You are on page 1of 10

UNIVERZITET U TRAVNIKU FARMACEUTSKO-ZDRAVSTVENI FAKULTET TRAVNIK

Seminarski rad iz predmeta: „Analiza i kontrola lijekova“ Tema: GASNA HROMATOGRAFIJA

Travnik, akademska 2011/2012

Student:

0

SADRŽAJ :

UVOD....................................................................................................................2 GASNA HROMATOGRAFIJA........................................................................3-4 GAS NOSAČ.....................................................................................................4-5 KOLONE...........................................................................................................5-6 STACIONARNE LIKVIDNE FAZE................................................................6-7 UNOŠENJE UZORKA U INJEKCIONI SISTEM............................................7-8 PRIMJENA............................................................................................................8 LITERATURA......................................................................................................9

1

UVOD
Hromatografske metode služe za odjeljivanje, identifikaciju i kvantitativno odreĎivanje hemijskih sastojaka u složenim smjesama.Svim hromatografskim tehnikama zajedničko je postojanje nepokretne (stacionarne) i pokretne (mobilne) faze. Plinovita ili tekuća mobilna faza nosi komponente uzorka kroz stacionarnu fazu, a odjeljivanje se temelji na razlikama u brzini kretanja komponenti kroz stacionarnu fazu.Hromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st. Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje otopine biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim Ca-karbonatom. Odjeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime (grč. Chroma = boja) .Hromatografija može biti preparativna ili analitička. Preparativna teži da razdvoji komponente iz smješe za buduću upotrebu. Analitička hromatografija obično funkcioniše sa manjim količinama materijala i teži ka mjerenju relativne proporcije analitika u smjesi .Ova dva metoda se ne isključuju meĎusobno.

2

GASNA HROMATOGRAFIJA

Kod gasne hromatografije nepokretna faza je tečna ili čvrsta ,a pokretna je gasovita i nju čine inertni noseči gas i pare jedinjenja,koja se razdvajaju. Do dodira uzmeĎu ovih faza dolazi u hromatografskoj koloni. Zavisno od agregatnog stanja primjenjene nepokretne faze gasna se hromatografija dijeli na hromatografiju gas-tečno ili hromatografija gasčvrsto.Hromatografija gas-čvrsto podrazumjeva kolonu napujenu adsorbensom ujednačene krupnoće na kome se jedinjenja razdvajaju putem selektivne adsorpcije.Hromatografija gastečno kao nepokretnu fazu koristi kapilarni sloj tečnosti ravnomjerno rasporeĎen po inertnom nosaču ili po unutrašnjem zidu kolone. Razdvajanje komponenata iz smeše gasnom hromatografijom zasniva se na razlici ukoeficijen tima raspodele izmeĎu stacionarne tečne i mobilne gasovite faze (gas nosač). Šema gasnog hromatografa prikazana je na slici 1. Tehnika se primenjuje samo za ona jedinjenja koja se nalaze u gasovitom stanju, ili se pogodnim metodama mogu prevesti u gasovito stanje. Masti i ulja imaju relativno veliku molekulsku masu i nizak napon pare, pa se teško mogu direktnoispitivati gasnom hromatografijom. PrevoĎenjem masnih kiselina u metil-estre, koji imaju znatnonižu tačku isparavanja i stabilniji su, prevazilaze se navedeni problemi . Do razdvajanja faza dolazi uslijed različitih pokretljivosti različitih komponenata smeše unutar hromatografske kolone. Pri tome, kod najvećeg broja gasnohromatografskih analiza primenjuje se tzv. tehnika eluiranja koja se sastoji u neprekidnom proticanju nosećeg gasa konstantnom brzinom kroz hromatografski sistem. Koeficijent participacije-raspodele (K) definiše se kao odnos količine date komponente unutar tečne i gasne faze.Kod većine jedinjenja veličina K zavisi u najvećoj meri od rastvorljivosti njegovih para pod datim uslovima u upotrebljenoj tečnoj fazi. Uzorak se inače, pomoću šprica unosi u zagrijani isparivač gdje istog trena ispari i biva potom nošen pomoću gasne faze. Pri izlasku iz kolone razdvojena jedinjenja zajedno sa nosećim gasom prolaze kroz detektor i registruju se električni signali, čiji su intenziteti proporcionalni koncentracijama datih komponenata u nosećem gasu. Svaki signal, u takvom hromatografu, odgovara jednom hemijskom jedinjenju i okarakterisan je kvalitativno i kvantitativno vremenom zadržavanja (retencionim vremenom) i površinom.Vrijeme zadržavanja nekog jedinjenja predstavlja vrijeme koje protekne od ubrizgavanja smeše do pojave maksimuma odgovarajuċeg mu signala.Poredjenje retencionog vremena nepoznatog jedinjenja sa retencionim vremenom nekog poznatog jedinjenja (snimljenog-hromatografisanog pod istim uslovima) je jedna od najčešćih metoda identifikacije date komponente smeše. Retenciono vreme zavisi od temperature kolone, vrste i količine tečne faze, brzine protoka nosećeg gasa, dužine kolone, pada pritiska u koloni i zapremine praznog prostora u koloni i instrumentu zamerenje (tzv. mrtve zapremine). Zbog toga je moguće uporedjivati samo retenciona vremena izmerena pod istim uslovima protoka i temperature na istoj koloni, tj. istom uredjaju. Najpouzdaniji način poredjenja retencionih vremena je hromatografisanje nepoznate smeše, potom njeno hromatografisanje uz prethodno dodavanje u nju izvesne količine standarda i ponovno hromatografisanje ovako obogaćene smeše.Podešeno retenciono vrijeme je vrijeme koje je dobijeno oduzimanjem vremena potrebnog za savlaĎivanje mrtve zapremine, tj vremenu prolaska neke supstance kroz kolonu bez njenog zadržavanja (interakcije) unutar kolone. To je vrijeme od koga je oduzeto retenciono vreme vazduha.Relativno retenciono vreme je odnos podešenih retencionih vremena date komponente uzorka i standarda.Korigovano retenciono vreme dobija se kao umnožak podešenog retencionog vremena ifaktora odnosa pritiska nosećeg gasa na ulazu i na izlazu iz kolone.Ako je neko jedinjenje član homologne serije, moguća je njegova

3

identifikacija na osnovu semi-log dijagrama retencionog vremena ili retencione zapremine, preko broja C-atoma date homologne serije ugljovodonika, koja daje signal na istom mestu.

Gasni hromatograf sastoji se iz: cilindra sa nosećim gasom, merača protoka gasa,isparivača, šprica za unošenje uzorka, gasnohromatografske kolona, termostata,detektora, pisača i hromatografa.

SLIKA 1. Gasni hromatograf

1. 2. 3. 4.

GAS NOSAČ KOLONE STACIONARNE LIKVIDNE FAZE UNOŠENJE UZORKA I INJEKCIONI SISTEMI

GAS NOSAČ Osobine gasa nosača utiču na efikasnost razdavajanja, vrijeme analize i osetljivost detektora, pa se njegovom odabiru posvećuje velika pažnja. Bitno je da sve karakteristike gasa nosača ostanu konstantne (što je moguće više) tokom kretanja kroz aparaturu.Gas struji kroz kolonu i sa sobom uzorak u gasovitom stanju.Pri proticanju se zbog različitih koeficijenta raspodjele komponente iz smješe razdvajaju i kao takve dospjevaju u deteektor.Kao gasovi nosači se koriste helijum,azot,argon i vodonik,rjeĎe ugljen-dioksid,kisik i vazduh. Gasovi moraju biti permanentni, hemijski inertni prema analitima, malog viskoziteta,niske cijene i odlikovati se velikom čistoćom (99,99%) i dobrom termičkom provodljivošću (ukoliko se koristi detektor termičke provodljivosti). Obično se čuvaju u bocama od 40 dm3, pod pritiskomod 15 MPa (150 bar), osim CO2, koji se čuva pod pritiskom od 6 MPa. Pritisak od 150
4

bar-a na izlazu iz boce se redukuje membranskim redukcionim ventilom na oko 4-5 bar-a, a potom se pre ulaza u kolonu fino podešava igličastim ventilom. Optimizacija protoka mobilne faze izvodi se pomoču Van Deemterove jednačine. Apcisa minimuma krive zavisnosti visine ekvivalenta teorijskog poda od brzine kretanja gasa predstavlja optimalnu brzinu strujanja gasa nosača. Najveća efikasnost postiže se upotrebom vodonika,ili azota, ali je problem mala širina minimuma krive za N2, pa sa malim odstupanjima od optimalne brzine, efikasnost naglo opada. U kombinaciji GC-MS, N2 daje jon m/z =28, pa je onemogućeno snimanje masenih spektara ispod ove vrednosti. Osim toga, MS radi pod većim vakuumom, zbog čega i sistem pumpi mora biti snažniji, zbog čega se helijum pokazao kao mnogo pogodniji. Uobičajeni protok mobilne faze u ovakvom sistemu sa kvadrupolnim analizatorom iznosi 1 do 2ml/min. Gas nosač propušta se kroz molekulsko sito, koje se nalazi iza redukcionog ventila boce sa gasom, a prije ulaza u kolonu, da bi se uklonila vlaga i druge nečistoće . KOLONE Prema namjeni, kolone za gasnu hromatografiju se dijele na preparativne i analitičke, ali je mnogo rasprostranjenija podjela prema načinu pripreme i prečniku, na kolone sa punjenjem i kapilarne.Standardne punjene kolone su dužine od 1,5 do 10 m, prečnika od 2 do 4 mm, sadržaj likvidne faze iznosi od 5 do 10%, a prosječni prečnik zrna inertnog nosača od 100 do 150 μm. Inertni nosači obično su izraĎeni od materijala na bazi dijatomejske zemlje .Kapilarne kolone dijele se na: 1) Fused sillica WCOT – izraĎene su od amorfnog silikatnog materijala, osloboĎenog metalnih oksida, zbog čega pokazuje veliku inertnost. Vrlo su fleksibilne, a radi pojačanja se sa spoljašnje strane presvlače polimernim materijalima. Likvidna faza se u unutrašnjosti kolone ne vezuje fizičkim silama, već kovalentnim vezama preko silanolnih (SiOH) grupa. Pokazuju veliku stabilnost pri povišenim temperaturama i čistoću, a čak i minorne organske primjese porjeklom od stacionarne faze mogu se ukloniti propustanjem odgovarajućeg rastvarača. Osnovni nedostatak ovih kolona je visoka cijena i nedovoljno razvijeni postupci vezivanja polarnih likvidnih faza. 2) WCOT ( Wall-Coated Open Tubular) – standardne kapilarne kolone, danas gotovo potpuno van upotrebe. Unutrašnji zid im je prevučen samo stacionarnom likvidnom fazom. IzraĎuju se udužini do 200 m, prečnika 0,25 – 0,5 mm. Proizvode se od stakla koje se prethodno hemijski tretira, ne bi li se osiguralo dobro prekrivanje površine i ujednačena debljina likvidnog sloja. Ove kolone pokazuju manju lomljivost, nego što se predpostavlja, a problemi se uglavnom javljaju prilikom postavljanja, ili pomjeranja kapilara iz grijača gasnog hromatografa . 3) SCOT ( Support Coated Open Tubular) – kapilarne kolone sa unutrašnjim zidom prevučenim stacionarnom likvidnom fazom i sprašenim inertnim nosačem, prečnika oko 1mm, dužine 15-100m, prečnika zrna inertnog nosača oko 1 μm . 4) PLOT (Porous Layer Open Tubular) – kapilarne kolone sa unutrašnjim zidom stopljene silikeprevučenim slojem adsorbensa .
5

5) Mikropakovane kolone- izraĎuju se od nerĎajućeg čelika (ne preporučuju se pri analizi masnih kiselina) i stakla, koje je mnogo povoljniji materijal, jer je inertnije, lako se vidi da li je kolona dobro pakovana i da li se pojavljuju praznine u punjenju tokom upotrebe. U potpunosti su ispunjene inertnim nosačem sa stacionarnom likvidnom fazom na njemu. Nosač se dodaje koloni u malim količinama preko ljevka i pažljivo sabija pomoću vakuuma na drugom kraju kapilare. Ako je punjenje previše gusto, kolone će se tokom upotrebe blokirati. U suprotnom, kada je punjenjene dovoljno gusto, separacija komponenti biće nepotpuna .Da bi se postiglo adekvatno razdvajanje jedinjenja iz smeše, radna temperatura kolone mora se kontrolisati u rasponima od par stepeni Celzijusa. Po empirijskom pravilu ona iznosi nekolikostepeni više od prosječne temperature ključanja uzorka. U tom slučaju, eluciono vrijeme se kreće od 2 do 30 minuta. Kada se odabira radna temperatura, potrebno je napraviti balans, jer se sa njenim povećanjem skraćuje vrijeme elucije, ali se pogoršava rezolucija. Za Razdvajanje komponenata vrlo različitih tačaka ključanja, koriste se temperaturni programi, koji omogućavaju konstantne, ili periodične promjene temperature tokom vremena hromatografisanja .U kombinaciji tehnika GC MS upotrebljavaju se kapilarne kolone zbog malog protoka gasa nosača i velike moći razdvajanja. U ovom radu je korištena kolona SP-2560, dužine 100 m,unutrašnjeg prečnika 0,25 mm i 0,20 μm debljine filma stacionarne faze koja nije hemijski vezana za stopljena silikatna jedinjenja. Ova kolona omogućuje maksimalnu rezoluciju geometrijskih cis i trans i pozicionih izomera masnih kiselina .

STACIONARNE LIKVIDNE FAZE Osnovni zahtjev pri odabiru stacionarne likvidne faze je da obezbjedi odgovarajući stepen selektivnosti prilikom separacije. Istovremeno, trebalo bi da poseduje hemijsku itermičku stabilnost, kao i što duži rok upotrebe. Na selektivnost utiču mnogobrojni faktori, zbog čega se preporučuje eksperimentalno odreĎivanje ove veličine. Ipak, odlučujući uticaj ima polarnost, pa se prema tome likvidne faze dijele na: nepolarne, slabo polarne, polarne i visokopolarne. Izbor likvidnih faza izvodi se na osnovu Rohrschneider/McReynolds-ovih konstanti.Kod mikropakovanih kolona, polarnost je promjenjiva veličina i zavisiod načina pu njenja stacionarne faze, prirode inertnog nosača i operativnih uslova, kao što su temperatura i starost kolone. Sa druge strane, kod WCOT kolona, polarnost vrlo malo zavisi od debljine likvidnog sloja,pa se selektivnost može definisati sa velikom sigurnošću .Kao stacionarne likvidne faze koriste se visokomolekularna jedinjenja dobijena polimerizacijom,polikondenzacijom, ili poliesterifikacijom organskih, ili silicijumovih jedinjenja . Na kolonama sa likvidnim fazama od polietilen-glikola, metil-estri masnih kiselina sa 4 do 24 C atoma se mogu razdvojiti prema dužini ugljovodoničnig niza i stepenu nezasićenosti, ali se ne može postićizadovoljavajuće razdvajanje cis i trans izomera. Problemi se javljaju i kod analize složenih smeša, kao što su riblja ulja. Likvidne faze srednje polarnosti se koriste za rutinske analize biljnih ulja i životinjskih masti, kao i proizvoda koji ih sadrže (margarin, maslac, namazi, mlečna mast islično). Kapilarne kolone sa visoko polarnim cijanosilikonskim stacionarnim fazama, sa različitimudelom cijano propil grupa, omogućuju analizu kompleksnih smeša masnih kiselina, dobro razdvajanje
6

metil-estara polinezasićenih ω-3 masnih kiselina i geometrijskih i pozicionih izomera,što je uslovljeno jačom interakcijom cis izomera sa cijano-dipolom, pa se tako trans oblici eluirajupre odgovarajućih cisoblika .Za razdvajanje cis i trans masnih kiselina, osim kvaliteta, važni su i debljina filma likvidne faze,kao i dužina i unutrašnji prečnik kolone .Pri regularnoj upotrebi, kvalitet stacionarne faze se može pogoršati, što je obično posljedica hemijskog oštećenja. WCOT kolone su osjetljivije na ove promjene od mikropakovanih,prven stveno zbog manjeg sadržaja likvidne faze. Visokopolarne likvidne faze su vrlo osjetljive na kiseonik i vodu, pa se preporučuje da se i najmanji tragovi ovih jedinjenja uklone iz gasa nosača.TakoĎe, mogu sporo reagovati sa polarnim rastvaračima (hloroform, alkohol, ugljenikdisufid, itd.)i nečistoćama ubačenim u kolonu zajedno sa uzorkom, a svaka negativna reakcija se pojačava pri povišenim temperaturama koje se postižu tokom hromatografisanja. Proticanje gasa nosačane smije se prekidati sve dok se kolona zagrijava. Najveća oštećenja pojavljuju se u prvih nekoliko namotaja kolone, u kojima likvidna faza može biti potpuno uklonjena, ili pretrpeti ozbiljne degeneracije .

UNOŠENJE UZORKA U INJEKCIONI SISTEM
Za unošenje gasovitih uzoraka koristi se gasna slavina, a za unos tečnosti, injekcioni blok, koji jeugraĎen neposredno ispred kolone.Tečni uzorak se ubrizgava mikrošpricem, tako što se iglom mikrošprica probuši gumeni zaptivač(septum), a zatim se naglim pritiskom na klip šprica potiskuje odreĎena zapremina uzorka (0,1-10μl). Da bi rad kolone bio optimalan, uzorak ne smije imati veliku zapreminu i treba da se uvede kao „čep“ pare. Ako se uzorci injektuju sporo i u velikim zapreminama, pojavljuje se širenje pikova, a rezolucija se smanjuje .Injekcioni blok se, po empirijskom pravilu, zagrijava na temperaturu koja je za oko 50˚C viša od temperature kolone, jer ona omogućava momentalno isparavanje svih komponenata iz uzorka .Grijači se napajaju električnom strujom, a regulacija i kontrola temperature se obavlja pomoću instrumenta sa otpornim termometrom .

2.Šema split injektora
Kapilarne kolone imaju ograničen kapacitet i relativno je lako prepuniti ih uzorkom prevelikezapremine, ili koncentracije. Da bi se prevazišao ovaj problem, konstruisani su različiti injekcioni sistemi, a injektor sa razdeljivačem – split (slika 2) je najjednostavniji i daje odlične rezultate.Uzorak se unosi u gas nosač, koji se dijeli u dve struje : manju, koja je usmjerena na kolonu i veću koja se ispušta u atmosferu. Količina uzorka koja se unosi u kolonu regulisana je igličastimventilom (restriktorom), postavljenog u vod za ispiranje (split izlaz), a odnos razdeljivanja dvije struje ( Split Ratio-SR ) kreće se od 20:1 do 200:1 .Izraz za izračunavanje ovog odnosa glasi :

7

Qkol - protok kroz kolonu Qs.v.- protok kroz vod za ispiranje Osnovna mana ovog injektora je to što se uzorci viših tački topljenja ne unose kvantitativno u kolonu. Da bi se dobili što tačniji rezultati, prirodu rastvarača i njegovu zapreminu treba održavati konstantnom, iglu ubadati uvijek u istu tačku injektora, a početnu temperaturu kolone precizno reprodukovati.Pored opisanog injektora, dobre rezultate daju i splitless sistem injektovanja i takozvani sistem „on-column“, koji podrazumjeva direktno unošenje uzorka u kolonu.

Primjena gasne hromatografije Da bi se procjenila važnost gasne hromatografije, treba razlikovati dvije uloge te metode. Jedna uloga gasne hromatografije je razdvajanje, i u toj ulozi je ona neizbežan dio celokupne analize složenih organskih,organometalnih i biohemijskih smeša. Njena druga, bitno različita uloga, je sama analiza. Vremena zadržavanja pritom služe za kvalitativnu identifikaciju, a visine ili površine pika daju kvantitativne podatke. Gasno hromatografija ima mnogo veća ograničenja u pogledu kvalitativne analize od većine spektroskopskih metoda. Da bi se uklonila ta nepogodnost ulažu se veliki napori za kombinaciju posebnih sposobnosti razdvajanja koje poseduje tehnika gasne hromatografije sa posebnim sposobnostima odreĎivanja masene, IR ili NMR spektroskopije.

8

LITERATURA :

-

http://www.tehnologijahrane.com/analizahrane/gasna-hromatografija-masenaspektrometrija-gc-ms http://www.scribd.com/cickomicko85/d/19838951-Primena-gasne-hromatografije-uIZS http://www.mol.rs/instrumenti.htm http://www.ljiljan.ba/bs/getwiki/Gasna_hromatografija

9