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Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Quimica

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Prof. Rodrigo Pires do Nascimento 2012

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1. Introdução ao Laboratório de Microbiologia

 Apresentação do Laboratório de Microbiologia  Normas de Segurança em Laboratório  Observação dos Microrganismos no Ambiente

Os microrganismos são encontrados em praticamente todos os ambientes naturais, como ar, água, solo, alimentos, esgoto, corpo humano, plantas, animais, fendas hidrotermais, lagos salinos, etc. Nestas condições, eles se apresentam como populações mistas, e para que possamos estudá-los no laboratório, necessitamos separá-los em espécies individuais, formando culturas puras. Definições Cultura Pura – consiste no crescimento, em meio nutritivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes à mesma espécie de microrganismo. Colônia – aglomerado de clones (células idênticas) oriundos da multiplicação de uma célula mãe (progressão geométrica), em um meio nutritivo sólido, visível a olho nu. Esterilização – consiste na eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia – procedimento que envolve o uso das manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde não são desejados.

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Cultivo de Microrganismos: Meios de Cultura sólidos líquidos semi-sólidos (agar em pé)
agar inclinado agar em placa

Vidraria

tubos (rosca, algodão, alumínio) pipeta Pasteur beckers placas de Petri Erlenmeyers balões volumétricos

Câmaras de Cultivo

banhos incubadoras

Câmaras de Inoculação

câmara asséptica câmara de fluxo laminar

Esterilização:  Autoclave  Forno Pasteur  Filtros Esterilizantes Transferência de Microrganismos:  Alças e agulhas de inoculação  Pipetas (vidro ou plástico)  “Swabs”

Preservação dos Microrganismos:  Refrigeradores  Freezers  Liofilizadores Outros materiais de laboratório:  Bico de Bunsen  Cânulas de placas e pipetas  Algodão cardado  Papel de embrulho  Espátulas e Pinças

que orientará sobre as providências necessárias. material inflamável e equipamentos sensíveis a fumaça (microscópios).  Após trabalhar com qualquer tipo de material microbiológico. Flambe alças e agulhas antes e depois de usar (VERIFIQUE A PRESENÇA DE DEPÓSITOS APROPRIADOS PARA O DESCARTE DE PLACAS DE PETRI E PIPETAS). . Assim sendo. dos funcionários encarregados pela limpeza da sala e das pessoas que se aproximarem. pela segurança dos seus colegas. deverá ser comunicado ao responsável imediatamente. pois você pode quebrar algum frasco. água e sabão e também faça a limpeza da bancada. partes expostas do corpo ou vestes. Este equipamento de proteção individual (EPI) protegerá você e suas roupas comuns contra contaminações e danos. pipetas.  Qualquer contato de mãos. após ter sido utilizado. visando minimizar os acidentes e aumentar o nível de consciência dos profissionais de laboratório é importante seguir algumas normas:  Dentro do laboratório de microbiologia. por conseguinte. sempre use um jaleco. guarda-pó ou avental. etc.  Cuidado com gestos bruscos e impetuosos no decorrer de uma prática ou de um experimento.  Não fume no interior da sala.4 2. Mesmo que o risco seja baixo. infeccioso ou não. a sua atitude na sala de aula deverá ser consciente e sobretudo responsável com as normas de segurança aplicadas a qualquer Laboratório de Microbiologia NB-1. Deste modo.  Nunca coloque o instrumental (alças.  Assim que entrar no Laboratório. faça a desinfecção das mãos com solução germicida. cuidado nunca é demais. lavar as mãos antes de realizar qualquer atividade de aula prática ou pesquisa. o aluno irá trabalhar com material de baixo risco infeccioso e. será responsável pela sua própria segurança. Lembre-se que há gás. eventualmente. espalhando assim material biológico que pode ser infeccioso. Normas de Segurança de Aulas Práticas No decorrer das aulas. com material possivelmente infeccioso. causados por corantes ou outras substâncias.) sobre a mesa.

5  Antes de acender o Bico de Bunsen. em nenhum equipamento do laboratório. desliga-lo.  Cabelos compridos devem ser mantidos presos para evitar acidentes. sem a ordem do professor. coloca-lo na posição inicial.  Não abra. bases ou suspensões com microrganismos.  Para abrir e fechar um tubo que contenha material microbiológico ou meio de cultura a ser inoculado. segure-o com a mão esquerda (se for destro). EVITE ACIDENTES. sempre dentro da zona de segurança do Bico de Bunsen. os meios de cultura que estiverem sobre a mesa. beber.  Qualquer problema que venha a ocorrer comunique imediatamente ao responsável. Sempre que possível use pipetadores ou peras. retirar a lâmina. sem autorização do responsável. . Assim você evita qualquer dano em caso de um possível acidente. inocule ou retire o material e novamente aproxime a boca do tubo na chama. Sandálias abertas ou Chinelos não são permitidos dentro do laboratório.  Nunca pipete com a boca ácidos.  Não mexa.  Ao utilizar o microscópio. tire a tampa com a mão direita e procure retê-la com o dedo mínimo. maquilagem ou roer as unhas. EVITE CONTAMINAÇÃO. fazer higiene bucal. não esqueça de ao findar a sua utilização.  Utilize vestimentas adequadas.  Dentro de um laboratório de microbiologia não se deve comer.  Mantenha as unhas bem cortadas.  Coloque as lâminas utilizadas em uma travessa de vidro contendo desinfetante. verifique se a entrada de ar do bico esta na posição correta e se a saída de gás esta fechada. Aproxime então a boca do tubo na chama do bico. NUNCA DEIXE A TAMPA OU ROLHA SOBRE A MESA. limpar a objetiva com lenço de papel (caso utilize a objetiva de imersão) e cobri-lo adequadamente.

APLICAÇÕES • estudos que fundamentam a concessão. • estudos de campos. 3. químicas. renovação ou modificação de registro e pesquisas de produtos químicos. realizados. monitorados. • estudos conduzidos em laboratórios de qualquer natureza. • O Diretor de Estudos (Pesquisador Principal) é o principal responsável pela condução do estudo em toda a sua extensão. registrados e relatados. biológicos ou biotecnológicos. • testes de produtos químicos. equipamentos e pessoal necessário para a condução dos estudos. 3. biológicos ou biotecnológicos para obtenção de propriedades físicas. UNIDADE OPERACIONAL: Laboratório • A Unidade Operacional engloba instalações.1.2. físico-químicas e dados de segurança. Boas Práticas de Laboratório • É o conjunto de normas que dizem respeito à organização e às condições sob as quais estudos em laboratório e/ou campo são planejados.6 Produto Radioativo Risco Biológico 3. .

contendo. • O Patrocinador (Agência de Fomento) é a pessoa ou entidade que dá apoio a um estudo através de provisões financeiras ou outros recursos. notas ou cópias fiéis aos mesmos. microrganismos. sistema químico.3. designado pelo Diretor de Estudos para executar as atividades relacionadas à garantia de qualidade. • Os Dados Brutos são documentos de laboratório. físico. estado em que se encontra o estudo. • A Data de Finalização do Estudo é a data na qual se o relatório final é assinado pelo Diretor de Estudos. memorandos. ESTUDO • O Estudo é um ensaio ou conjunto de ensaios nos quais uma ou mais substânciasteste são estudadas para a obtenção de dados sobre suas propriedades e/ou segurança.7 • A Unidade de Garantia de Qualidade é uma pessoa ou um grupo de pessoas. 3. biológico ou biotecnológico ainda não exposto a substância-teste ou substância de referência. no mínimo. • A Data do Início do Estudo é a data na qual se inicia o trabalho no sistema-teste. os seguintes dados: substância-teste. vegetal. registros. . • A Agenda-Mestre é uma tabela onde constam dados referentes aos estudos conduzidos segundo os princípios da BPL. • A Data do Término do Estudo é a data na qual se termina o trabalho no sistemateste. o objetivo do estudo e como será conduzido. • O Espécime é qualquer material derivado de um sistema-teste encaminhado para exame. • O Protocolo (Plano) de Estudos é o documento que define o título. animal e ao meio ambiente. • O Sistema-Teste é qualquer animal. identidade do patrocinador e nome do diretor de estudos. resultantes de observações originais e das atividades de um estudo. natureza do estudo. análise ou armazenamento. data do início do estudo. devidamente autorizado e assinado pelo Diretor de Estudos. planta. • Os Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) são procedimentos escritos que descrevem como conduzir as rotinas laboratoriais ou atividades normalmente não especificadas ou detalhadas no protocolo de estudo. em que os últimos dados brutos são coletados. com respeito à saúde humana. sistema-teste.

1. O trabalho é conduzido. Os níveis são designados em ordem crescente. 4.8 4. com adoção das boas práticas laboratoriais (BPL). Equipamentos específicos de proteção ou características especiais de construção não são geralmente usados ou exigidos. Nível de Biossegurança 1 É o nível de contenção laboratorial que se aplica aos laboratórios de ensino básico. em bancada. meio ambiente e à comunidade. conforme o nível de contenção necessário. O laboratório não está separado das demais dependências da edificação. Estes níveis de contenção são denominados de níveis de Biossegurança. além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas laboratoriais. pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal do laboratório. O nível de Biossegurança 1 é adequado ao trabalho que envolva agentes bem caracterizados e conhecidos por não provocarem doença em seres humanos sadios e que possuam mínimo risco ao pessoal do laboratório e ao meio ambiente. Abaixo relacionamos os padrões e práticas especiais. em geral. onde são manipulados os microrganismos pertencentes a classe de risco 1. . O pessoal do laboratório deve ter treinamento específico nos procedimentos realizados no laboratório e devem ser supervisionados por um profissional treinado em Biossegurança e com conhecimentos específicos da área. Não é requerida nenhuma característica de desenho. Níveis de Biossegurança e Classes de Risco Para manipulação dos microrganismos pertencentes a cada uma das quatro classes de risco devem ser atendidos alguns requisitos de segurança. equipamentos de segurança e detalhamento de itens referentes às instalações que devem ser respeitados quando houver a manipulação de agentes classificados como microrganismos da classe de risco 1.

2. (3) precauções extremas serão tomadas em relação a objetos perfuro-cortantes infectados. O nível de Biossegurança 2 é semelhante ao nível de Biossegurança 1. onde são manipulados microrganismos da classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2.9 4. O nível de Biossegurança 3 possui semelhanças ao . Nível de Biossegurança 3 É destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3 ou para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco 2. Deve ser mantido controle rígido quanto a operação. inspeção e manutenção das instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos. sendo necessário. 4. É adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pessoais e para o meio ambiente. (4) determinados procedimentos nos quais exista possibilidade de formação de aerossóis e borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou outros equipamentos de contenção física. (2) o acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos operacionais. o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho e organização do laboratório). Nível de Biossegurança 2 É o laboratório de contenção.3. sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir. desenho e construção laboratoriais especiais. Difere do NB-1 nos seguintes aspectos: (1) O pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e devem ser supervisionados por profissionais competentes. além da adoção das boas práticas. Aplica-se aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico. classificados como microrganismos da classe de risco 2.

de diagnóstico. além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de outras áreas. Além das práticas padrões e especiais estabelecidas para os laboratórios NB1 e NB-2. ou de contenção. destina-se a manipulação de microrganismos da classe de risco 4. sendo . Esses laboratórios requerem. Nível de Biossegurança 4 Também chamado de laboratório de contenção máxima. 4. A equipe profissional deve possuir treinamento específico no manejo de agentes patogênicos. além dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1. É aplicável para laboratórios clínicos. ou seja. Os trabalhadores devem usar roupas de proteção específicas para esta área e equipamentos de proteção individual. O laboratório de nível de Biossegurança 3. ensino e pesquisa ou de produção onde o trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente fatais. O nível de Biossegurança 4 possui semelhanças quanto aos procedimentos e práticas estabelecidas ao nível de Biossegurança 3. além da existência obrigatória de dispositivos de segurança e do uso.10 nível de Biossegurança 2 e ao nível de Biossegurança 1.4. com microrganismos que acarretam elevado risco individual e baixo risco para a comunidade. de cabine de segurança biológica. barreiras de contenção (instalações. igualmente obrigatório. nível de Biossegurança 2 e ao nível de Biossegurança 1. Esse nível de contenção exige a intensificação dos programas de boas práticas laboratoriais e de segurança. devem ser adotadas as recomendações abaixo descritas que se aplicam à manipulação de agentes classificados como sendo da classe de risco 3. 2 e 3. potencialmente letais. sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir. onde há o mais alto nível de contenção. por isso recomendamos a leitura dos dois níveis anteriores. devendo ser supervisionados por profissional altamente capacitado e que possua vasta experiência com estes agentes. destina-se ao trabalho com agentes de risco biológico da classe 3. como resultado de exposição por inalação. desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança.

além de apresentarem um potencial relevado de transmissão por aerossóis. só funcionem sob o controle direto das autoridades sanitárias. ou de contenção máxima. por isso recomendamos a leitura dos três níveis anteriores. este deve ser testado previamente através de exercícios de treinamento. Os trabalhadores devem ser supervisionados por profissionais altamente competentes. O acesso ao laboratório deve ser rigorosamente controlado por sistemas automatizados. das práticas padrões específicas.11 acrescentado de especificidades que veremos a seguir. O nível de Biossegurança 4 é indicado para o trabalho que envolva agentes exóticos e perigosos que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infecções que podem ser fatais. É necessária a elaboração de um manual de trabalho pormenorizado. O laboratório do nível de Biossegurança 4 deve possuir características específicas quanto ao projeto e a engenharia para prevenção da disseminação de microorganismos no meio ambiente Todos os procedimentos dentro do laboratório devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica Classe III ou cabines de Classe II usadas em associação com roupas de proteção pessoal com pressão positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida. treinados e com vasta experiência no manuseio dos agentes manuseados. ventiladas por sistema de suporte de vida. dada a grande complexidade do trabalho. Um manual de operações específico para as instalações deve ser preparado ou adotado. classificados como microrganismos da classe de risco 4. Recomenda-se que os laboratórios de nível de Biossegurança 4. do equipamento de contenção e das características do planejamento do laboratório. O trabalho deve ser executado exclusivamente dentro de cabines de segurança biológica Classe III ou dentro de cabines de segurança biológica da Classe II associadas ao uso de roupas de proteção com pressão positiva. A instalação laboratorial deve estar localizada em uma edificação separada ou em uma área controlada dentro do edifício. sendo que só deve operar com técnicos especializados e treinados em procedimentos de Biossegurança. . que seja totalmente isolada de todas as outras. a equipe do laboratório deverá ter um treinamento específico e completo direcionado para a manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos e deverá ser capaz de entender as funções da contenção primária e secundária. além disso. além dos procedimentos de segurança específicos.

à comunidade e ao meio ambiente. Os laboratórios de nível de Biossegurança 4 podem se basear em um dos modelos ou em uma combinação dos dois modelos na construção de um só laboratório. cada tipo deve atender todos os requisitos identificados para o mesmo.974 e do decreto nº 1. em 1995. principalmente orientada pelo potencial de risco que oferece ao indivíduo. em cumprimento da Lei nº 8. apresenta. que estabelece normas para o trabalho em contenção com organismos geneticamente modificados e.5. o Brasil utilizava as classificações existentes mundialmente. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). de julho de 1997. 4. onde os microrganismos exóticos sofrem um controle rigoroso das autoridades de saúde pública. tais como a do Center for Disease Control (CDC). para o gerenciamento e normatização do trabalho com engenharia genética e a liberação no ambiente de OGMs em todo o território brasileiro. Até 1995. CLASSES DE RISCO A classificação de risco de um determinado microrganismo patogênico baseia-se em diversos critérios que orientam a avaliação de risco e está.752. surgem uma série de instruções normativas.12 Existem dois modelos de laboratório de nível de Biossegurança 4: (A) Laboratório onde todas as manipulações do agente são realizadas em uma cabine de segurança biológica Classe III (B) Laboratório onde a equipe usa uma roupa de proteção de pressão positiva. Todas as classificações utilizam os mesmos critérios para a avaliação de risco dos microrganismos. Se a combinação for utilizada. em seu anexo. porém existem alguns critérios variáveis de acordo com a realidade epidemiológica local. do Ministério de Ciência e Tecnologia. o que pode levar à confusões. dentre muitas. com a formação da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança. No Brasil. a classificação de agentes etiológicos humanos e animais com base no risco apresentado. Dentre elas está a Instrução Normativa nº 7. . National Institute of Health (NIH). Comunidade Européia. Cada país adota uma classificação.

O patógeno pode provocar infecções no homem e nos animais graves. São microrganismos que podem provocar infecções. Classe de risco 1 O risco individual e para a comunidade é ausente ou muito baixo. não existindo medidas profiláticas ou terapêuticas.1. porém. .5.5.3. Exemplos: Vírus da Encefalite Equina Venezuelana. Exemplos: Vírus Marburg e Vírus Ebola.13 Esta instrução agrupa os microrganismos em classes de 1 a 4.5. Salmonella tiphymurium.2. sendo o risco de propagação limitado. Exemplos: Bacillus subtilis. 4. São microrganismos que representam sério risco para o homem e para os animais. Classe de risco 3 O risco individual é alto e para a comunidade é limitado.4. ou seja. Classe de risco 4 O risco individual e para a comunidade é elevado. podendo se propagar de indivíduo para indivíduo.5. são microrganismos que têm baixa probabilidade de provocar infecções no homem ou em animais. Vírus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni. sendo altamente patogênicos. 4. 4. Serratia marcescens. de fácil propagação. 4. dispõe-se de medidas terapêuticas e profiláticas eficientes. porém existem medidas terapêuticas e de profilaxia. Classe de risco 2 O risco individual é moderado e para a comunidade é baixo. sendo a classe 1 a de menor risco e a classe 4 a de maior risco. HIV e Mycobacterium tuberculosis. Exemplos: Klebisiella pneumoniae.

impede-se que ocorra a contaminação de materiais estéreis e meios de cultivo estéreis por estes microrganismos. por exemplo. 3. impedir a contaminação de culturas pura. pipetas Pasteur. tubos com crescimento de Serratia. . que os microrganismos presentes no ar. desinfecção e assepsia. Objetivo: Conceitos de esterilização.14 5. ou ainda. ou depositados sobre as mais variadas superfícies que possam estar próximas ao ambiente de trabalho e que podem ser carregados com as partículas de poeira. Materiais: Tubos vazios esterilizados (18 x 150 mm). com auxílio de uma alça de platina. Assim. tubos de ágar simples inclinado.Incubar todos os tubos a 28°C por 72 horas.Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo ágar simples inclinado para um outro tubo contendo o mesmo meio de cultivo estéril. algodão cardado. papel de embrulho. utilizando pipeta Pasteur ou pipeta graduada estéril (2 mL) ou ponteiras estéreis (100 – 1000 L) 2. pipetas estéreis (ou ponteiras de 100 – 1000 L). Procedimentos: 1. tubos contendo meio caldo simples. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. Desenvolver habilidade de manipular tubos de ensaio contendo meio de cultivo estéril. alças e agulhas de platina. bem como transferir microrganismos de um meio sólido para outro meio sólido e também meio líquido. 4.Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo ágar simples inclinado para um outro tubo contendo caldo simples estéril. Manobras Assépticas As manobras assépticas vão impedir.Distribuir o caldo simples estéril do tubo estéril para um outro tubo vazio e estéril.

Observar. características como ausência de turvação. 1 flambar a alça 2 remover as tampas e flambar os tubos 3 transferir a cultura 4 flambar os tubos e retampar 5 flambar a alça novamente . nos tubos de ágar simples inclinado submetidos à inoculação com S. nos tubos de caldo simples. se houve ou não turbidez. marcescens. neste caso. nos tubos de caldo simples submetidos à inoculação com S. não formação de película ou depósito no meio de cultivo.15 Interpretação dos Resultados: Observar. pois a grande maioria das bactérias cresce turvando meio de cultivo líquido. colônias com aspecto vermelho-alaranjado. Se por algum motivo for observado qualquer um dos itens mencionados. marcescens. indica que o procedimento de assepsia não foi conduzido de maneira correta. significa que a manobra asséptica não foi conduzida corretamente. Observar. Se por algum motivo não for observado colônias com essa coloração. Porém. não é possível determinar se houve ou não contaminação. submetidos à transferência em condições de assepsia.

retirar a rolha de algodão. c) Deixar arrefecer o instrumento antes de obter o inóculo. mantendo a alça bem firme na mão. apresentam uma organização estrutural totalmente diferente daquelas encontradas em células. Os procariotos podem variar de 0. já arrefecida na zona de segurança.16 PRINCIPAIS TÉCNICAS DE MANOBRAS ASSÉPTICAS a) Trabalhar dentro da zona de segurança do bico de Bunsen ( 10 cm de raio). Observações Microscópicas de Microrganismos Os microrganismos constituem um grupo de seres vivos com dimensões reduzidas e bastante variáveis de acordo com o grupo a que pertencem. b) Flambar a alça antes e após a inoculação. quando for pipeta de vidro e mantê-la dentro da zona de segurança. dentro do tubo e retirar o conteúdo. por sua vez. Os eucariotos constituem o grupo mais heterogêneo. O microscópio pode ser óptico (utiliza a luz visível ou ultravioleta para gerar a imagem de um objeto que normalmente está colocado sobre uma lâmina de vidro) ou eletrônico. que pode chegar a 600 m). Os vírus. 6. . imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. preferencialmente na parte interna do recipiente. dentro da zona de segurança. A visualização dos microrganismos somente pode ser feita através de um equipamento denominado microscópio. ou seja. SEMPRE. variando de 10 a 100 m. g) Abrir uma pipeta ou uma caixa de ponteiras estéreis dentro da zona de segurança. e variam de 27 a 300 nm. d) Com o auxílio do dedo menor. f) Introduzir a alça de platina. e) Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio de cultivo estéril. flamba-la rapidamente.3 a 1 m (exceto o Epulopiscium. Em hipótese alguma coloque a alça ou a rolha na bancada ou mesmo retire da zona de segurança. os recipientes com meio de cultivo ou não devem ser abertos próximos a chama do bico. com meio de cultivo.

As distorções mais clássicas da microscopia óptica são conhecidas pelo nome de aberrações e são causadas por diferenças no plano do feixe de luz paralela que entra pelas lentes do microscópio. As interações podem ser definidas como Transmissão. .17 A grande maioria dos microscópios ópticos é capaz de fornecer um aumento final de até 1200 vezes. A aberração cromática é derivada dos diferentes planos de foco de cada um dos comprimentos de onda que formam a luz branca. A trajetória da luz de um microscópio óptico não corresponde exatamente ao modelo teórico fundamentado nos estudos de óptica geométrica. Porém. Reflexão. As interações da luz com as lentes dos microscópios ópticos causam distorções na imagem formada do objeto que quase sempre são percebidas pelo observador como uma falta de foco ou definição final da imagem. Absorção e Refração. cujo valor mais comumente utilizado é de 0. A curvatura de campo faz com que a imagem de um objeto plano seja curva. define-se como limite de resolução a distância mínima entre dois objetos a partir da qual estes podem ser vistos como entidades individualizadas.2 m e é conseguido através da seguinte fórmula: D = 0. Difração. Assim. espelhos) aos microscópios. anéis de difração. a resolução é a capacidade que um sistema óptico tem de distinguir objetos separados por pequenas distâncias.5 m e NA. mas sem grandes resoluções. A aberração esférica é causada pelo formato das lentes que desviam certos componentes do feixe luminoso provocando diferentes planos de foco. dependendo das lentes e dos condensadores.61 NA Onde o D corresponde ao limite de resolução (menor distância entre dois detalhes separáveis) e  corresponde ao comprimento de onda da luz visível. O limite de resolução do microscópio óptico é de aproximadamente 0. ou seja. o objeto terá foco apenas na região central. aberturas. a abertura numérica. A luz cria diferentes rotas decorrentes da sua interação com diferentes tipos de materiais que não pertencem (lâminas) ou que pertencem (lentes.

pois o nosso olho é mais sensível exatamente ao comprimento de onda verde. onde são combinados formatos e materiais diferentes para que se façam as correções necessárias. d) Plan-acromática – correção equivalente à das acromáticas e correção para curvatura de campo. b) Semi-acromática – possui fluorita na sua composição. c) Apocromática – a correção da aberração cromática se dá sobre todo o espectro visível. semelhante a acromática.18 As aberrações são corrigidas com o uso de lentes compostas formadas por até 10 lentes inseridas no corpo de uma lente objetiva. São satisfatórias para a observação direta. . Existem diferentes tipos de lentes objetivas: a) Acromática – apresenta a melhor correção da aberração cromática para a região central do espectro de luz visível.

. os quais fornecem todas as informações necessárias para que se escolha a melhor objetiva para a observação de diferentes amostras. As lentes objetivas são identificadas por uma série de códigos impressos no corpo de cada uma delas.19 e) Plan-apocromática – correção equivalente à das apocromáticas e correção de curvatura de campo.

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d) Limpar sempre a objetiva de imersão após o uso. Caso contrário. pois um excesso de xilol pode dissolver o cimento das lentes. i) Habitue-se não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o microscópio Uso do microscópio a) Com a amostra a ser examinada sempre na parte superior. c) Não tocar as lentes. f) Manter a platina sempre limpa e seca. Cuidado. colocar a lâmina sobre a platina. pois neste curso quase todas as técnicas empregadas exigem que a lâmina seja examinada sempre na posição horizontal. g) Não inclinar o microscópio. . limpe-as com algodão ou com pano que serão fornecidos. b) Ajustar a iluminação de forma a que passe maior quantidade possível de luz através da amostra. nunca focalizar abaixando o canhão com o parafuso macrométrico olhando para a ocular. Todas as conecções devem funcionar suavemente. tomando o cuidado de que a parte a ser examinada esteja bem no centro. e) Não esquecer a lâmina no microscópio após o uso. pode aplicar um pouco de xilol sobre o algodão. Se estiverem sujas. chame o professor. Limpa-la com o guardanapo apropriado. Portanto.21 Cuidados no uso do microscópio a) Nunca força-lo. Se o óleo está endurecido. h) Quando o microscópio não estiver em uso. b) As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. deverá ser guardado coberto ou em sua caixa.

A seguir. Nunca efetuar esta operação olhando pela ocular. leveduras. e) Após focalizar grosseiramente. Nunca movimentar o condensador para baixo para diminuir a quantidade de luz. h) Para utilizar a objetiva 100X. Se não conseguir. reajustar o foco com o parafuso micrométrico e a iluminação como no item f. f) Acertar a quantidade de luz. Nunca tentar focalizar diretamente com as objetivas de maior aumento Objetivos: Manusear adequadamente um microscópio óptico. O condensador deve estar sempre em posição elevada. é necessária a colocação de uma gota de óleo sobre a lâmina depois da perfeita focalização com as objetivas de aumento 10X e 45X. Reajustar a focalização com o parafuso micrométrico e a iluminação com o diafragma.5 cm da lâmina. distinguir morfologicamente bactérias. identificar os principais tipos morfológicos de bactérias. girar o revolver até encaixar a objetiva de aumento 100X. d) Olhar pela ocular e levantar levemente o canhão até obter uma focalização grosseira. utilizar o parafuso micrométrico para uma focalização fina. A iluminação deve ser adequada. nem fraca nem excessiva. g) Se necessário um aumento maior.22 c) Colocar a objetiva de menor aumento e abaixar o canhão utilizando o parafuso micrométrico até que a lente esteja cerca de 0. girar o revolver para utilizar a objetiva de aumento 45X. ficando esta imersa no óleo e sem que a lente toque na lâmina. Observando lateralmente. movimentando o diafragma. repetir a operação. bolores e protozoários. . conhecer os principais métodos de observação microscópica de microrganismos.

1ª PARTE (Coloração de Gram) Procedimentos: Culturas bacterianas em meio sólido ou líquido.8 g 100 ml Misturar as soluções A e B e deixar em repouso por 24 horas antes do uso. A. Composição dos corantes A. lugol.3.0 g 100 ml . Streptomyces sp. A. lupas. corante fucsina básica.1. Aspergilus niger).0 g 2.0 g 100 ml 1. placas ou tubos com crescimento microbiano (Escherichia coli. Solução de cristal violeta (corante) Solução A Cristal violeta Etanol:acetona 2. etanol-acetona (1:1 v:v). Bacillus subtillis. Solução de fucsina (contra-corante) Fucsina Água destilada A.2.. Staphylococcus aureus. lamínulas. corante cristal violeta. microscópio óptico e bico de Bunsen. microscópios ópticos. alça. fucsina). Saccharomyces cerevisiae.23 Materiais: lâminas. lâmina de microscopia.. bico de Bunsen. lugol. Streptococcus sp.0 g 20 ml Solução B Oxalato de amônia Água destilada 0. bateria de corantes da coloração de Gram (cristal violeta. Solução de lugol (fixador) Iodo Iodeto de potássio Água destilada 1.

Coloração de Gram 1.24 Coletar uma pequena amostra de uma suspensão de células microbianas ou de uma colônia crescida em agar sólido. B.Preparo do esfregaço da bactéria.85%. com o auxílio de uma alça devidamente flambada (estéril). espalhando a gota. Preparo do esfregaço na superfície da lâmina C. flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. sobre uma lâmina de microscópio. em seguida. . fixá-lo com calor. Deixar o material secar e. Deve-se suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0.

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. o lugol. o cristal violeta. em 1884. 3. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.Adicionar solução de Lugol (fixador) sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço corado e deixar em repouso por 1 minuto. etanol-acetona e fucsina básica. seguido de tratamento com um fixador.Adicionar suavemente com álcool 96º para remover o complexo insolúvel p-rosaanilina (máximo de 5 segundos) e depois enxaguar a lâmina com água destilada para remover excesso de solvente.Adicionar solução de Cristal Violeta ou Violeta de Genciana sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço e deixar em repouso por 1 minuto.25 2. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. 6. com um corante primário. lugol. fixado pelo calor. em sua porção hidrofílica (citoplasma e espaço periplasmático) e hidrofóbica . insolúvel. com os reagentes cristal violeta.Adicionar a solução de Fucsina ou Safranina sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço e deixar em contato por cerca de 40 segundos. Princípio da Coloração de Gram e Interpretação dos Resultados A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938). 4. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo (p-rosa-anilina).Descartar o excesso de corante e enxaguar a lâmina com água destilada. O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. 5.

a amostra é tratada com um corante secundário (contra-corante). Ao microscópio. portanto. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. podendo produzir resultados falsos. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros da peptidoglicana. Por outro lado. Células de bactérias Grampositivas. Portanto.26 (membrana). porosidade e integridade. tornando-as impermeáveis ao complexo. As figuras 1 e 2 mostram células de bactérias Gram-positiva e as figuras 3 e 4 mostram células de bactérias Gram-negativa. Em seguida. células velhas. . o uso de material fresco é importante. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. o etanol-acetona (1:1 v:v). Por outro lado. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. A etapa da descoloração é crítica. descorando as células. O corante cristal violeta pode ser substituído. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. a fucsina básica. densidade. com os mesmos resultados. A retenção ou não do corante primário é. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gramnegativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. ambas coradas pelo método de Gram e observadas ao microscópio óptico com aumento de 1000 vezes.

27 Figura 1 – Bacillus subtilis Figura 2 – Streptococcus oralis Figura 3 – Escherichia coli Figura 4 – Neisseria gonorrhoeae 2ª PARTE (visualização de fungos e leveduras) Em casos clínicos. na maioria das amostras. se a quantidade da amostra biológica for insuficiente para o exame microscópico e cultura do material. No entanto. desde que é método mais . a cultura. a observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico. pois demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma informação imediata ao médico. a qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. tem prioridade sobre o exame microscópico.

10ml .Liquido de montagem de Shear Composição: Acetato de potássio(solução aquosa a 2%) -------.Azul de Amann Composição: Lactofenol de Amann mais azul de algodão a 0.300ml Glicerina -------------------------------------------------. azul de algodão (corante) na proporção de 0.a. Excelente para coloração de esporos e micélios de fungos hialinos. Água .28 específico e em muitos casos. dependendo do tipo da amostra e suspeita clínica. Apresenta índice de refração de 1.180ml Glicerina p. mais sensível.120ml Álcool etílico 95% -------------------------------------. -----------------------. O exame microscópico da amostra é realizado por várias técnicas.45.1 –0. ------------------10ml Água destilada --------------------10ml Fenol crist.5%. Composição: Ácido lático p.5% Lactofuscina Fuscina ácida -------------------------------------. .Lactofenol de Amann É o mais usado em laboratórios de fitopatologia.1 a 0.0. Usualmente adicionase ao Lactofenol de Amann.1g Ácido lático --------------------------------------100ml .a.

assim a utilização da coloração não visa a diferenciação dos microrganismos. Cobrir a preparação com lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x). sobre fundo negro formado pela tinta nanquim EXAME MICROSCÓPICO COM COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Todos os fungos são “Gram-positivos” (coram-se de roxo). Nesta técnica. A amostra é . mas possibilita discriminar elementos fúngicos de artefatos existentes em urina. que se tornam mais evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. secreções e fezes. um erro bastante frequente é confundir linfócitos com células de leveduras. sobre uma lâmina.29 EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA) Utilizada em amostras de líquor. Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cápsula polissacarídica). A diferenciação é feita pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras. secreções ou exsudatos. para visualização de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus. Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada. além da presença de brotamentos. urina.

400x ou 1000x. A técnica se presta especialmente para fungos que esporulam na superfície de lesões / placas de Petri contendo meio de cultivo e cujos esporos não são produzidos no interior da frutificação. EXAME MICROSCÓPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA Preparações grosseiras para exame rápido podem ser obtidas estendendo-se sobre a superfície da lesão ou da cultura em placa de Petri um pedaço de fita adesiva transparente (durex). (ii) técnica da fita adesiva EXAME MICROSCÓPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA Preparações para exame rápido podem ser obtidas estendendo-se sobre a superfície cultura do fungo em placa de Petri um pedaço de fita adesiva transparente (durex). no qual o fungo é inoculado. A fita é removida cuidadosamente e readerida à lâmina. em movimentos circulares. A técnica se presta especialmente para fungos que esporulam na superfície de lesões / placas de Petri contendo meio de cultivo e cujos esporos não são produzidos no interior da frutificação. Primeiramente amostras ambientais devem ser coletadas e transportadas para o laboratório para serem processadas (isolamento por diluição seriada).30 espalhada de modo homogêneo. utilizando aumento de 100x. Com relação as amostras ambientais. a observação microscópica pode ser conduzida por 2 maneiras: (i) microcultivo: lâminas contendo uma fina camada de meio de cultivo. 400x ou 1000x. contendo 1 gota do corante azul de lactofenol. a utilização de visualização microscópica é essencial para a sua identificação e classificação. através da observação de estruturas de reprodução. Procedendo-se a observação ao microscópio. contendo 1 gota do corante azul de lactofenol. utilizando aumento de 100x. em uma lâmina de microscopia. . fixada com calor e submetida à coloração. A fita é removida cuidadosamente e readerida à lâmina. Procedendo-se a observação ao microscópio. Após cultivar e purificar os fungos isolados da amostra ambiental.

f b a e g d c a) Lâmina para microscopia com meio de cultura após inoculação do fungo. . é necessário ter uma placa de microcultivo esterilizada. c) Papel de filtro embebido em água destilada estéril. d) Placa de Petri. A placa funcionará como uma câmara úmida para o crescimento do fungo na superfície do meio de cultivo sobre a lâmina. g) Fungo filamentoso. Esta deve conter papel de filtro umedecido com água destilada estéril no fundo da placa e sobre o papel um bastão de vidro em forma de “U” junto com uma lâmina e lamínula. f) Meio de cultura.31 EXAME MICROSCÓPICO DIRETO EM MICROCULTIVO Para executar esta técnica. b) Bastão de vidro encurvado em forma de "U". e) Lamínula.

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