You are on page 1of 8

TEHNICI DE IZOLARE ŞI SORTARE CELULARĂ IZOLAREA ŞI SORTAREA CELULARĂ Majoritatea tehnicilor de analiză biochimică presupun izolarea celulelor din

contextul lor tisular. În acelaşi timp, pentru o analiză cantitativă şi calitativă coerentă, este necesar un număr relativ mare de celule. Dacă pornim investigaţia de la un fragment de ţesut, problema întâmpinată constă în faptul că acest fragment conţine un număr mare de specii celulare amestecate. Este deci necesară extragerea diferitelor specii celulare urmată de o sortare în funcţie de diferite criterii; dacă numărul de celule este satisfăcător, se poate trece la destructurarea celulară în vederea analizei conţinutului; dacă numărul de celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora în cadrul unor culturi celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiză ulterioară. Izolarea celulară din ţesuturi Cele mai accesibile ţesuturi animale pentru izolare celulară sunt cele fetale sau neonatale, în care dinamica şi multiplicarea celulară sunt accentuate iar stabilitatea joncţiunilor intercelulare ca şi cantitatea de matrice extracelulară sunt reduse. Desigur, celulele izolate trebuie să-şi păstreze viabilitatea fie că este vorba de o tentativă exploratorie fie că vor fi supuse cultivării ulterioare. Primul pas în vederea izolării celulare este reprezentat de denaturarea conexiunilor intercelulare şi a liantului reprezentat de matricea extracelulară. Joncţiunile intercelulare sunt dependente de prezenţa ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de îndepărtare) al calciului cum este EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat fragmentului de ţesut de investigat, va determina desfacerea joncţiunilor menţionate, cu eliberarea celulelor. Matricea extracelulară (incorect denumită anterior – substanţă fundamentală) poate fi denaturată prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al căror rol este de a digera componentele ale matricei extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). După tratarea unui fragment tisular prin tripsinizare (cu tripsină) şi EDTA, de obicei este suficientă o uşoară agitare a eşantionului pentru a disocia celulele viabile. În eprubeta de lucru se obţine o mixtură celulară, formată din celule izolate, în suspensie. Al doilea pas este separarea şi sortarea celulelor în suspensie, obţinute prin izolarea din ţesuturi. Procedurile de separare implică metode fizice, cum ar fi centrifugarea, care va fi descrisă la metodele de separare a organitelor celulare, pentru care a fost iniţial concepută. Alte proceduri de separare se bazează pe capacitatea celulelor de a adera mai mult sau mai puţin la diferite tipuri de suprafeţe (sticlă sau plastic). Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazată pe posibilitatea utilizării anticorpilor specifici. Aceşti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele sistemului imun, ca răspuns la structuri non-self) pot fi ataşaţi la suprafaţa celulelor, în mod diferenţial şi pot interacţiona adeziv cu diferite suporturi organice (colagen, polizaharide, microsfere de plastic. Aceste suporturi organice formează o suprafaţă de afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. După aderare, celulele pot fi desprinse fie prin agitare uşoară, tratament cu tripsină (tripsinizare) pentru a denatura proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care denaturează substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizăm o colagenază).

izolează celule din linia L şi determină formarea de clone celulare în cultură de ţesuturi. culturile tisulare reprezintă totalitatea tehnicilor de menţinere şi în unele situaţii de creştere şi multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. 1948 – Earle şi colab. Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschisă era manipulării genetice. Apoi. Un subansamblu de sonicare formează picături microscopice care conţin câte o celulă sau nu conţin de loc celule. Istoric 1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o soluţie salină şi în afara unui organism viu 1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că extensiile neuronale se dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii. linie cunoscută astăzi sub numele HeLa. El a cultivat fragmente de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a demonstrat că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul neuronal şi invadând suportul nutritiv. Celulele marcate circulă prin acest sistem de sortare (fig. Particulele şi picăturile neîncărcate îşi continuă parcursul în mod gravitaţional. Celulele obţinute prin această metodă de sortare pot fi supuse direct analizelor biochimice sau pot fi direcţionate spre alte metode de multiplicare celulară – culturi tisulare şi stabilizarea de linii celulare. 1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr determinat de diviziuni în cultură. picăturile cu încărcare pozitivă (şi care conţin celule marcate fluorescent) sunt depozitate într-un recipient fiind separate de cele încărcate negativ. Culturile de ţesut sunt utilizate pentru a iniţia culturi celulare. Aceste picături microscopice sunt încărcate pozitiv sau negativ în momentul formării. …) în flux laminar iar fluorescenţa fiecărei celule este măsurată precis. ajungând în recipientul de deşeuri. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substanţe endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Celulele marcate astfel (cu anticorpi marcaţi la rândul lor cu fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin activarea fluorescenţei. Culturi tisulare şi celulare Prin definiţie. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical uman.Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizează cuplarea cu anticorpi urmată de marcajul fluorescent al acestora. . Astfel. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000 de celule pe secundă. 1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un timp în cultură dacă sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un mediu aseptic. picăturile trec printr-un câmp electric care le deviază traiectoria în funcţie de încărcarea electrică. în funcţie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenţei. 1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor de celule somatice. 1952 – Gey şi colab.

.caracterizarea şi validarea unui stoc de celule.inginerie proteică – studiul mecanismelor de semnalizare şi de răspuns celular citotoxic sau genotoxic. culturile rezultă fie din explant (fără o etapă iniţială de disociere tisulară) fie după disociere enzimatică într-o suspensie celulară. Liniile celulare rezultate din culturi sunt genetic instabile şi heterogene din punct de vedere genotipic. poate fi astfel generată o linie celulară. Aplicaţii Culturile tisulare sunt utilizate pentru: . . Noţiunea de cultură de organ presupune ca ţesutul să nu fie disociat ci menţinut la interfaţa lichid-solid. arată că pentru creşterea celulelor în medii fără ser este necesară prezenţa unor factori de creştere şi hormoni. în cadrul unor organisme intacte. aceste elemente celulare pot prolifera în condiţii fizico-biochimice speciale prestabilite. a definit un mediu de cultură fără ser pentru celule de la mamifere. . . mai ales în sens biochimic.culturi primare – derivate direct din fragmente de ţesut sau organ.. . se pleacă de la un singur tip de celule . pe sticlă) sau in vivo. Clasificare Culturile pot fi clasificare grosier în: . absenţei enzimelor hepatice specifice şi dificultăţilor în reproducerea unui fenotip celular complet diferenţiat in vitro. Terminologie. tehnica permite menţinerea arhitecturii tisulare dar nu permite propagarea liniilor celulare în volum.culturi secundare (continue) .studiul celulelor în micromedii reglate fizic şi fiziologic. Noţiunea de cultură tisulară a unor fragmente mici este sinonimă cu cea de explant. deoarece termenul in vitro se referă la reacţii biochimice care au loc în afara celulelor iar termenul in vivo se referă la reacţii care au loc în interiorul unei celule vii. prin aderarea la un substrat de plastic sau sticlă sau în suspensie în mediul de cultură. Culturile tisulare nu reproduc cu acurateţe condiţiile in vivo datorită diferenţelor de micromediu. 1975 – Kohler şi Milstein au produs prima dată anticorpi monoclonali din linii celulare compuse din hibridoame. Experimentele de cultivare pot avea loc in vitro (ad literam. Au fost create primele celule hibrid umane-murine (HarrisWatkins).minimizarea utilizării animalelor de experienţă. Menţinerea fragmentelor mici la o interfaţă lichid-solid prin ataşarea tisulară la un substrat de plastic sau de sticlă permite creşterea celulelor pe substrat şi migrarea şi proliferarea celulară ulterioară. Există posibilitatea unor confuzii. 1976 – Sato şi colab. . Noţiunea de cultură celulară se referă la situaţia în care fragmentul de ţesut este disociat în elementele celulare componente.1965 – Ham şi colab. mecanisme sintetice de răspuns la stimuli externi.rezultate ca urmare a extracţiei celulelor din cultura primară şi cultivări ulterioare.studii de transfecţie (introducerea ADN exogen în genomul unor celule izolate şi caracterizate pentru investigarea comportamentului celular şi mutaţiilor).

care se multiplică de un număr limitat de ori (de obicei 30 de ori) sau se pot multiplica la infinit.sticlărie. În funcţie de tipul de substrat utilizat. cu un grad accentuat de diferenţiere (ex. balanţă analitică . Acest spaţiu include resurse de apă curentă. special amenajat. plastic) Particularităţi şi condiţii Culturile de celule sunt de obicei preparate într-un spaţiu de lucru steril.consumabile . fibroblaste care continuă să secrete colagen) şi care suferă progresiv procese de senescenţă.microscop fotonic pentru controlul culturilor. hotă de flux laminar (în care circulaţia aerului se face numai în direcţie ascendentă . sonicator. Morfologia celulelor în cultură este variabilă şi denotă de obicei tipul de ţesut din care derivă: liniile celulare derivate din sânge tind să crească în suspensii în timp ce celulele derivate din ţesuturi solide tind să crească în monostrat. se transform în celule tumorale. Necesarul de bază într-un laborator de culturi de celule este reprezentat de: .arie de lucru sterilă . Menţiune: Culturile celulare care se permanentizează presupun o propagare celulară pe o perioadă nedefinită şi. sterilizabil sau de unică utilizare (de preferat) .pe suport organic nutritiv .incubator. instrumentar specific. sistem de alimentare cu CO2.pe suport anorganic (sticlă. culturile pot fi: . Culturile continue finite constau în celule diploide. Celulele tumorale sunt foarte uşor de cultivat şi se obţin fie direct din tumori clinice fie prin inducţie din celule normale prin transfecţia unor oncogene virale sau prin tratamente chimice. izolat prin ecluze de exterior. agitator magnetic.sisteme de stocare şi congelare . toate în flux continuu.pe suport organic nenutritiv . de obicei. gaz electricitate.

Totuşi. centrifuga va fi amplasată într-un loc accesibil. Pentru a . lame sterile. rezistente la apă şi la diferiţi reactivi (soluţii alcaline. iar nivelul de CO2 variază între 510%. Controlul microbiologic al contaminării se realizează cu ajutorul unor plăci speciale de agar care se amplasează în interiorul hotei pentru cel puţin 4 ore. Instrumentar: bisturie. o hotă de flux laminar şi lămpi de ultraviolete pentru sterilizare.Designul unui laborator de culturi de celule Este un deziderat a constitui un laborator de culturi de celule. Temperaturile de lucru variază între 28°C (celule de la insecte) . cu capac transparent care permite examinarea stării conţinutului înainte de desigilare. pense fine foarfeci chirurgicali. fără neregularităţi. un trafic aeric redus. de aceea trebuie folosite tuburi de centrifugare sigilate. singura măsură care trebuie aplicată constant este igienizarea suprafeţelor şi volumelor de lucru. pornind de la zero şi respectând norme precise. În zonele de congelare în azot lichid. perfect transparentă. un laborator modern şi dotat financiar foloseşte materiale de lucru de unică utilizare. suprafeţe de lucru uşor lavabile. grad de umiditate şi nivele de CO2 atent controlate. Dispozitivele de curăţare şi sterilizare includ: autoclave. inclusiv împotriva unei eventuale contaminări virale. În funcţie de tipul de cultură intenţionat. Centrifuge: centrifugele sunt utilizate pentru tehnicile de rutină pentru subculturi pentru izolarea liniilor celulare sau pentru crioprezervarea celulelor izolate. Aerul este recirculat prin sisteme complexe de filtre care respectă mediul extern. Aparatură şi instrumentar: Hotă microbiologică: asigură un mediu de lucru curat pentru produsele biologice şi protejează operatorul de aerosolii care pot conţine patogeni. nefiind recomandată adaptarea unui laborator utilizat pentru alte scopuri. Este de preferat ca sistemul de lucru să fie unitar şi toate manipulările să se efectueze într-un singur spaţiu (unitatea de procesare tisulară şi celulară) care trebuie să fie separat de zona de primire a materialului de studiu (zonă de carantină) Spaţiul de lucru trebuie să fie steril. dezifectanţi). Condiţii de cultură Celulele de origine animală sunt destul de dificil de cultivat în raport cu cele bacteriene (excepţie fac celulele embrionare sau tumorale. Totuşi. acide. Centrifugele produc în mod normal aerosoli. un cuptor de sterilizare şi spălător de pipete. Incubatoare: culturile celulare au nevoie de locaţii speciale pentru supravieţuire.37°C (celule de la mamifere). podeaua trebuie să reziste la spargere iar geamurile trebuie să se închidă ermetic. pentru reducerea la minim a posibilităţilor de contaminare. La ora actuală există incubatoare cu nivele controlate de CO2 şi cu interior de Cu. necesită o iluminare adecvată. care cultivă uşor). Suprafaţa de lucru şi podelele: toate suprafeţele de lucru. se iau masuri specifice de asepsie. de temperatură. care inhibă dezvoltarea germenilor. podelele şi pereţii trebuie să fie netede şi uşor de curăţat. Dacă pe suprafaţa acestor plăci nu cultivă nici bacterii nici fungi. Este reprezentată de sticlărie specială pentru culturi şi sticlărie uzuală de laborator. Sticlăria trebuie să fie neutră. Se va verifica permanent echilibrarea centrifugii înainte de amorsare şi starea de coroziune. înseamnă că mediul de lucru este propice din punct de vedere microbiologic. Hota este dotată de obicei cu filtre HEPA (high efficiency particulate air). Incubatoarele uzuale asigură condiţii de creştere constante.

temperatură optimă.acces la nutrienţi care să simuleze cât mai precis mediul intern al organismului din care a fost extras fragmentul de ţesut De obicei.4).2-7.serul – este un amestec complex de albumine. de obicei prin zonă ecluză .experimentatorul va purta echipament special şi mască de protecţie .compoziţie: o naturale o semisintetice o sintetice . celulele sau fragmentele de ţesut extrase sunt amplasate în vase speciale de cultură cu un mediu de cultură specific.2-7.4 şi o tărie ionică adecvată . Cel mai folosit este serul fetal de viţel . Culturile sunt menţinute în incubatoare cu condiţiile menţionate mai sus şi controlate electronic.manipularea probelor biologice se face numai cu instrumentar steril.suprafeţele de lucru se decontaminează înainte şi după utilizare .pH 7. . Regulile care guvernează un spaţiu aseptic sunt: .după valoarea nutritivă: o medii de creştere (permit o proliferare celulară abundentă) o medii de menţinere (care nu încurajează proliferarea dar menţin viabilitatea celulară Compoziţia mediilor de cultură: .echilibrul ionic obţinut cu ajutorul soluţiilor izotone (menţinerea presiunii osmotice). eventual de unică utilizare şi semiautomatizat sau complet automatizat .consistenţă: o lichide o semilichide (mediu nutritiv + agar sau coagulat de plasmă sangvină) . .săruri anorganice: sunt necesare pentru menţinerea echilibrului osmotic şi reglarea potenţialului de membrană . .elemente nutritive indispensabile metabolismului.sterilitatea permanentă controlată a spaţiului de lucru Mediile de cultură Mediile de cultură trebuie să asigure: . Clasificarea mediilor de cultură: În funcţie de: .temperatura de 37°C pentru celulele mamifere .permite supravieţuirea în condiţii de pseudonormalitate a celulelor sau fragmentelor de ţesut recoltate sunt necesare câteva condiţii esenţiale: .acces limitat la camera de culturi celulare. factori de creştere şi inhibitori ai acestora. conţinutul de O2 şi CO2 favorabile.evitarea contaminării cu germeni patogeni – se realizează prin adăugarea de antibiotic la mediul de cultură. Asepsia este una din condiţiile esenţiale pentru realizarea unei culturi tisulare sau celulare.pH optim (7. . Este un element esenţial al mediilor de cultură pe bază de ser.

. Principii de lucru Vom menţiona aici principiile de urmat şi de evitat în efectuarea şi manipularea unor culturi celulare: Principii de urmat: . .utilizarea de recipiente separate cu medii pentru diferitele linii celulare.proteinele şi peptidele sunt importante în mediile artificiale.examinarea zilnică a culturilor pentru posibile contaminări bacteriene sau fungice.lipide şi acizi graşi: importante pentru mediile artificiale. pH. fibronectina. acizi tricarboxilici şi intermediari Culturile celulare pot fi conservate la temperaturi scăzute (-135°C).se foloseşte întotdeauna echipament individual de protecţie (halat. microscoapelor.evitarea ambalării în carton a instrumentarului sau culturilor.ordinea şi curăţenia pe suprafaţa de lucru .echipament special pentru camera de culturi. Nu se trece cu un vas pe deasupra altora. tampon bicarbonat de sodiu şi CO2 – uşor de obţinut într-un incubator cu CO2.sisteme tampon. se curăţă masa cu alcool 70% şi se lasă circa 15 minute între manipularea succesivă a 2 linii celulare diferite. transferina.testarea celulelor pentru contaminarea cu Mycoplasma. . incubatoarelor. în mediu există şi un indicator al pH-ului (roşu fenol care virează de la galben la roşu aprins şi apoi la violaceu). . . . contaminare) . filtrelor.marcarea corectă a recipienţilor. Cele mai importante vitamine pentru culturi celulare sunt cele din grupul B. Se utilizează în special medii cu glucoză. Congelarea se face progresiv cu o rată de (-1) – (-3)°C pe minut. includ albumina. . . Cu Se (pentru detoxifiere şi îndepărtarea radicalilor liberi). opţional se pot folosi mănuşi termoizolante. ochelari). riboflavina. .controlul de calitate al mediilor şi reactivilor înainte de utilizare (data expirării. includ colesterolul şi steroizii. după o condiţionare prealabilă şi tratare cu agenţi de crioprotecţie. . tiamina şi biotina. . galactoză dar şi cele cu maltoză sau fructoză. . mediilor. . eprubetelor cu conţinutul şi data preparării. mănuşi. ieftin şi netoxic).carbohidraţi: reprezintă sursa principală de energie pentru celule. care sunt necesare pentru menţinerea pH-ului (tampon fosfat.bonete speciale care să acopere părul strâns.microelemente: Zn. - .manipularea unei singure linii celulare o dată. vizieră şi şorţ special pentru manipularea azotului lichid.între operaţiuni. .vitamine: sunt prezente fie în ser (pentru mediile pe bază de ser) sau sunt adăugate în mediile artificiale. . necesare pentru creştere şi proliferare.aseptizarea hotei.

nu se acceptă furnizori neautorizaţi.expirarea mediului de cultură.acumularea deşeurilor la nivelul zonei de lucru. modificări de culoare şi pH. . de obicei gradul de confluare este menţionat în protocolul de utilizare al culturii. Controlul de calitate Se vor urmări: . .manipularea celulelor din surse incerte în sistemul principal de lucru.provenienţa şi integritatea liniilor celulare o liniile celulare să nu fie contaminate o originea liniilor şi profilul ADN complete o instrucţiuni de utilizare detaliate .murdărirea băilor de apă. deoarece se ajunge la selectarea unor rezistenţe care fac liniile celulare inutilizabile din punct de vedere comercial.permiterea confluării complete a culturilor. . sub formă de coci sau filamente. Este necesară examinarea microscopică zilnică o cu Mycoplasme (procariote autoreplicative). . . . .De evitat: .evitarea contaminării microbiene – sunt posibile 3 tipuri de contaminări: o bacteriană şi fungică: vizibile prin creşterea bruscă a turbidităţii mediului. fără recongelare. efectele contaminării cu Mycoplasma sunt mai insidioase:  reducerea ratei de creştere a celulelor  modificări morfologice  aberaţii cromosomiale  alterări ale metabolismului acizilor nucleici şi aminoacizilor o virală: în special pentru serul bovin . .utilizarea de antibiotice în mod continuu.calitatea reactivilor şi materialelor o serul fetal bovin nu trebuie să fie infectat cu virusul diareei bovine o tripsina porcină este sursă de Myocoplasma o toate materialele trebuie să aibă certificate de calitate la zi. .menţinerea liniilor celulare în cultură continuă. acestea se menţin în carantină până la efectuarea tuturor testelor specifice.decalibrarea echipamentului.aglomerarea personalului în laborator. de obicei mediul rezistă 6 săptămâni la 4°C după adăugarea glutaminei şi serului.