～14.4

凋亡相关蛋白
CD95（Apo/FAS） 20.59±5.49 13.0～28.9
FasL Fas 配体 0.55±0.17 0.3～0.8

细胞动力学参数
SPF S-期细胞比率 0.15±0.13
Apo 细胞凋亡指数 0.33±0.26

某些基因编码蛋白表达
CD44V5 粘附因子突变体-5 6.19±1.21
CD44V6 粘附因子突变体-6 5.98±1.53
CerbB-2 4.07±3.00
nm23 肿瘤转移异制基因 85.89±7.99
DCC 80.31±10.11
p16 抗多肿瘤基因 41.32±9.34
p53(V) 突变型 p53 0.80±0.37

84
二、人体细胞 DNA 含量参数的正常参考值

表 3-1-1 人体各种正常组织 DI、倍体、SPF 和 PI 分布

组织 n DI 倍性 SPF(% ) PI (% )
（x±s） （x±s） （x±s）
食管 21 1.00±0 D 10.4±3.0 16.5±4.8
肝 13 1.00±0 D 12.0±4.2 16.5±4.2
肠 39 1.00±0 D 10.6±4.9 15.5±4.0
胃 16 1.00±0 D 12.4±5.4 17.7±5.9
肺 26 1.00±0 D 9.4±3.4 16.0±4.4
乳腺 14 1.00±0 D 12.3±4.9 13.6±4.9
脑 17 1.00±0 D 8.9±5.4 13.4±5.4
腮腺 9 1.00±0 D 6.0±3.9 11.9±5.0
骨髓 15 1.00±0 D 7.0±4.2 11.8±5.2

三、正常人体组织某些基因编码蛋白的表达水平及其它参数

CD44S 粘附因子 37.27±10.61

CD44V5 粘附因子突变体-5 14.46±8.05
CD44V6 粘附因子突变体-6 21.3±13.40
CerbB-2 8.14±3.72
Nm23 肿瘤转移抑制基因 87.00±9.10
DCC 72.00±8.57
P16 多肿瘤抑制基因 86.27±12.86
P53（V） 突变型 P53 1.70±1.29
Apo 细胞凋亡指数 2.66±2.49
SPF S-期限细胞比率 5.21±4.58
CD14 巨噬细胞 18.70±5.00
CTL 细胞毒 T 细胞 11.90±3.80

85
 第四章 实用流式细胞术彩色图谱

细胞膜

溶酶体

中心粒
线粒体
细胞核

高尔基体
内质网
酶原粒
细胞浆
蛋白质
脂质双分
子层

图 4-1-1 细胞结构模式图

流式细胞术是检测细胞各种成分的重要细胞生物学工具。它可以定量测定细
胞膜、细胞浆和细胞核中的各种细胞成分, 还可以研究细胞的各种功能状态（细
胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、吞噬性
等等）。目前又可以定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分。

细胞膜：脂质双分子结构中相嵌多种蛋白质分子——即细胞表面抗原、表面糖
类、表面受体、细胞因子、膜电位、膜结合钙离子、细胞表面电荷等，
这对确定细胞的性质及其功能是十分重要的；
细胞浆：各种细胞成份，包括蛋白质、RNA、各种细胞器中的特殊成分、各
种抗原、基因编码蛋白、细胞因子、细胞浆内钙离子、pH 值等；
细胞核：DNA、RNA、蛋白质、各种基因表达蛋白、抗原蛋白等。

86
(一) 不同流式细胞术分析方法对肿瘤细胞 DNA 含量的分析

1、1 例肺癌患者瘤组织细胞 DNA 含量的不同分析方法

(1-碎片峰，2-凋亡细胞峰，3-DNA 二倍体细胞 G0/1 峰，4-DNA 异倍体 G0/1 细胞峰)

4 4

3 3

2 2

1 1

图 4-1-2 肺癌细胞 DNA 含量的 Modifit LT 分析直方图（左：直方图，右：分析图）

(横座标——DNA 含量；纵座标——细胞数量)

图 4-1-3 肺癌细胞 DNA 含量的 CellQuest 分析直方图

（横座标——FL2-A：细胞面积；纵座标——细胞数）

3 4
2
1

图 4-1-4 肺癌细胞 DNA 含量的假三维图

87
 细
4

3
2
1

图 4-1-5 肺癌细胞 DNA 含量的二维散点图

（FL2-W——细胞宽度；FL2-H——细胞面积）

1 3
1 2

图 4-1-6 肺癌细胞 DNA 含量的等高线图

（FL2-W——细胞宽度；FFL2-A——细胞面积）

88
2、DNA 直方图和假三维图举例

图 4-1-7 1 例肺癌患者骨髓细胞 DNA 含量分析（左：直方图；右：假三维图）

（SPF 较高：15.74%）

图 4-1-8 1 例 NHL 患者化疗后骨髓细胞 DNA 含量分析（左：直方图；右：假三维图）

（细胞凋亡：24.66%）

图 4-1-9 1 例肠癌患者肿瘤细胞的 DNA 含量分析（左：直方图；右：假三维图）

（伴异倍体峰：DI=1.31）

89
二、 实验条件对流式细胞术分析结果的影响

1、低渗处理

低渗处理前正常人外周血细胞 DNA 直方图

（G0/1 峰 CV 值为 3.34%, G0/1 峰前无明显细胞碎片峰）

低渗外理 5h 后正常人外周血细胞的 DNA 直方图

（G0/1 细胞峰 CV 值变化不明显：3.55%，但 G0/1 峰前有明显细胞碎片峰：蓝色）

图 4-2-1 低渗处理前、后外周血细胞 DNA 含量分析直方图

90
2、未固定细胞样品染色后存放时间对细胞表面标志检测结果的影响

图 4-2-2 未固定细胞染色后存放时间对 CD44S 表达分析结果的影响

左：染色后立即检测样品——细胞群分布集中，阳性率高
右：染色后置 4℃5h 后检测样品——荧光强度减弱，分布弥散，阳性率降低

3、在散射光图上设一个“门”分析多种参数
荧光标记：FL1：CD3-FITC，FL2：CD（16+56）-PE

散射光图（设定细胞为淋巴细胞） 左上限：CD3-/CD（16+56）+细胞（18.63%）

右限：CD（16+56）+细胞（16.21%） 右限：CD3+细胞（76.46%）

图 4-2-3 用 CellQuest 软件设 1 个“门”分析多种细胞参数

91
4、用 CellQuest 软件设多个“门”分析某 1 种参数
荧光标记：FL1：CD3-FITC，FL2：CD（16+56）-PE

在散射光图上设“门”：
R1——淋巴细胞
R2——单核细胞
R3——粒细胞
R4——红细胞碎片

左上限（R1）
：NK 细胞 左上限（R2）：CD3-/CD（16+56）+细胞

左上限（R3）
：CD3-/CD（16+56）+细胞 左上限（R4）：CD3-/CD（16+56）+细胞

图 4-2-4 设“门”选择对外周血 NK [CD3-/CD（16+56）+] 细胞检测结果的影响

（检测外周血 NK 细胞，应选择 R1“门”进行分析）

92
 设“门”：
R1——样品全部细胞
12345

R2——淋巴细胞
R3——粒细胞
R4——红细胞碎片
R5——单核细胞

外周血细胞的散射光图（不太好）

R
R1 中的 CD71+细胞 R2 中的 CD71+细胞 R3 中的 CD71+细胞
（17.52%）

R4 中的 CD71+细胞 R5 中的 CD71+细胞

图 4-2-5 设“门”选择对患者外周血 CD71+（转铁蛋白受体）细胞检测结果的影响

横座标为 CD71-FITC；纵座标为侧向角散射（SSC）
（检测外周血 CD71+细胞表达率,应该选择 R1“门”进行分析）

93
 设“门”：
R1——全部血细胞
R2——淋巴和单核细胞
R3——淋巴细胞
R4——粒细胞
R5——单核细胞
R6——全部血细胞加红细
胞碎片

血细胞散射光图

R1 中的 CD44+细胞 R2 中的 CD44+细胞 R3 中的 CD44+细胞

R4 中的 CD44+细胞 R5 的 CD44+细胞 R6 中的 CD44+细胞

图 4-2-6 设“门”选择对患者外周血 CD44S+细胞检测结果的影响

横座标为 CD44S-FITC；纵座标为侧向角散射（SSC）
（检测外周血 CD44S+细胞表达率，应该选择 R1“门”进行分析）

94
5、DNA 含量分析时去除二联体细胞的方法

流式细胞术的脉冲处理：
G1 期的二联体细胞具有和
G2M 期 单个细 胞 相 同 的
DNA 含量，容易导致分析
为假阳性，通过对荧光信
号脉冲宽度(FL2-W)和面
积(FL2-A)的同时检测，能
有效区分二联体细胞和单
个细胞。
红色细胞群：为去除二联
体待分析的单细胞群

异倍体 G2M 期细胞

异倍体 G0/1 期细胞 FL2 电信号脉冲宽度与高
二倍体 G0/1 期细胞 度的二维散点图
R1：去除二联体的待分析
细胞

二倍体 G0/1 期细胞峰

异倍体 G0/1 期细胞峰

以散点图中的 R1 细胞
异倍体 G2M 细胞峰 群分析的 DNA 直方图

图 4-2-7 1 例肺癌患者肿瘤细针穿剌细胞去除二联体后的 DNA 倍体分析图

95
6、校准流式细胞仪线性度和检测流式细胞仪灵敏度

微球的散射光图 不同荧光强度微球在 FL1 荧光道的分布

不
不同荧光强度微球在 FL2 荧光道的分布 不同荧光强度微球在 FL3 荧光道的分布

不同荧光强度微球在 FL4 荧光道的分布 FL1-FL2 荧光道的双参数散点图

图 4-2-8 RCP-30-5A 微球在 BD 流式细胞仪各荧光检测通道中的直方图及二维散点图

（RCP-30-5A 是 1 种空白微球和各种具有不连续荧光强度的混合荧光微球）

96
7 在细胞 DNA 直方图上鉴别细胞凋亡与 DNA 异倍体 G0/1 期细胞峰

在二倍体 G0/1 期细胞峰左侧有 1 个 在二倍体 G0/1 期细胞峰左侧有 1 个

独立细胞峰 明显的的斜肩峰

在二倍体 G0/1 期细胞峰左侧 在二倍体 G0/1 期细胞峰左侧有

有 1 个大斜肩细胞峰 细胞峰 1 个独立
图 4-8-62 在 DNA 二倍体 G0/1 期细胞峰左侧待鉴定的细胞峰例举

DNA 直方图（在 50 道处有 1 个等高双峰） FL2，Caspase-3+细胞检出率（64.65%）

图 4-8-63 用 Caspase-3 鉴别、确定 DNA 异倍体 G0/1 峰的方法

在 DNA 直方图上，靠近二倍体 G0/1 期细胞峰前出现一个亚二倍体细胞峰，是

DNA 异倍体细胞峰，还是凋亡细胞峰？用 Caspase-3 与样品细胞作用后，当 Caspase-3
+率增高时，该细胞峰为细胞凋亡细胞峰；当 Capase-3+率很低时，该细胞峰则可能
为低 DNA 二倍体的异倍体细胞 G0/1 期细胞峰。

97
8 在 DNA 直方图上鉴别细胞增殖（SPF）与 DNA 异倍体 G0/1 细胞峰

原发性肝癌癌组织标本(右斜肩峰) 胃癌淋巴结转移灶标本(右肩峰)

图 4-8-64 DNA 二倍体 G0/1 期细胞右肩峰的例举

左：直方图（斜肩峰）；右：分析图（红色-二倍体 G0/1 峰，黄色-可疑异倍体 GO/1 峰）

CD71+细胞检出率为 4.03%，显著低于 DNA 含量分析 SPF 为 9.54%

图 4-8-65 同一标本细胞的 DNA 含量与转铁蛋白受体（CD71+）表达关系分析

(FL1：CD71 细胞表达)

在 DNA 直方图上，二倍体 G0/1 细胞出现右肩峰时，先对 DNA 直方图作为二倍体细胞周

期分析，若 SPF 比率与 CD71+细胞检出率接近时，则该右肩峰为增殖细胞；若 SPF 比率显
著高于 CD71+细胞检出率时，则该右肩峰可能为 DNA 异倍体细胞 G0/1 峰。

98
9 细胞凋亡和细胞坏死在细胞 DNA 直方图上的对比

图 4-8-52 细胞坏死碎片峰的 DNA 直方图

细胞碎片峰呈反抛物线形，在 DNA 直方图左侧，自左向右呈从高至低的分布特征。该标本
还有 1 个 DNA 二倍体 G0/1 细胞峰（红色）和 2 个 DNA 异倍体 G0/1 细胞峰（黄色和绿色）

图 4-8-53 凋亡细胞峰的 DNA 直方图

在 DNA 二倍体细胞 G0/1 峰前出现一个呈对称分布的亚二倍体 DNA 含量的细胞峰即为凋亡
细胞峰；该标本还有 1 个 DNA 二倍体 G0/1 细胞峰（红色）和 1 个 DNA 异倍体细胞 G0/1 细
胞峰（黄色）

图 4-8-54 细胞碎片和凋亡同时存在的 DNA 直方图

在细胞 DNA 直方图上，在 DNA 二倍体细胞 G0/1 峰前，即有呈反抛物线形分布的细胞碎片
峰，也有呈对称分布的细胞凋亡峰；还有 1 个 DNA 二倍体 G0/1 期细胞峰（红色）和 1 个
DNA 异倍体 G0/1 期细胞峰（黄色）

99
(三) 细胞总蛋白质检测

图 4-3-1 细胞总蛋白质含量分析

（横座标——细胞蛋白质含量；纵座标——细胞数）

左图：对照细胞，仅有一个细胞峰，巅峰值在 70 道左右；
右图：恶性肿瘤细胞，除在 70 道左右处有一个与正对照样品相似的细胞峰外，还在 120 道
左右处出现一个高 PI 值的细胞峰

1 例肝癌患者肿瘤细胞蛋白质总量的特征：蛋白质含量增加，蛋白质指数(PI=1.71)增高

100
（四） RNA 检测

对照细胞 RNA（左：直方图，右：分析图）

(横座标——RNA 含量；纵座标——检测细胞数)

恶性肿瘤细胞 RNA（左：直方图，右：分析图）

图 4-4-1 细胞的 RNA 含量分析

1 例胃腺癌患者肿瘤细胞的 RNA 分布特征：

RNA 含量增加，RNA 指数(RI=11.67)明显著增高

101
（五） 细胞 DNA 倍体分类

1、DNA 含量分析参数

DNA 二倍体（D）细胞直方图 DNA 近二倍体（ND）细胞直方图

DI=1.00

DNA 四倍体（T）细胞直方图 DNA 非整倍体（AN）细胞直方图

DNA 多异倍体（M）细胞直方图

图 4-5-1 细胞各种 DNA 倍体类型、DI 值及细胞周期分析图

102
2、 二倍体细胞（diploid,D）：组织细胞中只有 1 个 DNA 干系，DI=1.00；
（1）外周血 DNA 二倍体细胞直方图 (横座标——DNA 含量；纵座标——细胞数)

正常人外周血 DNA 二倍体直方图，（CV= 1.68%）

（D，DI 为 100，G0/1 峰 CV 值极小，终末细胞无明显增殖活性）

正常人外周血 DNA 二倍体细胞直方图(CV=3.57%)

（D，DI 为 1.00，G0/1 峰 CV 值较小，终末细胞无明显增殖活性）

1 例结肠腺癌患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图（CV=5.14%）

（D，DI 为 1.00，CV 值较大，无明显增殖活性）

图 4-5-2 外周血的 DNA 二倍体细胞直方图

103
（2）骨髓组织的 DNA 二倍体细胞直方图

1 例 T 细胞性 NHL 患者的骨髓 DNA 二倍体细胞直方图

（D，DI 为 1.00，SPF 为 3.48%）

1 例恶性淋巴瘤患者的骨髓 DNA 二倍体细胞直方图

（D，DI 为 1.00，SPF 为 15.8%）
图 4-5-3 骨髓组织的 DNA 二倍体细胞直方图

（3）粘膜活检组织的 DNA 二倍体细胞直方图

1 例浅表性胃炎患者胃粘膜组织细胞 DNA 二倍体细胞直方图，

（D，DI 为 1.00，SPF 为 3.41%）

104
 1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 二倍体细胞直方图（大细胞凋亡峰）
(D，DI 为 1.00，SPF 为 2.31%，Apo 为 41.32%)
图 4-5-4 活检组织的 DNA 二倍体细胞直方图

（4）实体组织的 DNA 二倍体细胞直方图

1 例胃癌Ⅰ期患者癌组织 DNA 二倍体细胞直方图，

（D，DI 为 1.00，SPF 为 10.4%）
图 4-5-5 实体组织的 DNA 二倍体细胞直方图

3、 近二倍体细胞(near-diploid,ND)：除二倍体细胞外，另有 1 个异倍体干系细胞 DI=0.90～

1.10。

（1）外周血的 DNA 近二倍体细胞直方图

1 例恶性淋巴瘤患者化放疗 4 年后外周血近二倍体细胞直方图
（ND，DI 为 1.09 的近二倍体 G0/1 期细胞大肩峰，）

105
 1 例肺腺癌，化疗后患者外周血的 DNA 近二倍体细胞直方图
（ND，DI 为 1.07 的近二倍体 G0/1 期细胞独立大峰，）

1 例胃癌手术后患者外周血 DNA 近二倍体细胞直方图

（ND，DI 为 1.08 近二倍体 G0/1 期细小肩峰，）

1 例喉癌术后 6 个月，肺转移、肝转移患者外周血 DNA 近二倍体细胞直方图

（ND，DI 为 1.09 的近二倍体 G0/1 期细胞明显肩峰，）

106
 1 例胃癌患者手术、化疗后患者外周血 DNA 近二倍体细胞直方图
（ND，DI 为 1.07 的近二倍体 G0/1 期细胞大独立峰，）

图 4-5-6 外周血的 DNA 近二倍体细胞直方图

（2）骨髓组织 DNA 近二倍体细胞直方图

1 例霍奇金淋巴瘤放、化疗后患者骨髓 DNA 近二倍体细胞的直方图

（ND，DI 为 1.06 近二倍体 G0/1 期细胞大斜肩峰，）

1 例 HD，放、化治疗后患者骨髓 DNA 近二倍体细胞的直方图

（ND，DI 为 1.09 近二倍体 G0/1 期细胞独立峰，CV 值小，
）

图 4-5-7 骨髓组织的 DNA 近二倍体细胞直方图

107
（3）活检组织 DNA 近二倍体细胞直方图

1 例肺腺癌患者癌组织穿剌细胞中 DNA 近二倍体细胞直方图

（ND，DI 为 1.08 的近二倍体 G0/1 期细胞独立峰，）

图 4-5-8 活检组织 DNA 近二倍体细胞的直方图

（4）实体组织 DNA 近二倍体细胞直方图

1 例小细胞性肺癌患者癌组织 DNA 近二倍体细胞直方图

（ND， DI 为 1.09 的近二倍体 G0/1 期细胞独立大峰）

图 4-5-9 实体组织的 DNA 近二倍体细胞直方图

108
4、 四倍体细胞（tetraploid,T）：除 DNA 二倍体细胞外，另有 1 个 DNA 干系细胞，其 DI
值在 1.90～2.10 之间。

（1）外周血的 DNA 四倍体细胞直方图

1 例恶性淋巴瘤合并白血病患者外周血 DNA 四倍体细胞直方图

（T，DI 为 1.90 的四倍体 G0/1 期细胞巨大峰，）

图 4-5-10 外周血 DNA 四倍体细胞直方图

（2）体腔液的 DNA 四倍体细胞直方图

1 例左乳腺癌术后、化疗后转移患者胸水 DNA 四倍体细胞直方图

（T，DI 为 2.00 的四倍体 G0/1 期细胞小峰，）

图 4-5-11 体腔液的 DNA 四倍体细胞直方图

109
（3） 实体组织的 DNA 四倍体细胞直方图

1 例卵巢癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞的直方图

（T，DI 为 1.97 的四倍体 G0/1 期细胞小峰，）

1 例乳腺癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞的直方图

（T，DI 为 1.97 的四倍体 G0/1 期细胞较小峰，）

1 例结肠癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞的直方图

（T， DI 为 2.03 的四倍体 G0/1 期细胞巨大峰，）

图 4-5-12 实体瘤组织 DNA 四倍体细胞直方图

110
5、 非整倍体细胞(aneuploid, AN)：除二倍体细胞外，另有 1 个 DNA 异倍体干系细胞，DI
值为 <0.90 或>1.10，但除外 T 细胞。
（1）外周血的 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例结肠癌手术后、化疗后 15 天患者外周血 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.29 的非整倍体 G0/1 期细胞巨大峰，）

1 例霍奇金淋巴瘤患者外周血的 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.23 的非整流器倍体 G0/1 期细胞巨大峰，）

图 4-5-13 外周血 DNA 非整倍体细胞直方图

（2）骨髓组织的 DNA 非整倍体细胞直方图

一例小细胞性肺癌患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.15 的低 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞肩峰）

111
 1 例乳腺癌术后 20 天患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图
（AN，DI 为 1.11 的低 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞小峰，）

1 例非霍奇金淋巴瘤患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.30 的非整倍体 G0/1 期细胞较大峰，）

图 4-5-14 骨髓组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（3）体腔液的 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例胃癌转移、出现黄疸患者胸水 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.19 的低 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞峰）

112
 1 例肺癌伴胸水、心包积液，肿瘤转移患者胸水的 DNA 非整倍体细胞
（AN，DI 为 2.57 的高 DI 值 DNA 非整倍体 G0/1 期细胞峰，
）

图 4-5-15 体腔液 DNA 非整倍体细胞直方图

（4）活检组织的 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例肺癌，淋巴结转移患者肺癌组织剌穿细胞 DNA 非整倍体的直方图

（AN，DI 为 2.74 的高 DI 值 G0/1 期细胞小峰，）

1 例肺癌，淋巴结转移患者肺癌组织穿剌细胞 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 2.47 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞小峰，）

图 4-5-16 穿剌组织 DNA 非整倍体细胞直方图

113
 1 例宫颈癌患者活检组织的 DNA 非整倍体细胞直方图
（AN，DI=1.13 的低 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞小肩峰）

1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.56 的非整倍体 G0/1 期大细胞峰，
）

1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.24 的 DNA 非整倍体 G0/1 期大细胞峰，）

114
1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（AN，DI 为 2.24 的非整倍体 G0/1 期大细胞峰，
）

1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 2.14 的非整倍体 G0/1 期大细胞峰）

图 4-5-17 活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例舌白斑患者口腔粘膜细胞的 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.16 的非整倍体 G0/1 期小细胞峰，
）

图 4-5-18 粘膜组织 DNA 非整倍体细胞直方图

115
（5）肿瘤淋巴结转移灶的 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例胃癌术后复发患者再手术转移淋巴结 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 值为 1.13 的低 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞大肩峰，）

1 例肝细胞癌患者淋巴结转移灶的 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 4.01 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期小细胞峰，）

图 4-5-19 肿瘤淋巴结转移灶 DNA 非整倍体细胞直方图

（6）实体组织 DNA 非整倍体细胞直方图

1 例卵巢癌，大网膜转移患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 1.67 的非整倍体 G0/1 期较大细胞峰，）

116
 1 例食管癌患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（AN，DI 为 2.56 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期巨大细胞峰，）

1 例直肠癌患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（AN，DI 为 4.15 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞峰，）

图 4-5-20 实体组织 DNA 非整倍体细胞直方图

6、 多异倍体(multiploid,M)：除二倍体细胞外，另有 2 个或 2 个以上 DNA 异倍体干系细胞，

包括：2 个 AN、3 个 AN、A N+T、AN+ND、T+ND、2 个 AN+ND、2 个 AN+T 等等。

117
（1） 骨髓组织 DNA 多异倍体细胞直方图

1 例胃恶性淋巴瘤患者骨髓组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括：DI 为 1.11 的非整倍体 G0/1 期细胞肩峰和 DI 值为 1.37 的非整倍体 G0/1 期细胞
斜肩峰）

1 例乳腺癌患者骨髓组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括：DI 为 1.22 的非整倍体和 DI 为 1.93 的四倍体 G0/1 期细胞峰）

图 4-5-21 骨髓组织 DNA 多异倍体细胞直方图

118
（2）体腔液的 DNA 多异倍体细胞直方图

1 例非霍奇金淋巴瘤患者脑脊液中 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 DI 为 1.07 的近二倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 1.41 的非整倍体 G0/1 期细胞峰）

1 例肺癌伴胸腔积液，肿瘤转移患者血性胸水 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括：DI 为 1.10 的小的近二倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 2.58 的高 DI 值非整倍体 G0/1
期细胞峰）

图 4-5-22 体腔液 DNA 多异倍体细胞直方图

119
 1 例肺癌、淋巴结转移、复发患者肺癌组织穿剌细胞中 DNA 多异倍体细胞直方图
（M，包括： DI 为 1.30 的非整倍体和 DI 为 1.63 的非整倍体 G0/1 期细胞峰；并伴有 1 个大
的细胞凋亡峰）

1 例输尿管癌术后 10 年、转移患者肺癌穿剌组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括：DI 为 1.11 的非整倍体的大 G0/1 期独立细胞峰和 DI 为 1.29 的非整倍体 G0/1 期
细胞小肩峰）

1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 1 个 DI 值为 1.78 的非整倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 值为 2.68 的高 DI 值非整倍体
G0/1 期细胞峰，伴细胞凋亡）
图 4-5-23 活检组织 DNA 多异倍体细胞直方图

120
（3）实体组织 DNA 多异倍体细胞直方图

1 例乳腺癌患者癌组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 DI 为 1.79 的非整倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 2.45 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞
峰）

1 例嗜铬细胞瘤患者瘤组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 DI 为 1.51 的非整倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 2.04 的四倍体 G0/1 期细胞峰）

1 例膀胱癌患者癌组织细胞 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括：DI 为 1.71 的非整倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 2.99 的非整倍体 G0/1 期细胞峰）

121
 1 例结肠癌，复发、转移患者癌组织细胞的 DNA 多异倍体细胞直方图
（M，包括：DI 为 1.55 的非整倍体 G0/1 期细胞大峰和 DI 为 1.79 的非整倍体 G0/1 期细胞小
峰，伴明显的细胞碎片）

1 例卵巢癌化疗后患者癌组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 DI 为 1.19 的非整倍体 G0/1 期细胞小峰和 DI 为 2.06 的四倍体 G0/1 期细胞大峰）

1 例脑膜瘤患者瘤组织 DNA 多异倍体细胞直方图

（M，包括 DI 为 1.10 的近二倍体 G0/1 期细胞峰和 DI 为 1.39 的非整倍体 G0/1 期细胞峰，并
伴细胞碎片）

122
 1 例肝细胞癌患者癌组织的 DNA 多异倍体细胞直方图
（M，包括 DI 为 2.03 的四倍体大峰和 DI 为 2.48 的高 DI 值非整倍体 G0/1 期细胞小峰）

图 4-5-24 实体组织 DNA 多异倍体细胞直方图

123
六、DNA 倍体异质性分析

图 4-6-1 不同部位取材检测肿瘤组织 DNA 倍体异质性的示意图

（1、 2、3 为同一肿瘤组织的不同取材部位）

在 1、 2、 3 的 3 块肿瘤组织细胞的 DNA 直方图上，如果 3 块组织中，原则上任意 2

块组织 DNA 异倍体 G0/1 期细胞 DI 值之间相差>0.20 时，则为不同克隆细胞，该肿瘤为 DNA
倍体异质体肿瘤；如果 3 块肿瘤组织中，各组织 DNA 异倍体克隆细胞的 DI 值之差均<0.20
时，则为同一克隆，该肿瘤则为 DNA 倍体同质体肿瘤。但若两 DI 值<0.2 但确已形成 2 独
立的细胞峰，仍视为不同的细胞的克隆。

DNA 倍体同质体包括： DNA 二倍体同质体肿瘤

DNA 近二倍体同质体肿瘤
DNA 四倍体同质体肿瘤
DNA 非整倍体同质体肿瘤
DNA 多异倍体同质体肿瘤。
而 DNA 倍体异质体肿瘤包括：
DNA 二倍体与各种 DNA 异倍体的组合
各种 DNA 异倍体类型之间或非整倍体类型之间的组合。

DNA 倍体异质性分析包括：
肿瘤原发灶不同部位组织的 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶与浸润灶的 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶与转移灶的 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶与复发灶的 DNA 倍体异质性分析

124
1、 肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析(1)——同质体肿瘤

（1）DNA 二倍体异质性分析

癌-1：DI 值为 1.00——DNA 二倍体细胞，SPF 为 12.37%

癌-2：DI 值为 1.00——DNA 二倍体细胞，SPF 为 17 .3%

癌-3：DI 值为 1.00——DNA 二倍体细胞，SPF 为 18.13%

图 4-6-2 1 例乳腺癌患者二倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现相同克隆的 DNA 二倍体细胞，该肿瘤为：DNA 倍体同质体肿瘤

125
（2）DNA 单异倍体（四倍体）异质性分析

癌-1：DI 值为 1.00 和 2.03 ——DNA 四倍体细胞，SPF 为 6.14%

癌-2：DI 为 1.00 和 2.03——DNA 四倍体细胞，SPF 为 10.80%

癌-3：DI 为 1.00 和 2.02——DNA 四倍体细胞，SPF 为 7.53%

图 4-6-3 1 例食管癌患者四倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现同一克隆 DNA 异倍体细胞克隆，DI 值为：2.03，2.03，2.02。

该肿瘤为：DNA 倍体同质体肿瘤

126
（3）DNA 单异倍体（非整倍体）异质性分析：

癌-1：DI 为 1.00 和 1.89——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 1.00%

癌-2：DI 为 1.00 和 1.82——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 1.59%

癌-3：DI 为 1.00 和 1.76——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 4.04%

图 4-6-4 1 例右侧卵巢癌患者非整倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织均为 DNA 非整倍体细胞克隆，

DNA 异倍体克隆 DI 值分别为：1.89、1.82、1.76；属同一 DNA 异倍体克隆。但 DNA
非整倍体 G0/1 细胞峰大小不同。
该肿瘤为：DNA 倍体同质体肿瘤

127
（4）DNA 多异倍体异质性分析：

癌-1：DI 为 1.00、1.12、1.78 和 2.21——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 6.91%

癌-2：DI 为 1.00、1.13、1.80 和 2.20——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 16.06%

癌-3：DI 为 1.00、1.13、1.83 和 2.23——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 10.75%

图 4-6-5 1 例结肠癌患者多异倍体肿瘤患者的 DNA 克隆异质性分析

3 块组织均出现相同的 DNA 多异倍体细胞克隆，

3 个 DNA 异倍体克隆：① 1.12、1.13、1.13；② 1.78、1.80、1.83；③ 2.21、2.20、2.23
异倍体克隆分布：癌-1：①、②、③；癌-2：①、②、③；癌-3：①、②、③；
该肿瘤为：DNA 倍体同质体肿瘤

128
2、肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析(2)——异质体肿瘤

癌-1：DI 为 1.00、1.15 和 2.18——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 13.17%

癌-2：DI 为 1.00、1.12 和 2.20——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 8.23%

癌-3：DI 为 1.00、1.13、2.50——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 16.39%

图 4-6-6 1 例乳腺癌患者多异倍体肿瘤 DNA 干系的异质性分析

3 块组织出现不同的 DNA 非整倍体细胞克隆，

3 个 DNA 异倍体克隆：① 1.12，1.13，1.15；② 2.18，2.20；③ 2.50。
异倍体克隆的分布：癌-1：①、②；癌-2：①、②；癌-3：①、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

129
 癌-1：DI 为 1.00 和 1.85——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 8.17%

癌-2：DI 为 1.00 和 1.81——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 0.80%

癌-3：DI=1.00、1.14 和 2.37——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 7.83%

图 4-6-7 1 例肺癌患者多异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织中出现 2 个非整倍体和 1 个多异倍体细胞克隆，

3 个 DNA 异倍体克隆：① 1.14；② 1.81，1.85；③ 2.37。
异倍体克隆在各组织中的分布：癌-1：②；癌-2：②；癌-3：①、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

130
 癌-1：DI 为 1.00、1.31 和 2.47——多异倍体细胞，SPF 为 8.17%

癌-2：DI 为 1.00、1.10 和 1.40——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 4.36%

癌-3：DI 为 1.00、1.27 和 1.44——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 9.39%

图 4-6-8 1 例贲门癌患者多异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

在 3 块组织中，出现近二倍体、非整倍体的多异倍体细胞克隆
4 个异倍体克隆：① 1.10；② 1.27，1.31；③ 1.40，1.44；④ 2.47。
异倍体克隆分布：癌-1：②、④；癌-2：①、②；癌-3：②、 ③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

131
 癌-1：DI 为 1.00 和 1.86——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 1.29%

癌-2：DI 为 1.00、1.75 和 1.95——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 2.59%

癌-3：DI 为 1.00、1.17 和 1.95——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 11.71%

图 4-6-9 1 例大肠癌多异倍体肿瘤患者 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 1 个非整倍体克隆和 2 个多异倍体细胞克隆，

DNA 异倍体克隆：① 1.17；② 1.75、1.86；③ 1.95。
异倍体克隆在各组织中的分布：癌-1：②；癌-2：②、③；癌-3：①、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

132
 癌-1：DI 为 1.00 和 1.87——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 7.05%

癌-2：DI=1.00，1.26，1.89——DNA 多异倍体细胞，SPF=18.60%

癌-3：DI 为 1.00、1.12 和 1.99——DNA 多异倍体细胞， SPF 为 10.49%

图 4-6-10 1 例直肠癌患者多异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 1 个非整倍体和 2 个多异倍体细胞克隆，
2 个 DNA 异倍体克隆：① 1.12，1.26；②1.87、1.89、1.99
异倍体克隆的分布：癌-1：②；癌-2：①、②；癌-3：①、②。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

133
 癌-1：DI 为 1.00 和 1.69——DNA 非整倍体细胞，SPF 为 1.91%

癌-2：DI 为 1.00、1.07 和 1.77——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 3.87%

癌-3：DI 为 1.00、1.17 和 2.06——DNA 多异倍体克隆，SPF 为 10.89%

图 4-6-11 1 例卵巢癌,子宫、直肠转移患者多异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 1 个非整倍体和 2 个多异倍体细胞克隆，

4 个 DNA 异倍体克隆：① 1.07；② 1.17；③ 1.69，1.77；④ 2.06。
异倍体克隆的分布：癌-1：③；癌-2：①、③；癌-3：②、④。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

134
 癌-1：DI 为 1.00 和 1.14——DNA 非整倍体细胞， SPF 为 13.16%

癌-2：DI 为 1.00、1.14 和 1.54——DNA 多异倍体细胞， SPF 为 3.41%

癌-3：DI 为 1.00、1.34 和 1.60——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 10.80%

图 4-6-12 1 例食管癌患者多异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 1 个非整倍体和 2 个多异倍体细胞克隆，

3 个 DNA 异倍体克隆：① 1.14,1.14；② 1.34；③ 1.54,1.60。
异倍体克隆的分布：癌-1：①；癌-2：①、③；癌-3：②、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

135
 癌-1：DI 为 1.00、1.10 和 2.00——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 15.77%

癌-2：DI 为 1.00、1.07 和 1.47——DNA 多异倍体细胞， SPF 为 11.47%

癌-3：DI 为 1.00、1.10 和 1.72——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 6.37%

图 4-6-13 1 例肝细胞癌患者多异倍肿瘤患者 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 3 个多异倍体细胞克隆，
4 个 DNA 异倍体克隆：① 1.07，1.10；② 1.47；③ 1.72；④ 2.00。
异倍体克隆的分布：癌-1：①、④；癌-2：①、②；癌-3：①、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

136
 癌-1：DI 为 1.00、1.27 和 1.44——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 9.39%

癌-2：DI 为 1.00、1.31 和 2.47——DNA 多异倍体细胞， SPF 为 8.17%

癌-3：DI 为 1.00、1.11 和 1.40——DNA 多异倍体细胞， SPF 为 4.36%

图 4-6-14 1 例胰头癌患者多异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 3 个多异倍体细胞克隆，
4 个 DNA 异倍体克隆：① 1.11；② 1.27，1.31；③ 1.40，1.44；④ 2.47。
异倍体克隆的分布：癌-1：②、③；癌-2：②、④；癌-3：①、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

137
 癌-1：DI 为 1.00、1.08 和 1.66——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 30.91%

癌-2：DI 为 1.00、1.10 和 1.70——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 34.63%

癌-3：DI 为 1.00、1.34 和 1.60——DNA 多异倍体细胞，SPF 为 10.80%

图 4-6-15 1 例卵巢肿瘤患者多异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织共出现 3 个多异倍体细胞克隆，
3 个 DNA 异倍体克隆：① 1.08，1.10；② 1.34；③ 1.60，1.66，1.70。
异倍体克隆的分布：癌-1：①、③；癌-2：①、③；癌-3：②、③。
该肿瘤为：DNA 倍体异质体肿瘤

138
3 肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析的临床意义

（1） 从肿瘤 DNA 倍体异质性特征看肿瘤的多克隆起源

癌-1：DNA 二倍体细胞即二倍体克隆起源肿瘤

癌-2：DNA 非整倍体细胞即非整倍体克隆起源肿瘤

癌-3：DNA 多异倍体细胞即多克隆起源肿瘤

图 4-6-16 DNA 倍体异质性与肿瘤的克隆起源

——1 例乳腺癌患者肿瘤不同部位组织的 DNA 倍体细胞克隆起源分析

139
（2） DNA 倍体异质性和肿瘤的克隆组合特征

癌-1：DNA 非整倍体-1（DI=1.23）

癌-2：DNA 非整倍体-2 (DI=2.36)

癌-3：DNA 多异倍体=DNA 非整倍体-1+DNA 非整倍体-2

图 4-6-17 DNA 倍体异质性与肿瘤的克隆组合特征

——1 例肺癌患者肿瘤不同部位组织 DNA 倍体异质性分析

140
（3） DNA 倍体异质性和异倍体克隆形成过程

癌-1：DNA 二倍体细胞，未见 DNA 异倍体

癌-2： DNA 二倍体 G0/1 细胞峰出现右肩峰——可疑 DNA 异倍体

癌-3：明显的 DNA 异倍体细胞独立峰——DNA 异倍体形成

图 4-6-18 DNA 倍体异质性与肿瘤的克隆形成（1）

1 例直肠癌患者肿瘤不同部位组织 DNA 倍体异质性分析：3 块组织，从 DNA 二倍体→可疑

DNA 异倍体→DNA 异倍体

141
 癌-1：DNA 二倍体 G0/1 期细胞的右肩峰——可疑异倍体细胞

癌-2：明显的 DNA 异倍体细胞峰（DI=1.43）

癌-3：除 1 个异倍体峰（DI=1.51, 与癌-2 相似）外，还有另 1 个异倍体（DI=1.73）细胞峰

图 4-6-19 DNA 倍体异质性与肿瘤的克隆形成（2）

1 例贲门癌患者不同部位肿瘤组织 DNA 倍体异质性分析：3 块肿瘤组织，从可疑异倍体→1

个异倍体→2 个异倍体

142
（4）骨髓细胞 DNA 倍体异质性和化疗效果

患者肿瘤化学治疗前：骨髓细胞异倍
体细胞为主，占 80.2%；DI 值为 1.84，
为非整倍体（AN）；临床病情严重

在肿瘤化学治疗中：患者骨髓 DNA 异
倍体峰显著降低，仅占 17.4%，DI 值
仍为 1.84；临床出现缓解

在化学治疗后：患者骨髓 DNA 异倍体

峰完全消失；临床出现完全缓解

1 例 NHL 患者化疗过程中三次
检测骨髓细胞 DNA 倍体变化的
对比图

绿色直方图——第 1 次检测
红色直方图——第 2 次检测
蓝色直方图——第 3 次检测

图 4-6-20 DNA 倍体异质性与疗效观察

143
4、肿瘤原发灶和淋巴结转移灶细胞 DNA 倍体异质性分析

癌灶：DI 为 1.00 和 1.14——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 4.92%

转移淋巴结：DI 为 1.00 和 1.14——DNA 非整倍体细胞（AN）， SPF 为 2.79%

图 4-6-22 1 例胃癌患者癌灶与淋巴结转移灶的 DNA 倍体异质性分析

——二者有相同的 AN 克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆；

转移淋巴结：为 1 个相同的 DNA 倍体克隆。
癌原发灶与转移淋巴结为：DNA 倍体同质体肿瘤

144
 癌灶：DI 为 1.00 和 1.17——DNA 非整倍体细胞（AN）， SPF 为 4.53%

转移淋巴结：DI 为 1.00、1.13 和 1.29——DNA 多异倍体细胞（M）， SPF 为 14.75%

图 4-6-21 1 例结肠癌患者癌灶与淋巴结转移灶的 DNA 倍体异质性分析

——1 个为 AN，1 个为 M 细胞克隆

癌原发灶： 1 个 DNA 非整倍体克隆；

转移淋巴结：除 1 个与癌灶相同 DNA 非整倍体克隆外，还有 1 个非整倍体克隆，为 M；
癌原发灶与转移淋巴结为：DNA 倍体异质体肿瘤

145
 癌灶 ：DI 为 1.00、1.17 和 3.08——DNA 多异倍体细胞（M）
， SPF 为 5.38%

转移淋巴结：DI 为 1.00、1.94 和 3.22——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 1.67%

图 4-6-23 1 例直肠癌患者癌灶与淋巴结转移灶的 DNA 倍体异质性分析

——不同 M 的细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆，1 个高 DI 值（3.08）非整倍体克隆；

转移淋巴结：1 个 DNA 四倍体克隆，1 个高 DI 值（3.22）非整倍体克隆。
癌原发灶与转移淋巴结为：DNA 倍体异质体肿瘤

146
 癌灶：DI 为 1.00、1.21 和 2.07——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 25.33%

转移淋巴结：DI 为 1.00、1.17 和 4.05——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 10.60%

图 4-6-24 1 例原发性肝细胞癌患者癌灶与淋巴结转移灶的 DNA 倍体异质性分析

——不同 M 的细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆，1 个 DNA 四倍体克隆；

转移淋巴结：1 个 DNA 非整倍体克隆，1 个高 DI 值（4.05）非整倍体克隆。
癌原发灶与转移淋巴结为： DNA 倍体异质体肿瘤

147
 癌灶：DI 为 1.00、1.10 和 1.59——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 2.82%

转移淋巴结：DI 为 1.00 和 1.09——DNA 近二倍体细胞（ND），SPF 为 10.60%

图 4-6-25 1 例食管癌患者癌灶与淋巴结转移灶的 DNA 倍体异质体分析

2 个相同 ND 外，癌灶另有 1 个 AN

癌原发灶：1 个 DNA 近二倍体克隆，1 个 DNA 非整倍体克隆；

转移淋巴结：1 个 DNA 近二倍体克隆。
癌原发灶与转移淋巴结为： DNA 倍体异质体肿瘤

148
5、肿瘤原发灶和癌旁组织细胞 DNA 倍体异质性分析

癌灶：DI 为 1.00 和 1.18——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 11.58%

癌旁：DI 为 1.00 和 1.18——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 14.75%

图 4-6-26 1 例原发性肝细胞癌患者癌灶与癌旁组织的 DNA 倍体异质性分析

——2 个相同 AN 细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆；

癌旁组织：1 个相同 DNA 非整倍体克隆；
癌原发灶与癌旁组织为：DNA 倍体同质体肿瘤

149
 癌灶：DI 为 1.00、1.21 和 2.06——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 10.44%

癌旁：DI 为 1.00、1.12 和 1.96——DNA 多异倍体细胞（M），SPF 为 13.69%

图 4-6-28 1 例胃癌患者癌灶与癌旁组织的 DNA 倍体异质性分析

——2 个不同 M 细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆，1 个四倍体细胞克隆；

癌旁驵织：1 个 DI 值相近的 DNA 非整倍体克隆，1 个 DI 值相近的四倍体细胞克隆。
癌原发灶与癌旁组织为 DNA 倍体同质体肿瘤

150
 癌灶：DI 为 1.00 和 2.48——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 438%

癌旁：DI 为 1.00 和 1.20——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 24.3%

图 4-6-27 1 例胰腺癌患者癌灶与癌旁组织的 DNA 倍体异质性分析

——2 个不同的 AN 细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 高 DI 值(DI=2.48)非整倍体克隆；

癌旁组织：1 个 DNA 非整倍体克隆；
癌原发灶与癌旁组织为：DNA 倍体异质体肿瘤

151
癌灶：DI 为 1.00 和 1.25——DNA 非整倍体细胞（AN），SPF 为 2.16 %

癌旁：DI 为 1.00——DNA 二倍体细胞（D），SPF 为 3.44%

图 4-6-29 1 例乳腺癌患者癌灶与癌旁组织的 DNA 倍体异质性能分析

——AN 和 D 细胞克隆

癌原发灶：1 个 DNA 非整倍体克隆；

癌旁组织：1 个 DNA 二倍体克隆。
癌原发灶与癌旁组织为 DNA 倍体异质体肿瘤

152
(七) 人类体细胞染色体的流式细胞术检测

图 4-7-1 人类男性体细胞 46 条染色体的 DNA 含量直方图

图 4-7-2 人类男性体细胞 46 条染色体 DNA 含量等高线图

CA3

图 4-7-3` 人类体细胞染色体三维立体图

153
八、 细胞动力学参数检测

图 4-8-1 细胞周期相关参数示意图

图 4-8-2 细胞凋亡信号传导相关蛋白表达示意图

154
 CD71(转铁蛋白受体)
Annexin-Ⅴ（磷脂结合蛋白）
EMA（上皮膜抗原）
Apo2.7（线粒体膜抗原）

PI- DNA（DNA 含量分析）

Ki-67（人类细胞核抗原）
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）
Caspase-3（半光氨酸蛋白酶）
TUNEL(末端脱氧核苷酰转移酶)
PCNA（增殖细胞核抗原）
CEA (癌胚抗原)
CK（细胞角蛋白）

图 4-8-3 细胞增殖和细胞凋亡检测指标示意图

细胞动力学常用参数检测方法：
细胞增殖：DNA 含量分析法——SPF、PI 法
PCNA+细胞表达水平检测法
Ki-67+细胞表达水平检测法
CD71+细胞表达水平检测法
Brdu 单抗掺入水平检测法

细胞凋亡：PI-DNA 含量检测——亚二倍体峰分析法
Apo 2.7 检测法
Annexin-V-FITC/PI 检测法
Caspase-3 检测法
TUNEL 检测法

细胞分化：CEA 检测法(carcinoembryonic antigen,CEA)

CK 检测法（cyto-keratin,CK）
EMA 检测法(epithelia membrane antigen,EMA)

155
1、细胞增殖活性的检测

（1） DNA 含量测定法

正常人外周血细胞 DNA 含量直方图 肿瘤患者外周血细胞 DNA 含量直方图

SPF 为 0.25% SPF 为 1.02%

正常人骨髓细胞 DNA 含量直方图 肿瘤化疗后骨髓细胞 DNA 含量直方图

SPF 为 2.93% SPF 为 3.78%

肿瘤组织非整倍体细胞 DNA 患者肿瘤组织多异倍体细胞 DNA

含量直方图 SPF 为 14.18% 含量直方图 SPF 为 28.52%

图 4-8-4 用 DNA 含量分析法检测各种细胞 S-期细胞比率

156
 药物剂量 200mg 时，SPF 为 38.03% 药物剂量 100mg 时，SPF 为 41.25%

药物剂量 50mg 时，SPF 为 44.64% 药物剂量 25mg 时，SPF 为 46.34%

药物剂量 12.5mg 时，SPF 为 51.39% 对照组未加药时，SPF 为 66.31%

图 4-8-5 用 DNA 含量分析法检测白血病 K562 细胞的 S-期细胞比例（SPF）

——药物对 K562 细胞增殖的抑制作用随剂量增加而增加，SPF 越来越小

157
（2）用增殖细胞核抗原（PCNA）检测细胞增殖活性

乳
1 例胃腺癌患者外周血细胞 1 例 NHL 患者骨髓细胞
PCNA+细胞为 16.98% PCNA+细胞为 44.49%

1 例恶性淋巴瘤患者肿瘤组织 1 例大肠癌患者淋巴结转移灶细胞
PCNA+细胞为 73.73% PCNA+细胞为 86.24%

1 例原发性肝细胞癌转移患者腹水细胞 1 例大肠癌肝转移患者肝癌细胞
PCNA+细胞为 94.10% PCNA+细胞为 99.12%

图 4-8-6 增殖细胞核抗原在不同肿瘤组织中的表达

(FL1-H：PCNA-FITC)

158
 骨髓组织
PCNA+细胞为 18.32%

淋巴结转移灶
PCNA+细胞为 64.56%

肿瘤组织
PCNA+细胞为 99.32%

图 4-8-7 1 例肺腺癌患者不同组织增殖细胞核抗原（PCNA）的表达
(FL1-H：PCNA-FITC)

159
（3）用 Ki-67 检测细胞增殖活性

1 例胃癌患者癌旁 7cm 的正常胃

粘膜组织标本 Ki-67+细胞表达率
为 18.45%

1 例乳腺癌患者的肿瘤组织标本
Ki-67+细胞表达率为 49.18%

1 例乳腺癌患者腋窩淋巴结转移
灶 标 本 Ki-67+ 细 胞 表 达 率 为
73.24%

图 4-8-8 Ki67 在肿瘤患者不同组织中的表达

(FL1：Ki-67-FITC)

160
 1 例卵巢癌病理Ⅰ级患者瘤组织 1 例宫颈癌病理Ⅰ级患者瘤组织
Ki-67+细胞为 0.34% Ki-67+细胞为 4.62%

1 例卵巢癌病理Ⅱ级患者瘤组织 1 例宫颈癌病理Ⅱ级患者瘤组织
Ki-67+细胞为 34.65% Ki-67+细胞为 47.22%

1 例卵巢癌病理Ⅲ级患者瘤组织 1 例宫颈癌病理Ⅲ级患者瘤组织
Ki-67+细胞为 89.31% Ki-67+细胞为 99.46%

图 4-8-9 卵巢癌和宫颈癌患者肿瘤组织 Ki-67+细胞表达率与病理分级

161
（4） 用 CD71 检测细胞增殖活性

外周血细胞
CD71+细胞为 1.46%

骨髓细胞
CD71+细胞为 1.87%

肿瘤组织细胞
CD71+细胞为 18.54%

图 4-8-10 1 例乳腺癌患者不同组织的转铁蛋白受体（CD71+）细胞的表达

（FL1：CD71-FITC）

162
 1 例恶性淋巴瘤患者的外周血 1 例乳腺癌患者的肿瘤组织
CD71+细胞为 2.11% CD71+细胞为 6.43%

1 例乳腺癌双肺转移患者骨髓组织 1 例肺癌患者肿瘤组织
CD71+细胞为 7.55% CD71+细胞为 11.71%

1 例 T 细胞性 NHL 患者骨髓组织 1 例大肠癌腹腔转移患者骨髓组织

CD71+细胞为 39.87% CD71+细胞为 47.65%

图 4-8-11 各种肿瘤患者肿瘤组织 CD71+细胞的表达

163
（5）用 Brdu 单克隆抗体检测细胞增殖活性
用 BrdU 取代 TDR（胸腺嘧啶核苷），参加细胞 DNA 合成，用荧光标记 Brdu 抗体
掺入量。先给小鼠腹腔注射 Brdu，6h 后再注入 FITC 荧光标记的抗 Brdu 抗体，采用流式
细胞术检测胸腺细胞 BrdU 掺入量，进而了解胸腺细胞的增殖状况

图 4-8-12 小鼠胸腺细胞 Brdu 掺入前、后细胞增殖活性的变化

左：对照样品——细胞增殖率（M2%）为 2.74%
右：实验样品——细胞增殖率（M2%）为 36.52%

右限：BrdU+ 细胞为 46.96% M2：BrdU+细胞为 46.78%

图 4-8-13 Brdu 单抗掺入胸腺细胞后流式细胞分析结果的不同表达方法

（左：荧光散点图； 右：荧光直方图）

164
5、细胞周期素的检测

图 4-8-14 细胞周期素在细胞周期不同时相中的表达

加段文字

165
 1 例肺癌患者瘤组织穿剌细胞 1 例肺癌纵隔淋巴结转移患者瘤组织
cyclin-D3+细胞为 2.51% cyclin-D3+细胞为 3.68%

1 例肺癌伴胸水患者瘤组织 1 例肺癌伴胸水患者瘤组织
cyclin-D3+细胞为 23.52% cyclin-D3+细胞为 28.54%

织
1 例肺癌复发患者瘤组织 1 例肺癌脑转移患者瘤组织
cyclin-D3+细胞为 34.65% cyclin-D3+细胞为 61.86%

图 4-8-15 癌组织细胞中周期蛋白（Cyclin -D3）表达的不同水平

（FL1：cyclin D3- FITC）

166
2、细胞凋亡的检测

⑴ 早早期细胞凋亡检测——半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3 ）法：

图 4-8-16 Caspasesc 介导细胞凋亡的级联反应原理

化疗前 Caspase-3+检出率为 3.49% 化疗后 Caspas-3+检出率为 94.86%

图 4-8-17 1 例胃癌患者化疗前后胃镜活检组织 Caspase-3+细胞的检出率

(FL2：Caspase-3-FITC)

167
 1 例乳腺癌患者肿瘤组织
caspase-3+细胞检出率为 3.51%

1 例肺癌患者化疗后肿瘤组织
caspase-3+细胞检出率为 54 .68%

1 例胃癌淋巴结转移患者化疗后肿
瘤 组 织 caspase-3+ 细 胞 检 出 率 为
97.82%

图 4-8-18 不同肿瘤组织 Caspase-3+细胞的表达

(FL2：Caspase-3-FITC)

168
（2）早期细胞凋亡检测——Annexin-V/PI 法

图 4-8-19 Annexin- V/PI 法检测细胞凋亡原理的示意图

Annexin-V-PI 法原理：细胞凋亡时，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）从细
胞膜内侧移位到细胞膜的外侧（细胞表面）；PS 并能与 Annexin-V-FITC 结合，
再 利 用 PI 分 子 不 能 通 过 活 细 胞 膜 的 特 性 ； 用 流 式 细 胞 术 检 测 分 析
Annexin-V-FITC+/PI–细胞，即为细胞早期凋亡细胞。

死亡细胞

活细胞 凋亡细胞

图 4-8-20 细胞凋亡的 Annexin-V/PI 检测结果(换)

169
 对照样品

地塞米松(100 μM, 4h )样品

喜树碱 (100 μg/ml, 4h)

样品

图 4-8-21
用 Annexin-V-PI 法对用药前后细胞凋亡指数变化的检测
FL1：Annexin-V/FITC； FL2：PI
（绿色——凋亡细胞，蓝色——活细胞，红色——死亡细胞）

170
 外周血细胞
——1 例脑膜瘤患者
细胞凋亡指数为 8.24%

骨髓组织细胞
——非霍奇金淋巴瘤患者
细胞凋亡指数为 5.42%

肿瘤组织细胞
——1 例卵巢癌患者
细胞凋亡指数为 2.83%

图 4-8-22 采用 Annexin V-PI 法检测凋亡细胞在不同组织中的表达

（FL1：Annexin-V-FITC； FL2：PI）

171
 1 例乳腺癌患者外周血细胞
凋亡指数为 0

1 例肺腺癌患者外周血细胞
凋亡指数为 3.14%

1 例胃癌患者化疗后外周血细胞
凋谢亡指数为 10.58%

图 4-8-23 Annexin-V/PI 法检测外周血凋亡细胞表达的不同水平

172
（3）早期细胞凋亡检测——细胞线粒体膜蛋白（Apo-2.7）法

阴性对照样品

检测的阳性样品

图 4-8-24 流式细胞术 Apo2.7 检测细胞凋亡的不同表示方法

（左：散点图，右：直方图）

1 例 NHL 化疗后患者外周血 1 例左乳癌患者瘤组织

Apo2.7+细胞为 89.53% Apo2.7+细胞为 1.42%

图 4-8-25 Apo2.7+细胞在不同肿瘤组织中的表达
(FL2：Apo2.7-PE)

173
 1 例口腔粘膜扁平苔癣癌变患者
外周血 Apo2.7+细胞为 0.32%

1 例转移性骨癌患者外周血
Apo2.7+细胞为 39.46%

1 例肺腺癌手术、化疗后
外周血 Apo2.7+细胞为 95.56%

图 4-8-26 各种肿瘤患者外周血 Apo2.7+细胞的表达

174
（4）早期细胞凋亡检测——Hoechst-PI 染色法

染色原理：Hoechst 33242 是一种只能使活细胞着色的染料（绿色荧光），PI 是一种只能

使死细胞着色（细胞膜通透性强，红色荧光）；细胞凋亡的特性之一是具有完整的细胞膜。
所以只有凋亡细胞才能对 PI 不着色，而对 Hoechst 33242 着色；故 PI-/Hoechst+细胞为凋亡
细胞。

图 4-8-27 Hoechst 33242-PI 染色法测定细胞群中的凋亡细胞

（蓝色：活细胞，红色：死细胞，绿色：凋亡细胞）

（5）晚期细胞凋亡检测——TUNEL 法

图 4-8-28 大鼠脑缺血导致脑细胞凋亡水平升高(FL1：TDT-FITC)

（左：对照样品的 TdT+细胞为 4.64%；右：实验样品的 TdT+细胞为 31.54%）

175
(6) 晚晚期细胞凋亡检测——DNA 含量分析法

图 4-8-29 细胞凋亡的形态学变化

176
① 外周血细胞凋亡检测

图 4-8-30 1 例食管中段癌腹腔淋巴结转移、放疗中患者细胞凋亡
(小凋亡细胞峰， 3.42%)

图 4-8- 31 1 例胃癌患者手术、化疗后外周血细胞的细胞凋亡
(较小凋亡细胞峰， 为 7.27 %)

图 4-8-32 1 例急性淋巴细胞性白血病化疗后患者外周血细胞的细胞凋亡
(独立凋亡细胞峰，18.04%)

177
 图 4-8-33 1 例肺癌脑转移、化疗后患者外周血细胞的细胞凋亡
（凋亡细胞大肩峰，25.22 %）

图 4-8-34 1 例食管下段贲门癌化疗后患者外周血细胞的细胞凋亡
（CV 值较小的凋亡细胞峰，32.11%）

图 4-8-35 1 例左肺鳞癌患者纵隔淋巴结转移、化疗后外周血细胞的细胞凋亡
（CV 值较小的巨大细胞凋亡，34.33%）

178
 图 4-8-36 1 例大肠癌患者化疗后外周血的细胞凋亡
（巨大细胞凋亡峰，50.73%）

图 4-8-37 1 例非霍奇金淋巴瘤、化疗及放疗后患者外周血的细胞凋亡
（巨大凋亡细胞峰，59.67%）

图 4-8-38 1 例恶性淋巴瘤患者外周血的细胞凋亡
（小细胞凋亡峰，28.80 %；伴异倍体）

179
② 骨髓细胞的细胞凋亡检测

图 4-8-39 1 例小细胞肺癌患者化疗中骨髓的细胞凋亡
（较大细胞凋亡峰，19.71%）

图 4-8-40 1 例非霍奇金淋巴瘤患者化疗中的骨髓细胞的凋亡
（巨大细胞调亡峰，35.99%）

图 4-8-41 1 例宫颈鳞癌患者放疗中骨髓的细胞凋亡
（巨大细胞凋亡峰，49.81%）

180
 图 4-8-42 B 系恶性淋巴瘤患者化疗中骨髓的细胞凋亡
（巨大细胞凋亡峰，20.23 %；伴异倍体）

③ 体腔液细胞凋亡检测

图 4-8-43 1 例胃恶性淋巴瘤合并白血病患者化疗及放疗后脑脊液细胞的凋亡
（较小细胞凋亡峰，12.72 %；伴异倍体）

图 4-8-44 1 例卵巢恶性肿瘤患者腹水细胞的凋亡
（较大细胞凋亡峰，16.55 %；伴异倍体）

181
④ 转移淋巴结的细胞凋亡检测

图 4-8-45 1 例食管中段癌患者食管旁转移淋巴结的细胞凋亡
（较小细胞凋亡峰，2.83 %；伴异倍体)

⑤ 癌组织的细胞凋亡

图 4-8-46 1 例胃癌患者化疗后癌组织细胞的凋亡
（明显细胞凋亡峰，13.44%）

图 4-8-47 1 例左乳腺癌患者癌组织细胞的凋亡

（明显凋亡细胞峰，4.80 %；伴异倍体）

182
⑥ 培养细胞的细胞凋亡

图 4-8-48 家兔血管内皮细胞在药物浓度 5.0μU / ml 培养 3h 后的凋亡

（小细胞凋亡峰，21.43%）

图 4-8-49 家兔血管内皮细胞在药物浓度 12.5μU / ml 培养 3h 后的凋亡

（较大细胞凋亡峰，46.23%）

图 4-8-50 家兔血管内皮细胞在药物浓度 20μU / ml 培养 3h 后的凋亡

（巨大细胞凋亡峰，63.70%）

183
 图 4-8-51 SGC-7901 细胞（胃癌细胞株）在呋尿嘧啶处理前的细胞凋亡
（小凋亡细胞峰，1.05%）

图 4-8-52 SGC-7901 细胞（胃癌细胞株）在呋尿嘧啶处理后 12h 的细胞凋亡

（较大细胞凋亡峰，6.55%）

图 4-8-53 SGC-7901 细胞（胃癌细胞株）在呋尿嘧啶处理后 24h 的细胞凋亡

（大细胞凋谢亡峰，37.49%）

184
3、细胞分化的检测

（1） 细胞角蛋白抗原（CK）

1 例肺癌患者肿瘤组织
CK+细胞为 32.16%

1 例胃癌复发患者，肿瘤组织
CK+细胞为 64.32%

1 例肝癌骨转移患者，肿瘤组织
CK+细胞为 98.66%

图 4-8-60 细胞角蛋白（CK）在不同肿瘤组织细胞中的表达
（FL1：CK-FITC）

185
（2） 癌胚抗原（CEA,CD66e）

1 例肺炎患者炎症灶穿剌细胞中 1 例卵巢囊肿患者卵巢组织
CEA+细胞为 7.23% CEA+细胞为 4.26%

1 例大肠癌患者肿瘤组织 1 例食管癌患者肿瘤组织
CEA+细胞为 39.72% CEA+细胞为 37.43%

组
1 例胃癌患者肿瘤组织 1 例大肠癌患者肿瘤组织
CEA+细胞为 49.39% CEA+细胞为 87.76%

图 4-8-61 各种癌组织中癌胚抗原（CEA+或 CD66e+）的表达

（FL1：CD66e-FITC）

186
（九） 机体免疫功能的检测

图 4-9-1 外周血免疫细胞间相互关系图

187
 图 4-9-2 细胞免疫反应原理示意图
(细胞表面抗原与带荧光标记的抗体特异性结合，形成荧光抗原抗体复合物，用流式细胞仪
检测细胞的荧光强度和荧光标记细胞相对数，从而判断免疫细胞的数量和绝对数)

图 4-9-3 外周血免疫细胞的散射光及各种细胞的分布

（红色细胞群: 淋巴细胞；绿色细胞群：单核细胞；桃红色细胞群：粒细胞）

188
 N

M
L

图 4-9-4 人类外周血细胞的流式细胞术检测参数一览表

189
1、 外周血 T、B、NK 细胞的同步检测法

散射光图 右限：CD45+细胞

左上限：B 细胞 左上限：NK 细胞；右限：T 细胞

右限：T 细胞；右上限：Ts 细胞 右限：Th 细胞

图 4-9-5 外周血 T、B、NK 细胞的六色免疫表型分析
使用 PAINT A GATE 软件进行人外周血 6 色荧光分析：图内呈灰色的点表示未染色细胞。
T 辅助细胞（Th）： CD3+/CD8-/CD4+/CD19- 28.7% (紫色)
T 抑制/细胞毒 T 细胞(Ts)： CD3+/CD8+/CD4-/CD19- 13.6% （红色）
B 细胞(BC)： CD3-/CD8-/CD4-/CD19+ 19.5% （蓝色）
T 细胞(TC)： CD3+/CD16+56 弱+/CD8+/CD19- 11.3% （黄色）
NK 细胞(NKC)： CD3-/CD16+56+/CD8 弱+/CD19- 16.5% （绿色）

190
2、外周血 T 细胞的检测

图 4-9-6 T 淋巴细胞发育分化过程中膜表面抗原的表达

T 淋巴细胞发育分化过程与细胞膜表面抗原表达（各期细胞表面标志顺序：从高到低）：

Ⅰ期——CD34+、CD7+、CD10+、CD2+、CD1a+、CD45+、CD4/8+

Ⅱ期——CD4/8+、CD45+、CD1a+、CD7+、CD10+

Ⅲ期——CD4/8+、CD1a+、CD45+、CD2+、CD3+、CD10+、CD7+

Ⅳ期——CD4/8+、CD3+、CD2+、CD7+、CD45+

191
（1） 用荧光标记 3 参数检测外周血 T 细胞亚群

图 4-9-7 外周血细胞散射光图 图 4-9-8 外周血成熟 T 细胞

FSC：前向角散射，SSC：侧向角散射 “门”内，1 例肺腺癌患者 CD3+细胞为

64.32%

图 4-9-9 外周血辅助性 T 细胞 (右上限) 图 4-9-10 外周血抑制性 T 细胞（右上限）

1 例肺腺癌患者外周血 1 例肺腺癌患者外周血
CD3+/CD4+（Th）细胞为 33.57% CD3+/CD8+（Ts）细胞为 54.31%

192
（2） 用荧光标记双参数检测外周血 T 亚群细胞

外周血成熟 T 细胞
右下限：CD3+/CD19-细胞为 80.65%

图 4-9-11 用荧光标记双参数检测外周血成熟 T 细胞（CD3+/CD19-）

外周血 T 辅助细胞（Th）
右上限：CD3+/CD4+细胞为 45.65%

图 4-9-12 用荧光标记双参数检测外周血细胞 T 辅助细胞

外周血 T 抑制细胞（Ts）
右上限：CD3+/CD8+细胞为 19.00%

图 4-9-13 用荧光标记双参数检测外周血 T 抑制细胞

193
（3） 用荧光标记单参数检外周血 T 细胞亚群

外周血细胞散射光图 外周血成熟 T 细胞
横座标：SSC；纵座标：FSC CD3+细胞为 81.36%

外周血辅助性 T 细胞(Th) 外周血抑制性 T 细胞(Ts)

CD4+细胞为 45.56% CD8+细胞为 36.96%

图 4-9-14 用荧光标记单参数检测外周血 CD3+、CD4+和 CD8+细胞

1 例正常人外周血 T 细胞亚群的荧光标记单参数分析

194
（4） 外周血 T 细胞亚群的检测分析

① CD4+/CD29+细胞

1 例硬膜恶性淋巴瘤患者外周血
CD4+/CD29+细胞为 3.12%（右上
限）

1 例 NHL 患 者 外 周 血
CD4+/CD29+细胞为 13.72% （右
上限）

1 例肺癌患者外周血 CD4+/CD29+
细胞为 23.18%（右上限）

图 4-9-15 各种肿瘤患者外周血 T 辅助细胞诱导亚群（CD4+/CD29+）的表达

(FL1：CD29-PE；FL2：CD4-FITC)

195
② D4+/CD45-RA+细胞

1 例右上肺鳞癌患者外周血
CD4+/CD45-RA +细胞为 0.32%

1 例肺癌化疗、放疗后患者外周血
CD4+/CD45-RA +细胞为 18.42%

1 例右腮腺恶性淋巴瘤放疗、化疗
后外周血 CD4+/CDA45-R +细胞
为 24.39%

图 4-9-16 不同肿瘤患者外周血 T 抑制细胞诱导亚群（CD4+/CD45-RA+）的表达

（FL1：CD4-TITC；FL2：CD45-RA-PE）

196
③ CD8+/CD28+细胞

CD8-/CD28+细胞 CD8+/CD28+细胞
（ (细胞毒 T 细胞）

CD8-CD28-细胞 CD8+CD28-细胞
（抑制性 T 细胞）

图 4-9-17 CD8-FITC/CD28-PE 单抗双荧光标记染色的表达方法

染色方法：CD8+/CD28+——细胞毒 T 细胞
CD8+/CD28-——抑制性 T 细胞

图 4-9-18 外周血细胞毒 T 细胞（TCL，CD8+/CD28+）的检测

（FL1——CD8-FITC；FL2——CD28-PE）

1 例正常人外周血 CD8+/CD28+细胞为 9.54%，CD8+/CD28-为 21. 68%

197
 对照样品 1 例 NHL Ⅲa 期患者外周血
CD8+/CD28+细胞为 0.72% CD8+/C28+细胞为 10.15%

1 例右肺癌手术后患者外周血 1 例乳腺癌患者外周血
CD8+/C28+细胞为 21.45% CD8+/C28+细胞为 6.25%

1 例胃腺癌术、化后转移患者外周血 恶性淋巴瘤患者外周血
CD8+/C28+细胞为 14.98% CD8+/C28+细胞为 22.65%

图 4-9-19 各种肿瘤患者外周血细胞毒Ｔ细胞(CTL，CD8+/CD28+)表达率

198
④ 外周血 T 活性细胞的检测

图 4-9-20 T 细胞活化因子的时效关系

活性 T 细胞
（CD3-/HLA-DR+） （CD3+/HLA-DR+）

静止 T 细胞
（CD3-/HLA-DR-） （CD3+/HLA-DR-）

图 4-9-21 外周血 T 活性、静止细胞的检测

（FL1：CD3-FITC；FL2：HLA-DR-PE）

1 例正常人外周血细胞 CD3/HLA-DR）检测

199
 1 例 NHL Ⅲb 期患者外周血 T 活性
细胞为 0.32%

1 例右上肺癌患者外周血 T 活性细
胞为 6.41%

NHL 患者外周血干细胞移植采集
后外周血 T 活性细胞为 23.21%

图 4-9-22 不同肿瘤患者外周血活性 T 细胞（CD3+/HLA-DR+）的表达

200
 图 4-9-23 不同浓度 PMA 对 T 细胞的激活（CD69+细胞）

图 4-9-24 剌激剂作用 4 小时后 CD3+细胞内及细胞表面 CD69 的表达

（空心细胞峰为剌激后 CD69+表达峰；%——CD69+细胞的百分比；GM——CD69+细胞
的绝对数。 ）

剌激剂：图 A：PMA-ION 图 D：PMA-ION

图 B：PMA/ION+BFA 图 E：PMA/ION+BFA
图 C：PMA/ION+MN 图 F：PMA/ION+MN

201
 CD45-RA-/CD45-RO+细胞为 66.4%， CD45-RA-/CD45-RO+细胞为 68.5%，
CD45RA+/CD45RO-细胞（幼稚 T 细胞） CD45RA+/CD45RO-细胞（幼稚 T 细胞）
为 30.3% 为 13.3%

图 4-9-25 CD4+淋巴细胞 CD45-RO、CD45-RA 的表达

MS 移植后 1 个月 MS 移植后 5 个月
CD45RO-/CD45RA+细胞为 3.02%， CD45RO-/CD45RA+细胞为 39.5%
CD45RA-/CD45RO+细胞为 40.1%； CD45RA-/CD45RO+细胞为 55.5%

图 4-9-26 造血干细胞移植后患者外周血 CD45RO/CD45RA 的检测分析

正常对照 CD154+细胞为 0.27% SLE 患者 CD154+细胞为 2.28%

图 4-9-27 正常人、红斑狼疮（SLE）患者外周血活化 CD4 细胞（CD154+）的检测

202
2、外周血 B 淋巴细胞（CD19+、CD20+）的检测

图 4-9-28 正常 B 细胞分化成熟过程中各种抗原表达示意图

B 细胞发育成熟过程与细胞表面标志：

（每期细胞表面标志表达顺序：从高到低）

Ⅰ期——CD34+、CD45+、CD19+、CD23+、TDT+

Ⅱ期——CD10+、CD45+、CD19+、CD20+、CD22+、

Ⅲ期——CD20+、CD45+、FMC7+、CD19+、CD22+、CD10

Ⅳ期——CD20+、CD45+、FMC7+、CD19+、CD23+

203
1 例肝癌肺、骨、脑多处转移患者外周血 CD19+细胞为 0.21%（左：散点图，右：直方图）

1 例胰头癌肺转移患者介入化疗后外周血 CD19+细胞为 11.43%（左：散点图，右：直方图）

1 例胃癌患者手术后外周血 D19+细胞为 5.86%（左：散点图，右：直方图）

204
1 例淋巴瘤合并白血病患者化疗后外周血 D19+细胞为 54.26%（左：散点图，右：直方图）

图 4-9-29 外周血 B 细胞（CD19+）不同表达水平和不同表达方式的比较

（FL1：CD19-FITC）

外周血 B 细胞（CD20+）的同型对照标本（左：散点图，右：直方图）

1 例 B 系恶性淋巴瘤、颈淋巴结侵犯患者外周血 B 细胞（CD20+）表达率为 39.97%

（左：散点图，右：直方图）

图 4-9-30 外周血 B 细胞（CD20）的检测及其不同表达方式

（FL1：CD20-PE）

205
（2）活性 B 细胞检测

1 例乳腺癌手术后转移化疗后外周
血 CD5+CD19+细胞为 0.42%

1 例正常人外周血 CD5+/CD19+细
胞为 7.43%

1 例急性淋巴细胞白血病患者三年
后复发时外周血 CD5+/CD19+细胞
为 52.21%

图 4-9-31 不同肿瘤患者外周血活性 B 细胞（CD5+/CD19+细胞）的表达

（FL1：CD19-FITC；FL2：CD5-PE）

206
 正常人 SLE 患者

图 4-9-32 正常对照和 SLE 患者外周血 CD40+细胞的表达

（CD40 抗原主要分布于正常人各种发育阶段的 B 细胞和肿瘤化的 B 细胞表面）

B 细胞的功能细胞——浆细胞（CD19+/CD38+） 活性 B 淋巴细胞（CD20+/CD5+）
（右上限：浆细胞为 1.80%） （右上限：活性 B 细胞为 69.50%）

图 4-9-33 外周血浆细胞和活化 B 淋巴细胞的检测

207
3、 外周血 NK 细胞的检测

1 例乳腺癌患者外周血
CD3-/CD（16+56）+细胞为
14.43%

图 4-9-34 荧光标记双参数检测外周血 NK 细胞（左上限）

1 例胃癌患者手术后外周血
CD（16+56）+细胞为 30.42%

1 例肺癌患者化疗后外周血
细胞 CD（16+56）+细胞为
52.46%

图 4-9-35 采用外周血 CD(16+56)+细胞检测 NK 细胞的表达水平

（FL2：CD（16+56）-PE）

208
 1 例食管癌患者外周血
CD56+细胞为 21. 43%

图 4-9-36 采用外周血 CD56+细胞检测 NK 细胞表达水平

（FL2：CD56-PE）

1 例乳腺癌淋巴结转移患者
外周血 CD16+细胞为 1.84%

图 4-9-37 采用外周血 CD16+细胞检测 NK 细胞的表达水平

（FL1——CD16-FITC）

209
4、某些血细胞的细胞表面标志的表达

外周血细胞散射光图 同型对照散点图

CD3+细胞直方图 外周血 CD3+/CD8+细胞散点图

图 4-9-38 免疫检测的散射光图、同型对照、CD3+细胞直方图和 CD3+/CD8+细胞散点图

210
 图 4-9-39 外周血成熟 T 细胞（CD3+）的不同表达方式

1 例右肺癌手术后患者外周血 CD3+细胞为 70.68%（左：散点图，右：直方图）

图 4-9-40外周血 Ts(CD8+)细胞的不同表达方式
（FL2——CD8-PE）
1 例 NHL Ⅲa 期患者外周血 CD8+细胞为 18.45%（左：散点图，右：直方图）

图 4-9-41
外周血 Ts 细胞（CD28+）的不同表达方式
（FL2——CD28-PE）
1 例右肺癌手术后外周血 CD28+细胞为 34.73%（左：散点图，右：直方图）

211
 1 例恶性淋巴瘤患者外周血
CD29+细胞为 21.69%

图 4-9-42 肿瘤患者外周血 CD29+细胞的标测（FL2——CD29-PE）

1 例胃癌手术后、化疗后转移
患 者 外 周 血 CD28+ 细 胞 为
56.67%

图 4-9-43 肿瘤患者外周血 CD28+细胞的检测（FL2——CD28-PE）

1 例食管癌患者外周血 CD15+
细胞为 68.52%

图 4-9-44 肿瘤患者外周血粒细胞（CD15+）的检测（FL1——CD15-FITC）

212
 1 例右肺癌患者外周血 CD45-RA+细
胞为 38.65%

图 4-9-45 患者外周血 CD45-DR+细胞的检测（FL2——CD45-RA-PE）

1 例卵癌患者外周血 CD14+细胞为
4.76%

图 4-9-46 患者外周血单核细胞（CD14+）的检测（FL1——CD14-FITC）

1 例肺癌患者肿瘤组织 CD14+细胞
为 2.48%

图 4-9-47 患者肿瘤组织巨噬细胞（CD14+）的检测（FL1——CD14-FITC）

213
 1 例宫颈癌患者外周血
CD35 细胞为 6.56%

图 4-9-48 患者外周血 CD35+细胞的检测（FL1——CD28-FITC）

1 例乳腺癌患者外周血
CD45+细胞为 80.82%

图 4-9-49 患者外周血 CD45+细胞（全部白细胞）的检测（FL1——CD45-FITC）

214
图 4-9-50 患者外周血 CD45+细胞（全部白细胞）和活化 T 细胞（CD69）细
胞 因子的检测

215
（十） 造血干细胞的表达

图 4-10-1 CD34 抗原在血细胞发生过程式中的表达

216
1 荧光标记单参数检测造血干细胞——CD34-FITC

外周血造血干细胞检测的散射光图
(设门取淋巴细胞和单核细胞进行分析)

图 4-10-2 1 例 NHL 患者 PBSCT 动员后外周血造血干细胞（CD34+）的单参数检测

(FL1：CD34-FITC)
CD34+细胞为 4.64%（左：散点图；右：直方图，见两个阴性细胞峰可能为淋巴细
胞和单核细胞峰）

1 例肺癌化疗后患者外周血 1 例乳腺癌患者骨髓组织 CD34+细胞

CD34+细胞为 0.68% 为 2.11%

图 4-10-3 患者不同组织 CD34+细胞的表达 (FL1: CD34-FITC)

217
 1 例小细胞肺癌患者 PBSCT 动员后外周血 CD34+细胞为 5.48%
（左：散点图；右：直方图）

1 例小细胞肺癌患者 PBSCT 动员后外周血

CD34+细胞为 2.69%
（左：散点图；右：直方图）

1 例 NHL 患者 PBSCT 动员后外周血 CD34+细胞为 6.63%）

（左：散点图；右：直方图）

图 4-10-4 不同肿瘤患者外周血 CD34+细胞的表达 (FL1: CD34-FITC)

218
（2）荧光标记双参数检测造血干细胞

① CD34-FITC/CD33-PE 双参数检测造血干细胞

单荧光抗体标记的造血干、
祖细胞（右限，CD34+细胞为
2.11%）

单色荧光单抗标记的造血祖
细 胞 （ 右 限 ， CD33+ 细 胞 为
5.66%）

双荧光单抗标记的造血干
细 胞 （ 右 下 限 ，
CD33-/CD34+ 细 胞 为
1.98%）

图 4-10-5 1 例非霍奇金淋巴瘤患者骨髓组织造血干细胞的双色荧光标记检测
（FL1——CD34-FITC；FL2——CD33-PE）

219
 骨髓组织中的 CD33+细胞
右限，造血祖细胞为 22.57%

骨髓组织中的 CD34+细胞
右限，造血干祖细胞为 4.21%

骨髓组织中的 CD33-/CD34+细胞
右下限，造血干细胞为 1.49%

图 4-10-6 1 例小细胞肺癌患者骨髓组织造血干细胞的双荧光标记检测

220
 外周血 CD33+细胞表达
右限，造血祖细胞为 5.44%

外周血 CD34+细胞表达
右限，造血干、祖细胞为 1.42%

外周血 CD33-/CD34+细胞表达
右下限，造血干细胞 为 1.31%

图 4-10-7 1 例非霍奇金淋巴瘤患者外周血干细胞的双荧光标记检测

221
 外周血 CD33+细胞
右限，造血祖细胞为 2.67%

外周血 CD34+细胞
右限，造血干祖细胞为 0.62%

外周血 CD33-/CD34+细胞
右下限，造血干细胞为 0.41%

图 4-10-8 1 例肺癌（实体瘤）患者外周血干细胞的双荧光标记检测

222
② CD45-FITC/CD34-PE 双参数检测

粒细胞

单核细胞

淋巴细胞

外周血细胞散射光图 CD45+细胞图

横座标：FSC-H； 横座标：CD45-FITC
纵座标：SSC-H 纵座标：SSC-H

CD34+细胞图 CD34+/CD45+细胞图

横座标：SSC-H 横座标：CD34-PE
纵座标：CD34-PE 纵座标：CD45-FITC

图 4-10-9 外周血的干细胞（CD45+/CD34+）的表达
(Flow cytometry analysis of Diaclone CD34 Control Cells CD45-FITC/CD34-PE dual staini ng)

223
R1：在外周血中 CD45+细胞 R2：在 CD45+细胞中的 CD34+细胞

R3：血细胞中的 CD34+细胞 R4：造血干细胞

图 4-10-10 外周血中造血干细胞的 CD45+/CD34+细胞检测法

224
R1：在外周血中 CD45+细胞 R2：血细胞中的 CD34+细胞

R3：CD45+细胞中的 CD34+细胞 R4：造血干细胞

图 4-10-11 外周血中造血干细胞的 CD45+/CD34+细胞检测法

225
（3）荧光标记三参数检测造血干细胞——ProCOUNTTm 法

图 4-10-12 外周血 CD34+细胞的 ProCOUNTTM 检测——对照样品

CD34+细胞绝对数：31.7/μl
外周血细胞用 ProCOUNT 系统试剂和软件检测 CD34 细胞含量
图中：红色群体是经过多参数设门后精确设定的 CD34 阳性细胞群体；
绿色群体是进行定量计数的标准微球

226
 图 4-10-13 外周血 CD34+细胞的 ProCOUNTTM 检测——实验样品
CD34+细胞绝对数：6484.6/μl

外周血细胞用 ProCOUNT 系统试剂和软件检测 CD34 细胞含量

图中：红色群体是经过多参数设门后精确设定的 CD34 阳性细胞群体；
绿色群体是进行定量计数的标准微球

227
“门”R2：成熟 T 淋巴细胞（CD3+）

“门”R3：B 淋巴细胞（CD19+）

“门”R4：单核细胞（CD14+）

228
 “门”R2 和“门”R3：造血干细胞（CD34+）

“门”R2 和“门”R3：同型对照

图 4-10-14 磁珠分离 CD34+细胞前、后骨髓组织各种细胞成分的变化

（左图：分离前样品；右图：分离后样品）

229
（十一） 白血病细胞的免疫分型

1、白血病患者骨髓组织细胞的变化过程

图 4-11-1 正常人骨髓组织的细胞表面抗原的表达特征

图 4-11-2 白血病初诊患者的骨髓组织细胞表面抗原的表达特征

230
 图 4-11-3 白血病缓解期患者骨髓组织的细胞表面抗原的表达特征

R1 有核细胞
R2 CD34+细胞
R3 CD34-/CD19+细胞
R4 CD10+/CD38+细胞
R5 CD38+/CD10+细胞
R6 CD38+/CD10+细胞
R7 CD38-/CD10+细胞
R8 CD38+/CD10-细胞
R9 CD38+/CD10-细胞

231
2、B 细胞型急性淋巴细胞白血病的免疫表型特征

R1

R2

图 4-11-4 1 例 B 细胞性急性淋巴细胞患者白血病细胞免疫表型的分析

（R1 中细胞占 87.73%，表达 CD19、CD10、CD13、CD20；不表达 CD7、CD15、HLA-DR）

232
图 4-11-5 1 例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分
析

（R2 中细胞占 92.10%，表达 CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、HLA-DR）

233
图 4-11-6 1 例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 CD19、CD10、CD22、CD20、HLA-DR、CD34）

234
图 4-11-7 1 例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 42.90%,表达 CD10、CD22、CD19、CD34、HLA-DR、CD13、CD33）

235
 急性 B 淋巴细胞性白血病（“门”内为白血病细胞）

图 4-11-8 1 例急性 B 淋巴细胞性白血病患者白血病细胞抗原κ、λ链的检测

（κ、λ链单独表达阳性示细胞是克隆性增生的结果）

236
3、T 细胞型急性淋巴细胞白血病的免疫表型特征

R4

R1
R2

图 4-11-9 1 例急性 T 淋巴细胞型白血病患者病细胞免疫表型分析

（R1 中细胞占 72.87%，表达 CD5、CD34、CD10、CD7、CD13）

237
238
图 4-11-10 1 例 T 细胞型急性淋巴白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 85.4%，表达 CD5、CD7、CD19、CD71 及胞浆 CD3）

239
图 4-11-11 1 例 T 细胞型急性淋巴白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 87.25%，表达 CD3、CD5、CD7、CD71、HLA-DR 及 CD13）

240
5、急性髓系白血病 M1 型白血病细胞的免疫表型特征：

R4

R3
R2

图 4-11-12 1 例急性粒细胞白血病患者白血病细胞的免疫表型分析

（R2 中细胞占 70.69%，表达 CD34、CD13，不表达 CD10、CD19、CD7、CD15、

CD14、CD33）

241
 图 4-11-13 1 例急性粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 91.2%, 表达 CD13、CD34、CD33、HLA-DR、CD7、CD71）

242
5、急性髓系白血病 M2 型白血病细胞的免疫表型特征

R3

R2

图 4-11-14 1 例原始细胞伴成熟型细胞白血病细胞的免疫分型分析

（R3 中细胞占 89.55%，表达 CD19、CD13、CD34、HLA-DR、CD33，不表达

CD5、CD7、CD20）

243
图 4-11-15 1 例急性单核细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 79.2%, 表达 CD13、CD33、CD34、HLA-DR）

244
图 4-11-16 1 例急性粒细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 83.1%,表达 CD13、CD33、CD71）

245
图 4-11-17 1 例急性粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 70.2%, 表达 CD13、CD34、CD33、HLA-DR）

246
6、急性髓系白血病 M3 型白血病细胞的细胞表型特征

R2

R3

图 4-11-18 1 例早幼粒细胞 M3 患者白血病细胞的免疫表型分析

（R3 中细胞占 95.76%，CD13+、CD33+、CD15，不表达 HLA-DR、CD34、CD14、

CD10、CD19、CD7-CD5）

247
图 4-11-19 1 例急性早幼粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 90.3%, 表达 CD13、CD33、CD71，不表达 HLA-DR、CD19）

248
图 4-11-20 1 例急性早幼粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 74.0%, 表达 CD13、CD33、CD71，不表达 HLA-DR、CD19）

249
7、急性粒细胞白血病—M4、M5 型的免疫表达特征

R4

R2

R3

图 4-11-21 1 例急性粒细胞白血病 M4-5 型患者的白血病细胞的免疫表型分析

（R2 中细胞占 91.2%，表达 CD34、CD15、CD13、HLA-DR、CD7；不表达

CD5、CD14、CD33、CD19、CD10）

250
图 4-11-22 1 例急性单核细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 86.8%, 表达 CD13、CD33、CD34、CD14、CD71、HLA-DR）

251
 图 4-11-23 1 例急性粒单核细胞性白血病患者细胞的免疫表型分析
（R2 中细胞占 87.6%，表达 HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD71）

252
8、急性粒细胞白血病—M6 型的免疫表达特征

图 4-11-24 1 例红白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 63.0%，表达 CD33、CD71，不表达 CD5、CD7、CD10、CD19、CD13、
HLA-DR、CD20、CD22）

253
 图 4-11-25 1 例急性红白血病患者白血病细胞的免疫表型分析
（R2 中细胞占 56.2%, 表达 CD19、CD34、CD71、CD117、HLA-DR）

254
9、混合型白血病的免疫表型特征：

图 4-11-26 1 例急性混合细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 89.6%, 表达 CD13、CD19、CD14、CD33、CD34、HLA-DR）

255
图 4-11-27 1 例以 T 细胞为主的混合型淋巴细胞性白血病患者白血病细胞免
疫表型分析

（R2 中细胞占 85.4%, 表达 CD5、CD7、CD13、CD34、CD34、CD19）

256
 图 4-11-28 1 例急性 T、B 细胞混合型淋巴细胞白血病患者
白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 95.8%, 表达 CD5、CD7、CD13、CD19、CD34、CD71）

257
10、骨髓异常增生综合症的免疫表型分析：

图 4-11-29 1 例骨髓异常增生综合症（MDS）患者细胞免疫表型分析

（R2 中细胞表达 CD80、CD25、CD56、CD8）

258
11、白血病患者骨髓、脑脊液微小残留病的检测

骨髓：在 CD45+细胞中 脑脊液：在 CD45+细胞中

CD10+/CD19+细胞为 85.90% CD10+/CD19+细胞为 13.70%

图 4-11-30 1 例 B 淋巴细胞患者治疗缓解后骨髓组织和脑积液白血病细
胞的检测

259
图 4-11-31 M2 患者脑积液中检测出大量 CD34+细胞和 CD13+细胞

260
 正常人外周血细胞（阳性峰位于 102） CML 患者外周血细胞（阳性峰位于 103）

图 4-11-32 白血病患者外周血细胞磷酸酪氨酸激酶的变化

取 CD45+细胞 细胞胞浆 CD3+/CD22-细胞

图 4-11-33 1 例 T 细胞白血病患者外周血细胞的胞浆的 CD3+表达

——1 例白血病患者出现 CD5+、CD7+、CD34+和 CD19+时，用于鉴别 T 细胞性与 B 细胞

性白血病；胞浆 CD3+/CD22-者，为 T 细胞性白血病。

261
（十二） 细胞因子的检测

1 白细胞介素-2 受体（IL-2R，CD25）

点
h
1 例大肠癌患者外周血 CD25+细胞为 17.45%(左：点阵图：右：直方图)

1 例低分化胃癌患者外周血 CD25+细胞为 18.48%（左：点阵图 ；右：直方图）

1
例
肝
、
肾
、
骨等多发转移癌患者外周血细胞样本，CD25+细胞为 21.43%

图 4-12-1 外周血白细胞介素-2 受体（IL-2R）表达（CD25+）细胞 (FL1：CD25-FITC)

262
2 干扰素-γ（IFN-γ）

1 例肝细胞癌骨、肺、脑转移患者
外周血细胞 IFN-γ+细胞的表达率
为 0.67%

1 例肺腺癌患者化学治疗后
外周血细胞 IFN-γ+细胞的
表达率为 28.58%

1 例非霍奇金淋巴瘤患者手术、化疗
后外周血细胞 IFN-γ+细胞的表达
率为 72.39%

图 4-12-2 不同肿瘤患者外周血细胞的干扰素-γ（IFN-γ）的表达 (FL1：IFN-γ-FITC)

263
3 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）

1 例胃癌患者外周血 TNF-α+细胞
表达率为 8.74%

1 例恶性淋巴瘤患者化疗后外周血
TNF-α+细胞表达率为 77.84%

1 例非霍奇金淋巴瘤患者化疗后外
周 血 TNF- α + 细 胞 表 达 率 为
93.47%

图 4-12-3 外周血中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的不同水平表达 (FL2：TNF-α-PE)

264
4、细胞内细胞因子的检测

正常人 CD8+细胞中 IFN-+细胞为 6.75% 白血病患者 MS 移植前为 43.79%

MS 移植后 1 月 IFN-γ+细胞为 1.92% MS 移植后 6 月 IFN-γ细胞为 14.40%

图 4-12-4 骨髓移植前、后患者外周血 CD8+细胞的 IFN-γ的表达

图 4-12-5 热休克蛋白在中暑患者血细胞中的表达

（红点：热应激组；蓝点：37℃培养组；绿点：基础组）

265
 图 4-12-6 特异性抗原（巨细胞病毒）活化 T 淋巴细胞（CD69）实验
（CD69 细胞和 CD45-RA 细胞中 IL-2、TNF-α和 IFN-γ表达的对比）

266
图 4-12- 7 PMA-ION 刺激 4 小时 T 细胞活化因子——CD69 在细胞内和细胞表面的表达
（左图：细胞内细胞活化因子的表达；右图：细胞表面细胞活化因子的表达）

灰色细胞峰——对照细胞；
空心细胞峰——加剌激剂细胞

剌激剂的分布：A 图：PMA-ION D 图：PMA-ION

B 图：PMA/ION+BFA E 图：PMA/ION+BFA
C 图：PMA/ION+MN F 图：P
PMA/ION+MN

267
6、用 CBA 方法检测可溶性血清蛋白分子（Cytometric Bead Array ，CBA）

图 4-14-8 流式细胞术检测可溶性分子（CBA 法）的基本原理

图 4-12-9 CBA 实验的流式细胞术检测示意图

IL2 IL4 IL8 TNF-α IL10 IFN-γ

图 4-12-10 几种血清可溶性大分子的捕获示意图
（采用夹心法分析策略，以微球来捕获可溶性大分子）

268
 IL-2 IL-2
IL-4 IL-4
IL-8 IL-8
TNF-α TNF-α
IL-10
IL-10
IFN-γ IFN-γ

对照样品 实验样品

IL-2 IL-2
IL-4 IL-4
IL-8
IL-8
TNF-α
TNF-α
IL-10 IL-10
IFN-γ IFN-γ

对照样品 实验样品

图 4-12-11 白细胞介素（IL）等在血清中的表达的实例

269
 IL-2
IL-2 IL-2
IL-4
IL-4 IL-4
IL-8
IL-8 IL-8
TNF-α
TNF-α TNF-α
IL-10
IL-10 IL-10
IFN-γ
IFN-γ IFN-γ

IL-2 IL-2 IL-2

IL-4 IL-4 IL-4
IL-8 IL-8 IL-8
TNF-α T NF-α TNF-α
IL-10 IL-10 IL-10
IFN-γ IFN-γ IFN-γ

图 4-12-12 流式细胞术检测人血清细胞因子的 CBA 检测

（在药物不同浓度作用下，血清某些可溶液性细胞因子的变化）

270
 • 免疫分析

• 酶分析

• 受体-配基分析

• 蛋白质 - 蛋白质相互作用分
析
• 蛋白质 - 核酸相互作用分析

• 核酸杂交分析

图 4-12-13 CBA 临床应用的示意图

•（十三） 网织红细胞的检测

271
 4
10

有核细胞
3

红细胞 网织红细胞
10

IRF
FSC-Height -->
2
10
1
10

血小板

10 1 10 2 10 3 10 4

Thiazole Orange -->

图 4-13-1 流式细胞术 TO 染色不成熟网织红细胞的检测

IRF 数据分析：排除有核细胞，排除血小板，定义 IRF 区域，定义网织红细胞

图 4-13-2 剌激红细胞生成素作用后外周血的不成熟网织红细胞（IRF）、血红蛋白和网织
红细胞计数的变化——IRF 升高最早

272
 4

4
10

10
3

3
10

10
BIOTIN LEVEL -->

BIOTIN LEVEL -->

2

2
10

10
1

1
10

10
10 1 10 2 10 3 10 4 10 1 10 2 10 3 10 4

THIAZOLE ORANGE --> THIAZOLE ORANGE -->

剌激前（网织红细胞为 0.15%） 剌激后 6 小时(网织红细胞为 0.27%)

4

4
10

10
3

3
10

10
BIOTIN LEVEL -->

BIOTIN LEVEL -->

2

2
10

10
1

1
10

10

10 1 10 2 10 3 10 4 10 1 10 2 10 3 10 4

THIAZOLE ORANGE --> THIAZOLE ORANGE -->

剌激后 24 小时(网织红细胞为 1.23%) 剌激后 72 小时(网织红细胞为 2.67%)

图 4-13-3 EPO 剌激网织红细胞成熟——体内剌激红细胞生成

（横座标：噻唑橙； 纵座标：生物素水平）

273
 Erythroid
Maturation
1.2

0.8 Nucleated
Glycophorin
CD71 (TfR)
RNA
0.6 Hemoglobin

0.4

0.2

0
Erythroblast Normoblast, Normoblast, Reticulocyte, Reticulocyte, Erythrocyte
early late IRF late

图 4-13-4

274
（十四） 血小板的检测

图 4-14-1 血小板功能与活化示意图

275
276
1、血小板抗体检测

血小板对照样品样品（左：散点图；右：直方图）

血小板抗体阴性患者（左：散点图；右：直方图）

血小板抗体阳性患者（左：散点图；右：直方图）

图 4-14-2 血小板抗体检测

277
2、 血小板表面糖蛋白（CD41）的检测

1 例正常人外周血血小板的 CD41+细胞为 6.53%

（左：散射光图——设“门”；右：荧光图 ）

1 例 T 细胞性白血病患者外周血血小板的 CD41+细胞为 9.78%

（左：散射光图——设“门”；右：荧光图 ）

1 例大肠息肉患者手术后患者外周血血小板的 CD41+细胞为 12.71%

（左：散射光图——设“门”；右：荧光图 ）

图 4-14-3 人外周血血小板表面糖蛋白（CD41）的表达 (FL1：CD41-FITC)

278
 1 例原发性血小板减少性紫癜患者 1 例再生障碍性贫血患者
外周血血小板 CD41+细胞为 6.3 0%胞 外周血血小板 CD41+细胞为 4.74%

1 例小细胞性肺癌免疫治疗后患者 1 例急性髓细胞性白血病化疗后
外周血血小板 CD41+细胞为 35.75% 患者外周血血小板 CD41+细胞为 57.14%

1 例肝硬化、腹水手术并免疫治疗后患者 1 例乳腺癌术后化疗、免疫治疗患者
外周血血小板 CD41+细胞为 75.23% 外周血血小板 CD41+细胞为 77.61%

图 4-14-4 各种患者外周血血小板——CD41+细胞的表达

279
3、 网织血小板的表达、识别、统计分析

设阈值：散射光图上 逻辑设门： 计算网织血小板占全部

设“门”取血小板 血小板的百分率为 2.67%
（横座标——侧向角散射；
纵座标——网织血小板）

图 4-14-5 网织血小板识别、统计分析方法

样品 RNA 酶处理前：“门”内 样品 RNA 酶处理后：“门”内

网织血小板为 7.32% 网织血小板为 0.41%

图 4-14-6 1 例患者外周血细胞 RNA 酶处理前、后网织血小板的测定结果

（横座标——侧向角散射；纵座标——网织血小板）

280
 散点图 R3“门” 直方图 M1
网织血小板为 15.64% 网织血小板为 13.94%
图 4-14-7 同一份标本散点图与直方图分析方法的比较
（横座标——侧向角散射；纵座标——网织血小板）

正常对照（1.97%） 再障患者（0.47%） ITP 患者（12.12%）

外周血干细胞动员后 大剂量化疗后明显减低
网织血小板显著增加(10.53%) （0.15%）
图 4-14-8 不同干扰因素对患者网织血小板表达的影响
（横座标——侧向角散射；纵座标——网织血小板）

281
 肝
移植前 肝移植后

图 4-14-9 肝脏移植前、后患者外周血血小板的变化
（横座标——侧向角散射；纵座标——网织血小板）

图 4-14-10 单核细胞与血小板粘连的表达

（1 例心肌梗塞患者单核细胞与血小板的粘连现象）

282
 移植前（0.41%） 第 4 天(0.27%)

第
第 9 天(2.40%) 第 14 天(5.29%)

第 19 天

第 16 天(6.71%) 第 19 天(8.05%)

图 4-14-11 异体骨髓移植前、后不同时间外周血网织血小板的变化
（横座标——侧向角散射；纵座标——网织血小板）

283
4、 活化血小板的检测

同型对照(0%)

活化血小板（CD62P+/CD63+）的低表达（5.24%）

活化血小板（CD62P+/CD63+）的高表达（75.45%）

图 4-14-12 外周血血小板活化（CD62P+/CD63+）的检测

284
 散射光图设“门”取细胞

“门”内为 CD61+细胞

右限为 PAC+细胞

图 4-14-13 血小板活化早期标志物（PAC）的检测

（左：同型对照：右；实验样品）

285
 散射光图设“门”取细胞

“门”内为 CD61+细胞

右限为 PAC+细胞

图 4-14-14 外周血血小板活化 PAC-1（Ⅱb/Ⅲa）的检测分析

（左：同型对照：右；实验样品）

286
 对照样品（左：设‘门’取分析细胞；右：CD62p+/CD63+细胞为 0.52%）

实验样品（左：设‘门’取分析细胞；右：CD62p+/CD63+x 细胞为 56.72%）

图 4-14-15 外周血血小板活化 CD62p/CD63+细胞的检测

287
（十五） HLA-B27 表达的检测

散射光图 在淋巴细胞中取 CD3+细胞

（取淋巴细胞——绿色部分） （FL2，绿色部分）

CD3+细胞中 HLA-B27+细胞分布直方图 (FL1 为 HLA B27-FITC)

左：正常对照样品 HLA-B27+细胞为 1.24%

右：受检患者样品 HLA-B27+细胞为 94.54%

图 4-15-1 强直性脊柱炎患者外周血细胞 HLA-B27 的表达

288
 散射光图（左：同型对照样品；右：受检患者外周血细胞）
(取红色细胞部分为淋巴细胞)

在淋巴细胞中取 CD3+（红色部分）细胞进行分析（左：同型对照；右：受检患者）

HLA-B27+细胞直方图（图中绿竖线为分界线）

（左：同型对照样品阳性细胞表达率为 0.54%；右：受检患者阳性细胞为 87.35%）

图 4-15-2 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞的 HLA-B27 的检测方法

289
 正常对照样品

（左：散射光图，设‘门’取淋巴细胞；右：散点图，HLA-B27+/HLA-B7-细胞为 0.45%）

受检患者样品

（左：散射光图,设“门”取淋巴细胞；右：散点图，右下限 HLA-B27+/HLA-B7-细胞为 92.45%）

图 4-15-3 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞的 HLA-B27 表达的检测

290
 HLA-B27 检测的同型对照
（左：散点图，HLA-B27+/HLA-陈细胞为 2.45%；右：直方图，HLA-B27+细胞为 4.86%）

HLA-B27 表达阳性患者
(左：散点图，HLA-B27+/HLA-B7-细胞为 100%；右：直方图，HLA-B27+ -细胞 100%)

图 4-15-4 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞中 HLA-B27+细胞的不同表达方式

291
十六、常见癌基因编码蛋白的检测

Rb
p53(V)
p16
基因编码 DCC
蛋白表达 MCC
APC
于细胞核 Ras
或细胞浆 Bcl-2
CerbB-2
myc
bl

CD44V5
CD44V6
基因编码蛋白表达于细胞表面 nm23
p170
Fas/Apo-1
CD44S

图 4-16-1 癌基因编码蛋白表达检测指标示意图

图 4-16-2 癌基因蛋白表达检测的原理

细胞膜 、细胞浆和细胞核中的各种基因编码蛋白，通过与荧光标记的单克隆抗体特异
性结合，产生抗原-抗体复合物，用流式细胞术检测细胞的荧光强度和荧光标记阳性细胞百
分率，从而获得该基因表达蛋白的绝对计数和相对计数。

292
1、 抑癌基因编码蛋白表达的检测

1 例乳腺癌肿瘤细胞 1 例胃癌癌旁组织
（3.84% ） （23.45%）

1 例卵巢癌腹水细胞 1 例乳腺癌淋巴结转移灶
（27.85%） （49.87%）

1 例乳腺癌骨髓细胞 1 例大肠癌外周血细胞
（70.34%） （96.48%）

图 4-16-3 视网膜母细胞瘤基因（RB）编码蛋白在不同肿瘤组织中的表达
(FL1：Rb-FITC)

293
 癌组织 Rb+细胞为
4.67%

淋巴结转移灶 Rb+细胞为
71.24%

外周血 Rb+细胞为
98.65%

图 4-16-4 RB 基因编码蛋白在 1 例大肠癌患者不同组织中的表达

(FL1：Rb-FITC)

294
1 例直肠管状腺癌瘤组织 1 例大肠癌肿瘤组织
（0.33%） （13.54%）

1 例胃癌肿瘤组织 1 例肺癌肿瘤组织
（44.39%） （30.19%）

1 例胃癌肿瘤组织 1 例食管癌肿瘤组织
（88.43%） （72.71%）

图 4-16-5 DCC 基因编码蛋白在不同肿瘤组织中的表达

(FL1：DCC-FITC)

295
 1 例输尿管癌术后复发患者瘤组织
p53(V)+细胞表达率为 18.87%

1 例乳腺癌患者瘤组织 p53（V）+
细胞表达率为 27.43%

1 例肺癌患者瘤组织 p53(V)+细胞
表达率为 46.68%

图 4-16-6 p53（V）基因编码蛋白在癌组织细胞中的表达
（FL1：p53V-FITC）

296
 1 例右乳腺癌患者肿瘤组织 p53（V）+细胞为 0.34%

点
1 例卵巢癌患者肿瘤组织 p53（V）+细胞为 51.35%

1 例肺癌手术前放疗、化疗患者肿瘤组织 p53（V）+细胞为 99.87%

图 4-16-7 p53（V）基因编码蛋白在不同癌组织细胞中的表达
（左：散点图；右：直方图）

297
 外周血细胞 p53(V)+细胞表达率为
3.2%

淋巴结转移灶细胞 p53(V)+细胞表达率
为 71.91%

肿瘤组织 p53(V)+细胞表达率为
88.45%

图 4-16-8 1 例结肠癌患者不同组织中 p53（V）基因编码蛋白表达的分布

（FL1：p53（V）-FITC）

298
 外周血细胞 淋巴结转移灶
p16+细胞表达率为 72.46% p16+细胞表达率为 24.87%

癌旁正常组织 原发灶肿瘤组织
p16+细胞表达率为 66.47% p16+细胞表达率为 5.98%

图 4-16-9 1 例直肠癌患者不同组织 p16 基因编码蛋白的表达

（FL1：p16-FITC）

299
1 例肺癌多器官转移患者肿瘤组织 1 例胃癌肝转移患者肿瘤组织
（3.73%） （1.24%）

1 例肺癌骨转移患者肿瘤组织 1 例胃癌淋巴结转移患者肿瘤组织，
（26.46%） （59.76%）

1 例乳腺癌患者癌旁组织 1 例胃癌Ⅰ期患者肿瘤组织
（93.51%） （88.75%）

图 4-16-10 p16 基因编码蛋白在不同肿瘤组织细胞中的表达

（FL1：p16-FITC）

300
 1 例肺癌远处广泛转移患者肿瘤组
织 p16+细胞为 3.44%

1 例肺癌肺内转移患者瘤组织
p16+细胞为 21.3%

1 例肺癌未转移患者瘤组织 p16+
细胞为 90.13%

图 4-16-11 癌组织细胞 P16 基因编码蛋白表达与肿瘤转移

（FL1：p16-FITC）

301
2、癌基因编码蛋白表达的检测

外周血细胞
p21+细胞表达率为 0.76%

淋巴结转移灶细胞
p21+细胞表达率为 45.65%

肿瘤组织细胞
p21+细胞表达率为 98.12%

图 4-16-12 1 例卵巢癌患者不同组织细胞 p21 基因编码蛋白表达的比较

（FL1：p21-FITC）

302
1 例胃癌Ⅱ期患者肿瘤组织 乳腺癌患者肿瘤组织
（1.38%） （4.76 %）

1 例卵巢癌患者肿瘤组织 1 例宫颈癌患者肿瘤组织
（39.76%） （69.5%）

1 例胰腺癌肝转移患者肿瘤组织 结肠癌肺转移肿瘤组织
（73.89%） （94.42%）

图 4-16-13 不同肿瘤患者癌组织 p21 基因编码蛋白的表达

（FL1：p21-FITC）

303
 外周血细胞 癌旁正常组织
CerbB-2+细胞表达率为 7.64% CerbB-2+细胞表达率为 12.34%

淋巴结转移灶 瘤组织
CerbB-2+细胞表达率为 66.74% CerbB-2+细胞表达率为 85.79%

图 4-16-14 1 例卵巢癌患者不同组织 CerbB-2 基因编码蛋白的表达

（FL1：CerbB-2 -FITC）

304
 1 例食管癌患者肿瘤组织 1 例乳腺癌术后肺转移患者肿瘤组织
（3.88%） （13.48%）

1 例卵巢癌大网膜转移患者 大肠癌淋巴结转移患者
肿瘤组织 cerbB-2+细胞为 33.13% 肿瘤组织 cerbB-2+细胞为 55.65%

1 例胃癌 LNM 患者肿瘤组织 1 例胰头癌肺转移患者肿瘤组织

（86.87%） （96.33%）

图 4-16-15 各种癌组织细胞 CerbB-2 基因编码蛋白表达的不同水平

（FL1：CerbB-2 -FITC）

305
 1 例胃癌Ⅱ期患者肿瘤组织 Bcl-2+
细胞为 3.65%

1 例胃癌附近淋巴结转移患者肿瘤
组织 Bcl-2+细胞为 63.64%

1 例胃癌肝、肺、骨广泛转移患者
肿瘤组织 Bcl-2+细胞为 96.68%

图 4-16-16 癌组织细胞 Bcl-2 基因编码蛋白表达与肿瘤转移

（FL1： Bcl-2 -FITC）

306
 1 例高分化肺癌组织 1 例高分化结肠癌患者肿瘤组织
（14.91%） （18.11%）

1 例中分化肺癌患者肿瘤组织 1 例中分化结肠癌患者肿瘤组织
（31.55% ） （73.49%）

1 例低分化肺癌组织 1 例低分化结肠癌组织
（74.48%） （79.33%）

图 4-16-17 肿瘤组织细胞 BCL-2 基因编码蛋白表达与病理分级

（FL1： Bcl-2 -FITC）

307
3、调整基因编码蛋白的检测

1 例胃癌转移患者肿瘤组织 1 例肝细胞癌转移患者肿瘤组织
（1.24 %） （11.54 %）

1
1 例结肠癌患者肿瘤组织 1 例胃癌患者肿瘤组织
（20.13%） （50.63%）

1 例卵巢癌患者肿瘤组织布 1 例食管癌患者肿瘤组织
（83. 38%） （89. 46%）

图 4-16-18 不同癌组织细胞 CD44S 基因编码蛋白的表达

308
 外

图 4-16-19 1 例肺癌患者 CD44S 基因在不同组织中的表达

（左：外周血，98.54%； 右：肿瘤组织，42.58%）

1 例直肠癌患者肿瘤组织 CD44S+细胞为 71.91%

图 4-16-20 CD44S 基因编码蛋白在组织中表达的不同分析方法

（左：散点图，右：直方图）

309
 1 例胃癌患者外周血 1 例肠癌患者肿瘤组织
（3.80%） （2.76%）

1 例乳腺癌淋巴结转移患者骨髓组织 1 例卵巢癌Ⅲ期化疗后患者瘤组织
（20.66%） （49.24%）

1 例子宫内膜癌Ⅱ-Ⅲ期患者肿瘤组织 1 例卵巢癌手术化疗后复发患者肿瘤组织
（66.87%） （98.64%）

图 4-16-21 CD44V5 基因编码蛋白在各种癌组织细胞中表达

（FL1：CD44V5 -FITC）

310
 1 例升结肠癌患者外周血 1 例子宫内膜癌患者外周血
（3.46%） （3.86.%）

1 例胃癌患者外周血 1 例乳腺癌转移子宫内膜癌肿瘤组织
（2.87%） （36.47%）

1 例子宫内膜癌Ⅱ-Ⅲ级患者瘤组织 1 例直肠癌腹腔转移患者肿瘤组织
（48.86%） （49.76%）

图 4-16-22 CD44V6 基因编码蛋白在各种肿瘤组织中的表达

（FL1： CD44V6 -FITC）

311
 1 例胃癌患者肿瘤组织 CD44V6+
细胞为 14.52%

1 例胃癌淋巴结转移患者肿瘤组织
CD44V6+细胞为 28.51%

1 例胃癌远处广泛转移患者癌组织
CD44V6+细胞为 94.28%

图 4-16-23 胃癌患者肿瘤组织 CD44V6 基因编码蛋白表达与肿瘤转移

（FL1： CD44V6 -FITC）

312
 1 例结肠癌患者肿瘤组织
nm23+细胞为 16.74%

1 例直肠癌患者肿瘤组织
nm23+细胞为 45.68%

1 例升结回肓部肠癌患者
肿瘤组织 nm23+细胞为 83.65%

图 4-16-24 nm23 基因编码蛋白在各种癌组织细胞中的表达

（FL1： nm23 -FITC）

313
4、多药耐药基因编码蛋白（p170）的表达

外周血样本 p170+细胞率为 15.32%，平均荧光强度为 90

肿瘤组织样本 p170+细胞为 97.78% ，平均荧光强度为 57.6

图 4-16-25 1 例卵巢癌患者 p170 蛋白在外周血及肿瘤组织细胞中的表达

（左：散点图，右：直方图； FL2：p170-PE）

314
 1 例小细胞肺癌肿瘤组织 p170+细胞表达率为 0.59% ，平均荧光强度为 3.2

1 例原发性肝癌肿瘤组织 p170+细胞表达率为 8.05%，平均荧光强度为 6.0

1 例非霍杰金淋巴瘤肿瘤组织 p170+细胞表达率为 49.54%，平均荧光强度为 32.3

315
1 例胰腺癌肿瘤组织 p170+细胞表达率为 99.59%，平均荧光强度为 37.9

1 例直肠癌肿瘤组织 p170+细胞表达率为 31.26%，平均荧光强度为 56.2

图 4-16-26 各种肿瘤组织多药耐药基因（p170）的表达
（左：散点图，右：直方图； FL2：p170-PE）

316
 化疗前 p170 表达率为 17.44%，平均荧光强度为 41.8

化疗后 1 个月 p170 表达率为 50.3%，平均荧光强度为 67.0

图 4-16-27 1 例胃癌患者化疗前后肿瘤活检组织 p170 蛋白表达的变化

（左：散点图，右：直方图； FL2：p170-PE）

317
 化疗前 p170 表达率为 0.53%，平均荧光强度为 10.9

化疗后 1 个月 p170 表达率为 100.0%，平均荧光强度为 71.1

图 4-16-28 1 例非霍奇金淋瘤患者化疗前后骨髓细胞 p170 蛋白的表达

（左：散点图，右：直方图； FL2：p170-PE）

318
 化疗前 p170 基因在外周血细胞中的低水平表达（9.98%）

化疗后 3 个月 p170 基因在外周血细胞中的高水平表达(97.11%)

化疗后 9 个月 p170 基因在外周血细胞中的较高水平表达（43.25%）

图 4-16-29 肿癌患者外周血细胞 p170 基因骗蛋白表达与化疗时间的关系

（左：散点图，右：直方图； FL2：p170-PE）

319
5、Fas 基因蛋白的检测.

1 例升结肠癌肿瘤组织样本 CD95 的低水平表达（0.57%）

1 例乳腺癌肿瘤组织样本 CD95 的中水平表达（47.15%）

1 例胃癌患者瘤组织样本 CD95 的高水平表达（68.97%）

图 4-16-30 在癌组织细胞中 CD95 表达的不同水平和不同分析方法

(左：散点图，右：直方图；FL2：CD95-FITC)

320
正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

图 12 精子发生示意图

321
正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

322
正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图

（单倍体细胞 100%） （单倍体细胞 100%）

323
（十八） 自发荧光药物进入细胞浓度的检测

对照样品（0h） 实验样品(加药 12h)

阳性细胞为 13. 45%

阿霉素自发荧光在外周血细胞中的表达
1 例白血病患者给药（阿霉素）后 12h 外周血细胞中药物浓度的检测

对照样品(0h) 实验样品(加药后 24h)

阳性细胞为 49.29%

表阿霉素自发荧光在外周血细胞中的表达
1 例乳腺癌患者给药（表阿霉素）后 24h 外周血细胞中药物浓度的检测

图 4-18-1 自发荧光药物在体内组织细胞中的表达

324
(十九) -其它

正常对照 M1 为 0.45% Ph 染色体（-）者 M1 为 0.05%

出现少部分 Ph 染色体患者 出现大量 Ph 染色体者

M1 为 15.76% M1 为 89.54%

图 4-19-1 急性淋巴细胞白血病（ALL）-Ph 染色体频率与患者外周血细胞 KOR-SA3544

抗原表达
——用于诊断 Ph 阳性 ALL 及检测 Ph 型 ALL 缓解期微小残留灶

325
 患者红细胞 CD59+细胞表达明显降低 患者红细胞 CD55+细胞显著降低

患者白细胞 CD59+细胞显著增加 患者白细胞 CD55+细胞显著增加

图 4-19-2 1 例阵发性血红蛋白尿(PNH)患者红、白细胞 CD55 和 CD59 的表达 (直方图)

发作性夜间血红蛋白尿症（PNH）时，由于糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合蛋白和 GPI 结合
蛋白的发生障碍，红细胞 CD55（DAF）和 CD59 减少或缺如，故用来确定 PNH 的诊断。

326
 同型对照 正常人

轻度阵发性血红蛋白尿患者 重度阵发性血红蛋白尿患者

图 4-19-3 阵发性血红蛋白尿(PNH)患者病情与外周血 CD55+/CD59+细胞表达(点阵图)

327
 正常人外周血细胞 MS 患者外周血细胞

图 4-19-1 多发性硬化病（MS）患者外周血 T 细胞 CD8+细胞中 IFN-γ的表达

——在外周血细胞散射光图上，设“门”取淋巴细胞，分析 CD3+细胞；分析 CD3+/CD8+

细胞与 IFN-γ双参数表达分析

328
329