You are on page 1of 7

I Wydział Lekarski II Wydział Lekarski

16.02.2010/23.02.2010 18.02.2010

Ćwiczenie 15
Wirusy DNA
I. Seminarium: Właściwości ogólne i patogeneza zakaŜeń wybranych wirusów DNA w powiązaniu z ich chorobotwórczością

II.

Do wykonania: 1. Izolacja wirusa z materiał klinicznego (keratoconjunctivitis) w hodowli komórkowej 2. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej – odczyn „monospot” (wykrywanie przeciwciał heterofilnych – nieswoista diagnostyka serologiczna) 3. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej – ciąg dalszy: wykrywanie przeciwciał przeciw antygenom VCA, EA i EBNA-1 wirusa EBV przy uŜyciu metody ELISA – serologiczne odczyny swoiste 4. Diagnostyka serologiczna w przypadku reaktywacji zakaŜenia EBV 5. Odczyn ELISA w diagnostyce zakaŜeń parwowirusem B19 – wykrywanie przeciwciał i antygenu wirusa w surowicy krwi 6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŜeń adenowirusami

III.

Demonstracje: 1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo–rdzeniowych i mózgu – zastosowanie metody multiplex-PCR. Sekwencje starterów, układy kontrolne. 2. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z uŜyciem programu BLASTN

/dr n. med. Maciej Przybylski/

1

Ze stojących na lodzie probówek z materiałem klinicznym umieszczonym w poŜywce utrzymującej pobrać 1 ml i przenieść do probówki z hodowlą 3. wraŜliwa na zakaŜenie zarówno herpeswirusami jak i adenowirusami) 2. Po rozpoznaniu wstępnym mononukleozy zakaźnej lekarz zdecydował się na wykonanie serologicznych testów diagnostycznych. W obrazie krwi stwierdzono umiarkowaną leukocytozę (12 500 leukocytów/mm3) oraz obecność limfocytów atypowych. Materiał poddano wstępnej obróbce typowej dla badań wirusologicznych. osłabienia i wysokiej gorączki. niecharakterystyczne ubytki nabłonka rogówki. Do wykrywania przeciwciał heterofilnych stosuje się testy aglutynacyjne z uŜyciem stabilizowanych krwinek baranich zawierających antygeny heterofilne (test Paula-Bunnela-Davidsohna . Do wykonania: Na szkiełkach podstawowych sprawdzić reakcje surowic kontrolnych (dodatniej i ujemnej) z lateksem MZ.PBD) krwinek końskich (test „monospot”) lub lateksu opłaszczonego antygenem heterofilnym (test MZ). 2 . łzawienie oraz pojedyncze. Zlać poŜywkę wzrostową znad hodowli komórkowej (Vero – hodowla komórek nabłonkowych z nerki małpiej. Pobrano wymaz ze spojówek. Obserwacja efektu cytopatycznego po 24 h (na jutrzejszym ćwiczeniu) Do wykrywania antygenów wirusowych w zakaŜonej hodowli komórkowej moŜna stosować odczyn immunoperoksydazowy. Następnie wykonać właściwe badanie z surowicą pacjenta. bolesność palpacyjną wątroby oraz powiększenie śledziony. punktowe. Odczyn Monospot (wykrywanie przeciwciał heterofilnych): W przebiegu mononukleozy zakaźnej wzrost miana przeciwciał heterofilnych często występuje juŜ w pierwszym tygodniu od pojawienia się objawów klinicznych.1. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdził przekrwienie spojówek. uczucie piasku pod powiekami. Izolacja wirusa z materiału klinicznego na hodowli komórkowej Opis przypadku: Do okulisty zgłosiła się 52-letnia kobieta uskarŜająca się na zaczerwienienie spojówek. odczyn immunofluorescencji lub testy immunoenzymatyczne. które potwierdziłyby diagnozę wstępną. Do wykonania: (Uwaga: wszystkie czynności związane z hodowlami komórkowymi wykonujemy przy zachowaniu jalowości) 1. . Diagnostyka serologiczna mononukleozy zakaźnej Opis przypadku (pacjent 1): Osiemnastoletni męŜczyzna zgłosił się do lekarza z powodu bólów gardła. powiększenie węzłów chłonnych szyi. łzawienie. 2. Objawy te pojawiły się u niej poprzedniego dnia. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdził powiększenie migdałków.

punktu 2.3.d. wyników testów laboratoryjnych i wyników testów nieswoistych (P-B-D. swoiste testy serologiczne mogą być pomocne w ocenie statusu odpowiedzi humoralnej w przypadkach zakaŜeń pacjentów z grup ryzyka w 3 . Zastosowanie odczynu ELISA do wykrywania swoistej odpowiedzi humoralnej (IgM.) Wykrycie w surowicy swoistych przeciwciał skierowanych przeciw antygenom wirusa Epsteina-Barr stanowi potwierdzenie zakaŜenia. przy czym przeciwciała te nie pojawiają się u wszystkich ludzi. Odczyn ELISA w diagnostyce mononukleozy zakaźnej – poszukiwanie swoistych przeciwciał (c. Utrzymujące się długotrwale wysokie miano przeciwciał anty-EBNA charakterystyczne jest dla zakaŜeń przewlekłych wywołanych przez EBV oraz dla zmian limfoproliferacyjnych o etiologii EBV. test lateksowy MZ. Jako ostatnie pojawiają się przeciwciała anty-EBNA (przeciw antygenowi jądrowemu). W odniesieniu do do objawów klinicznych. nieco później anty-EA (przeciw antygenowi wczesnemu). 4. monospot) ułatwia postawienie jednoznacznej diagnozy mononukleozy zakaźnej. Swoista odpowiedź humoralna w mononukleozie zakaźnej: W przebiegu mononukleozy zakaźnej jako pierwsze pojawiają się przeciwciała anty-VCA (przeciw antygenowi kapsydu). która jest najpowszechniejszą formą objawową ostrego pierwotnego zakaŜenia EBV w populacji immunokompetentnej. IgG) wobec antygenów EBV w przypadku reaktywacji zakaŜenia latentnego (pacjent 2) Oprócz diagnostyki w przypadku podejrzenia mononukleozy zakaźnej. u których występują objawy mononukleozy zakaźnej.

z wrodzonymi zaburzeniami immunologicznymi oraz u pacjentów cierpiących na nowotwory. brak apetytu i utrzymującą się podwyŜszoną temperaturę ciała (37. Stwierdzono takŜe znacznie wydłuŜony czas krwawienia. 5. chroniczne aktywne zakaŜenie EBV lub zespoły zbliŜone do mononukleozy.odniesieniu do cięŜkich postaci zakaŜeń EBV. zarówno zakaŜenia pierwotne jak i wynikajace z reaktywacji latentnego EBV mogą prowadzic do szeregu zespołów klinicznych takich jak zespoły limfoproliferacyjne. matka zdecydowała się przyprowadzic do przychodni 8-letniego chłopca. W badaniu przedmiotowym z odchyleń stwierdzono bladość skóry oraz drobne wybroczyny na błonach śluzowych jamy ustnej i gardła. wzrost stęŜenia Ŝelaza w surowicy i zwiększone OB. Przebieg zakaŜenia pierwotnego parwowirusem B19 4 . Stwierdzono niedokrwistość normocytową. znacznie zmniejszoną liczbę retikulocytów. granulocytopenię z względną limfocytozą oraz małopłytkowość.5°C) przy wieczornym pomiarze. lecz o cięŜszym przebiegu. Wykonano badanie laboratoryjne krwi. U pacjentów poddanych immunosupresji. W wywiadzie stwierdzono w okresie ostatnich dwóch tygodni postępujące zmniejszenie aktywności ruchowej. Lekarz zlecił wykonanie badań serologicznych: oznaczenie przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 w klasach IgM i IgG oraz oznaczenie antygenu wirusa B19 we krwi pacjenta. Na podstawie wyników badań klinicznych i laboratoryjnych stwierdzono zmniejszoną czynność krwiotwórczą szpiku. Jako jedną z moŜliwych przyczyn uznano zakaŜenie parwowirusem B19. Odczyn ELISA w diagnostyce przełomu aplastycznego związanego z zakaŜeniem parwowirusem B19 Opis przypadku Z powodu powtarzających się od kilku dni krwawień z nosa. senność.

pojawiły się objawy zapalenia płuc. 5. Po trzech dniach w linii komórkowej A549 (linia wraŜliwa na zakaŜenie adenowirusami) pojawił się nasilony efekt cytopatyczny. biorąc pod uwagę wirusową etiologię zakaŜenia. pokojowej w ciemności. Po wyjęciu z kominka szkiełko delikatnie osuszyć bibułą. Odczytać pod mikroskopem świetlnym (w pow. zalać zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS). W pozostałych liniach efekt cytopatyczny nie wystapił. Pacjent pali papierosy. 4. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŜeń adenowirusami Opis przypadku: U 20 – letniego męŜczyzny przebywającego na oddziale chirurgii. 6. W badaniu osłuchowym stwierdzono szmery oddechowe w dolnej lewej części klatki piersiowej. Pośród innych badań mikrobiologicznych. Powtórzyć punkt 3. 5): Do wszystkich opisanych dołków dodać po 50 µl chromogenu (tetrametylbenzydyny – TMB). 3. delikatnie poruszając szkiełkiem. Na preparat nakroplić 20 µl chromogenu. Następnie pasek inkubować przez 10 min. Ŝe pacjent miewał juŜ zapalenia płuc (ostatnio dwa lata temu). swoiste wobec wszystkich typów adenowirusów wywołujących zakaŜenia u człowieka) Wykonanie odczynu: UWAGA: Na kaŜdym stole jest przygotowany preparat z utrwalonymi komórkami zakaŜonymi adenowirusem. zlecił laboratoryjną identyfikację czynnika etiologicznego. adenowirusy).*)TAC – transient aplastic crisis DO WYKONANIA W ODCZYNACH ELISA (do punktów 3. Lekarz. Wirus został poddany inaktywacji. Po inkubacji naleŜy przerwać reakcję enzymatyczną dodając do wszystkich dołków po 50 µl 0. Inkubować przez 10 minut w 37°C w komorze wilgotnej Szkiełko umieścić w szklanym kominku do płukania. ortomyksowirusy. Z wywiadu wynika. Uwaga! Dotknięcie okrągłego pola na szkiełku doprowadzi do starcia komórek! Nie dotykać! 1. wykonano badanie polegające na izolacji wirusa z popłuczyn oskrzelowych w hodowlach komórkowych. U chorego występował napadowy suchy kaszel. materiał posiano na hodowle komórkowe wraŜliwe na zakaŜenie wirusami oddechowymi (paramyksowirusy. W badaniu radiologicznym w dolnym płacie płuca lewego stwierdzono kilka obszarów nacieczonych śródmiąŜszowo. 6. Po obróbce.5N roztworu H2SO4. płytki oddech i podwyŜszona temperatura ciała (38. 2. płukać przez dwie minuty. Na preparat utrwalony na szkiełku podstawowym nakroplić 20 µl wzorcowej surowicy (Buteleczka z ciemnego szkła podpisana „Chromogen IP”).8°C przy wieczornym pomiarze). z przeznaczeniem do odczynu immunoperoksydazowego z uŜyciem surowicy wzorcowej (przeciwciała monoklonalne przeciw białkom heksonów adenowirusów. inkubować przez 5 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej. 5 . 400x) 4. w temp. w ósmej dobie po wykonanym zabiegu splenektomii. Wynik naleŜy odczytać nie później niŜ pół godziny po przerwaniu reakcji. Z komórek hodowli wykonano rozmaz na szkiełkach podstawowych.

silnym bólem głowy. procedury: I. Badanie laboratoryjne płynu mózgowo-rdzeniowego wykazały umiarkowaną pleocytozę. lekki niedowład połowiczy oraz tachykardię. poziom glukozy i białka w normie. II. Badanie wykonano wg. III. zaburzenia równowagi.DEMONSTRACJA: 1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu – zastosowanie testu multiplex PCR (demonstracja) Opis przypadku: Do izby przyjęć szpitala rejonowego przywieziono 37-letniego męŜczyznę z temperaturą 39°C. dreszczami. Pobrano krew i płyn mózgowo-rdzeniowy do badań ogólnych imikrobiologicznych. Na podstawie wyników badań zdecydowano się wykonać równieŜ badanie wirusologiczne płynu mózgowo-rdzeniowego metodą multiplex-PCR pod kątem wirusa opryszczki. nudnościami i wymiotami. Ekstrakcja DNA z próbki materiału klinicznego (200 µl płynu mózgowo-rdzeniowego) Amplifikacja DNA metodą reakcji łańcuchowej polimeryzacji Detekcja zamplifikowanych fragmentów DNA (rozdział elektroforetyczny produktów PCR w Ŝelu agarozowym) Zdjęcie Ŝelu po elektroforezie: 6 . W badaniu przedmiotowym stwierdzono zamroczenie.

fas” zawierający sekwencję produktu PCR przeprowadzonego ze starterami swoistymi dla adenowirusów (plik znajduje się na pulpicie). 7. aŜ program przeszuka bazę danych. wolne od DNA HSV) HSV 1 TK-. W sekcji “Basic BLAST” wybrać program “nucleotide blast” Wkleić skopiowaną sekwencję do okna “Enter accesion number. Otworzyć okno przeglądarki. Powinna być widoczna strona internetowa NCBI BLAST (basic local alignment search tool – podstawowa wyszukiwarka lokalnych sekwencji komplementarnych). oporne na acyklowir HSV 1 TK+. 4. gi or FASTA sequence” (ctrl+v) Sprawdzić. b.100 par zasad K (-): kontrola ujemna (DNA człowieka. Na podstawie podobieństwa sekwencji badanej i zestawu sekwencji z bazy danych zidentyfikować typ wirusa. Wybrana jest baza danych “nucleotide collection (nr/nt)” Zaznaczono opcję “highly similar sequence” Zaznaczono opcję “Show results in a new window” Nacisnąć przycisk “BLAST”. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z uŜyciem programu BLASTN 1. 8. wraŜliwe na acyklowir P M-R: badany płyn mózgowo . czy: a. w przegladarce pojawi się okno wyników. Zaznaczyć całą sekwencję nukleotydów i skopiować ją (ctrl+c). c.rdzeniowy Długość produktów: HSV-1 (gen polimerazy DNA): 469 pz HSV-2 (gen polimerazy DNA): 390 pz Kinaza tymidynowa: 1200 pz 3.Oznaczenia: 100 bp M: znacznik długości produktu . 5. HSV 2 TK-: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające zmutowany gen kinazy tymidynowej. Poczekać. 6. 3. HSV 2 TK+: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające prawidłowy gen kinazy tymidynowej. Zidentyfikowany typ adenowirusa: Podobieństwo: [%] 7 . W komputerze na sali ćwiczeń: w programie “notatnik” otworzyć plik sekwencji “adenowirus. Określić stopień podobieństwa najbardziej zbliŜonej sekwencji. 2.