Les différentes stratégies de quantification

:
Ce chapitre présente les 2 principales stratégies de quantification relative utilisée classiquement : la méthode des droites standards et celle des Ct. Les modèles mathématiques à la base des méthodes sont détaillés. Une comparaison des 2 méthodes sur un exemple simple et leurs avantages et inconvénients respectifs sont présentés. Plus précisément, nous illustrons des exemples de biais introduits par la méthode des Ct si celle-ci est mal utilisée. Consultez la page WEB : http://www.gene-quantification.info/ voir Relative quantification

1°/ Introduction
Vous pouvez vous référer au Technical Note LC10/2000 de Roche. La PCR quantitative en temps réel s’appuie sur des mesures faites pendant la phase dite exponentielle de la PCR. Les principes de la quantification par PCR en temps réel s’appuient sur deux concepts de base différents : - la quantification absolue : en s’appuyant sur des dilutions standards de concentration connue, la concentration absolue du gène cible est déterminée : ce type de quantification est utilisé pour déterminer le nombre absolu de particules infectieuses (virus, bactéries) dans des échantillons biologiques. On y distingue une quantification absolue faite avec et sans standards externes. - la quantification relative ou comparative : la concentration du gène cible est exprimée par rapport à un gène référence (obtenu à partir du même échantillon biologique) : pas besoin de standards de concentration connue. Cette méthode est recommandée pour les expressions de gènes et pour le dosage de gène. On y distingue une quantification relative s’appuyant sur des courbes standards de calibration (méthode des droites standards) et l’autre s’appuyant sur les efficacités respectives des gènes référence et cible et les Cp obtenus pour les échantillons et le calibrateur, sans courbe de calibration (méthode des Ct).

2°/ La quantification absolue :
La concentration de la cible est exprimée en valeur absolue déterminée à partir du standard. Consultez la page WEB : http://www.gene-quantification.info/ voir Absolute quantification A l’aide d’un standard externe mais sans contrôle interne : Vous pouvez vous référer au Technical Note n° LC11/2000 de Roche. Le standard externe permet de créer une courbe standard à partir duquel est calculée la concentration en molécules cibles des échantillons. L’efficacité PCR doit être la même sur le standard ou sur les échantillons. A l’aide d’un standard externe mais avec contrôle interne : Vous pouvez vous référer au Technical note n° LC12/2000 de Roche.

la détection simultanée et la différenciation du contrôle interne et de l’échantillon sont possibles à l’aide de sondes d’hybridation différentes. Le logiciel Data Analysis effectue automatiquement le calcul des concentrations de la cible et du gène référence.gene-quantification. déterminer une gamme de mesure pour chaque couple permettant de quantifier tous les échantillons. Cette droite étalon va servir à quantifier les concentrations inconnues d’échantillons biologiques à partir d’échantillons standards (produit de PCR cloné ou non). les efficacités PCR des gènes cible et de ménage sont différentes). 3°/ La quantification relative Vous pouvez vous référer au Technical Note LC13/2001 de Roche. On va normaliser la mesure du gène cible par celle du gène référence (Ncible / Nréference) pour chacun des échantillons. . Consultez surtout la page WEB : http://www.variations dans la quantité et la qualité des échantillons . ajouté après l’extraction de l’échantillon pour contrôler d’éventuels effets inhibiteurs de la PCR et donc éventuelle détection de faux négatifs. Concept général : Pour chaque échantillon. Le calcul du rapport cible/référence doit être fait manuellement ou en utilisant une feuille de calcul de type Excel. Cependant. il ne subira pas de changement d’expression en fonction des conditions analysées.variations dans les erreurs de pipetage .variations d’efficacité de RT La méthode des droites standard (quantification relative avec des standards externes) : Cette méthode nécessite l’établissement d’une droite standard par gène.info/ voir Relative quantification La quantification relative fait intervenir un gène de ménage (Housekeeping gene HKG) qui va servir de normalisateur : ce gène est en effet considéré comme stable dans le modèle présenté.Le principe est identique à la méthode ci-dessus avec en plus un ARN synthétique. Les séquences de la cible sur ce contrôle interne et dans l’échantillon biologique leur permet d’être co-amplifiés avec le même couple d’amorces. passés en même temps que les échantillons inconnus. on va donc déterminer la concentration en gène cible (Ncible) et la concentration en gène de ménage (ou référence : Nréf) en s’appuyant sur les droites standards de chaque gène (Si. On va contrôler l’efficacité PCR de chaque couple. bien sur.rendement d’extraction différent entre échantillons . Ce gène de contrôle va permettre de compenser d’éventuels biais de PCR provenant de : .

Sans correction de cette différence d’efficacité. .pour quantifier de faibles concentrations (Cp a partir de 25-30 cycles pour la plupart des couples).Les critères de préparation d’une courbe standard sont : . Ces 2 efficacités doivent être les plus proches l’une de l’autre. L’efficacité PCR du couple choisi doit être la même pour le standard et pour les échantillons. on doit dupliquer voire tripliquer les points de mesure pour améliorer la robustesse du calcul. Avec cette technique. . La méthode des Ct (quantification relative normalisée par un calibrateur) : L’expression de gènes cibles et référence est fonction de l’efficacité de la PCR et du Cp enregistré. la précision du résultat dépend des efficacités de PCR des gènes cibles et référence. une seule détermination est nécessaire pour chaque dilution . il n’est pas nécessaire de connaître la valeur absolue du nombre de copies des échantillons.au moins 4 points pour créer la droite couvrant la gamme de concentration attendue de la cible. Si le standard est un plasmide et les échantillons des cDNA. pas besoin d’une droite standard pour chaque run. il peut être utile d’effectuer le calcul de l’efficacité sur une dilution de cDNA afin de le vérifier. Dans cette méthode. Si elles ne le sont pas : . Les résultats sont exprimés par un rapport cible/référence de chaque échantillon normalisé par le rapport cible/référence d’un échantillon appelé calibrateur.pour des concentrations intermédiaires et fortes (Cp inférieur à 25 cycles pour la plupart des couples PCR). le résultat obtenu sera approximatif (introduction de biais de calcul) .

le rapport K = NT / NR est constant et identique pour le calibrateur et l’échantillon S. La méthode des Ct va calculer le rapport normalisé suivant : Rapport = NT(S)/NR(S) / NT(C)/NR(C) = K(S) / K(C) = 1 En effet. le nombre de molécules de gènes cibles (ou de gène référence) est identique pour les 2 (même si bien sur les valeurs des Ct sont très différentes). sur la ligne de seuil placée sur les profils obtenus pour l’échantillon calibrateur et pour l’échantillon. Autrement dit.- la différence d’efficacité peut être corrigée pour obtenir un résultat précis. le nombre de copies détectées des gènes cibles T et référence R ne sont pas tout a fait les mêmes. au Ct. Par contre. La PCR est décrite par l’équation suivante : N = N0 x Ecp N : nombre de molécules au cycle Cp N0 : nombre initial de molécules E : efficacité de la PCR Cp : cycle seuil Principes : . . Donc : K(S) / K(C) = 1 . La normalisation par l’échantillon calibrateur permet de comparer les échantillons entre eux. Au Cp respectif des 2 gènes. on a : NT = NT0 X ETCPT NR = NR0 X ERCPR On pose : S (Sample) pour échantillon et C pour Calibrateur (échantillon calibrateur) . On pose : T (Target) pour gène Cible et R pour gène Référence.dans une première étape. le rapport obtenu pour chaque échantillon est divisé par le rapport obtenu pour l’échantillon calibrateur. Les biais liés aux différences de sensibilité dans la détection du gène cible et référence vont alors s’annuler. Les biais liés aux différences de qualités et quantités des échantillons sont éliminés (le biais est le même pour la cible et pour la référence et donc s’annule). le rapport cible/référence pour chaque échantillon et l’échantillon calibrateur est calculé.Dans une seconde étape.

1. on peut utiliser la méthode des ∆∆Ct pour la quantification relative sans avoir à créer de courbes standards en parallèle. Une fois validée. Rapport = E ∆∆Ct = E CpT(C)-CpT(S)+CpR(S)-CpR(C) = E (CpT(C).Equation 1 A/ Si l’efficacité des 2 PCR est identique (E = ET = ER). B/ Si les 2 efficacités sont différentes. La valeur absolue de la pente ∆Ct = f (dilution de l’échantillon) doit être inférieure à 0. pour valider cette méthode de quantification. Le facteur R représente le facteur d’expression du gène cible dans l’échantillon par rapport à son expression dans le calibrateur. de prouver que les efficacités de PCR de la cible et de la référence sont très proches. Il est important.CpR(C)) – (CpT(S)-CpR(S)) =E∆CtC-∆CtS Avec ∆Ct = CpT-CpR La formule initiale de calcul était : 2∆∆Ct Elle suppose que les 2 PCR cible et référence ont toutes deux une efficacité maximale de 100%. Un moyen de le prouver est de calculer les ∆Ct en fonction des dilutions successives d’un même échantillon. le modèle mathématique peut s’écrire : .

C’est une autre forme d’expression de l’équation 1 ci-dessus. 1ère méthode : les droites standards On a établi à l’aide de dilutions successives d’un AN standard. on va prendre l’exemple suivant : On va quantifier l’expression du gène c-myc humain dans différents tissus (foie. Le tissu calibrateur choisi arbitrairement est le cerveau. C’est la formule utilisée par le logiciel RealQuant de Roche lorsqu’on tient compte des différences d’efficacités entre les 2 PCR. rein). Un logiciel appelé REST© (Relative Expression Software Tool) va permettre de comparer non pas un échantillon contrôle vs un échantillon inconnu mais un groupe d’échantillons contrôles vs un groupe d’échantillons inconnus. On l’a exprimé en « facteur de dilution du RNA standard » : . 4°/ Comparaison des 2 méthodes de quantification relative Pour illustrer l’utilisation des 2 méthodes de quantification relative (droite standard et ∆∆Ct) et montrer que ces 2 méthodes aboutissent aux mêmes résultats. on a pu établir le nombre de copies de chacun des 2 gènes dans chaque échantillon. une courbe standard pour chacun des 2 gènes. poumon. Le gène référence choisi est la GAPDH. A partir de ces 2 courbes. cerveau.

Ct ∆Ct = CpT-CpR ∆∆Ct = ∆CtC .6 37 16.2 15.37 1.83 GAPDH = R 23.05 c-myc / au cerveau 1 5.Tissu Cerveau Rein Foie Poumon c-myc 0. Elle dépend de votre capacité à reproduire vos mesures.63 22.03 26.81 c-myc / GAPDH 0.02 0.66 24. .01 ∆Ct 6.65 2.5 5.81 ∆∆Ct 0 2.7 2ème méthode : les ∆∆Ct On a posé l’hypothèse que chacune des 2 PCR est efficace à 100%.28 0. sont éliminées par la normalisation sur une référence par rapport à un échantillon calibrateur.7 0.5 Toutes les variables comme les variations dans les quantités d’échantillon par exemple.41 0.6 23.86 4.∆CtS Tissu = C Cerveau Rein Foie Poumon c-myc = T 30.21 4.5 34. également des efficacités de vos PCR.54 1. des concentrations en molécules cibles de vos échantillons inconnus.15 c-myc / au cerveau 1 5.25 25.07 0. Quelle méthode choisir ? L’utilisation de telle ou telle méthode est dépendante en fait de la précision exigée par vos mesures. On note les Cp obtenus pour chaque gène dans chaque échantillon.49 1. On obtient des résultats identiques pour les 2 méthodes.039 0.40 2.93 GAPDH 0.39 27.

4 106 14 30 1.6 2. on peut calculer – en fonction d’efficacité différente – le nombre de molécules-filles générées au bout de n cycles en calculant (1+E)n : Cycles Eff 100% Eff 90% Facteur écart Eff 80% Facteur écart 10 1024 613 1. 5°/ Les biais introduits par la PCR – attention au ∆∆Ct Dans de très nombreux cas. Imaginons que l’on parte d’une seule molécule cible à l’origine.9 15 32768 15181 2 6746 4. . Par contre.Le mode de conservation du standard doit être optimisé afin d’éviter tout biais liés a son éventuelle dégradation. Mais dans ce cas. placer des échantillons standards sur chaque carrousel entraîne un surcoût et occupe des places prises sur les échantillons.Un nombre de point élevé dans la droite permettra d’augmenter cette reproductibilité. La quantification par les ∆∆Ct va permettre de gagner de la place (de l’argent également) en ne plaçant que des échantillons sur le carrousel. la droite standard doit être reproduite à chaque run de PCR. Son utilisation exige en contre partie un formatage précis des expériences (cf le paragraphe RealQuant dans la seconde partie). une réaction PCR ne permet pas d’amplifier avec une efficacité de PCR de 100% (par exemple. . La formule classique de la PCR (N = N0 X Effn) permet de calculer le nombre de molécules théoriquement obtenues pour des PCR présentant des efficacités différentes.5 106 9. la précision des calculs peut en pâtir. il est possible de détecter des variations d’un facteur 2.La quantification par le standard externe est la méthode la plus simple à mettre en œuvre.8 127500 8. Sinon il est possible d’utiliser la formule décrite ci-dessus (cf 3°/ B) sous Excell par exemple. Ces variations dans la reproductibilité des expériences vont dépendre de certains facteurs : .2 25 33.3 106 3.07 109 230 106 4.7 357 2. Des droites standard de différents runs vont nécessairement présenter des variations.Dans le premier cas (droite refaite chaque fois). Si vous travaillez avec des efficacités de PCR cible et référence éloignées. Elle peut également être sauvegardée et importée pour des runs ultérieurs. En effet : . Une fois les primers optimisés. vous pouvez introduire des biais importants (cf ci-dessous). des variations d’un facteur 5 sont détectables mais plus difficilement d’un facteur 2. puisque standard et échantillons inconnus varient de la même façon.8 20 1048575 375899 2. il est possible d’utiliser le logiciel RealQuant de Roche qui va tenir compte de ces différences pour quantifier précisément. le pourcentage de GC contenu dans le produit amplifié intervient largement). Dans ce cas.6 45 106 23 .Dans le second cas (importation d’une droite standard externe).

35 19.75 ∆Ct cible 6.009 1016 0.34 21.63 X4.7 15.52 12.66 2.35 19.8 et ER = 2 avec les résultats de Cp suivants : Ref 19.95 16.35 19.26 /52.98 9.68 18 27.97 X102 /111 X1016 /981 X60.8 32. nous avons choisi l’exemple suivant : Un calibrateur et 6 échantillons présentent des rapports variables « gènes cibles sur gène référence ».35 Target 24.97 102.On observe que plus la différence d’efficacités entre les 2 PCR est grande. Gène ref 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 Gène cible 5000 250000 1000 100 25000 500000 50 5000000 5 300000 1000000 10000000 Qte de cibles dans l’échantillon / calibrateur 50 fois plus 5 fois moins 50 fois moins 5 fois plus 100 fois plus 100 fois moins 1000 fois plus 1000 fois moins 60 fois plus 200 fois plus 2000 fois plus Calibrateur Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K On pose l’hypothèse que l’efficacité PCR du gène référence (R) est de 100% et celle du gène cible (T) n’est que de 80% (C pour Calibrateur et S pour Sample) En utilisant la formule : ET CpT(C)-CpT(S) X ER CpR(S)-CpR(C) ∆Ct cible = CpT(C)-CpT(S) ∆Ct ref = CpR(S)-CpR(C) On pose ET = 1.19 0.35 19.03 12. Afin de bien comprendre les biais que peut introduire la méthode des ∆∆Ct si elle n’est pas contrôlée.72 0.35 19.72 6.65 11.35 19. Le tableau 1 ci-dessous résume les nombres de copies de chaque gène.93 ∆Ct ref 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50.73 7.42 31.35 19.68 -2.001 60.019 4.74 -6.5 201 1998 ∆Ct X50 /5.88 -7.78 -11.84 11.35 19. .4 17.5 X200 X2000 Fact Calib Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K Fact : facteur d’expression du gène cible dans l’échantillon par rapport au calibrateur.35 19.69 0.9 36. plus le facteur d’écart entre l’efficacité maximale et chacune des efficacités (et donc l’erreur introduite) sera grand.35 19.35 19.

15 0.3 2.5 fois .3 2.66 2.5-3.5 3.26 /52.Des écarts significatifs entre les deux avec des facteurs d’écart entre 1.63 235 0.2 2 1.01 6.63 X4.Avec ce calcul précis.03 12. Si on est moins rigoureux et que l’on se contente d’utiliser la même valeur d’efficacité (100% par exemple) pour les gènes cibles (= target) et référence : On pose ET = 2 et ER = 2 avec les mêmes valeurs de Cp. on obtinet un facteur d’écart de 3.8 X50.78 -11.63 X235 /250 X3517 /3333 X126 X522 X7804 Facteur d’écart 2 1. .98 9. on obtient des résultats de facteurs d’expression différents : ∆Ct cible Calib Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K 6.et de 100% -moins précise.97 X102 /111 X1016 /981 X60.5 Si on compare les résultats obtenus entre les 2 méthodes.66 /100 X6.004 3517 0.2 et 3. On retrouve les valeurs théoriques énoncées dans le tableau 1. Ainsi on obtient un facteur d’écart de 1.3 2 2.88 -7.72 6. Ainsi vraie valeur Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K 50 5 50 5 100 100 1000 1000 60 200 2000 ET = 1.3 pour une quantité de molécules cibles 1000 fois plus – et moins – abondante dans les échantillons G et H.2-1.84 11.66 /100 X6.3 pour une quantité de molécules cibles 5 fois plus – et moins – abondante dans les échantillons B et D .93 ∆Ct ref 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∆Ct 102 0.5 3.63 X235 /250 X3517 /3333 X126 X522 X7800 Si on compare les résultats obtenus avec les 2 méthodes (efficacités de 80% -correcte.5 3.5 X202 X1998 ET = 2 X102 /6. on obtient les « vrais » facteurs d’expression des échantillons.73 7. on observe : .74 -6.0003 126 522 7804 Fact X102 /6.pour le gène cible ou target).Des facteurs d’écart qui augmentent avec les valeurs relatives du gène cible dans l’échantillon par rapport au calibrateur.68 -2.72 /5.

meilleure sera la reproductibilité. on estime mal la quantité relative du nombre de gènes cibles dans chaque échantillon. en particulier si votre efficacité PCR est moyenne. Exemple: sonde d’hybridation. A cause de ces distributions statistiques. Plus l’efficacité PCR est grande. le nombre exact de copies dans le tube va de 7-13 (distribution de Poisson).5% 41% Concentration initiale 10 copies 10 copies 10 copies 10 copies 1 2 3 4 Le CV obtenu pour 10 copies est le plus élevé : a ces concentrations.7% 1. On perd également toute possibilité d’information entre chaque échantillon : les échantillons G et K sont différents d’un facteur 2 en tenant compte de l’efficacité correcte et d’un facteur 2. on peut effectuer une quantification relative exacte (avec correction de la différence d’efficacité) a l’aide du logiciel RealQuant de Roche.3% 0.4% 0. de la qualité des échantillons biologiques (présence d’inhibiteurs. 6°/ La reproductibilité des mesures La reproductibilité des résultats est essentielle afin de valider les résultats obtenus. La reproductibilité est directement dépendante de la concentration en cibles initiales. PCR de 131bp TNF alpha humain 6-4 réplicats par points de concentration CV. les distributions statistiques jouent un grand rôle: ainsi. des concentrations de vos échantillons.1% 8.7% CV. On observe ce phénomène en dupliquant les points de mesure et en calculant les cœfficients de variation obtenus sur ces mesures pour des dilutions successives. on doit dupliquer ou tripliquer les points de mesure afin de pouvoir différencier 10 copies de 20 (plus que pour différencier 1000 de 2000). Le mode de conservation des échantillons biologiques (en particulier l’échantillon standard utilisé régulièrement) est un élément important de la reproductibilité. Plus cette dernière est forte. conc. plus la PCR sera robuste. Elle est par contre indépendante du format de fluorescence utilisé. quand on pipette 10 copies par capillaires en moyenne.8% 16. pensez a dupliquer vos points de mesure lorsque les Cp obtenus pour ces mesures se situent vers 25-30 cycles. 5.En ne tenant pas compte de l’efficacité réelle de la cible.2 avec une estimation de cette efficacité. De manière générale. Elle dépend des efficacités de PCR. L’efficacité de PCR est un facteur important pour la reproductibilité des résultats. en particulier lorsque l’on travaille avec des échantillons présentant un faible nombre de copies. cycles de . défauts dans leur conservation) et bien sur de la qualité des pipetages. trop faible concentration de conservation. Mal conservés (mauvaise température de conservation. Ct 0. Si les efficacités des gènes cibles et référence sont différentes.

.De travailler dans des gammes de concentration en cibles élevés (Ct faibles. aliquoté) dans des valeurs de Cp comprises entre 26 et 31. Si pour ces valeurs de Cp de cet ordre.congélation-décongélation successifs). l’écart type des valeurs de Cp est très élevé.23 4 30. En pratique.39 0.De dupliquer les points de mesure afin d’être plus précis. En particulier dans des gammes de concentrations en cibles plus faibles (Ct supérieur à 30 cycles). Mesurer un écart réduit (donc être le plus précis possible) suppose : . mais ils donnent un ordre d’idée de l’écart type que l’on peut obtenir en travaillant dans des conditions « robustes » (standard concentré. Les résultats obtenus (sur 27 expériences) sont les suivants : Gamme : Moyenne Cp Ecart type 1 26. on peut se poser des questions quant a la capacité a reproduire des points expérimentaux avec ce couple. . a quoi peut on s’attendre ? Nous avons récoltés des données d’une utilisatrice du département d’endocrinologie (Jocelyne Leclerc) qui refait une gamme standard a chaque carrousel. . l’échantillon va se dégrader au cours du temps et cela va introduire des biais entre expérience. C’est à ces conditions que vos mesures seront les plus précises. un biais de pipetage même faible peut entraîner des erreurs.15 2 27. De tels écarts ont été décrits sur le Light Cycler pour des applications de dosages de gènes par exemple.47 Ces résultats ne sont pas extrapolables a toutes les expériences bien sur. Elle utilise une aliquote de son ADN standard. avec 5 points de gamme (nommés ici de 1 a 5). robustes et donc les plus reproductibles possibles (fragments courts par exemple).D’être capable de reproduire sur plusieurs jours les mêmes expériences.D’utiliser des PCR efficaces.27 5 31.92 0. Assurez vous des « niveaux » de chaque capillaire avant de lancer votre carrousel.77 0.14 0. La qualité des pipetages est bien sur une condition nécessaire à la reproductibilité des mesures. En particulier pour les plus faibles volumes (10 ul). 7°/ La précision des mesures : Un écart d’un facteur 2 entre 2 échantillons en utilisant une PCR 100% efficace représente un écart d’un cycle entre leur Ct respectif. inférieurs à 25 cycles) afin d’être le plus reproductible possible (voir 6°/) .18 3 28.98 0. qu’elle dilue extemporanément de 2 en 2.

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