TECNICAS GENERALES

EN MICROBIOLOGIA
vinificatum.blogspot.com
Jose María Xandri Tagueña

Micología Industrial
Mohos
MYCOLOGíA INDUSTRIAL
Nociones sobre Mycología lndustrial.- Los Mohos.- Formación endó-
gena.- Formación exógena.- Penicillum o Moho verde.- Aspergillus.-
Mucor.- La Podredumbre noble.- Caracteres morfológicos.- Fisiología
del Botrytis cinerea.- Cultivo sobre mosto de uva.- Formación de ácido
cÍtrico.- Formación de ácido glucónico.- Formación de glicerol.
Los Mohos.- Entre los mohos se aprecia el cuerpo vegetativo constituido por
una ó varias células, generalmente de forma alargada ó filamentosa, y se puede conside-
rar dividido en dos partes, que desempeñan diferente oficio:
El micelio que proporciona el alimento, adherido al sustrato nutritivo en el -
que penetra.
El esporángio, que es el organo fructifero, que produce células especiales lla-
madas esporas, capaces de dar vida a un nuevo individuo, de la misma especie.
Las esporas son células generalmente redondeadas dotadas de gran poder de -
resistencia.. Cuando caen en un sustrato nutritivo apropiado, germinan y dan origen a-
un micelio.
El exámen al microscopio de un micelio no es suficiente para poder conocer -
a que familia pertenece un moho determinado, es necesario ver el organo de
ción y el modo de formarse la espora, que puede ser de dos maneras diferentes:
Sexualmente: Cuando se realiza la fusión de dos células.
Asexualmente: Cuando no se realiza la fusión de dos células.
Formación endógena.- Cuando la espora se origina en el interior de la célula,
esta se convierte en esporangio. El esporangio puede formarse en el extremo de una hi-
fa que se levanta del micelio del moho, tomando entonces el nombre de esporangio una
forma mas perfecta del esporangio es el asca, la que caracteriza el orden de los Ascomi-
cetos, al que pertenecen los saccharomicetos.
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Formación exógena.- Cuando la espora se forma fuera de la célula, por se-
paración.
La espora en este caso se denomina Conidia, y las células sobre la que se en-
cuentran adheridas y las soporta se denomina conidióforo. Las conidias pueden estar -
aisladas, en grupos ó formando cadenas.
La forma más perfecta del conidióforo es el basidio, organo que soporta las -
conidias, en número, tamaño y forma determinada.
Otra forma de organo de fructificación es la clamidosporas, cuando una parte
del micelio se subdivide en numerosas células, que se separan con caracteres de espora, -
con paredes espesadas y demás características.
La zigospora, el asca y el basidio, son fructificaciones principales, la conidia y
clamidospora, son fructificaciones secundarias.
Numerosos mohos presentan una y otra. Las fructificaciones con conidias -
son las más difundidas.
Hay numerosos microorganismos en los que no se aprecia fructificación secun-
daria, y son denominados hongos imperfectos.
Se destacan para su estudio los mohos siguientes que se consideran como los
más interesantes en la vinificación: Botrytis cinerea ( gris), el Penicillum ( verde), el -
Aspergillus ( negro ), y el Mucor ( blanquecino ).
Siendo de mucha importancia para el reconocimiento de estos mohos, la ob-
servación al microscopio de los órganos de fructificación. Por lo que deberán buscarse
en la masa del moho y si no se encuentra, cultivarle en condiciones de que se produz-
can.
Penicillum o Moho Verde.- Se desarrolla y prospera sobre la uva en otoños
húmedos y lluviosos, produciendo grandes daños, disminuyendo el producto y comu-
nicando al mosto y vino, sabor marcado y desagradable, a moho.
En las paredes de las bodegas y en los envases, especialmente de madera,
también suele desarrollarse cuando las condiciones de medio ambiente, y poco cuida-
do de la limpieza, lo favorecen.
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Forma vegetativa del Penicillium.- El cuerpo vegetativo está constituido por un mice-
lio blanco-grisáceo, del que se destacan numerosos filamentos que se ramifican y en -
cuyo extremo se dividen y a su vez se bifurcan nuevamente, formando células alarga-
das formando los esterigmas, que soportan numerosa serie de conidias colocadas en -
rosario.
La conidias son un poco más pequeñas que las del Botrytis, de color verdo-
so, muy resistentes y muy ligeras facilmente difundidas por el viento y los insectos.
Este moho ataca la uva pero especialmente cuando presenta rotura invadién-
dola rápidamente, generalmente está en compañia con el Botrytis, Aspergillus y Mu-
cor.
El penicillium es siempre dañoso, ataca los azúcares más rápidamente que -
los ácidos, ataca a los taninos y materia colorante más enérgicamente que el Botrytis
y puede hacer amargo al vino; pero especialmente grave es el sabor a moho que origi-
na en mosto, vino e incluso en destilado, que los hace inservibles. También como el
Botrytis deja en el mosto sustancia que perjudica el desarrollo de la fermentación.
Aspergillus.- Es otro moho que se desarrolla frecuentemente en las uvas, -
comprende varias especies ae caracteres diversos especialmente en el color, que puede
ser amarillento, grisáceo ó verdoso claro y negro.
Consta de un micelio más grueso que el Penicillium, del que emergen coni-
dióforo sin segmentación, en cuya extremidad presentan un engrosamiento sobre el -
cuál están insertos los esterigmas, estos a su vez soportan las conidias, que son más -
gruesas que las del penicillium.
El mucor produce en la uva, efectos parecidos a los del penicillium, con el
que suele casi siempre aparecer juntos.
Mucor.- En asociación con los mohos antes tratados, pueden existir otros
como sucede con el Mucor. Este es frecuente en la materia orgánica de sitios húme-
dos. En la uva acompaña expresamente al Botrytis y Penicillium y Aspergillus, for-
mando espeso filtro blancuzco.
Al microscopio se observa que este moho está constituido por un ovillo ó -
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masa filamentosa sin divisiones, o sea de un micelio formado de una sola célula, que
puede alcanzar proporciones gigantescas.
De este micelio se le.vanta un filamento que en su extremidad presenta un-
hinchamiento que contiene numerosas esporas. Cuando el micelio se sumerge en un
líquido azúcarado puede dividirse en varias porciones y estas adquirir formas redon-
deadas.
Estas nuevas formas pueden separase y dar origen a un nuevo micelio ó se-
guir reproduciéndose por gemación como si fuera un verdadero saccharomyceto. En
el interior del filamento miceliar, pueden formarse englutinados de plasma, los que -
rodeándose de una espesa membrana, dan lugar a gemas, resistentes y capaces de con-
servar la especie.
Actuando sobre la uva, consumen notable cantidad de azúcar, y en el mos-
to dan lugar a formación de ácido oxálico y alcohol, pudiendo algunas especies for-
mar hasta un 7 %.
MICROFLORA DE LOS VINOS
Cultivo de Mycoderma Vini en el vino. La membrana cubre la su-
perficie del líquido y asciende sobre la pared, (X natural) (S. Rossi)
Mycoderma Tenax; colonia su-
perficial sobre gelatina de mos-
to de uva el 10% después de -
7 días a 20° (X, 30) (S. De Ro-
ssi).
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (1) (S. Smith, G ).
I
11
í.
III
IV
v VI
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (11)
"
VII
IX
X
VIII
XI
XII
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (111)
XIII
XV
XVII
XIV
XVI
XVIII
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (IV)
XIX
XXI
XX
XXII
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (V)
XXIII XXIV
XXVI
...."'..
XXV
XXVIII XXVII
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MICOLOGIA INDUSTRIAL (Leyenda)
1.- Mucor mucedo.- Columna (izda.) y esporangio con pared quebrantada -
y esporas emergentes ( 150 aumentos ).
11.- Mucor racemosus.- Clamidosporas ( 325 aumentos ).
111.- Mucor racemosus.- Imagen del cultivo en cámara húmeda tomada dos ho-
ras después de la del fotograbado III. ( 15O aumentos ).
IV.- Mucor racemosus.- Germinación de la espora. A la izquierda, abajo, se -
ve una espora no germinada. La flecha señala la espora abultada después
de la germinación ( 380 aumentos ).
V.- Mucor racemosus.- Esporangióforo ramificado con esporagios y esporas
( 325 aumentos ).
VI.-
VII.-
VIII.-
IX.-
X.-
XI.-
XII.-
Mucor racemosus.- Levaduras mucorales y células esféricas después de ha-
ber permanecido ~ 4 horas en mosto ( 150 aumentos ).
Mucor plumbeus.- Columna ( 380 aumentos).
Rhizopus nigricans.- Rizoides con: 1, base del esporangióforo; 2, base del
estolón ( 70 aumentos ).
Aspergillus glaucus.- 1, conidia, a las ocho horas de permanencia en cáma-
ra húmeda; 2, la misma conidia tras encontrarse doce horas en cámara hú-
da ( 575 aumentos ).
Aspergillus glaucus.- Cámara húmeda, a las 36 horas ( 150 aumentos ).
Aspergillus glaucus.- Peritecio quebrantado con ascos y acosporas ( 575 -
aumentos ).
Penicillium expansum.- Conidióforos con conidias ( 600 aumentos ).
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XIIl.-
XIV.-
Aspergillus glaucus.- Cámara húmeda, cinco días. Formación de conidias
( 380 aumentos ).
Penicillium brevicaule.- Conidióforo con esterigmas y conidias ( 575 au-
mentos ).
XV.- Citromyces sp.- Conidióforos con esterigmas ( 575 aumentos ).
XVI.- Aspergillus glaucus.- Cámara húmeda, 60 horas ( 70 aumentos ).
XVII.- Thamnidium elegans.- Esporangiolos ( 150 aumentos ).
XVIII.- Penicillium roqueforti.- Colonia sobre agar-mosto, 72 horas a 25° C ( ta-
maño natural ).
XIX..... Paecilomyces ( 400 aumentos ).
XX.- . Monilia sitophila.- (420 aumentos ).
XXI.- Oospora lactis.- (600 aumentos).
XXII.- Botrytis cinerea.- Conidióforos con conidias ( 900 aumentos ).
XXIII.- Cladosporium herbarum. Conidióforo con conidias. ( 500 aumentos aprox. )
XXI V.- Trichothecium roseum.- Conidióforos con conidias ( 380 aumentos ).
XXV.- P1,111ularia pullulans.- MIcelio y conidias. La flecha señala una conidia en
reposo con dos células ( 380 aumentos ).
XXVI.- Fusarium sp.- 1, conidióforos con manojos de conidias; 2, conidias germi-
nantes; 3, conidias falciformes ( 380 aumentos ).
XXVII.- Alternaria circinans.- Conidióforos con conidias ( 300 aumentos ).
XXVIII.- Phoma sp.- Picnidios ( 380 aumentos ).
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PODRECUMBRE NOBLE
El desarrollo y la actuación de el hongo microscópico, el Botrytis cinerea -
sobre las uvas del racimo, puede ser según las circunstancias de medio ambiente y es-
tado de la uva, una acción beneficiosa ó perjudicial, pasando por una serie de estados
intermedios. En el primer caso se denomina "podredumbre Noble" y en el segundo
caso" podredumbre Vulgar ".
En regiones de climas con periodos húmedos y periodos soleados, son favorables para
el desarrollo de la "podredumbre noble". La forma de propagación y desarrollo del
hongo, es por la geminación de sus esporas ( conidias ) en la superficie del grano, -
cuando las condiciones de húmedad son favorables, entonces al caer en la superficie -
de la película del grano, emite tubos de germinación de unas 15011 de diámetro, par-
tiendo del interior de estos tubos otros más finos y estos finos tubos ( de 111 de diá-
metro) atraviesan la cutícula y se desarrolla un micelio que invade intercelularmente
una capa de cuatro a ocho células o sea un espesor de aproximadamente 1 mm. Se
acusa esta invasión por.la aparición de manchas célulares más oscuras que se extien-
den hasta recubrir completamente la superficie del grano, el que va desecándose y -
arrugándose, conocida esta fase como de "grano de podredumbre plena".
Si la humedad ambiente es excesiva, se acusan micelios grisáceos sobre la -
superficie del grano, estos micelios si siguen desarrollándo y aglutinándose y si logran
penetrar en el grano por alguna fisura, penetran en la pulpa y la consumen con conse-
cuencias muy perjudiciales, esta es la podredumbre vulgar.
Esta es la más frecuente en nuestro país en años lluviosos y si además hay
granizo que rompe las uvas, las consecuencias perjudiciales expuestas se manifiestan -
más sensiblemente.
Caracteres Morfológicos.- El aspecto más corriente es de un micelio tabica-
do, robusto, que forma conidióforos ramificados, que emite conidias redondeadas de
6 - 8 11 , e incoloro ó más espeso, grisáceo.
El micelio de este moho puede dar lugar a otra forma, varias de sus hifas se unen y -
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remontándose se agrupan en masa de aspecto diverso, predominando el de esclerocio.
De este esclerocio en condiciones oportunas nace un tallo que se ensancha en el ex-
tremo ( apotecio ), es concavo y produce ascas con 8 esporas. Esta forma se deno-
mina Schlerotinia Fuckeliana.
Este moho se desarrolla no solamente en la uva, sino también en otras plan-
tas y flores, originando perjuicios.
Fisiología del Botrytis cinerea.- La actuación del Botrytis sobre el sustra-
to que parasita, se caracteriza por la combustión profunda del mismo, consume los -
azúcares y los ácidos, desapareciendo estos más rápidamente que los azúcares, y el -
ácido tártrico más que el ácido málico.
Forma glicerol y un mucüago soluble la dextrana, y en ciertas condiciones
manitol a partir de la glucosa, ácido cítrico a partir de las exosas y además ácido acé-
tico y láctico y alcohol etílico.
Numerosas diastasas han sido identificadas en el Botrytis cinerea: Una oxi-
dasa o más bien un complejo de forma oxidasica que engloba la tanasa ó polifenolo-
xidasa, la lacasa, la catalasa, la glucosa-oxidasa, el ácido ascórbico-oxidasa, entre otras
de la que t ~ b i é n se destaca la pectinasa que hidroliza las pectinas de las paredes ce-
lulares, la celulasa que descompone la celula, una proteolasa y la Ureasa, pudiendo -
apreciarse el amplio campo de actuación y las posibles y profundas modificaciones del
medio sobre el que actúe este moho.
Cultivo sobre mosto de uva.- Una siembra asépticamente realizada, deposi-
tando sobre la superficie de mosto estéril, bien sea un trozo de micelio ó unas gotas-
de suspensión de esporas. Al cabo de unos días, cuando la siembra se realizó en esta
última forma, se aprecia la formación de la superficie de una serie de manchas blan-
quecinas, que se desarrollan recubriendo la superficie del mosto formando velo espeso
como fieltro que continúa espesándose, formando una membrana que la dextrana le -
da consistencia vizcosa en la parte inferior sumergida.
El micelio primero blanco, va haciéndose rápidamente grisáceo por la apari-
ción de conidias.
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Conidióforo en forma de plumero.
a.- Penicillium, b.- Citromyces. 'Q:)m.i{,CClC;Ollí2S del
cO'li d i é9oro
¡VI e t l.l.l a
e 01.. 1 ci,. Q S
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5 tQr', 9"'.) .":; ~ C \ 0 4 n G\.lr¡e
Aspergillus
Penicillium
Conidióforos en cabeza de As-
pergillus. a.- jóvenes, b.- vie-
jos.
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Blastoconidia ( = Mucor-Levadura j
observada con microscópio de Fase
( 700 aumentos aprox. )
Mucor racemosus.- Parte superior izquierda -
cOllidiósporos en cabeza. Parte superior dere-
cha conidiósporo abriéndose. Parte inferior iz-
quierda levadura-mucor. Parte inferior derecha
hifas de oidio.
Mucor racemosus.- Izquierda: Hifas, Oididos y blastoconidias ( = Levaduras),
parte oscura Condriosomas en int. de células. Centro: 4 Blastoconidios, inte-
rior tétradas y configuración de condriosomas. Dcha.- Aislados y bacterias-
-cuerpo junto con Condriosomas.
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a.- Cabeza de conidias normal de Botrytis cinerea,
b.- Falso conidióforo desarrollado en cultivo de la-
boratorio.
Botrytis cinerea
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El consumo de azúcar es rápido, en 38 días desaparece la mitad de la rique-
za, calculándose que para formar 1 gr. de micelio, se consumen 10 de azúcar.
El efecto del Botrytis, sobre los ácidos del mosto muy variable según las ce-
pas y condiciones. Hay cepas capaces de rebajar la acidéz de la uva, mientras que -
otras, consideradas como acidógenas, la aumentan. Se considera que los mostos del
pH bajo se desacifican, mientras que en los de pH alto hay acidificación.
La disminución de la acidéz es originada generalmente por la combustión -
de los ácidos tátrico y málico, y el aumento por la formación de ácidos cítricos y glu-
cónico, que se trata a continuación.
Formación de ácido cítrico (R-Gayon pág. 173 ).- Como es frecuente en
otros mohos, el Botrytis, forma ácido cítrico por oxidación de los azúcares, fenóme-
no relacionado con la supiración del moho. La ecuación global de la formación del
ácido cítrico por oxidación de la glucosa, es la siguiente:
De manera similar a lo que ocurre en la fermentación alcohólica, el primer
estado de esta oxidación, es el del paso a partir de los triasefosfatos a ácido pirúvico.
El ácido cítrico según el ciclo de Krebs proviene de la condensación del ácido pirúvi-
ca.
Según el ciclo Krebs ( pág. 68 R-Gayon ) el ácido cítrico proviene de la -
condensación del ácido pirúvico y del ácido oxalacético.
2COOH - Co - CH2 - COOH + 2CH3 - CO - COOH + 02
ácido oxalacético ácido pirúvico
2 COOH - CH2 - COH ( COOH ) - CH2 - COOH + C02
ácido cítrico
El ácido oxalacético proviene de la carboxilación del ácido pirúvico.
CH3 - Co - COOH + C02 COOH - CH2 - CO - COOH
Influencia del pH en la formación de ácido cítrico por el Botrytis.
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Según los datos referentes a un cultivo en mostos, de Botrytis, a los 45 días
de actuación y con diferentes pH, los resultados fueron:
pH de partida 2,6 3,06 3,47 4,03 4,7 5,81 7
ácido cítrico formado en m.e.q. 4 8 39 59 68 84 89
Formación de ácido glucónico.- Varios mohos por intermedio de la diasta-
sa glucosa - oxidasa, son capaces de formar ácido glucónico a partir de la glucosa, lo -
que realiza por oxidación del grupo carboxilado de la funciólI aldehídica de la glucosa:
2 CH2 - OH -(CHOH)4 - CHO + 02 = 2 CH2 - OH - (CHOH)4 - COOH
El Botrytis Cinerea posse glucosa - oxidasa y en los medios de cultivo y en
las uvas con podredumbre, mientras que en las uvas sanas no se encuentra más que -
trazas. Las dosis de ácido glucónico en mostos de uva con podredumbre puede regis-
trar las cifras de 1- 2 g.p.l., siendo signo de esta podredumbre la presencia marcada -
de dicho ácido glucónico.
Formación de glicerol.- Por varios autores ( Laborde, Mi.íller-Turgau ) se de-
mostró la formación de gliceról por acción del Uotrytis Cillerea, acusándose en dosis -
sensibles en lo¡¡ vinos de Sauternes.
Se considera que el mecanismo de esta formaciólI de gliccról J costa dt: los
azúcares y en [Jse aerobia, iguál al de formación en el c u r ~ o de fermcntacióJl Jnaero-
bia de los azúcares.
El ácido pirúvico es metabolizado, pero el gliceról se acumula. El pH me-
dio influye muy sensiblemente, especialmente a partir de los 25 - 30 días de actuación,
diferenciándose muy marcadamente las riquezas en gliceról de varios medios de cultivo
con diferentes pH. Disminuyendo el gliceról primeramente formado, tanto más rápi-
damente cuanto más alto es el pH, disminución originada por cOlJlbustión.
Ribercau -Gayon y Peynuud ( * ) exponen un conjullto deL.lbdo de la ac-·
ción del Botrytis cinerea sobre los ácidos.
( *) Tratado de Enología. TOlJlo 1, pág. 177.
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MICROFLORA DE LOS VINOS
Mycoderma Duplex: de la membrana superfi-
cial de un cultivo en vino blanco diluido, des-
pués de 8 días ( X. 1000 ) (S. De Rossi).
Mycoderma Duplex: colonia
superficial en gelatina de mos-
to de uva al 10% después de
7 días a 20
Q
( X. 30 ) (S. De
Rossi ).
Tapón sulfurador pa-
sserUll.
Tapón carbonicador Rossi
Dispositivos para
atmosferas contro-
ladas.
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