You are on page 1of 13

1. Metode de evaluare a populatiilor microbiene.Clasificare.

Tehnici de diluare si concentrare - metode directe, care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei sau metode indirecte, în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenta, impedanţa);- metode nonculturale, care permit evaluarea rapidă a populaţiei microbiene analizate şi metode culturale, care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei; metode automatizate, "on line", care permit analiza directă a probelor din fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză. Tehnici de diluare - Serii liniare, în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate; - Serii logarítmice (diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie geometrică (ex. 0.1/0.01/0.001/0.0001 etc.). Pentru realizarea diluţiilor decimale, într-un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia coli). Tehnici de concentrare - utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor patogene; Metode de îmbogăţire, care presupun inocularea probei de analiză într-un mediu favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule; Metode de separare fizică sau fizico-chimică a celulelor prin filtrare, centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici directe sau culturale; Metode de separare prin interacţiuni hidrofobe-hidrofile, interacţiuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine. 2. Numararea microorganismelor prin examen microscopic direct folosind citometrul THOMA Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor. Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare). Diferenţierea dintre tipurile de citometre constă în mărimea variabilă a suprafeţei unui pătrăţel elementar. În cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1 mm2 este divizată în 400 de pătrăţele elementare cu latura de 1/20 mm. Numărul de celule prezente într-un cm de suspensie de analizat se determină cu formula: N = n·4 · 106 ·k în care: N este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar; k - coeficient de diluţie. În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintă mobilitate. 3. Estimarea electronica a numarului de microorganisme.Principiul de functionare al aparatului de tip Coulter Aparatul de tip Coulter funcţionează după următorul principiu: De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într-un electrolit, ale căror borne sunt conectate la tensiune continuă. Prin aspiraţia provocată la partea superioară a tubului, celulele aflate în exteriorul tubului trec pe rând prin orificiu şi deplasează o dată cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoacă o creştere tranzitorie a rezistenţei circuitului, ceea ce generează un impuls electric a cărui amplitudine este proporţională cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurtă durată, aparatul permite numărarea unui număr mare de celule, una câte una, într-un timp foarte scurt. Este posibilă şi o clasificare a celulelor în funcţie de de volumul lor. Această tehnică, deşi sofisticată, este considerată extrem de interesantă şi se aplică cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând simultan cu numărarea şi dimensionarea celulelor. Rezultatele sunt reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule; Sarcina electrică a celulelor poate influenţa analiza conducând la obţinerea de rezultate eronate; Această tehnică nu se poate aplica în cazul culturilor ce conţin în suspensie, alături de celulele microorganismului cultivat, şi particule solide.

b – exemple de sisteme de detecţie c – diagramă de repartiţie a dimensiunilor Adesea markerii coloranţi utilizaţi pot oferi diferite tipuri de răspunsuri: .discuri în care mediul de cultură specific este deshidratat şi acoperit cu o folie din plastic. . Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescentei. în plăci Petri. Fluorescenta emisă de fiecare microorganism este captată printr-un fotomultiplicator şi analizată.Dacă colorantul este un marker de viabilitate. In cazul numărării coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu sursă de lumină. din histogramă se deduce numărul de celule viabile şi starea fiziologică a populaţiei. apariţia vizibilă a coloniilor va depinde de particularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologica cantitativa si calitativa "Petrifilms" . Această tehnică prezintă dezavantajul că unele celule pot să rămână ataşate de instrumentul de etalare. când detecţia se face prin măsurarea fluorescentei emise de celulele în prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom). inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat. se vor forma colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia. in placi Petri Metodologia de analiză presupune adoptarea a două modalităţi de inoculare a celulelor în/pe mediul de cultură solidificat. primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de mediu steril. în care. Numărarea indirectă a microorganismelor prin cultivare pe medii dense Citirea şi interpretarea rezultatelor După termostatarea în condiţii optime.45°C. Suspensia se răspândeşte uniform pe întreaga suprafaţă a mediu-luide cultură cu ajutorul unui instrument special (de exemplu. La inocularea a 1 cm3 suspensie de . Tehnica clasica de numarare prin cultivare pe medii dense. cu formula: ufc/cm3 (g) = n • d în care d este coeficientul de diluţie corespunzător plăcii din care s-a realizat numărarea.Dacă histograma cuprinde net două picuri este posibilă numărarea separată a microorganismelor dintr-o cultură mixtă (de exemplu. fluidifîcat şi temperat la 40. Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe. spatulă Drigalski). pot fi diferenţiate bacteriile vii de cele moarte după colorare cu acridin oranj.1 cm3 probă diluată se transferă într-o placă Petri sterilă. . când 0. de obicei după 48-72 h de cultivare. În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care sa făcut numărarea se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm 3 probă de analiză. Principiul de funcţionare al citometrului în flux: a. când 1 cm3 din fiecare diluţie se transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. a fost repartizat mediul de cultură cu agar.inoculare în masa mediului solidificat. Citometria in flux Permite numărarea şi aprecierea stării fiziologice a celulelor. şi anume: a. lupă pentru mărirea imaginii şi un dispozitiv de marcare şi înregistrare a coloniilor numărate. Peste suspensia din fiecare placă se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific.. prin termostatare în condiţii optime. . cu efecte negative asupra acurateţei rezultatului analizei. După solidificarea mediului. b. circulare ale plăcii. cu agar (10-15 cm3). După colorare celulele sunt antrenate printr-un orificiu îngust şi trec una câte una prin faţa unei surse luminoase.4.în mod similar. n reprezintă media aritmetică a coloniilor numărate în cele două plăci. adică după înglobarea celulelor în mediu şi solidificare. dar şi microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. 5. în cazul în care pentru aceeaşi diluţie s-au inoculat câte două plăci în paralel. În cazul microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat. Tehnica de microscopie în imunofluorescenţă permite detectarea unei categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.prin suspensionarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen cu citrat în preparat microscopic se vor putea diferenţia celulele vii (incolore) de cele moarte (colorate în albastru). 7. Dacă markerul este un anticorp sau o sondă nucleică se pot număra specific anumite microorganisme dintr-o populaţie eterogenă. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin mişcări orizontale. în prealabil. Pentru obţinerea unor rezultate mai concludente se recomandă inocularea a câte două plăci în paralel pentru fiecare diluţie analizată. Această histogramă traduce deci un profil al populaţiei. streptococi şi lactobacili). Microscopia in fluorescenta si imunofluorescenta Tehnica de microscopie în fluorescenţă utilizează coloranţi specifici pentru diferenţierea celulelor vii de cele moarte.. 6.

a. apa conţinută în suspensie rehidratează mediul şi prin termostatare este posibilă creşterea microorganismelor.10 cm3) se transferă aseptic în rezervorul aparatului de filtrare. drojdii.celule. virajul culorii. . sterile. 8. mediul de cultură specific este impregnat în membrană şi astfel.lame pentru evidenţierea selectivă a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu specific cu geloză).pentru număr total de coliformi. creşterea numărului de probe analizate. Lame specializate pentru control microbiologic selectiv . . După termostatare. bacterii coliforme. . Avantaje: reducerea timpului de analiză. număr total de drojdii şi mucegaiuri. apoi lichidul se trece prin filtru (cu pori mici. 9. după filtrare. . după care membrana se ridică aseptic cu o pensetă sterilă şi se transferă într-o placă Petri sterilă în care în prealabil s-a repartizat mediul de cultură adecvat. . In momentul utilizării se extrage aseptic lama din tub. după care se reintroduce în tubul steril şi se termostatează la temperatura optimă de creştere. .lame Lactocult . precipitat bleu). o cantitate controlată de lichid de analizat (1 . pe care o posedă Escherichia coli. cu agar. 16-24 h pentru bacterii şi 3-4 zile pentru drojdii şi mucegaiuri. Benzile de hârtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip) . reducerea preţului de cost/probă.lame pentru determinarea fungilor filamentoşi (geloză tripticază soia. . Pentru analiză. tripticază soia cu TTC + geloză cu roz bengal şi cloranfenicol ş. .BCIG — brom cloro indoxil β glucuronidă este indicator al β glucuronidazei. Prin termostatare în condiţii optime la suprafaţa membranei se formează colonii caracteristice. se pot număra coloniile caracteristice care s-au dezvoltat la suprafaţa lamei.constau din benzi sterile de hârtie impregnate cu mediu specific. specifică microorganismelor analizate. are loc virajul culorii — precipitat bleu. pentru care se precizează: timpul necesar de menţinere în contact cu proba de analizat.pentru controlul microbiologic al laptelui. Există diferite tipuri de Petrifilm pentru: număr total de microorganisme.).lame pentru evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloză tripticază soia + VRBC geloză).sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid şi eficient al alimentelor.se pretează cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui). Evaluarea numarului de microorganisme dupa flitrare prin membrana Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de microoganisme. membrana se plasează într-o placă Petri sterilă. capabili să reţină toate microorganismele). se imersează în proba de analizat. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor Particularităţi ale Petrifilmelor 3M .lame Microtest.1- . creşterea calităţii şi îmbunătăţirea substanţială a productivităţii.lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0. care se pot număra şi analiza din punct de vedere morfologic. care nu conţin compuşi ce produc colmatarea filtrului.01 TTC*) -destinate pentru determinarea numărului total de microorganisme.lame Biokar . volumul de lichid pe care îl adsorb (0. Evaluarea numarului de microorganisme prin utilizarea mediilor de imersie Tehnici moderne prevăd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu geloză sau benzi de hârtie impregnate cu medii adecvate. In alte cazuri.brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfatază. produsă in general de drojdii şi mucegaiuri.TTC — clorură de trifenil tetrazoliu (culoarea virează spre roşu datorită reducerii de către microorganisme cu formare de formazan). Lamele cu medii de cultură gelozate se menţin în tuburi speciale.BCIP . . .

constant. extracţie. 10 min. în general prin centrifugare (2000-4000 rot. 11. utilizând metoda Kjeldahl (proteine = Nx 6.9% NaCl. biomasa microbiana este recuperată. NADH. Metoda biuretului este cea mai recomandată în astfel de studii. Această tehnică se aplică cu succes pentru studiul culturilor pure în sisteme continue de fermentaţie. ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii.nu se aplică decât în cazul mediilor lichide fermentate în care microorganismele sunt singurele particule în suspensie. care au abilitatea de a reemite lumina absorbită prin modificarea lungimii de undă Compuşii care emit fluorescentă (fluorofluori) cu importanţă pentru evaluarea populaţiilor microbiene Relaţia dintre fluorescentă şi concentraţia compusului care emite fluorescentă .pot fi aplicate atât pentru evaluarea populaţiilor aparţinând microorganismelor unicelulare. pentru îndepărtarea impurităţilor din mediul de fermentaţie. Celulele separate de mediul de fermentaţie prin filtrare sau centrifugare sunt spălate pentru îndepărtarea impurităţilor. dar. Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare. Măsurarea bioluminescenţei se realizează la λ = 562 nm cu ajutorul unor aparate speciale (fluorimetre). la 4°C). Această emisie. considerând aceasta aproximativ constantă per celulă. este posibilă stabilirea prin echivalenţă a concentraţiei de biomasa. . până la greutate constantă. Pentru rezultate mai concludente se recomandă corelarea conţinutului în ATP cu numărul de celule. dar mai ales în cazul microorganismelor filamentoase. Determinarea conţinutului de ATP Evaluarea biomasei microbiene prin determinarea conţinutului de ATP tinde să se generalizeze. ATP. metoda Lowry.Creşterea şi multiplicarea celulelor este în dependenţă directă cu biosinteza de proteine.conţinutul de biomasă nu reflectă întotdeauna gradul de multiplicare al celulelor. apoi se reintroduce in ambalajul steril şi se termostatează in condiţii optime. Dezavantaje . necesitând tehnici de liză a celulelor. Astfel de componenţi sunt: proteine. în cazul mucegaiurilor. Metoda Lowry se utilizează atunci când concentraţia de celule în suspensia de analizat este mică. De exemplu. Pentru evaluarea conţinutului total de proteine sunt recomandate metodele clasice: metoda biuretei. Principiul acestor metode constă în măsurarea concentraţiei unor componenţi celulari şi.. 10. Cantitatea de proteine se determină prin comparaţie cu o curbă etalon cu albumina serică bovină. este spălată de mai multe ori cu soluţie 0. conform ecuaţiei: ATP + luciferina + O2 → oxiluciferină + AMP+ PPi + CO2 + lumina. apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau fizice pentru eliberarea componenţilor celulari şi evaluarea acestora prin tehnici standardizate de analiză.Metoda este laborioasă mai ales dacă se au în vedere dificultăţile de extracţie a ATP-ului din celulele microbiene.Dacă fiecare celulă conţine o concentraţie intracelulară . . metoda Kjeldahl. AND). de ADN. Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazează pe emisia luminoasă produsă prin oxidarea luciferinei la oxiluciferină.nu se poate face distincţie între biomasa vie şi cea autolizată. apoi uscată la temperatura de 105°C. Principiul metodei constă în formarea unui complex colorat între ionii de cupru şi grupările proteice încărcate cu sarcini negative.Pentru analiză. celulele cresc acumulând intracelular substanţe de rezervă şi formează pereţi celulari groşi fără să se producă diviziunea celulară. reacţie catalizată de către enzima luciferază în prezenţă de ATP. Determinarea concentraţiei proteinelor celulare . separare. sau hidroliza proteinelor şi dozarea aminoacizilor. banda sterilă se imersează în lichidul de analizat.Biomasa microbiana are un conţinut remarcabil. metoda Bradford. Estimarea cantitatii de biomasa prin dozarea unor constituienti celulari Determinarea cantitativă a unor componenţi aflaţi în concentraţie aproximativ constantă în celulele microbiene oferă indicaţii asupra evoluţiei unei culturi. Tehnica de analiză a ATP-ului nu oferă rezultate corespunzătoare în cazul unor populaţii eterogene ce conţin celule de vârste variabile. 12. acizi nucleici (ARN. este obţinută în câteva secunde. care poate fi măsurată spectrofotometric. Determinarea acizilor nucleici .25). Dezavantaje . Evaluarea populatiilor microbiene prin masurarea fluorescentei Aceasta poate fi emisă de anumiţi componenţi celulari.este puţin sensibilă. Conţinutul în proteine se poate exprima şi prin dozarea azotului. cu factori de variaţie de la 1 la 10. reţinute o dată cu celulele. determinarea sa este destul de sofisticată. Acest constituent este în general absent în ingredientele mediului de cultură. . Tehnici de evaluare a cresterii prin determinarea globala a biomasei .1 cm3). din păcate. fiind un intermediar important al metabolismului celular cu rol în metabolismului energetic.. Variaţia conţinutului de ATP al microorganismelor este în funcţie de specie şi de starea fiziologică. . Pentru dozare se apelează la metode spectrofotometrice (λ= 260 nm) sau colorimetrice. ceea ce exclude eventualele interferenţe.

sincrone). spre exemplu. conform relaţiei: A=ε·I·C în care: A este absorbanta. dar aplicarea sa este recomandată pentru evaluarea populaţiilor ce conţin celule cu vârste şi stări fiziologice constante (culturi continue. Factori care influenţează fluorescenta .concentraţia celulelor în suspensie. În cursul creşterii celulare cantitatea de NADH creşte în raport direct proporţional cu multiplicarea celulelor. turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109 bacterii/cm3 corespunde unei suspensii cu o concentraţie de 0. Corelaţia absorbanţăbiomasă substanţă uscată . modificări ale activităţii metabolice a celulelor determinate. În practica industrială fluorescenta se măsoară "on line" direct în bioreactor. prin limitarea oxigenului. Această metodă este mai puţin precisă şi se utilizează de obicei în studii comparative. Principiul metodei . permiţând astfel evaluarea concentraţiei de biomasă. este relativ specifică. C . În funcţie de substanţa uscată a masei celulare şi de absorbanţa culturii. sensibilă şi exactă. temperatură. poate fi trasată o curbă etalon A = f (biomasă substanţă uscată). cu o stare fiziologică constantă.5 g/dm3 albumină. măsurată la λ = 600 nm. cel mai adesea se recurge la NADH. conform curbei Principiul măsurării fluorescentei unei culturi . Această corelaţie este valabilă până la o valoare limită a absorbantei. lungimea de undă. prezenţa unui agent antispumant. De exemplu.Dintre compuşii fluorofluori. Pentru măsurare se lucrează întotdeauna cu celule vii.a. măsurată spectrofotometric.pH. Această metoda de analiză permite evaluarea celulelor vii. care emite fluorescentă la 460 nm. variabilă în funcţie de: aparatul de măsură.aproximativ constantă a unuia din fluorofluorii prezentaţi în tabel concentraţia de celule se poate determina în funcţie de fluorescenta emisă.coeficient de extincţie ''celular“. 13. când este excitată în lumină la lungimea de undă λ = 340 nm În forma oxidată (NAD) coenzima nu are fluorescenţă. care se determină cu ajutorul unui spectrofotometru sau nefelometru. Tehnici turbidimetrice si nefelometrice de evaluare a cresterii microorganismelor Metoda comparativă O metodă simplă (tehnica mestrezat) constă în compararea turbidităţii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor etaloane cu albumină. comparativ cu mediul de cultură steril considerat ca referinţă. ε . natura suspensiei ş.Similar cu legea Beer-Lambert există o proporţionalitate între absorbanta culturii (densitatea optică) şi concentraţia de celule în suspensie. Metoda turbidimetrică Tehnica permite stabilirea concentraţiei de celule în funcţie de absorbanţa suspensiei de celule.

timp care este in directă concordanţă cu numărul de microorganisme vii din proba de analizat. sau ca urmare a creşterii concentraţiei de . Tehnica nu se pretează întotdeauna pentru evaluarea creşterii microorganismelor filamentoase. sucuri. într-o serie de 10 eprubete egale se repartizează o soluţie de clorură de bariu 1%. pe tot parcursul desfăşurării procesului fermentativ. este utilizată pentru aprecierea numărului total de bacterii vii. ca urmare a trecerii albastrului de metilen din forma oxidată. este posibilă estimarea concentraţiei de biomasă. Această metodă nu este specifică şi. Principiul metodelor bazate pe studiul potenţialului oxido-reducător Acestea se bazează pe măsurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui indicator redox. . al treilea etalon. producerea de compuşi alcalini sau ca efect al schimburilor ionice. Nivelul de detecţie al acestei metode este foarte scăzut. la 9·108 celule/cm3. 14.). Atunci când aceste modificări pot fi corelate cu creşterea. . altele decât celulele microbiene. etalonul următor corespunde la o concentraţie de 6·108 celule/cm3. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu glicerol). Intensitatea şi viteza de modificare a potenţialului redox depind de numărul şi natura microorganismelor.Această metodă rapidă este valabilă în cazul microorganismelor unicelulare dezvoltate în medii definite şi limpezi. clorura de trifeniltetrazoliu (TTC). în general. agitare.1 cm3 Ia 1 cm3 . Cei mai utilizaţi indicatori redox sunt: resazurina. Indicatori redox utilizaţi pentru aprecierea numărului total de bacterii 15. . Modificarea viscozităţii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de evaluare a creşterii. dextran ş. perturbă evident măsurătorile. volatil. un număr de 106 bacterii produc reductaze care determină decolorarea unei soluţii de albastru de metilen după o oră.opacitatea formată de sulfatul de bariu rezultat din reacţie corespunde în prima eprubetă unei concentraţii bacteriene de 3·108 celule/cm3. Evaluarea proprietatilor microbiene prin studiul potentialului redox Potenţialul de oxido-reducere – rH Numeroase microorganisme modifică potenţialul oxido-reducător al mediilor de cultură prin utilizarea oxigenului şi eliberarea substanţelor reducătoare ca urmare a activităţii lor reductazice. carne. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea pH-ului si a vascozitatii Determinarea pH – ului . microorganismele determină frecvent modificarea pH-ului mediului de cultură prin formare sau consum de acizi organici.în practica de laborator se prepară etaloane nefelometrice din sulfat de bariu. De exemplu. Metoda nefelometrică . azotului bazic total. Prezenţa de particule în suspensie.Ca urmare a activităţilor metabolice. de activitatea metabolică.Aplicabilitate . graţie punerii la punct a unor biofotometre sterilizabile cu funcţionare continuă. Evaluarea viscozităţii mediului . albastru de metilen. Se poate aplica pentru măsurări în sistem continuu ("on line").în fiecare eprubetă se completează apoi volumul până la 10 cm3.a. de natura mediului de cultură şi de condiţiile de mediu (aerare. alcalinităţii totale. colorată în albastru.Ca urmare a evoluţiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaţiei se produc modificări ale proprietăţilor reologice ale mediului fermentativ. Eprubetele ce conţin etaloanele se obturează cu dopuri de cauciuc. pentru a preveni concentrarea. în cantităţi progresiv crescânde de la 0. la un leucoderivat incolor. Tehnici de evaluare a activităţii reductazice se aplică în prezent pentru aprecierea numărului de microorganisme vii din lapte. temperatură) etc.permite măsurarea luminii difuze şi oferă informaţii asupra dimensiunilor celulelor şi concentraţiei lor în suspensii lichide. iar în momentul utilizării se omogenizează conţinutul. Modificarea pH-ului mediilor de cultură este în general sesizată senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. fie acumulării de produşi de fermentaţie (poliglucide: xantan. cu o soluţie de acid sulfuric 1%. Se preferă să se realizeze dozarea titrimetrică cu determinarea: acidităţii totale şi volatile.

se modifică prin dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfăşurării procesului fermentativ ca urmare a transformării moleculelor electric neutre în molecule ionizante. care pot face măsurători “on line". starea fiziologică şi se pot evidenţia tinctorial anumite proprietăţi ale microorganismelor. iar în cazul culturilor de drojdii şi mucegaiuri nu se produc modificări mari ale conductanţei mediului.Determinarea cantitativă a produşilor de fermentaţie care au legătură directă cu creşterea: CO2. Măsurarea impedanţei .citrat sintetaza. sau conductanţa mediului de cultură. malat dehidrogenaza. cu atât mai rapid cu cât microorganismele se dezvoltă mai repede. deoarece prin metabolismul lor se produc puţine molecule ionizabile. În prezent. lactic dehidrogenaza. Evaluarea activităţii unor enzime . se reduce conductivitatea mediului. calorimetrie continuă. comparativ cu un mediu martor de referinţă.a. acid gluconic . Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din pectină de către pectinesterazele fungice şi prin aceasta se poate estima indirect cinetica creşterii culturii fungice. acid acetic . Modificarea impedanţei variază in funcţie de: concentraţia de celule şi tipul microorganismului. frecvenţa semnalului aplicat.. s-a stabilit că evoluţia vitezei de formare a căldurii în sistemul fermentativ este direct proporţională cu concentraţia de biomasă 17. dar nu permite evaluarea numărului de celule vii. oferă informaţii asupra evoluţiei culturii şi pot fi corelaţi cu creşterea.ascorbat oxidaza. Pentru cazul vâscozităţilor foarte mari nu s-a realizat până un prezent un instrument de precizie pentru măsurarea viscozităţii. glutamat dehidrogenaza. prin închiderea sistemului de răcire al bioreactorului şi măsurarea evoluţiei temperaturii pe perioade scurte de timp. iar pragul de detecţie este de aproximativ 106 -107 celule·cm3. Examenul microscopic începe întotdeauna prin realizarea unui preparat între lamă şi lamelă . firme specializate (ex. 16. [kJxdrrfJ].căldura rezultată prin fermentaţie. Metoda permite cuantificarea foarte fină a cineticii formării substanţelor volatile întimpul fermentaţiei şi corelarea acestora cu creşterea celulelor.diaforaza.căldura produsă prin agitare. etanol. Evaluarea proprietatilor microbiene prin metoda calorimetrica Evaluarea calorimetrica Majoritatea reacţiilor metabolice care sunt implicate în creşterea şi multiplicarea celulelor microbiene sunt reacţii exergonice. Una dintre metode se bazează pe măsurarea conductivităţii într-un mediu cu geloză şi KOH în care este captat CO2 rezultat prin fermentaţie.gluconat kinaza. temperatură. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea CO2-ului rezultat si prin masurarea impedantei Determinarea CO2 Sunt cunoscute în prezent mai multe tehnici de evaluare a conţinutului de CO2 rezultat ca urmare a activităţii metabolice a microorganismelor. teste colorimetrice: acid ascorbic . acid acetic. Mărimea Qa poate fi măsurată cu ajutorul unui termometru sau termistor. Za. Qo . căldura eliberată variind direct proporţional cu numărul de celule vii.Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma şi dimensiunile celulelor unor elemente de structură.Impedanţa electrică Z. ergosterol (în cazul mucegaiurilor) ş. Această căldură poate fi măsurată în bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici: calorimetrie dinamică. Qf. Se măsoară modificarea impedanţei mediului pe parcursul dezvoltării culturii. a laptelui. mediul de cultură. Zref. modul de măsurare. Prin înlocuirea progresivă a ionilor hidroxil cu ioni carbonat. Variaţia impedanţei se calculează cu formula: Aplicabilitate Metoda este rapidă şi permite analiza unui număr mare de probe. Microcalorimetrele permit măsurarea schimburilor termice între mediul de fermentaţie şi mediul exterior. acid glutamic . Evaluarea proprietatilor microbiene prin dezvoltarea chimica a produsilor de metabolism si prin evaluarea activitatii unor enzime Dozarea chimică . mai slabi conductori.(NAD→ NADH → H+): aldehida acetică — aldehid dehidrogenaza. compania Boehringer) comercializează numeroase kituri de dozare.Testele se referă la dozarea de compuşi din mediul de fermentaţie (substrat sau produşi de fermentaţie) care pot fi determinaţi prin evaluarea activităţii unor enzime. prin calorimetrie în flux. Qag .căldura produsă prin aerare. calorimetrie în flux.celule. şi anume: teste pentru măsurarea în UV a unui cofactor oxidat . Prin tehnici de cultivare continuă. Acumularea de căldură în timpul cultivării se calculează cu relaţia: Qa = Qf + Qag Qo – QE în care: Qa — căldura acumulată în timpul fermentaţiei. Valoarea Of se calculează în funcţie de pierderile de căldură. 19. proprietăţile suprafeţei şi geometria electrodului şi distanţa dintre electrozi. Această metodă este utilizată pentru analiza cărnii. 18. cu un prag de detecţie de 1-10 µW. Studiul microscopic al microorganismelor . Prin cromatografie de înaltă performanţă a fost posibilă analiza fazei gazoase. QE — pierderile de căldură în mediu. Există în prezent viscozimetre pentru un domeniu larg de măsurare a viscozităţii.

lichefiere stratiformă (6). . cu grosisment x 10 şi x40.c -culturi pe geloză înclinată (inoculare lineară): biomasa invadează întreaga suprafaţă (1). prin intermediul unei scări arbitrare — micrometru ocular. .C este coeficientul micrometric. se determină numărul de diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lăţime).culturi prin înţepare în medii cu gelatină. 20. Măsurătorile în plan orizontal permit stabilirea. circulară (2). mucegaiuri) examenul microscopic în stare vie. divizată în 100 de diviziuni. creştere difuză (4). în preparate umede. care se analizează cu obiective uscate. filamentoasă (6). Micrometrul obiectiv este o lamă de sticlă dreptunghiulară în centrul căreia se află un cerc cu contur uniform în care este gravată scara de 1 mm împărţită în 100 de diviziuni egale. Se notează câte diviziuni ale micrometrului obiectiv se suprapun exact peste un număr de diviziuni ale micrometrului ocular. studiul unor particularităţi privind modul de reproducere şi dimensionarea în plan orizontal a celulelor. Dimensionarea în plan orizontal a celulelor microbiene . Cu excepţia unor studii de evidenţiere a mobilităţii. rizoidală (7). etalonată pentru grosismentul de lucru al microscopului prin intermediul micrometrului obiectiv (scara etalon). pentru a evita deplasarea celulelor. permite un studiu eficient al caracterelor morfologice. cili. creştere filiformă (2). lichefiere sub formă de sac (7): lichefiere totală (8). care stabileşte corespondenţa dintre cele două scări: unde: . incluziuni ş. In cazul bacteriilor. Mod de dimensionare . Pentru măsurare se folosesc de preferinţă preparate umede în care suspendarea celulelor se face în soluţie de 0. se calculează coeficientul micrometric.lăţime). plisată cu striaţiuni concentrice (9).Se plasează lama micrometrului obiectiv pe măsuţa microscopului şi se caută imaginea scării etalon cu obiectivul cu grosisment x 10 şi apoi cu cel x45. formă de fus în masa de geloză (10). . ondulată (3). numărul de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular se multiplică cu coeficientul micrometric stabilit anterior.N numărul de diviziuni pe micrometrul obiectiv. Pentru obţinerea dimensiunilor reale ale celulelor dimensionate. voal (4).n numărul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind în N. bacteriile se studiază numai in preparate uscate şi colorate (colorarea simplă.a forma coloniilor: punctiformă (1).a). In cazul microorganismelor eucariote (drojdii. erodată (5). perlată (2). După stabilirea coeficientului micrometric. convex (3). .b -profilul coloniilor: plat (1): bombat (2). în locul scării etalon. pe măsuţa microscopului se aşează preparatul care conţine celulele de dimensionat.Micrometrul ocular este un disc de sticlă în centrul căruia se află o scară gradată cu lungimea de 10 mm. a două din dimensiunile celulei (lungime . în mod indirect. colorare diferenţială. lobată (4). filiformă (1). prin manevrarea platinei se face suprapunerea celor două scări.(umed). Cu ajutorul scării prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei. plisată cu striaţiuni radiale (8). creştere rizoidală sau arborescentă (5).1% geloză. . ondulată (3). Se montează în interiorul ocularului prin deşurubarea lentilei superioare şi se sprijină pe diafragma ocularului. Micrometrul ocular şi Micrometrul obiectiv.Dimensionarea celulelor microbiene se execută în scopul identificării microorganismelor a căror creştere prezintă anumite limite condiţionate ereditar sau pentru a stabili influenţa unor factori asupra vitezei de creştere celulară. Cunoscând că o diviziune reală a scării etalon este egală cu 10 µm.e –culturi pe mediu lichid: sediment (1): tulburare (2).d . . O diviziune a micrometrului obiectiv este egală cu 10 um. se potriveşte distanţa optimă prin deplasarea diafragmei din tub şi se înşurubează din nou lentila frontală a ocularului. Acest examen permite diferenţierea culturilor de drojdii şi mucegaiuri de cele de bacterii. În cazul în care liniile scării nu se văd distinct. creştere ondulată (3). utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nu este eficientă din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. peliculă sub formă de inel (3). pe cale microscopică. în formă de dom (4). arborescentă (4): lichefiere cratiformă (5). colorare de structuri celulare: capsule. umbonat (5): . Studiul caracterelor culturale Caractere culturale ale microorganismelor în diverse tipuri de culturi .

facultativ anaerobe . N2). în mediu se adaugă substanţe cu caracter reducător ca tioglicolat de Na. . pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor. oxidaze. bacterii butirice.2.Tipuri de comportamente diferenţiate ale microorganismelor .. .nu necesită oxigen pentru creştere. în condiţii aerobe. iar carbonul din compusul organic se regăseşte în dioxidul de carbon.21. Urmează inocularea în strii în profunzimea masei de gel. a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare şi nomenclatură a principalelor tipuri de metabolism. strict anaerobe (b).strict (obligat) anaerobe . utilizând compuşi organici ca acceptori finali ai electronilor. 22. Microorganismele facultativ anaerobe. Importanţa generală a metabolismului energetic în viaţa microorganismelor.Procesul este dependent de oxigenul din aer. în componenţa căreia intră dehidrogenaze. microorganismele sunt încadrate în 4 categorii principale: strict aerobe (a).nu tolerează oxigenul şi mor în prezenţa acestuia. mediul se fluidifică prin încălzire pe baie de apă şi apoi se temperează la 42. având ca produse finale CO2 si H2O. utilizând preferenţial oxigenul când este disponibil datorită cantităţii mai mari. Pipeta se introduce până la partea inferioară a eprubetei. Microorganismele incluse în aceste tipuri pot produce superoxid dismutază şi catalază ce catalizează reacţiile: . cu ajutorul unei pipete Pasteur.4 atunci când pH = 7. Studiul tipului de metabolism energetic In eprubete (8x180 mm) se repartizează câte 10-15 cm3 mediu de cultură. + 0. Nu pot obţine energie prin respiraţie propriu-zisă şi folosesc fermentaţia şi respiraţia în acest scop (ex.3 V. prin care se asigură transferul de masă şi energie între celulă şi mediul ambiant. Se dezvoltă bine în medii lichide în care solubilitatea oxigenului din aer este mai redusă. aerotolerante anaerobe (c). sulfura de Na. sau cultura se menţine în atmosferă de gaze inerte (CO2. BCA+glucoză şi se sterilizează. Aceste microorganisme au capacitatea de a creşte aerob utilizând oxigenul din aer (respiraţie aerobă) sau anaerob. determinat de totalitatea reacţiilor biochimice catalizate secvenţial de enzimele celulei vii. a donatorilor de electroni sau de hidrogen şi a acceptorului final de electroni.Ţinând cont că mediile ce vin in contact cu 02 au un potenţial redox de + 0. citocromi. cultivarea se face în condiţii de aerare.sunt dependente de oxigenul din aer. . cistein-SH. . aerotolerante anaerobe . După răcire şi solidificare mediul se termostatează corespunzător. microaerofile (d).. .45°C. Substanţele reducătoare permit menţinerea unui potenţial de oxido-reducere scăzut. se dezvoltă la suprafaţa lichidelor. microorganismele pot prezenta trei tipuri de metabolism energetic. a mediilor solide.este procesul în cursul căruia reacţiile chimice producătoare de energie necesită prezenţa oxigenului molecular ca acceptor final de electroni. când acceptorul de electroni sau hidrogen este un compus anorganic.sunt cedaţi prin procesul de oxidare unor compuşi anorganici acceptori. a surselor de energie. .este întâlnită la bacteriile strict anaerobe.nu necesită O2 pentru creştere şi cresc la fel de bine în prezenţa sau absenţa sa.. în momentul utilizării.0.2. . metanogene). Fermentaţia . dar cresc mai bine în prezenţa sa. Respiraţia aerobă .microaerofile . Respiraţia anaerobă . îşi adaptează echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare până la produşii finali. Oxigenul serveşte ca acceptor final de electroni transportaţi prin catena respiratorie.este procesul prin care substratul este transformat până la C02. apoi se ridică încet pentru inocularea uniformă (cu 3-4 picături suspensie celule) a mediului de cultură. Ia un potenţial de oxidoreducere de -0. Tipuri de metabolism energetic Viaţa celulei microbiene în condiţii compatibile oferite de mediul ambiant este determinată de caracterele genetice care îi imprimă un anumit metabolism. de aceea. deoarece nu pot descompune apa oxigenată cu efect distructiv asupra celulei. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi şi vase speciale numite anaerostate în care O2 este legat chimic. Aceste bacterii obţin o cantitate mică de energie şi pot creşte în absenţa oxigenului molecular. . citocrom-oxidaze. . iar e.este un proces în care reacţiile chimice producătoare de energie necesită prezenţa unor compuşi organici ca acccptori finali de electroni.Respiraţia aerobă este dependentă de cantitatea de oxigen din aer.Metabolismul oxidativ anaerob poate fi întâlnit şi la microorganisme facultativ anaerobe.se dezvoltă la distanţă mică de suprafaţa mediului de cultură când concentraţia în oxigen este de 2-10%. In funcţie de natura acceptorului final de electroni. atunci când urmărim obţinerea de celule în cantităţi mari (drojdie comprimată) sau obţinerea de substanţe intracelulare. .Microorganismele aerobe dispun de o catenă respiratorie diversificată.aerobe . În funcţie de particularităţile de creştere în raport cu necesarul de oxigen.Respiraţia aerobă este foarte avantajoasă din punct de vedere energetic pentru celula microbiană.

) prezintă interes practic în scopul stabilirii condiţiilor optime de mediu pentru creşterea randamentului în produsul cu importanţă economică. de stadiul de creştere şi de condiţiile de cultivare. CO 2 format este eliberat în mediul înconjurător. .în una din eprubete se acoperă suprafaţa mediului cu 1 cm3 ulei de parafină steril. . alcooli. Determinarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi.după termostatare corespunzătoare se examinează eprubetele şi se notează virarea culorii indicatorului şi eventual formarea de gaz.metabolism inactiv sau "inert". Studiul capacitatii microorganismelor de a metaboliza glucidele Pentru identificarea microorganismelor. aldehide şi cetone. care prin fermentaţie produc acizi şi uneori gaze.metabolism fermentativ. . xiloza. alcooli şi gaze (CO2. . ce pot fi utilizate de microorganisme drept surse de carbon şi energie. CO2 şi apă (metabolism oxidativ). galactoza.absenţă acidifiere sau formare de gaz. formarea de alveole de gaz (în mediu cu geloză). uneori acidifiere mediu fără formare de gaz . zona de formare a dextrinelor o culoare roşie-brună. Metoda bazată pe studiul pH-ului .absenţă modificări în eprubeta cu parafină . Evidentierea metabolismului oxidativ si fermentativ prin metoda bazata pe determinarea pH-ului Microorganismele metabolizează substanţele nutritive în mod diferenţiat. În cazul respiraţiei aerobe.înainte de utilizare. Studiul potenţialului de hidroliză al amidonului .se aplică în general pentru studiul bacteriilor. procurându-şi energia necesară proceselor vitale. După sterilizare. microorganismele au capacitatea de a metaboliza în mod diferit substratul cu formare de acizi. A. Zona devine mai evidentă prin adăugarea în placă a unei soluţii de Lugol. Asimilarea glucidelor simple – auxanograma .2% amidon solubil.1% şi se solidifică din nou. După 7-10 zile se observă vizual hidroliza amidonului după zona clară aflată în jurul coloniei sau în jurul liniei de inoculare. Dintre acestea mai frecvent se utilizează: arabinoza. Prin metabolizarea specifică a acestor substanţe se pot forma acizi organici. H2) (metabolism fermentativ anaerob). mediul se fiuidifică pe baie de apă. mediul se repartizează în plăci Petri şi după solidificare. fructoza. .metabolism oxidativ.metabolism oxidativ sau "inert".Unele microorganisme (bacterii şi mucegaiuri) sunt capabile să sintetizeze hidrolaze extracelulare de tipul α şi β amilaze. care pot hidroliză enzimatic amidonul până la produse cu greutăţi moleculare din ce în ce mai mici.In funcţie de particularităţile metabolice şi de condiţiile de cultivare. şi anume erithrodextrine. achrodextrine. 24.pentru cultivare se utilizează un mediu semisolid ce conţine un indicator de pH. modificarea poziţiei dopului de parafină . glucoza. la selectarea unor microorganisme înalt productive. .absenţă formare gaz. uneori acidifiere fără formare de gaz metabolism fermentativ (bacterii). . cu firul inoculat în suspensia de celule se inoculează "în punct" sau se trasează o linie de-a lungul diametrului plăcii. acidifiere în ambele eprubete cu sau fără formare de gaz.pentru analiză se utilizează câte două eprubete de mediu care se inoculează prin înţepare cu firul exact în zona centrală a tubului de gel. Pentru evidenţierea tipului de metabolism se utilizează două metode principale.23.a. glucoza. Determinarea semicantitativă a activităţii amilolitice a diferitelor microorganismese poate realiza prin stabilirea raportului intre diametrul zonei în care s-a produs hidroliza completă a amidonului şi diametrul coloniei microorganismului de . uneori creşte alcalinitatea în eprubeta cu parafină . este important să se studieze şi capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin urmărirea potenţialului de metabolizare a unor compuşi introduşi în mediul de cultură al microorganismului studiat. Cantitatea şi natura produselor rezultate depind de caracterele ereditare ale microorganismelor. maltoză. atunci când acestea reprezintă unica sursă de carbon prezentă în mediul de cultură. gaze. sau acizi. prin dezvoltarea microorganismelor la suprafaţa mediului de cultură.acidifiere la suprafaţa mediului din eprubeta fără parafină. . formare gaz fără acidifiere. Posibile rezultate .Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le favorizează creşterea.acidifiere cu formare de gaz. In acest caz amidonul nehidrolizat va căpăta culoare albastră. iar zona în care amidonul este complet hidrolizat va rămâne incoloră. zaharoza. apoi se adaugă soluţie de glucoza astfel încât concentraţia finală în mediu să fie de 0. glucoamilaze. Evidenţierea tipului de metabolism se va face prin punerea în evidenţă a produşilor finali de metabolism. Pentru punerea în evidenţă a acestor proprietăţi se foloseşte un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0. absenţă acidifiere sau alcalinizare mediu. După inoculare şi termostatare corespunzătoare rezultatele se interpretează astfel: . în special formarea de gaze. maltoza. lactoza. enzime ş. care în cazul metabolismului fermentativ se concretizează în: acumulare de gaz în tub Durham (mediu lichid).

Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul fermentaţiei şi va reţine vaporii de apă şi alte substanţe volatile. între dopul de vată şi gâtul eprubetei se introduce o bandă de hârtie sterilă îmbibată în soluţie 10% acetat de plumb.cultivarea "în punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin . drept medii de cultură se recomandă apa peptonată sau un mediu lichid care conţine un aminoacid special (de exemplu. Inoculul obţinut se transferă.inocularea celulelor "în punct" pe suprafaţa unui mediu de cultură solidificat (mediul Sierra) sau Tween 80 (polisorbat 80). tulpinile lipazopozitive vor prezenta în jurul coloniilor o zonă clară. sau inocularea se realizează în profunzimea tubului de gel drept (pentru microorganisme anaerobe. 25. cistină.prin dezaminare (dezaminaze) se formează acizi şi amoniac.cultivarea "în punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de măsline steril .după termostatare în condiţii optime de creştere. la o balanţă cu precizie.înainte de repartizarea în plăci Petri. Amoniacul poate să rezulte în urma dezaminării aminoacizilor prezenţi în mediul de cultură al microorganismului de studiat. în condiţii determinate de timp şi temperatură de termostatare.30°C. Studiul metabolismului lipidic Activitatea lipazică (esterazică) a microorganismelor poate fi pusă în evidenţă prin diferite metode. Acesta este parţial folosit drept sursă de azot. cisteină).006 % albastru de Victoria. glicerol.Fermentaţia lactică este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este metabolizat sub acţiunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice în acid lactic ca produs principal al fermentaţiei. In cazul bacteriilor lactice homofermentative. iar excesul se elimină şi poate fi evidenţiat pe cale chimică. În mediu se adaugă 0. Tulpinile cu activitate lipolitică vor fi puse în evidenţă prin prezenţa în jurul coloniilor a unui precipitat de culoare albastru-deschis. când proba capătă culoare galben-oranj. . pe lângă acid lactic se acumulează şi produse secundare: acid acetic. bulion-arginină). mediul Mossel. în proporţie de 2-4 %. Pentru obţinerea inoculului. Metabolismul aminoacizilor Pentru studiul metabolismului aminoacizilor se analizează mai multe aspecte: Formarea amoniacului. .. timp de 3 zile. 48.. Mediul se repartizează în eprubete. Durata cultivării este 7-10 zile. Studiul fermentaţiei alcoolice . mediul Lingby cu geloză. Eliberarea de H 2S se evidenţiază prin înnegrirea hârtiei ca rezultat al formării sulfurii de plumb (PbS). în ventil se introduce. şi anume: . . Producerea de indol este o caracteristică taxonomică importantă pentru caracterizarea şi identificarea enterobacteriilor şi a bacteriilor aparţinând genului Pseudomonas. Cu firul încărcat cu celule se aplică striuri la suprafaţa mediului (pentru microorganisme aerobe). drept urmare a precipitării oleatului de calciu. dat de sărurile acizilor biliari. 26.studiat. După cântărirea iniţială a fiecărui vas. . O altă metodă de evidenţiere a H2S eliberat de către microorganisme constă în cultivarea acestora pe un mediu specific. alcool etilic. se transferă în must de malţ lichid cu concentraţie 6°P (baloane cu 25 cm3 mediu) şi se termostatează 24 h la 25. 24. După termostatare în condiţii oprime. care conţine proteine şi sulfat de fier: mediul peptonă-fier-agar. apoi se cântăreşte fiecare vas şi se calculează prin diferenţă cantitatea medie de CO2 degajată. când rezultă indol.5 atm şi se înclină sau se păstrează ca atare. Această proprietate se poate pune în evidenţă prin cultivarea microorganismelor în mediu de bulion de carne cu peptonă repartizat în eprubete şi sterilizat. sterilizat separat de vasul ce conţine mediul. repartizat în plăci Petri . se sterilizează şi se inoculează cu celulele aparţinând microorganismului de studiat. sub formă de tub de gel. acestea se termostatează la 30°C. CO2. producerea de amoniac este evidenţiată prin reacţia de culoare cu reactivul Nessler (câteva picături). un volum redus (2-3 cm3) de acid sulfuric concentrat. astfel încât să nu atingă suprafaţa mediului. cu o pipetă sterilă în 3 vase de fermentare ce conţin 150 cm 3 must de malţ cu aceeaşi concentraţie sau must de struguri cu 20% zahăr. . Mediul cu agar repartizat în eprubete se sterilizează la 0.caz special este degradarea triptofanului sub acţiunea enzimei triptofanază.prin aceasta. o dată cu eliberarea de H2S are loc înnegrirea mediului ca rezultat al formării sulfurii de fier. În acest caz se pot utiliza şi variante de mediu de cultură cu . pe must de malţ-agar înclinat. tulpinile cu activitate lipazică vor prezenta în jurul coloniilor o zonă opacă. După inocularea mediului cu o suspensie de celule. La intervale de 6. prin orificiul superior. Studiul fermentaţiei lactice . Prin creşterea biomasei.Pentru studiul fermentaţiei aicoolice şi al factorilor care condiţionează viteza de fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparţinând genului Saccharomyces. Producerea de H2S Sub acţiunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conţin sulf în moleculă (metionină. Degradarea specifică a unor aminoacizi Numeroase specii de microorganisme conţin enzime capabile să producă degradarea specifică a unor aminoacizi. are loc eliberarea de H2S. prezenţi în mediul de cultură.prin reacţii de decarboxilare a aminoacizilor (decarboxilaze) rezultă amine. prevăzute cu ventile de fermentaţie. După montarea ventilului de fermentaţie. 72 ore se face agitarea mustului pentru eliminarea Co2 format. facultativ anaerobe sau microaerofile). Pentru evidenţierea producerii de amoniac. Se recomandă ca dopul eprubetei să se acopere cu o folie din plastic pentru a evita evaporarea rapidă a gazului ce se formează. celulele de drojdie din eprubeta cu cultură pură.

d . In geloză nutritivă obişnuită se adaugă o soluţie (5-10%) de gălbenuş de ou în ser fiziologic steril. cu ajutorul anticorpului cunoscut sau să se identifice un anticorp necunoscut. Dacă în compoziţia mediului de cultură se utilizează un indicator de pH (de exemplu. Microplăcile sunt folosite pentru evidenţierea şi dozarea anticorpilor şi toxinelor prin utilizarea diluţiiior. . dacă mediul conţine albastru Evans. şi microorganismul responsabil de aceasta cu ajutorul antigenilor cunoscuţi. test cu antigen colorat (2).reacţia pe lamă (se observă o aglutinare în picătura din dreapta). în cazul unei îmbolnăviri. In cazul utilizării microscopului cu . cu specificitate înaltă. De exemplu. cal ş. Pentru evidenţierea celulelor se folosesc lame sau microplăci care permit efectuarea de teste multiple cu o serie de anticorpi.inhibiţie prin hemaglutinare: hematie şi antigen (1). tulpinile cu activitate lecitinazică vor prezenta în jurul coloniilor o zonă opacă.studiul activităţii lecitinazice se face utilizând un mediu cu gălbenuş de ou. prin interacţiunea dintre situsurile active. Reacţiile de precipitare sau aglutinare se pot realiza pe lamă sau pe microplacă de titrare (fig b). anticorpi marcaţi indirect (3). în jurul coloniilor tulpinilor active va apărea o zonă cu coloraţie galbenă ca urmare a acidifierii produse de acidul butiric format. comparativ cu restul mediului de culoare albastră. Citirea se poate face vizual sau automatizat. induce formarea anticorpilor specifici (puterea antigenică). După termostatare în condiţii optime de creştere. deci un microorganism necunoscut. anticorpi marcaţi direct (2). roşu de fenol). Atunci când se utilizează un suport pe care se fixează anticorpul are loc o precipitare sau aglutinare pasivă. Această reacţie se produce in vivo dar şi in vitro. Precipitarea are loc în cazul unor antigeni moleculari (de exemplu toxine).adaos de compuşi indicatori. utilizând fie anticorpi "naturali" policlonali (obţinuţi de la animale: iepure. de natură bine definită. Principiul metodelor imunologice Atunci când un antigen pătrunde în organismul gazdă. Aceste reacţii sunt utilizate şi în taxonomia microorganismelor şi pentru realizarea unor analize microbiologice. Pentru dozări cantitative de antigeni sau anticorpi se realizează diluţii şi se analizează probele turbidimetric sau nefelometric (λ = 350-400 nm). Metoda directă utilizează antigen şi anticorp marcat specific. Reacţii imunologice de bază a reacţia în tub (ring-test): test simplu în capilar (1). în cazul unor analize. numită şi aglutinare activă sau omogenă). Mediul se repartizează în plăci Petri sterile şi după solidificare celulele microorganismelor de studiat se inoculează "în punct" pe suprafaţa mediului.Principiul metodei imunologice. Testul anticorp Brucella utilizează antigen colorat (fig.a).Reactii imunologice de baza. în jurul coloniilor cu activitate lipazică va apărea o zonă clară.tipuri de anticorpi utilizaţi: anticorpi nemarcaţi (1). la care se adaugă antigenul. testul de aglutinare "Spectate" (RP Diag. obţinuţi prin inginerie genetică (hibridoame). care caracterizează fiecare specie şi uneori unele varietăţi (serotipuri). Metoda indirectă utilizează un anticorp specific şi o antiglobulină (fig. Se amestecă antigenii cu anticorpii în eprubete şi se observă apariţia unei precipitări sau aglutinări. Imunofluorescenţa. Potenţialul de degradare a acizilor graşi se poate evidenţia prin utilizarea acestora ca unică sursă de carbon. competiţie faţă de anticorpi între antigenii purtaţi de hematii şi antigenii de detectat (2).test) utilizează un tub capilar care conţine un ser (anticorp). Aglutinarea are loc în cazul unei legături dintre anticorp şi un antigen particular (aglutinare simplă sau directă. care conţine un ansamblu de antigeni. Suportului are natură diferită (bile de latex.o bacterie. De obicei se pun în evidenţă antigenii. Reacţia în eprubetă. Reacţia în tub sau test inel (ring .Tehnici principale de analiza Imunologia constă în studiul relaţiilor dintre substanţele străine unui organism superior (antigeni) şi apărătorii specifici ai acelui organism (anticorpi). De exemplu. . b . Microorganismele conţin numeroase tipuri de antigeni. Antigenii sunt macromolecule cu compoziţie chimică diferită care au situsuri active. Studii imunologice. fie anticorpi monoclonali. c). Sisteme particulare. Rhône-Poulenc) permite evidenţierea prezenţei bacteriilor din genul Salmonella. Reacţia pe lamă sau placă. reacţionează cu anticorpii printr-o reacţie de precipitare. Reacţia antigen-anticorp realizată in vitro permite. 27. Anticorpii sunt imobilizaţi pe microbile de latex care se colorează diferit în funcţie de tipul de anticorpi.Precipitarea sau aglutinarea în mediu lichid se bazează pe reacţii care au loc în prezenţa antigenilor şi anticorpilor corespondenţi. a). particule magnetice). hematii. Marcajul fluorescent al anticorpului permite vizualizarea antigenului. În zona de contact se formează un precipitat floconos (în formă de inel). Manifestările unei astfel de reacţii sunt variabile: . să se identifice antigenul. Rezultatele sunt interpretate în funcţie de culoarea obţinută. Tehnici principale de analiză .un antigen molecular (element microbian sau toxină) reacţionează cu un anticorp printr-o reacţie de precipitare sau neutralizare. c .

după solidificarea microorganismului test. Detectarea se face în UV. Tehnici de separare a antigenilor şi anticorpilor. specifice microorganismelor eucariote.pentru produse solide ş. De exemplu. După termostatare corespunzătoare se analizează aspectul zonei din imediata vecinătate a coloniilor. apoi se omogenizează. prin fluorescenţă. Coagulazele sunt enzimele care coagulează plasma şi împiedică fagocitoza. Această metodă permite evaluarea cantitativă a celulelor aparţinând unei tulpini sau evidenţierea contaminanţilor. şi anume: metanol : apă pentru lapte: cloroform . dozarea aflatoxinelor se realizează prin măsurarea fluorescenţei. se recoltează 0. pentru bacterii din genurile Staphylococcus. şi anume: . Metode chimice se aplică în special pentru evidenţierea toxinelor cu greutate moleculară redusă. pe medii specifice (de exemplu. pentru dozarea aflatoxinelor se realizează mai întâi extracţia cu soluţie metanolică. În mediul cu geloză de fiuidificat se adaugă 20-25 picături de sânge. După termostatare corespunzătoare. Ochraprep). reţinuţi pe coloană (Aflascan.epifluorescenţă. . . G1). Mediul se repartizează în plăci Petri şi se inoculează "în punct" cu celulele de studiat.5 cm3 ser fiziologic steril). sistemul RP Diag (Rhône-Poulenc) permite detectarea şi extracţia aflatoxinelor şi ochratoxinei prin utilizarea anticorpilor monoclonali. după care se adaugă 0. ADNazele (cu referire la enzimele care distrug materialul nuclear al celulelor) se evidenţiază prin cultivare pe un mediu specific care conţine ADN. De exemplu.fără modificări . Metode generale presupun în primă fază extracţia şi purificarea toxinelor. Pentru identificarea şi dozarea lor se apelează la metode cromatografice. Hemolizinele sunt enzime care produc liza hematiilor. Studiul enzimelor care determină patogenitatea Enzimele care produc patogenitate sunt de mai multe tipuri. După eluţie cu metanol. Coagularea se examinează comparativ cu o probă martor (0. B2. Ele sunt puse în evidenţă prin cultivarea microorganismelor pe medii solidificate cu sânge (de miel sau de cal). urmată de separare princromatografie de afinitate cu anticorpi monoclonali (anti B 1. Tehnicile cele mai actuale de evidenţiere a patogenităţii microorganismelor presupun utilizarea sondelor moleculare sau studiul secvenţelor de cromozoni şi al plasmidelor implicate în imprimarea acestui caracter.1% şi în acest caz developarea unei zone de culoare roz în jurul coloniilor certifică un test ADN-ază pozitiv.formarea unei aureole clare. timp de 24 h.5 cm3 cultură.absenţă hemoliză. Amestecul se termostatează la 37°C şi se examinează din oră în oră. Studiul potentialului patogen al microorganismelor Sunt analizate enzimele care produc patogenitate şi se evidenţiază pericolul toxicogen al microorganismelor. Metode imunologice se utilizează tehnica ELISA sau tehnica de aglutinare în mediu lichid. Aflaprep. se repartizează în plăci Petri şi. se inoculează în strii.5 cm3 cultură + 0. dată de methemoglobină .zona verzuie. Astfel. Pentru separarea antigenilor sau anticorpilor se apelează în prezent la tehnici de imuno-afinitate.a. 28. care se transferă într-o eprubetă de hemoliză. preparatul se colorează cu ajutorul unui marker specific fluorescent.5 cm3 plasmă de iepure diluată (1:5). timp de 24 h. ca urmare a eliberării hemoglobinei -hemoliză β. După cultivarea microorganismelor. hidroliza ADN-ului este evidenţiată prin vaporizare cu acid clorhidric 1N. se pot distinge cu uşurinţă celulele fluorescente de altele. Evidenţierea producerii de toxine Pentru evidenţierea potenţialului toxicogen al microorganismelor sunt utilizate mai multe metode. . Există sisteme comerciale pentru analize de înaltă specificitate. Streptococcus). chimice sau prin fluorescenţă. Metodele de extracţie şi solvenţii utilizaţi variază în funcţie de produs. după reacţia cu SFB (Solution Fluorometry with Bromine).hemoliză α. Acidul poate fi înlocuit cu o soluţie de albastru de toluidină 0. Prezenţa unei zone clare în jurul coloniilor certifică un test pozitiv.