You are on page 1of 102

T.

C UKUROVA NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS

DOKTORA TEZ

Hasan KARADA

SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSAN ERTROSTLERNDEN SAFLATIRILMASI VE BAZI PESTSTLERN ENZM AKTVTES ZERNE ETKSNN NCELENMES

KMYA ANABLM DALI

ADANA, 2007

T.C UKUROVA NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS


SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSAN ERTROSTLERNDEN SAFLATIRILMASI VE BAZI PESTSTLERN ENZM AKTVTES ZERNE ETKSNN NCELENMES Hasan KARADA DOKTORA TEZ KMYA ANABLM DALI

Bu tez 17/08/2007 Tarihinde Aadaki Oybirlii/Oyokluu le Kabul Edilmitir.


mza............ Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGN DANIMAN mza.. Prof.Dr. ermin GL YE mza.................... Prof.Dr.SeyhanTKEL YE

Jri

yeleri

Tarafndan

mza. Prof.Dr. Llfer TAMER YE

mza.. Do.Dr.GzideYCEBLG YE

Bu tez Enstitmz Kimya Anabilim Dalnda hazrlanmtr. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUN Enstit Mdr

Bu alma ukurova niversitesi Bilimsel Aratrma Projeleri Birimi Tarafndan Desteklenmitir. Proje No: FEF 2003D17
Not: Bu tezde kullanlan zgn ve baka kaynaktan yaplan bildirilerin, izelge, ekil ve fotoraflarn kaynak gsterilmeden kullanm, 5846 sayl Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hkmlere tabidir.

Z DOKTORA TEZ SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSAN ERTROSTLERNDEN SAFLATIRILMASI VE BAZI PESTSTLERN ENZM AKTVTES ZERNE ETKSNN NCELENMES Hasan KARADA UKUROVA NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS KMYA ANABLM DALI Danman : Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGN Yl: 2007, Sayfa: 89 Jri: Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGN Prof.Dr.SeyhanTKEL Prof.Dr. Llfer TAMER
Prof.Dr. ermin GL

Do.Dr.GzideYCEBLG

Speroksit Dismutaz (SOD), (E.C:1.15.1.1) speroksitin hidrojen perokside dismutasyonunu katalizler. Bu almada, SOD, DEAE-Selloz kromatorafisi ve bakr-iminodiasetik asit-agaroz kromatorafisi kullanlarak izole edilmitir. Enzim % 33,8 verimle 196,3 kat saflatrlmtr. Vmax ve Km srasyla 5000 U/mg prot. ve 3.10-3 mM ksantin olarak bulunmutur. Optimum scaklk, 15 C (288 K) olarak belirlenmitir. Depolama kararll aratrlmtr. Aktivasyon enerjisi 16,856 kj/mol, denatre olmaya balanan scaklk 19 C (292 K) olarak hesaplanmtr. Geri dnm says (kcat) ve katalitik etkinlik (kcat/Km ) srasyla 1667 s-1 ve 555 667 s-1. mM-1 Ksantin-1 olarak bulunmutur. SODnin molekler arl 20 000 olarak saptanmtr. Cyprodinilin SODyi yarmal (kompetitif) olarak inhibe ettii, Fludioxonilin ise SODyi yarmasz (non-kompetitif) bulunmutur. olarak inhibe ettii

Anahtar Kelimeler: Speroksit Dismutaz, Saflatrma, Eritrosit, Cyprodinil, Fludioxonil.

ABSTRACT PhD THESIS PURIFICATION OF SUPEROXIDE DISMUTASE FROM HUMAN ERYTHROCYTES AND EFFECT OF SOME PESTICIDE ON ENZYME ACTIVITY Hasan KARADA DEPARTMENT OF CHEMISTRY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF UKUROVA Supervisor: Asst.Prof.Dr. Ramazan BLGN Year: 2007, Pages: 89 Jury: Asst.Prof.Dr. Ramazan BLGN Prof.Dr. SeyhanTKEL Prof.Dr. Llfer TAMER
Prof.Dr. ermin GL

Assoc.Prof.Dr. GzideYCEBLG

Superoxide Dismutase (SOD), (E.C:1.15.1.1) catalyzes the dismutation of the superoxide to hydrogen peroxide. In this study, SOD isolated by using DEAEcellulose chromatography and copper-iminodiacetic acid agarose chromatography. Enzyme was purified 196,3 fold and 33,8 % efficiency. Vmax and Km were found as 5000 U/mg prot. and 3.10-3 mM Xanthine, respectively. Optimum temperature was determined as 15 C (288 K). Storage stability was investigated. Activation energy was calculated as 16,856 kj/mol and initiation of denaturation temperature was calculated as 19 C (292 K). Turnover number (kcat) and catalytic efficiency (kcat/Km ) were found as 1667 s-1 and 555 667 s-1.mM-1 Xanthine-1, respectively. Molecular weight of SOD was determined as 20 000. Cyprodinil inhibited SOD competitivly and Fludioxonil inhibited SOD non-competitivly.

Key Words: Superoxide Dismutase, Purification, Erythrocyte, Cyprodinil, Fludioxonil.

II

TEEKKR

Doktora almam boyunca, engin bilgi ve deneyimleriyle bana yol gsteren, danman hocam Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGNe, sayn hocam Prof.Dr. Seyhan TKELe, sayn hocam Do.Dr. Gzide YCEBLGe ve tez izleme komitesinde bulunan sayn hocam Prof.Dr. Llfer TAMERe sonsuz teekkrlerimi sunarm. Arkadalarm Ar.Gr. zlem ALPTEKN, Deniz YILDIRIM ve Dilek ALAGZn manevi destekleri iin teekkr ederim. Ayrca doktora almam boyunca bana destek olan eim Nuriyeye ve aileme teekkr ederim.

III

NDEKLER

SAYFA

Z..I ABSTARCT.II TEEKKRIII NDEKLER...IV SMGELER VE KISALTMALAR..VIII ZELGELER DZN...IX EKLLER DZN.X 1. GR1 1.1. Protein Saflatrma Amac Ve Stratejisi1 1.1.1. Protein Saflatrmann Amac...1 1.1.2.n Hazrlklar....3 1.1.2.1.Kaynak Seimi...3 1.1.2.2.Protein Hakkndaki Bilgi Birikimi.4 1.1.3. Protein Saflatrma Stratejisi...4 1.1.3.1. Aktivitenin Korunmas.5 1.1.3.2. Stratejik Planlama6 1.2. Kromatorafi.8 1.2.1. yon-Deiim Kromatorafisi..8 1.2.1.1. Proteinlerin yon-Deiim Kromatorafisi le Saflatrlmas...11 1.2.1.1.(1). yon Deitiricinin Seimi12 1.2.1.1.(2). Tampon Seimi.12 1.2.1.1.(3). Kolon Seimi.13 1.2.1.1.(4). rnek Tatbiki Ve Elsyon.14 1.2.2. mmobilize Bakr lgi Kromatorafisi..14 1.3. Pestisitler..16 1.3.1. Pestisitlerin Snflandrlmas:...16 1.3.1.1. Etkiledikleri Canl Gruplarna Gre...16 1.3.2. Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giri Yollar..17 1.3.2.1. Az Yoluyla Giri.17 1.3.2.2. Deri Yoluyla Giri..18

IV

1.3.2.3. Solunum Yoluyla Giri..18 1.3.3. Pestisitlerin Etki Mekanizmalar...18 1.3.3.1. Fiziksel Varsaym..18 1.3.3.2. Toksoforik Varsaym.19 1.3.3.3. Yerine Geme19 1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme.19 1.3.4. Aratrlan Pestisitler.20 1.4. Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri22 1.4.1. Serbest Oksijen Radikalleri22 1.4.1.1. Speroksit Radikali (O2 )22 1.4.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)...23 1.4.1.3. Hidroksil Radikali (OH )23 1.4.2. Antioksidan Savunma Sistemleri...23 1.4.2.1. Doal (Endojen) Antioksidanlar24 1.4.2.1.(1). Enzimler24 1.4.2.1.(2). Enzim Olmayanlar.24 1.4.2.2. Eksojen Antioksidanlar (lalar)...25 1.4.2.3. Gda Antioksidanlar.25 1.5. Speroksit Dismutaz ( Speroksit Oksidoredktaz, E.C:1.15.1.1, SOD)...25 1.5.1. Bakr-inko Speroksit Dismutaz25 1.5.1.1. karyotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD...26 1.5.1.2. Cu-Zn SODnin Yaps ve Katalitik Etkinii26 1.5.1.3. Cu-Zn SODnin Yaps.28 1.5.2. Mangan Speroksit Dismutaz...28 1.5.2.1. Mn-SOD Yerleimi...29 1.5.2.2. Mn-SOD Yaps30 1.5.3. Demir Speroksit Dismutaz..30 1.5.3.1. Fe-SODlerin Yerleimi31 1.6. Projenin Yeri Ve nemi...31 2. NCEK ALIMALAR..32 3. MATERYAL VE METOD42

3.1. Materyal..42 3.1.1. Kimyasallar42 3.1.2. Kullanlan Cihazlar...43 3.2. Metod...44 3.2.1. Enzimin Saflatrlmas..44 3.2.1.1. Hemoliz, Diyaliz Ve Santrifjleme44 3.2.1.2. DEAE-Selloz Kromatorafisi..44 3.2.1.3. Bakr-minodiasetik Asit-Agaroz Kromatorafisi.45 3.2.2. Speroksit Dismutaz Tayini45 3.2.2.1. Prensip 45 3.2.2.2. Aktivite lm..46 3.2.3. Protein Tayini.47 3.2.4. Pestisit Etkisi..48 3.2.5. Optimum Scaklk..48 3.2.6. Depolama Kararll.48 3.2.7. Molekler Arlk tayini49 3.2.7.1. Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)..49 3.2.8. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn (Vmax) Grafiksel Yntemle Belirlenmesi..52 3.2.9. Aktivasyon Enerjisinin Hesaplanmas...53 4. BULGULAR VE TARTIMA...55 4.1. Bulgular...55 4.1.1. Speroksit Dismutazn Saflatrlmas le lgili Bulgular.55 4.1.2. Speroksit Dismutazn Karakterizasyonu le lgili Bulgular...62 4.1.2.1. Optimum Scaklk..62 4.1.2.2. Aktivasyon Enerjisinin, Denatre Olmaya Balanan Scakln Hesaplanmas.63 4.1.2.3. Geri Dnm Says Ve Katalitik Etkinliin Hesaplanmas64 4.1.2.4. Depolama Kararllnn Aratrlmas..65

VI

4.1.2.5. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn (Vmax) Grafiksel Yntemle Belirlenmesi.66 4.1.2.6. Speroksit Dismutazn Molekler Arlnn Tayini.68 4.1.3. Cyprodinil Ve Fludioxonilin Speroksit Dismutaz Aktivitesine Etkisi..69 4.1.3.1. Cyprodinil le Salatrlm Speroksit Dismutazn Etkileimi69 4.1.3.2. Cyprodinil le Eritrositlerin Etkileimi..70 4.1.3.3. Cyprodinilin nhibisyon Tr...71 4.1.3.4. Fludioxonil le Salatrlm Speroksit Dismutazn Etkileimi...73 4.1.3.5. Fludioxonil le Eritrositlerin Etkileimi.74 4.1.3.6. Fludioxonilin nhibisyon Tr..75 4.2. Tartma..77 5. SONULAR VE NERLER82 5.1. Sonular..82 5.2. neriler...83 KAYNAKLAR...84 ZGEM89

VII

SMGELER VE KISALTMALAR

DEAE IDA SOD

: Dietilaminoetil : minodiasetik Asit : Speroksit Dismutaz

Cu-Zn SOD: Bakr-inko Speroksit Dismutaz Mn-SOD Fe-SOD XOD N.B.T : Mangan Speroksit Dismutaz : Demir Speroksit Dismutaz : Ksantin Oksidaz : Nitro Blue Tetrazolium : N,N,N,N-Tetra Metil Etilen Diamin : Amonyum perslfat : Michaelis-Menten Sabiti : Doygun substrat deriiminde enzimin ulaabilecei maksimum hz. : Aktivasyon Enerjisi : Geri Dnm Says : nhibisyon Sabiti : Protein

SDS-PAGE : Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi TEMED APS Km Vmax Ea kcat Ki Prot

VIII

ZELGELER DZN

SAYFA

izelge 1.1. Protein saflatrma tekniklerinin zellikleri.7 izelge 1.2. Yaygn kullanlan iyon deitiriciler..10 izelge 1.3. Cyprodinil ve fludioxonilin IUPAC ad ve yaps.21 izelge 1.4. Cyprodinil ve fludioxonilin zellikleri..21 izelge 3.1. % jel konsantrasyonlarna kar eklenmesi gereken maddeler...50 izelge 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite deerleri.57 izelge 4.2. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite deerleri... 60 izelge 4.3. Saflatrma tablosu.62 izelge 4.4. Speroksit dismutazn farkl scaklklarda llen aktivite deerleri...62 izelge 4.5. Speroksit dismutazn 1/Tye kar, ln V deerleri..64 izelge 4.6. Speroksit dismutazn depolama kararll ile ilgili bulgular..65 izelge 4.7. Speroksit dismutaz iin farkl substrat deriimlerinde llen aktivite deerleri....66 izelge 4.8. Standart proteinlerin g hzlarna kar log Molekl arlklar...68 izelge 4.9. eitli Cyprodinil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz aktivitesi zerine olan etkisi...70 izelge 4.10. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite deerleri.71 izelge 4.11. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Cyprodinil deriimlerinde llen aktivite deerleri.72 izelge 4.12. eitli Fludioxonil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz aktivitesi zerine olan etkisi.....73 izelge 4.13. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite deerleri.74 izelge 4.14. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Fludioxonil deriimlerinde llen aktivite deerleri.75

IX

EKLLER DZN

SAYFA

ekil 1.1. yon deitiriciler a) Anyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar b) Katyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar...9 ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks destei, b) metal elat ilgi desteine proteinlerin balanmas..........16 ekil 3.1. Standart protein grafii...48 ekil 3.2. Michaelis-Menten grafii...52 ekil 3.3. Lineweaver-Burk grafii53 ekil 3.4. Aktivasyon enerjisinin bulunmas iin Arrhenius grafii..54 ekil 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans deerleri....55 ekil 4.2. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nmdeki absorbans deerleri....56 ekil 4.3. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik aktivite deerleri.56 ekil 4.4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans deerleri...58 ekil 4.5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nmdeki absorbans deerleri...59 ekil 4.6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik aktivite deerleri60 ekil 4.7. Speroksit dismutaz iin aktivite-scaklk grafii..63 ekil 4.8. Speroksit dismutaz iin Arrhenius grafii64 ekil 4.9. Speroksit dismutazn depolama kararll grafii..66 ekil 4.10. Speroksit dismutaz iin Michaelis-Menten grafii.67 ekil 4.11. Speroksit dismutaz iin Lineweaver-Burk grafii..67 ekil 4.12. Speroksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonular.68 ekil 4.13. SDS-PAGE jel elektroforezinde standart olarak kullanlan sr albumini, ovalbumin, -Chymotrypsin ve sitokrom cnin molekl arlklarnn logaritmasna kar yrme hzlar..69

ekil 4.14. Cyprodinil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda aktivite grafii..70 ekil 4.15. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki

SOD aktivite grafii.....71 ekil 4.16. Cyprodinil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii..72 ekil 4.17. Fludioxonil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda aktivite grafii...74 ekil 4.18. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite grafii.....75 ekil 4.19. Fludioxonil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii..76

XI

1.GR

Hasan KARADA

1. GR

1.1. Protein Saflatrma Amac Ve Stratejisi lk kez Berzelius tarafndan kullanlan ve 1840 ylnda ders kitaplarna geen protein ad yunanca bir numara, birinci srada olmak anlamna gelen proteuo kelimesinden tretilmitir. Proteinler bu ad hakl olarak tamaktadr. Saysz hayat fonksiyonu proteinlere baldr ve proteinsiz bir canl sz konusu olamaz. Her hcrenin bileeni olan proteinlerin enzimatik kataliz, transport, depolama, mekanik destek, koordine hareket, sinir impluslarnn transmisyonu, immn koruma, byme ve farkllamann kontrol gibi fonksiyonlar vardr. Proteinlerin saflatrlmas hem bu fonksiyonlar yapan molekln belirlenmesi ve olayn mekanizmasnn aydnlatlmas hem de in vitro koullarda endstriyel veya analitik amala kullanlma olanann aratrlmas asndan byk nem tar (Telefoncu,1996).

1.1.1. Protein Saflatrmann Amac

Protein saflatrmann amac saf protein elde etmek deil daha sonraki almalar iin kullanlabilecek bir protein preparat hazrlamaktr. Bu almalar; proteinin aktivitesinin aratrlmas ve bu aktiviteden biyoteknolojik retim, analitik veya tedavi edici amala yararlanlmasna ynelik olabilecei gibi, protein yapsnn veya yap fonksiyon ilikisinin aratrlmasn da hedefleyebilir. Amaca uygun bir protein preparat hazrlayabilmek iin aadaki hususlarn netletirilmesi zorunludur. Gereksinim duyulan saf protein miktar Ne dzeyde aktivite kaybnn tolere edilebilecei Ne dzeyde saflk istendii Saflatrma ilemi iin ne kadar zaman ve para harcanabilecei, v.b.

Biyoteknolji devrimini yaadmz gnmzde kullanm amacna gre gerekli protein miktar birka mikrogram (klonlama almalar) ile birka kilogram (endstriyel ve farmastik uygulamalar iin) arasnda deiir. Protein retiminde

1.GR

Hasan KARADA

zaman ve maliyet ok nemlidir. Gerekli protein miktar ve saflk dzeyi kullanm amacna baldr. Bilimsel aratrmalar iin az miktarda protein yeterlidir fakat preperat kesinlikle zararl yabanc aktivite iermemelidir. Endstriyel uygulamalar iin byk lekte retim sz konusudur ve saflk ikinci derecede nem tar. Tedavi edici uygulamalar iin hazrlanan protein preperatnn ise yksek saflkta olmas gerekir. Protein aktivitesinin belirlenmesi hedeflenmi ise kesinlikle aktif formda (rnein; bir enzim, bir reglatr protein veya bir antikor gibi) elde edilmelidir. Bunun iin ok az miktarda protein yeterlidir. Fakat ama proteinin aktivitesinden yararlanmak ise daha fazla protein gerekecektir. nert proteinlerin bulunmas her iki ama iinde engel oluturmadndan, yabanc aktiviteler tamamen uzaklatrlm ise daha ileri dzeyde bir saflatrma gereksizdir. Saflatrmada uygulanacak her yeni adm zaman ve aktivite kaybna sebep olaca gibi verimi drp maliyeti arttracaktr. Yap aratrma almalarnda ise olduka fazla miktarda ve yksek saflkta proteine gereksinim vardr. Bu durumda maliyet ve zaman ikinci derecede nemlidir. Fakat yap-fonksiyon ilikisi aratrlyorsa saflatrma ilemi sresince aktivite kaybn minimize etmek iin ilem sresinin olabildiince ksaltlmas gerekir. Beirli bir miktar k maddesinden elde edilecek saf protein miktar saflatrma admlarnn toplam verimine baldr. Adm says verim ile ters fakat saflk derecesi ile doru orantldr. En az saflatrma adm ile amaca uygun saflkta protein preparat hazrlamak ok nemlidir. zellikle afinite kromatorafisi ve afinite-ultrafiltrasyon teknikleri protein saflatrlmasnda adm saysn dramatik biimde drmektedir. Bir protein preparatnn saflk dzeyini genel anlamda toplam protein yzdesi belirlemekle birlikte baka grup maddelerden kaynaklanan safszlklarda nemlidir. Proteinin kullanm amacna baml olarak istenen saflk dzeyide deiir. Tedavi edici amal kullanalacak protein preparatnn ok saf olmas istenir. Proses katk maddeleri, nkleik asit kalntlar v.b. safszlklarn kesinlikle uzaklatrlmas gerekir. Yksek dzeyde safla ulaabilmek iin yaplan saflatrma admlar bir yandan protein verimini drrken dier tarftan maliyeti ok arttrr. Bilimsel

1.GR

Hasan KARADA

aratrmalarda birka ilave saflatrma basama nemli olmayabilir ancak ticari retim durumunda en ekonomik koullarda allmaldr. Saflatrlan protein bir enzim ise ve yalnz enzimatik aktiviteden yararlanlacaksa toplam protein orannn % 80-90 arasnda olmas yeterlidir. Fakat protein olmayan safszlklar enzim aktivitesini olumsuz etkilememeli, preparat enzim aktivitesini interfere eden yabanc enzimleri zellikle proteolitik enzimleri iermemelidir. Yap aratrmalarnda kullanlacak proteinlerin saflk dzeyi tedavi edici amala kullanlanlar kadar olmasa bile en az % 95 saf protein iermelidir. Saflatrma ilemleri sresince protein denatrasyonundan korunmas ve biyolojik aktivitesini yitirmemesine zen gsterilmelidir. Bu ekilde hazrlanan protein preparat her trl almada kullanlabilirken ama yalnz polipeptid zincir dizisini (primer yap) aydnlatmak ise daha sert koullarda allmasnda saknca yoktur. Protein saflatrlmasndaki admlar denatrasyon ve proteolizi minimuma drecek ekilde seilmelidir (Telefoncu,1996).

1.1.2.n Hazrlklar

1.1.2.1.Kaynak Seimi

Seilen kaynakta hedeflenen protein hem kararl hem de bol bulunmaldr. Ayrca kaynan kolay salanabilir, bol ve ucuz olmasda nemlidir. Hayvansal kaynaklar seilirken saflatrlacak protein miktarna uygun byklkte hayvan seilmeli ve yabani hayvanlar yerine evcil hayvanlar tercih edilmelidir. Bir zorunluluk yoksa, hayvansal kaynaklar yerine kltr ortamnda retilebilen bakteri, maya, mantar veya memeli hcreleri kullanlmaldr. Bylece hcre oalmas annda biyosentezleri ynlendirebilme olanana kavuulur ve ihtiyaca uygun boyutta reaktr ile retim yaplabilir. Gen teknolojisinin salad olanaklar sayesinde hcre metabolizmas youn olarak hedeflenen proteinin biyosentezine ynlendirilebilmektedir. Seilen konuku (host) hcrenin proteini ekstraseller blgeye salglamas saflatrma asndan nemli stnlkler salar.

1.GR

Hasan KARADA

Kukusuz hayvansal ve mikrobiyal kaynaklar yannda bitkisel kaynaklardan da saf protein retiminde yararlanlabilir. Ancak mevsime, iklime bamllk ve transport gibi sorunlar bitkisel kaynaklarn kullanmn snrlandrmaktadr.

1.1.2.2.Protein Hakkndaki Bilgi Birikimi

Proteinin molekler yaps, fiziksel ve kimyasal zellikleri ekstraseller veya intraseller olmas ve hcre iinde bulunduu yerin bilinmesi saflatrma prosesin belirlenmesinde ok yardmc olur. Belirli bir proteinin hcre iindeki lokalizasyonu kaynaa baml deildir, kimyasal yaps ve molekl boyutu da genellikle benzerlik gsterir. Proteinin fonksiyonel aktivitesi hcre iindeki lokalizasyonu hakknda bilgi verir. rnein; ekstraseller byme faktr reseptrleri plazma membrannda bulunurken, transkripsiyonda grev alan enzimlerin ekirdekte lokalize olmalar doaldr. Proteinin intraseller veya ekstraseller membrana bal olmas veya organellerde bulunmas, znp znmemesi ekstraksiyon yntemi seiminde ve kullanlacak tamponunun bileiminin belirlenmesinde etkilidir. Saflatrlacak protein, glikoprotein veya lipoprotein ise zellikleri dier safszlk proteinlerinden ayrcalk gsterir ve rnein glikoproteinler lektin afinite kromatorafisi ile saflatrlabilirler.

1.1.3. Protein Saflatrma Stratejisi

Bir proteinin saflatrlmasnda uygun bir ilem dizisinin optimizasyonu ok nemlidir. En etkili, en hzl ve en ekonomik ayrma ve saflatrma proseslerinin mevcut bilgiler yardmyla belirlenmesi hedeflenir. Bu nedenle saflatrlacak proteinin bulunduu kaynaklar, zellikleri ve stabilitesinin iyice tetkik edilmesi gerekir. Uygulanacak ayrma ve saflatrma teknikleri proteinin biyolojik aktivitesini olumsuz etkilememelidir.

1.GR

Hasan KARADA

1.1.3.1. Aktivitenin Korunmas

zellikle intraseller proteinler saflatrma koullarndan ok etkilenirler. Hcre ierisinde indirgen koullar egemen olup pH 6,5-7,5 arasndadr ve protein konsantrasyonuda yksektir ( ~100 mg/ml). Hcre ve organellerin paralanmas sonucu ayr kompartmanlarda bulunan ve birbirini etkiliyebilen eitli maddeler bir araya gelecekler, proteoliz etkinleecek ve ortam pHs decektir. Ayrca proteinlerin kolayca ykseltgenmeleri sz konusudur. Tm bu problemlerin alabilmesi iin tampon ve tampona katlacak maddelerin seimi zel bir nem tar. Dk scaklkta (~ 4 C) ve hzl alma sonucu proteolizin etkinlii azalr. Proteolitik enzimler daha ok lizozomlarda lokalize olduklarndan homojenizasyon koullarnda lizozom membranlarn dayankl klmak iin tampon zeltiye maltoz ve sakkaroz gibi disakkaridler ilave edilebilir. Ayrca tampona proteolitik enzim inhibitrlerinin katlmas da ok etkili bir nlemdir. ou proteolitik enzimlerin molekl ktleleri 20-30 kDa arasnda olduundan hedeflenen proteinin mol ktlesi daha byk ise protein saflatrma prosesinin ilk admlarnda jel geirgenlik kromatorafisi uygulanabilir. Fakat bu tekniin kapasite ve ayrma gcnn ok dk olmas gibi sakncalar vardr. Asidik veya bazik pH koullar, organik zgenler ve scaklk protein denatrasyonuna neden olan ana parametrelerdir. Hcre ii pH koullarna (pH 6,57,5) uygun tampon sistemler kullanlmas, saflatrmann ilk admlarnda 4 Cde (proteolizi nlemek iin), daha sonraki admlarda ise oda scaklnda (20-25 C) allmas ou proteinler iin denatrasyona neden olmaz. Organik zgenler ile protein ktrme adm gerekli ise bu ilemin dk scaklkta yaplmas uygundur. Enzim aktif merkezleri reaktif gruplar ierdiinden substrat dnda birok yabanc madde ile etkileebilir ve enzim inaktif hale gelir. Hcre paralanmasndan sonra intraseller enzimlerin karlat ykseltgen ortam zellikle HS-proteazlarn hzl inaktivasyonuna sebep olur. Bunu nlemek iin tampona 2-merkaptoetanol veya ditiyotreitol ilave edilir. 2-merkaptoetanol ancak 24 saat koruyucu etkiye sahiptir ve kokusu rahatsz edicidir. Ditiyotreitol hem daha dk konsantrasyonda hem de uzun sre etkilidir. Ykseltgenler yannda Me2+ iyonlar da HS-gruplarn balayarak

1.GR

Hasan KARADA

inaktivasyona neden olurlar. Eer protein veya enzim kendisi metal iyonu iermiyor ise EDTA gibi kompleksletiricilerin de tampona katlmasnda yarar vardr. Ayrca tampona saflatrlacak enzimin substrat veya kofaktrnn katlmasda

inaktivasyona kar etkili bir nlemdir. Protein saflatrma admlarnda proteinin cam reaksiyon kaplarnn yzeyinde adsorpsiyonu byk bir sorundur. Bu sorunu aabilmek iin polipropilen kaplar kullanlr. zellikle seyreltik protein zeltileri yzey adsorpsiyonu ile nemli kayplar verdikleri gibi kuarterner yapl proteinlerin alt birimlerinin (subunit) ayrmasda sz konusudur. Ortama sr serum albumini (< % 0,1) veya non-iyonik deterjanlarn (< % 0,1) katlmas adsorpsiyon kayplarn en aza indirgerse de her iki katk maddesi protein saflatrmada baz sorunlara neden olabilir. Tampona eker alkolleri (gliserin, sorbitol, mannitol v.b) ve baz ekerlerin (glukoz, sakkaroz) katlmas su aktivitesini dreceinden denatrasyon ile fonksiyonel protein kaybn azaltr. Ayrca % 20den fazla gliserin katlrsa 20 Cde donmadan protein zeltisinin saklanmas mmkndr. Protein saflatrma ilemine uzun sreli ara verme (bir gece gibi) durumunda zeltiye bakteriostatik ve proteaz inhibitrleri ilave edilmeli ve souk odada saklanmaldr. Daha uzun sreli bekletmelerde zelti dondurulmaldr. Sv azot veya kuru buz-metanol karm ile ok dondurma tercih edilir. Yksek konsantrasyonlarda amonyum slfat proteinleri stabilize ettiinden bir gece veya daha uzun depolama amonyum slfat ile ktrme admndan sonra yaplmaldr.

1.1.3.2. Stratejik Planlama

Saflatrmann stratejik hedefi ucuz ve etkili yntemler ile yksek saflk ve verim ile protein kazanmaktr. Saflatrmada kullanlacak tekniklerin seimi ve sralamas ok nemlidir. izelge 1.1de protein saflatrmada kullanlan temel tekniklerin bir kyaslamas verilmitir.

1.GR

Hasan KARADA

izelge 1.1. Protein saflatrma tekniklerinin zellikleri (Telefoncu,1996)


Teknik PH ktrmesi (NH4)2SO4 ktrmesi Ekstraksiyon Biyoafinite kromatorafisi yon deiim kromatorafisi Hidrofobik etkileim kromatorafisi Kromatofokuslama (odaklama) Boya afinite kromatorafisi Ligand afinite kromatorafisi Jel Geirgenlik kromatorafisi Dayand zellik Yk Hidrofobisite Deiik Biyoafinite Yk Hidrofobisite Yk/ pI Deiik Biyoaktivite Molekl boyutu Kapasite Yksek Yksek Yksek Yksek Orta Orta Dk Orta Ortadk ok dk Etkinlik ok dk ok dk ok dk Yksek Orta Orta Yksek Yksek ok yksek Dk Verim Orta Yksek Yksek Deiebilir Orta Orta Orta Orta Dk Yksek Maliyet Dk Dk Dk Yksek Orta Orta Yksek Orta Yksek Orta

Saflatrmann ilk admlarnda daha ok deritirmeye ynelik (yksek kapasiteli) teknikler kullanlr. Bylece ortamdaki suyun byk ksm uzaklatrlm olur. ktrme, ekstraksiyon ve absorpsiyon kromatorafi teknikleri bu amala kullanlabilir. Ayrca gc asndan ktrme ve ekstraksiyon teknikleri etkin deilken kromatorafik teknikler zellikle afinite kromatorafisi ok etkindir ve 1000 kattan fazla saflatrma salar. Afinite-ultrafiltrasyon kombinasyonu gibi yksek ayrma gl tekniklerin kullanlmas saflatrma prosesindeki adm saysn ok drr. Fakat afinite tekniklerinin ok pahal olduu, bu nedenle ktrme gibi ucuz teknikler ile kontaminantlarn nemli oranda uzaklatrlmasndan sonra

uygulanmalar gerektii unutulmamaldr. Protein saflatrmada uygulanacak teknikler genel olarak aadaki sray izler: Homojenizasyon ktrme yon deiim kromatorafisi Afinite kromatorafisi Jel Geirgenlik kromatorafisi

1.GR

Hasan KARADA

Saflatrmann verimi protein tayini ile, ka kat saflatrma gerekletirildii ise birim protein ktlesi bana fonksiyonel aktivitenin llmesi ile bulunur. Protein saflk testi ve ka yabanc protein ierdii jel elektroforezi ile belirlenir. Safszlklarn molekl ktleleri SDS-PAGE ile tayin edilir ve safszlklar jel geirgenlik kromatorafisi ile uzaklatrlr.

1.2. Kromatorafi

Kromatorafi kelimesi Yunanca chroma renk ve Graphein yazmak kelimelerinden kaynaklanmtr. lk defa yirminci yzyln balarnda grnr renkli bitki pigmentlerin ayrlmasnda kullanlm bir tekniktir. Kromatorafi farkl bileiklerin deiken bir ekilde farkl fazlarda dalmasna dayanr. Daima duraan faz (stasyonel faz) ve hareketli faz (mobil faz) vardr. Hareketli faz duraan fazn zerinden geer ve ayrlmas istenen maddeyi de beraberinde srkler. Ayrlacak madde bileenleri farkl derecede duraan fazla etkileime girerler. Duraan fazla etkileimi fazla olan bileenler daha ar, etkileimi az olan bileenler ise daha abuk hareket ettiklerinden bileenler birbirinden ayrlr. Bileiklerin bileenlerine ayrlmasnda, duraan faz ile bileenler arasndaki etkileimin tabiatna gre farkl kromatorafik yntemler gelitirilmitir. Bu etkileim molekl byklne, polariteye, spesifik balanma zelliklerine veya elektrostatik ekim gcne dayanabilir (Telefoncu,1996). 1.2.1. yon-Deiim Kromatorafisi

Elektrostatik ekime dayanan bu adsorpsiyon kromatorafisinde rnekte bulunan bileenler ykl duraan faza olan afinitelerine gre ayrlrlar. yon deitiriciler iki ksmdan oluur: 1. inde ve yzeyinde kimyasal olarak (kovalent balarla) balanm ykl gruplar bulunan boyutlu, apraz balarla balanm znr olmayan dolgu maddesi (matriks).

1.GR

Hasan KARADA

2. Hareketli kar iyonlar. Kar iyonlar tersinir olarak ayn ykteki baka iyonlarca, znr olmayan dolgu maddesinde herhangi bir deiiklie yol amadan deitirilebilirler (Boyer, 1993). yon deitirici dolgu maddesi ayet pozitif gruplarla kimyasal olarak balanmsa, kar iyonlar negatif olup, bu tr iyon deitiriciler negatif iyonlar deitirdiklerinden anyon deitiriciler adn alrlar. Benzer ekilde ayet dolgu maddesi negatif gruplarla kimyasal olarak balanmsa, kar iyonlar pozitif olup, bu tr iyon deitiriciler pozitif iyonlar deitirdiklerinden katyon deitiriciler adn alrlar (ekil 1.1).

- + + +++

+ -

- +

+ - - - +

- - + a) b) ekil 1.1. yon deitiriciler a) Anyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar b) Katyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar (Pharmacia Fine Chemicals AB,1980) Dolgu maddesi alminyum silikatlar, sentetik reineler, polisakkaritler v.b. olabilir. Dolgu maddesinin tabiat iyon deitiricilerin mekanik kararlln, ak zelliini, bozulabilen biyolojik maddelere kar davrann ve ksmen de kapasitesini belirler. lk kullanlan iyon deitiricileri sentetik reineler olup suyun demineralizasyonunu ve su kalitesini dzeltmede ve atklardan iyonlarn

kazanlmasnda kullanlmtr. Bu tr iyon deitiriciler yksek derecede ykl gruplarla kovalent olarak balanm hidrofobik polimer dolgu maddeleri olup biyolojik maddelerin saflatrlmasnda uygun deildir zira yksek yk younluu ve polimerlerin hidrofobik oluu biyolojik maddelerin denatre olmalarna sebep olur. Biyolojik maddelerin ayrmnda ilk kullanlan iyon deitiriciler Peterson ve Sober (1956), tarafndan gelitirilen selloz iyon deitiricilerdir. Hidrofilik tabiat sebebiyle sellozun proteinleri denatre etme eilimi ok dktr. Pharmacia Fine Chemicals firmas tarafndan gelitirilen modifiye dekstran olan Sephadex, apraz bal agaroz olan Sepharose ve epiklorohidrin ile apraz balanarak

kuvvetlendirilmi selloz olan Sephacel iyon deitiricileri, kresel tanecikli

1.GR

Hasan KARADA

yksek gzenekli ilk iyon deitiricilerdir. Bu gnlerde ok farkl destek maddesi vardr ancak protein fraksiyonlanmas iin en yaygn tercih edilen destek maddesi sellozdur (Johnstone ve Thorpe, 1982). Fiberli sellozik iyon deitiricilerin peptid ve protein saflatrlmasnda tercih edilme sebebi peptid ve proteinlerin bu dolgu maddesinde ok kararl olmalardr (Boyer, 1993). Yaygn olarak kullanlan iyon deitiricilerin, deitirdikleri iyon yklerine gre trleri, destek maddeleri, destek maddesine kovalent olarak bal iyonik gruplar, kar iyonlar, pH kullanm aralklar ve zayf veya kuvvetli iyon deitirici trleri izelge 1.2de zetlenmitir. izelge 1.2. Yaygn kullanlan iyon deitiriciler (Telefoncu,1996)
yonik Grup PH Kullanm Aral Anyon Deitiricileri Zayf Anyon Deitiricisi Dietilaminoetil (DEAE) Fonksiyonel Grup: -O-CH2CH2N -(C2H5)2H Cl Kar iyon: Cl
+ -

Mevcut Maddeleri

2-9

Dekstran, Agaroz, Bilyeletirilmi selloz, Lifli selloz, Mikrogranler selloz

Kuvvetli Anyon Deitiricisi Kuaterner aminoetil (QAE) Fonksiyonel Grup: -O-CH2CH2N -(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 Cl Kar iyon: Cl
+ -

2-10

Dekstran, Lifli selloz

Katyon Deitiricileri Zayf Katyon Deitiricisi Karboksimetil (CM) Fonksiyonel Grup: -O-CH2COO Na Kar iyon: Na
+ +

3-10

Dekstran, Agaroz, Lifli selloz, Mikrogranler selloz

Kuvvetli Katyon Deitiricisi Slfopropil (SP) Fonksiyonel Grup: -O-CH2CH2CH2SO3 Na Kar iyon: Na+
+

2-12

Dekstran, Mikrogranler selloz

10

1.GR

Hasan KARADA

yon deitiricilerin kar iyonlar absorplama kabiliyeti kantitatif olarak kapasite olarak tanmlanr. yon deitiricisinin total kapasitesi, o iyon

deitiricisinin kuru gramnda bulunan ykl ve potansiyel olarak ykl gruplarn miktardr. Genel olarak miligram kuru arlk bana iyonlaabilen gruplarn miliekivalenleri olarak ifade edilir ve deneysel olarak titrasyonla tayin edilir. yon deitiricisinin kapasitesi destek maddesinin gzeneinin fonksiyonudur. malatlarn literatrnden protein iin mevcut kapasite mikrogranler, bilyelenmi selloz ve agaroz iin ok benzerdir (0,11-0,15 g albumin / ml DEAE trevi iyon deitiricisi). yon deitiricilerin yksek kapasitesi ok byk hacimlerin prosesine ve sonra konsantre ekilde eldesine imkan verir. yon deiim kromatorafisi ile ayrmada temelde iki etap vardr: lk etap rnek tatbiki ve iyon deitirici zerinde adsorpsiyon, ikinci etap ise adsorbe edilen rnek bileenlerinin kolondan ayrlm olarak ele edilmeleri (Boyer, 1993). 1.2.1.1. Proteinlerin yon-Deiim Kromatorafisi le Saflatrlmas

Proteinler iyon deitiricilere zt ykl gruplar arasndaki iyonik etkileimle tersinir olarak balanrlar. Balanan proteinler ya tampon zeltisinin iyonik gc kademeli olarak arttrlarak ya da tampon zeltisinin pH deitirilmek suretiyle protein yzeyindeki etkileen gruplarn yk yok edilmek suretiyle kolondan ayr ayr ele edilirler. Btn bu ilemler esnasnda iyonik deitiricinin yk sabit kalacak bir pH aral seilmelidir yoksa btn proteinler kolondan ayrlmadan birlikte ele olurlar. Balanma gc hem proteinin izoelektrik noktasyla hem de toplam yk ile balantldr. Dolaysyla ayn izoelektrik noktasna sahip iki protein denge izoelektrik fokuslama ile ayrlmazken iyon-deiim kromatorafisiyle ayrlabilirler (Johnstone ve Thorpe, 1982).

11

1.GR

Hasan KARADA

1.2.1.1.(1). yon Deitiricinin Seimi

Amfoterik maddeler olan proteinlerin net ykleri deikendir. Dk pHlarda pozitif, yksek pHlarda negatif ve izoelektrik noktada (pI) ise sfr

ykldr. Proteinlerde etkileime giren yk gruplar balca karboksil, amino veya tersiyer amino gruplardr. Dolaysyla anyon deitiricileri proteinlerin protonsuz karboksil gruplarn balarken protonlanm amino gruplarn iter. Genel kaide olarak toplam aspartik asid ve glutamik asid art deiken proteinler anyonik deitiriciler ile ayrlrken, lizin, arjinin ve histidin ierii farkl proteinler katyonik deitiricilerle ayrlabilirler. Ancak, bu kaide kesin bir kaide deildir, zira balanmay etkileyen bir ok faktr vardr. Bu sebeple proteinlerin ayrlmasna teebbs edilmeden protein karmnn hem asidik hem de bazik artlarda poliakrilamid jellerle elektroforezinin yaplmasnda fayda vardr. Elektroforetik ayrmlar, yaklak olarak anyon ve katyon deiim kromatorafisinin analitik versiyonlar olarak hizmet ederler. rnein, eer karmn iyi bir ayrm alkalin elektroforezle elde edilirse o zaman preparatif olarak benzer pHta anyon deitirici ile ayrlabilir. Prensipte amfoterik molekller hem anyon hem de katyon deitiricilerine balanabilirler ama byk biyomolekllerle allrken kararllk pH aralnnda dikkate alnmas gerekir. Kararl pH aral, biyomolekln denatre olmad pH araldr. ou kez ayrlmaya allan proteinin izoelektrik noktas bilinmez ve bir protein karmndaki proteinlerin birbirlerinden ayrlabilmesi iin ne tip bir iyon deitirici kullanlaca ancak deneme yanlma yntemi ile gerekletirilir. Az bir miktar rnek tampon zeltide zlr ve farkl iyon deitiricilerin bulunduu farkl test tplerine eit olarak konulur. 10-15 dakika bekletildikten sonra santrifjlenerek zeltinin 280 nmde absorbans okunur. Bal olarak en dk absorbans veren test tpndeki iyon deitirici uygun deitiricidir (Pharmacia Fine Chemicals AB,1980).

1.2.1.1.(2). Tampon Seimi

Tampon zeltisinin pH iyon deitiricinin alma aralnda olmal ve proteine zarar vermeyecek pH aralnda bir deerde olmaldr. Proteinin

12

1.GR

Hasan KARADA

deitiriciye balanmas iin pH izoelektrik noktasnn en az yar, tercihen bir birim uzanda (anyon deitiriciler iin stnde, katyon deitiriciler iin altnda) olmaldr. zoelektrik noktasnn ok zerindeki veya ok altndaki pHlar gereinden daha kuvvetli balanmay indklediinden sonuta denatrasyon ve dk geri kazanma yol aar. Proteinlerin baland pHtaki tampon balang tamponu olarak alnr, zira proteinler balanmal ancak serbest kalacaklar pHa yakn pHta olmaldr ki, ok yksek gte iyonik g kullanlmadan kolondan ele edilebilsinler. Balang pH ayn zamanda zayf m kuvvetli mi iyon deitirici kullanlmasnn gerektiini gsterir. Zayf iyon deitiriciler, anyon deitiricilerde pH 6nn altnda katyon deitiricilerde pH 9un zerinde yklerini kaybetmee balarlar. Kuvvetli iyon deitiriciler sadece ok dk iyonizasyonlu maddelerin ayrmnda kullanlr.

1.2.1.1.(3). Kolon Seimi

Dier kolon kromatorafilerinde de olduu gibi kullanlan cam kolonun i ap, kolon boyunca ayn olmal, k noktasnda l hacim mmkn olduunca az olmaldr. k musluu deliinin i ap 1 mm civarnda olmaldr. En kullanl kolonlarn boyu 90-100 cm olup ap rnein miktarnca belirlenir. rnein hacmi total kolon hacminin % 5ini gememeli hatta iyi bir ayrm iin % 1-2 tercih edilmelidir. Genelde 10-30 mg protein/100 ml reine iyi bir yklemedir. Daha fazla protein verimi arttrrken ayrm drr. Dolaysyla rnn safl azalr. Az ykleme ise, ayrm arttrrken verimi drr. yon deiim kromatorafisinde genelde 20-30 cm kolon boyu uygundur. Hatta daha ksa kolon boylar tercih edilir. Tatbik edilen rnek hacmi nemli deildir, zira balanan proteinler konsantrasyondan fazla etkilenmezler.

13

1.GR

Hasan KARADA

1.2.1.1.(4). rnek Tatbiki Ve Elsyon

rnek tatbik edilmeden balang tamponu ile dializ edilmelidir. Sonu hacmin nemi yoktur. rnein uygulanmasndan sonra kolon hacminin iki kat hacimdeki balang tamponu ile ykanmaldr ki balanmam proteinin tamam kolondan ele edilebilsin. Balanan proteinler bundan sonra artan iyonik gteki tamponla veya pH deitirilmi tamponla (anyon deitiricilerde pH drlerek, katyon deitiricilerde pH ykseltilerek) veya hem pH deitirilerek hem de iyonik g arttrlarak ele edilir. yonik gcn deitirilmesi genelde tercih edilir. nk bu daha iyi kontrol edilebilir. Sonu iyonik gcn 1,0 olmas genellikle ou proteinleri ele etmek iin yeterlidir. Ya tampon konsantrasyonu arttrlr ya da tampon konsantrasyonu sabit tutulurken dier iyonlar rnein sodyum klorr iyonlar arttrlr. Sodyum klorr iyonlarnn arttrlmas genelde daha iyi bir yntemdir. nk tamponlama kapasitesi dolaysyla pH ayrm boyunca sabit kalr (Johnstone ve Thorpe, 1982). 1.2.2. mmobilize Bakr lgi Kromatorafisi mmobilize

metal

ilgi

kromatorafisinde

proteinlerin

adsorpsiyonu

immobilize metal iyonu ile protein yzeyinde elektron verici gruplar arasndaki kordinasyon temelindedir. ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks desteini, b) ise metal elat ilgi desteine proteinlerin balanmasn gstermektedir. ounlukla kullanlan gei metal iyonlar Cu (II), Zn (II) , Co (II) , Fe (III) dr. Bu metaller elektron ifti kabul edicilerdir ve lewis asitleri olarak adlandrlrlar. Elektron verici atomlar (N,S,O) elatlatrc bileikte mevcuttur. Bunlar

kromatorafik destee balanmtr. Ayn zamanda metal iyonlar ile koordinasyon yapp metal elatlar olutururlar. Metal elatlar, iki dili, dili v.b. olabilir. Bu doldurulmu koordinasyon balarnn saysna baldr. Geriye kalan metal koordinasyon blgeleri normalde su moleklleri ile doldurulurlar ve proteinden gelen uygun elektron verici gruplarla yer deitirirler. Amino ucuna ek olarak, baz amino asitler, zellikle yan zincirlerindeki elektron verici atomlardan dolay balanmaya

14

1.GR

Hasan KARADA

uygundurlar. Bir ok amino asit art rnein glutamik asit, aspartik asit, tirozin, sistein, histidin, arginin, lisin ve metionin balanmada yer almasna ramen immobilize metal ilgi kromatorafisinde protein alkonmas ncelikle histidin artnn varlna baldr. elatlanm metal iyonlarna balanabilecek serbest sisteinler indirgenmi halde nadiren bulunurlar. Bunun yannda triptofan, fenilalanin ve tirozinin aromatik yan zincirleri histidin artklarnn yanna girebilecek yaknlkta ise balanma imkanlar olur. Proteinin immobilize metal ilgi kromatorafisi desteine adsorpsiyonu, histidin artnda bulunan imidazol azotunun protonlanmam formda olduu ntral veya hafife bazik pHda uygulanr. Genellikle elatlanm metal iyonuyla ba

yapmayan, bal olarak yksek iyonik gteki tamponlar (0,1-1,0 M NaCl ieren) spesifik olmayan elektrostatik etkileimleri indirgemek iin kullanlrlar. Hedef proteinin elsyonu protonlama, ligand deiimi veya metal iyonunun gl bir elatr iyonu (EDTA) ile ekstraksiyonu ile baarlabilir. midazol ile ligand deiimi yaklak ntral pHda uygundur. EDTA gibi gl elatlatrc ajanlarn uygulanmas bal proteinleri ele eder, bununla beraber balanma zellii bozulur ve kolonun metal iyonlar ile dier ayrm iin yklenmesi gerekir (Porekar ve Menart, 2001).

15

1.GR

Hasan KARADA

(b) ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks destei, b) metal elat ilgi desteine proteinlerin balanmas (Porekar ve Menart, 2001) 1.3. Pestisitler

Pestisit : Kltr bitkilerine zarar veren hastalk etmenleri, zararllar ve yabanc otlar gibi organizmalar ldren canl kkenli veya kimyasal maddelere pestisit ad verilir. Pestisit kelime olarak yabanc kaynakl olup, pest = zararl, cide = ldrc olmak zere zararl ldrc anlamnda bir bileik kelimedir (ncer, 2000).

1.3.1. Pestisitlerin Snflandrlmas:

Pestisitler deiik zelliklerine gre snflandrlrlar.

1.3.1.1. Etkiledikleri Canl Gruplarna Gre

Bu snflandrmada etkiledii canl n planda tutulur. Buna gre pestisitler;

16

1.GR

Hasan KARADA

a) nsektisidler (Bcekleri ldren) b) Akarisitler (Akarlar ldren) c) Nematisit (Nematodlar ldren) d) Mollussisit (Yumuakalar ldren) e) Rodentisit (Kemirgenleri ldren) f) Avisit (Kular ldren) g) Afisit (Yaprakbitlerini ldren) h) Fungisit (Funguslar ldren) i) Bakterisit (Bakterileri ldren) j) Herbisit (Otlar ldren) k) Algisit (Algleri ldren) olmak zere snflandrlr.

1.3.2. Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giri Yollar

Pestisitler hayvansal organizmalara deiik yollarla girerler. Pestisitler bu girileri srasnda baz hcre ve dokularn etkilenmesine, hatta lmne neden olurlar. Ayn zamanda baz doku ve organlar tarafndan pestisitin bir ksm tutularak etkisinin azalmas sonucunu getirir. Pestisitler hayvansal organizmaya yolla girerler. 1.3.2.1. Az yoluyla 1.3.2.2. Deri yoluyla 1.3.2.3. Solunum yoluyla

1.3.2.1. Az Yoluyla Giri

Besin ile birlikte alnan pestisit azda amilaz ve lipaz v.b. enzimlerle karlar. Bu enzimler etkili maddenin bir ksmn etkileyerek baz metabolitlere dntrr. Meydana gelen rnler etkili maddeden daha az veya daha ok zehirli rnler olabilir. Etkili madde daha sonra crop, yani kursaa gelir. Kursakta da baz

17

1.GR

Hasan KARADA

metabolitlere ayrlabilir. Daha sonra mideye gelen etkili madde epitel hcreleri tarafndan alnarak sinir sistemine ular veya vcut svsna yani kana geer.

1.3.2.2. Deri Yoluyla Giri

Hayvansal organizma derisi ile temas eden pestisitin bir ksm derinin d yzndeki kl, ty, pul gibi yaplar yardmyla tutulur. Geri kalan etkili madde deri tabakalarndan geerek sinir sistemine ular.

1.3.2.3. Solunum Yoluyla Giri

Gaz etkili pestisitler atmosfer havas ile birlikte solunum yoluyla girerek difzyon yoluyla hemolimf yani kana geer ve kan vastasyla organlara ular. Pestisitlerin organizmaya en hzl girii solunum yoluyla gerekleir. Ancak, zellikle bcekler, stigmalarn kapatmak suretiyle gaz etkili pestisitin vcut iine girmesini engellemeye alr.

1.3.3. Pestisitlerin Etki Mekanizmalar

Pestisitlerin

hayvansal

organizma

ve

dolaysyla

bceklerdeki

etki

mekanizmalar ile ilgili 4 varsaym vardr. Bunlar aadaki gibi gruplandrlabilir. 1.3.3.1. Fiziksel Varsaym 1.3.3.2. Toksoforik Varsaym 1.3.3.3. Yerine Geme 1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme

1.3.3.1. Fiziksel Varsaym

1956 ylnda Kens isimli aratrc tarafndan ortaya atlm bir varsaymdr. Bir organa ulaan etkili madde iyonlar lipoprotein balantlarna yerleerek onlarn yaplarnn, rnein geirgenliklerinin bozulmasna neden olurlar.

18

1.GR

Hasan KARADA

1.3.3.2. Toksoforik Varsaym

Etkili madde herhangi bir yolla organizmaya girdiinde etkili maddenin moleklleri organizmada mevcut bir kimyasal madde ile birleerek baz fizyolojik olaylarn engellenmesine veya tmyle ortadan kalkmasna neden olabilir.

1.3.3.3. Yerine Geme

Etkili maddenin herhangi bir bann organizmada mevcut bir antimetabolit ile yerdeitirmesi sonucu zehirlenme ortaya kar. rnein selenyum topraa verildiinde bitki tarafndan alnr ve bitki iin zehirli deildir. Ancak bu bitki ile beslenen bcek vcuduna giren selenyum bcek vcudunda kkrdn yerine geerek ani zehirlenmeye neden olur. Klorlandrlm hidrokarbonlardan Lindanede bu tr etki mekanizmas bulunduu bilinmektedir.

1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme

Deneysel olarak ortaya konmu ve en fazla zerinde durulan bir etki mekanizmasdr. Esas, enzimin bloke edilerek faaliyetinin engellenmesine dayanr. Herhangi bir organizmada bir fizyolojik olayda normal reaksiyon aadaki gibi gerekleir.

E+S

ES

P+E

Burada E, enzim; S, enzim ile reaksiyona giren madde; ES, ara rn; P,rndr. Yukardaki reaksiyonda enzim ile engelleyici bir madde, rnein bir pestisit reaksiyona girdiinde aadaki reaksiyon ortaya kar.

E+I

EI

19

1.GR

Hasan KARADA

Burada E, enzim; I, engelleyici madde rnein pestisit; EI, engellenmi enzimdir. Bu reaksiyondan da grlebilecei gibi sonuta bir rn meydana gelemez. nk etkili madde enzimin faaliyetini engellemitir. Sonuta da zehirlenme olay ortaya kar. Genel olarak sinir sistemi etki mekanizmas byle gerekleir. Sinir sisteminde bir uyartnn iletiimi kolin ve asetik asitin birlemesi sonucu meydana gelen asetilkolin ile salanr. Uyart iletiimi bittiinde kolinesteraz enzimi reaksiyona girerek asetilkolini kolin ve asetik asite paralayarak sinir sistemindeki uyart iletiimini durdurur. ok ksa zaman dilimi iinde gerekleen bu biyokimyasal reaksiyon normal bir reaksiyon olarak sreklidir. Hayvansal organizmaya, rnein bir bcek vcuduna sinir sistemi etkili bir pestisit girdiinde, pestisit kolinesteraz enziminin faaliyetini yani ilevini engelleyerek uyart sonucu meydana gelen asetilkolin, kolin ve asetik asite paralanamaz. Bunun sonucu sinir sistemindeki uyart srer ve sonuta zehirlenme olay gereklemi olur. Zehirlenmi organizmalarda srekli titremeler ite bunun sonucu, yani iletiimin srekli oluundan kaynaklanr. Organik fosforlu,

klorlandrlm hidrokarbonlar ve karbamatl pestisitlerde etki mekanizmas bu tr enzim faaliyetinin engellenmesi eklindedir.

1.3.4. Aratrlan Pestisitler

Cyprodinil ve fludioxonil fungisitlerini ieren Switch 62.5 WG bada ve sebzede (domateste) kuruni kf (Botrytis cinerea) hastalnn mcadelesinde kullanlacak sistemik ve kontak zelliklerine sahip yepyeni bir tarm ilacdr. Bu tarm ilac % 37,5 cyprodinil ve % 25,0 fludioxonil iermektedir. lacn bileimine giren iki etkili maddeden biri olan cyprodinil sistemik etkili olup methionin biyosentezini engelleyerek fungusun hayat devresini, bitki dokularna giriini ve misellerin geliimini nler. Cyprodinil yapraklar ve meyveden hzla bnyeye alnr. Bitkide yukarya doru ve yapran bir yznden dier yzne geer. lacn bnyesinde bulunan dier etkili madde fludioxonil kontak etkili olup bitki bnyesine

20

1.GR

Hasan KARADA

tanmas snrldr. Cyprodinil ve fludioxonil etkili pestisitin zelliklerini izelge 1.3. ve izelge 1.4. te grebiliriz (Ylmaz, 2002).

izelge 1.3. Cyprodinil ve fludioxonilin IUPAC ad ve yaps (Ylmaz, 2002)


Ad IUPAC Ad Kapal Forml Fludioxonil 4-(2,2-difluoro-1,3benzodioxol-4-yl) pyrrole-3carbonitrille
F F
N N

Molekl Arl 248,19

ekli

C12H6F2N2O2

N C O O N H

Cyprodinil

N-(4-cyclopropyl-6methyl-pyrimidin-2-

C14H15N3

225,3

yl)-aniline

izelge 1.4. Cyprodinil ve fludioxonilin zellikleri (Ylmaz, 2002)


Ad Organik zcde znrlk (25 C) Erime Noktas (C) Kimyasal Snf Pestisit Snf LD50 Deeri (mg/kg) Maksimum Kalnt Miktar (MRL, mg/kg) Fludioxonil suda 1,53 mg/L etanol 44 g/L metanol %2(w/v) aseton % 12(w/v) N-metil pirolidon % 60 (w/v) Cyprodinil suda 16 mg/L aseton 610 g/L etanol 160 g/L n-oktanol 160 g/L toluene 460 g/L hekzan 30 g/L 75,9 pirimidinamin fungisit 2000 den fazla 0,5 199,4 fenilpirol fungisit 5000 den fazla 2

21

1.GR

Hasan KARADA

1.4. Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri

Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmam elektron ihtiva eden atom veya molekllerdir. Ultraviyole nlar, evresel kirlilikler, sigara duman, stres, pestisitler, toksinler gibi fiziksel ve kimyasal ajanlarla dokularda hasar oluur. Normalde, hcrelerde en byk serbest radikal kayna elektron transport zincirinde elektron szntsdr (Lunec, 1990).

1.4.1. Serbest Oksijen Radikalleri

Biyolojik sistemlerdeki en nemli serbest radikaller, oksijenden oluan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasnda anahtar rol oynayan maddeler oksijenin kendisi, speroksit (O2 ), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH ) dir (Halliwell ve Gutteridge, 1984). Oksijenin elektronlar yle ekilde dalmlardr ki bu elektronlardan ikisi elememitir. Bu yzden oksijen bazen diradikal olarakta deerlendirilir. Oksijenin bu zellii onun dier serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini salar. Radikal olmayan maddelerle ise daha yava reaksiyona girer (Lunec, 1990). 1.4.1.1. Speroksit Radikali (O2 ) Hemen hemen tm aerobik hcrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu, serbest speroksit radikal anyonu meydana gelir. O2+eO2

Speroksit radikali, ksenobiyotikler gibi ajanlarla, ksantin oksidazn rol ald enzimatik tepkimelerle, baz oksidaz tepkimelerinde, fagositoz srasnda, elektron transport sistemi srasnda oluur. Speroksit radikali, SOD ile katalizlenen enzimatik dismutasyona girerek azalr (Halliwel ve ark, 1992).

22

1.GR

Hasan KARADA

1.4.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2) Molekler oksijenin, evresindeki molekllerden iki elektron almas veya speroksitin bir elektron almas sonucu peroksit oluur. Peroksit molekl iki hidrojen atomuyla birleerek hidrojen peroksiti (H2O2) meydana getirir. H2O2 membranlardan geebilen, uzun mrl bir oksidandr. Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksitin asl retimi, speroksitin dismutasyonu ile olur (Halliwel ve ark, 1992). 2O2 + 2H +

H2O2

+ O2

1.4.1.3. Hidroksil Radikali (OH ) Hidroksil radikali, hidrojen peroksitin gei metallerinin varlnda

indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir. Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH

Son derece reaktif bir oksidan molekldr. Yarlanma mr ok ksadr. Olutuu yerde byk hasarlara neden olur. Tioller ve ya asitleri gibi eitli molekllerden bir proton kopararak yeni radikallerin olumasna yol aar (Halliwel ve ark, 1992).

1.4.2. Antioksidan Savunma Sistemleri

Reaktif oksijen trlerinin oluumunu ve bunlarn meydana getirdii hasar nlemek iin vcutta birok savunma mekanizmalar gelimitir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya ksaca antioksidanlar olarak bilinirler. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen trlerini toplayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidanlar, doal (endojen kaynakl) ve eksojen kaynakl antioksidanlar olmak zere balca iki ana gruba

23

1.GR

Hasan KARADA

ayrlabildii gibi serbest radikalin meydana geliini nleyenler ve mevcut olanlar etkisiz hale getirenler eklinde de ikiye ayrlabilirler. Ayrca enzim ve enzim olmayanlar eklinde de snflandrlrlar. Hcrelerin hem sv hem de membran ksmlarnda bulunabilirler (Akku, 1995).

1.4.2.1. Doal (Endojen) Antioksidanlar

1.4.2.1.(1). Enzimler

Mitokondriyal Sitokrom Oksidaz Sistemi Speroksit Dismutaz Katalaz Glutatyon Peroksidaz Glutatyon-S-transferaz Hidroperoksidaz

1.4.2.1.(2). Enzim Olmayanlar

a) Lipid fazda bulunanlar - tokoferol (E vitamini) - karoten

b) Sv fazda (hcre sitozolnde veya kan plazmasnda) bulunanlar

Askorbik asit,

Melatonin, rat, Sistein, Serulplazmin, Transferin,

Laktoferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Metionin, Albumin, Bilirubin, Glutatyon.

24

1.GR

Hasan KARADA

1.4.2.2. Eksojen Antioksidanlar (lalar) -Ksantin Oksidaz nhibitrleri: Tungsten, Alloprinol, Oksiprinol, Folik asit, Pterin aldehid. -Soya Fasulyesi nhibitrleri: Ksantin dehidrojenazn proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dnmn inhibe ederler. -NADPH Oksidaz nhibitrleri: Adenozin, Lokal Anestezikler, Kalsiyum Kanal Blokerleri, Non-Steroid Antiinflamatuar lalar, Cetiedil, Difenilin odunyum, Rekombinant Speroksit Dismutaz, Trolox-C: E Vitamini Analoudur. -Endojen Antioksidan Aktiviteyi Arttran Maddeler: Glutatyon Peroksidaz

aktivitesini arttran Ebselen, Asetilsistein. - Dier Nonenzimatik Serbest Radikal Toplayclar: Mannitol, Albumin, DMSO. -Demir Redoks Dngsnn nhibitrleri: Desferroksamin, Serulplazmin -Ntrofil Adezyon nhibitrleri -Sitokinler: TNF ve nterlkin-I -Barbitratlar - Demir elatrleri

1.4.2.3. Gda Antioksidanlar

Btillenmi Hidroksitoluen (BHT), Btillenmi Hidroksianisol (BHA), Sodyum Benzoat, Ethoxyquin, Propylgalate, Fe-Speroksit Dismutaz (Akku, 1995).

1.5. Speroksit Dismutaz ( Speroksit Oksidoredktaz, E.C:1.15.1.1, SOD)

1.5.1. Bakr-inko Speroksit Dismutaz

1938de Mann ve Keilin, sr kanndan izole ettikleri bakr ieren mavi yeil proteini, haemocupreini tanmladlar.1953de benzer bir protein at karacierinden izole edilmi ve hepatocuprein olarak adlandrlmtr. Beyinden cerebrocuprein gibi bu tip dier protein sonradan izole edilmitir. 1970de eritrosit proteinin bakr gibi

25

1.GR

Hasan KARADA

inkoda ierdii bulunmutur. Bu proteinlerde hibir enzimatik reaksiyon grlmemi olup bazen metal depolayclar olarak nerildiler. Buna karn, 1969da Mc Cord ve Fridovich, eritrosit proteinin speroksit radikalini katalitike uzaklatrabildiini belirttiler. Bu eritrosit proteini bir speroksit dismuataz enzimi (SOD) olarak fonksiyon gstermektedir.Youn aratrmalara ramen, SODnin katalizledii baka substrat bulunamamtr. Demek ki SOD katalitike

speroksitlerin uzaklatrlmasna spesifik grnmektedir (Bertini ve ark, 1998). Bakr inko ieren speroksit dismutazlar olaan d bir ekilde kararldr. Eritrositlerden Cu-Zn SODnin saflatrlmasnda, hcreler paralanr. Hemoglobin kloroform ve etanol muamelesi ile ardndan santrifjleme ile ayrlr. Enzim organik faza girer, burada souk aseton eklenmesi ile ktrlr. Ardndan iyon deiim kromatografisi ile ileri derecede saflatrlr. Birok enzim byle ileme dayanamaz. Cu-Zn SOD, sya, proteazlarn saldrsna, guadinyum klorr, sodyum dodesil slfat ve renin denetrasyonuna kar olduka dayankldr (Fridovich, 1995).

1.5.1.1. karyotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD

Yaplan almalar Cu-Zn SODlerin hemen hemen tm karyotik hcrelerde var olduunu gstermitir. Hayvan hcrelerinde Cu-Zn SODlerin ou sitozolda yerlemitir, fakat bazlar lizozmlarda, ekirdekte ve i ve d mitokondrial membrann arasnda bulunur. Peroksizomlarnda ayn zamanda biraz Cu-Zn SOD ierdii kaydedilmitir (Slot ve ark, 1986). Bakteri veya siyanobakteriler gibi prokaryot hcrelerde Cu-Zn SODlerin daha az yaygn olduu dnlebilir. Fakat bu gr dzeltilmelidir. nk Cu-Zn SODnin prokaryotlardaki varl rneklerle kantlanmaktadr.

1.5.1.2. Cu-Zn SODnin Yaps ve Katalitik Etkinii imdiye kadar Cu-Zn SODler karyotlardan izole edilmi olup, 32 000 bal molekler ktleye sahiptir. ki protein alt nitesi ierir. Her bir alt nite aktif blgesinde bir bakr ve bir inko iyonu ierir (Fridovich, 1995). Bir farkl tip Cu-Zn

26

1.GR

Hasan KARADA

SOD, ekstraseller SOD (EC-SOD) tanmlanmtr. ntraseller Cu-Zn SODnin aksine EC-SOD yksek bal molekler ktleye (yaklak 135 000) sahiptir. Tetramerik glikoprotein ierir ve her alt nitesi bir bakr ve bir inko ierir. Bakteriyel Cu-Zn SODler karyot enzimler gibidirler. Genellikle dimerdirler ve alt niteleri bana bir Cu ierirler. Buna karn E.Coli enziminin bir monomere sahip olduu belirtilmitir (Battistoni ve ark, 1996). Tm Cu-Zn SODler ayn reaksiyonu katalizlerler; speroksitin ( O )
2

dismutasyonunu olduka hzlandrrlar.


O2 +O2 +2H+ H2O2+O2 (temel hal)

Katalizlenmemi speroksitin dismutasyon hz sabiti byk ounlukla zeltinin pHna bal iken, ki bu fizyolojik pHda yaklak 5.105 M-1.s-1 dir, sr eritrosit Cu-Zn SOD tarafndan katalizlenen reaksiyon hemen hemen pH 5,3-9,5 aralnda pHdan bamszdr ve speroksit reaksiyonu iin hz sabiti yaklak 1,6.109 M-1.s-1 dir. Cu-Zn SODdeki bakr iyonu dismutasyon reaksiyonunda indirgenmeye ve ykseltgenmeye uramaktadr.Yani,

Enzim-Cu2+ + O2 Enzim-Cu+ + O2 + 2H+ Net reaksiyon: O2 +O2 +2H+

Enzim-Cu+ + O2 Enzim-Cu2+ + H2O2


H2O2+O2

Zn2+ katalitik dngde fonksiyon gstermez fakat enzimi kararl hale getirir. Bu sonu, aktif blgede metaller karldnda ve tek yada birlikte tekrar yerine konduundaki denemelerden karlmtr. Hatta, metalden yoksun Cu-Zn SOD enzimine (apoenzim) bakr iyonlarnn eklenmesi ile SODnin tekrar aktivite kazanmas, bakrn eser miktarlarn lmede kullanlmtr. Genelde, dier gei metallerinin iyonlar, rnein Mn2+ fonksiyonel enzimi vermek zere bakr ile yerdeitiremez, fakat kobalt, civa veya kadmiyum iyonlar, enzim kararlln

27

1.GR

Hasan KARADA

arttrmak iin Zn2+ ile yerdeitirebilir (Fridovich, 1995). ayet Co2+, Cu2+ ile yerdeitirirse speroksit dismutasyonundan bahsedilebilir (ONeill ve ark, 1982). Fakat yalnzca 4,8.106 M-1.s-1 hz sabiti ile enzim alr.

1.5.1.3. Cu-Zn SODnin Yaps

eitli bitki ve hayvanlardaki Cu-Zn SODlerin tm amino asit dizilii (baz durumlarda boyutlu yaps) belirlenmi ve genel olarak hepsinin benzer olduu ortaya kmtr (Fridovich, 1995). lkin sr eritrosit Cu-Zn SODnin detayl yaps belirlenmitir. Her bir alt nite sekiz antiparalel krmal yapdan olumutur. Bakr iyonu 4 histidin artnn (amino asit diziliindeki 44,46,61 ve 118 numaral amino asitler) imidazol halkalarndaki azotlarla etkileim ile aktif blgede tutulur. inko iyonu ise bakra His 61, His 69, His 78 ve Asp 81in COO- (karboksi) grubu ile kprl konuma getirilmitir. Her iki metal ile etkileime giren His 61 dismutasyon iin gerekli protonun salanmasnda rol oynad dnlmektedir. nsan Cu-Zn SODsi benzer yap gsterip, 30x40x70 A civarnda elips eklinde dimerik bir enzimdir. Her bir alt nite bir inko ve bir bakr iyonuna ek olarak 153 amino asit art ierir.

1.5.2. Mangan Speroksit Dismutaz

E.Coliden ilkin izole edilen SOD, Cu-Zn SODden tamamyla farklyd (Fridovich, 1995). Mavi yeilden ziyade pembeydi, siyanr veya dietilditiyokarbamat tarafndan inhibe edilmiyordu, 32 000 den ziyade 40 000 bal molekler arla sahipti, kloroform art etanol muamelesi ile bozuluyordu ve aktif blgesinde mangan ieriyordu. Temel halde enzim, mangan +3 basamandadr. Bu farkllklara karn, Mn-SODler, Cu-Zn SODlerle temelde ayn reaksiyonu katalizlerler. Basitletirilmi reaksiyon mekanizmas aadaki ekilde yazlabilir;

28

1.GR

Hasan KARADA

Mn3+ +O2 Mn
2+

Mn3+-O2 Mn2+-O2 + 2H+

Mn2+ + O2 Mn3+ + H2O2

+ O2

pH 7,0 de speroksit dismutasyonu Cu-Zn SOD ve Mn-SOD iin benzerdir. Fakat Cu-Zn SODnin aksine Mn-SODnin hz alkali pH da der. rnein E.Coli Mn-SODsi iin hz sabiti pH 7,8de 1,8.109 M-1.s-1 iken pH 10,2de 0,33.109 M-1.s-1dir. Mn-SOD, Cu-Zn SODye gre deterjan gibi kimyasallarla denatrasyona veya syla denatrasyona daha fazla duyarldr (Halliwell ve Gutteridge, 1999).

1.5.2.1. Mn-SOD Yerleimi

Mn-SOD bakteriler, bitkiler ve hayvanlarda yaygn olarak bulunur. ou hayvan dokularnda ve mayada, tamamylada olmasada byk ounlukla Mn-SOD, mitokondride bulunur (Fridovich, 1995). Mn-SOD ve Cu-Zn SODnin bal aktivitesi dokuya ve tre baldr. Mitokondrisiz memeli eritrositi Mn-SOD iermez. Fare karacierindeki Mn-SOD, toplam SOD aktivitesinin yaklak % 10u kadardr. Normal byme ortamnda Dactylium dendroides mantarnn toplam SOD aktivitesinin % 80ini Cu-Zn SOD, % 20sini Mn-SOD oluturur. Bununla beraber, bakr iyonu kayna snrlanrsa, toplam seller SOD aktivitesini sabit hale getirmek iin fazlaca Mn-SOD sentezlenir (Shatzman ve Kosman, 1979). Bu fazla Mn-SOD sitozolda grlr. Benzer bir ekilde Cu-Zn SOD aktivitesinde artma, Mn-SOD aktivitesinde azalma Mn ile snrlandrlm diyet ile beslenen tavuk karacierinde gzlenmitir (De Rosa ve ark, 1980). Baz kabuklularda Mn-SOD mitokondrinin dndada bulunur. Mavi yenge Callinectes sapidus, mitokondri ve sitozolde Mn-SOD ierir fakat Cu-Zn SOD iermez.

29

1.GR

Hasan KARADA

1.5.2.2. Mn-SOD Yaps

Yksek organizmalardaki Mn-SODler genelde 4 protein alt nitesi ve nite bana 0,5 veya 1 Mn iyonu ierirler. Buna karn tamam olmasada bakteri enzimlerinin ou iki alt niteye sahiptir. Mn-SODnin aktif blgesinden mangann uzaklatrlmas ile katalitik aktivite yok olur. Mangan genelde demiride ieren gei metalleri ile yerdeitiremez. Hayvanlar, bitkiler veya bakterilerdeki Mn-SODlerin amino asit dizilileri birbirine benzerdir ve Cu-Zn SODnin diziliine benzemez (Halliwell ve Gutteridge, 1999).

1.5.3. Demir Speroksit Dismutaz

E.Coli bakterisinden 4 SOD enzimi saflatrlabilir; Cu-Zn SOD, Mn-SOD, demir ieren enzim Fe-SOD ve ayn dimerik moleklde demir enziminin ve mangan enziminin alt nitelerini ieren hibrid enzim (Fridovich, 1995). Fe-SOD ve MnSODnin her ikiside hcre matriksinde bulunmutur. Demir ieren SODler genelde iki protein alt nitesi ierirler. Buna karn bazlarnn 4 alt nite ierdii belirtilmitir. Dimerik enzimler genelde enzim molekl bana 1 yada 2 demir iyonu ierirler. Fe-SODlerdeki demir temel halde Fe3+ halindedir ve katalitik dng srasnda Fe3+ ve Fe2+ basamaklar arasnda gidip gelir. Yani,

Fe3+-enzim + O2 Fe2+-enzim + O2 + 2H+

Fe2+-enzim + O2 Fe3+-enzim + H2O2


H2O2+O2

Net reaksiyon: O +O +2H+ 2 2

Mn-SOD gibi Fe-SODlerde pH 7,0 ile karlatrldklarnda yksek pH da katalitik aktivitesi derler ve siyanr ile inhibe edilmezler. Speroksit ile reaksiyonunun hz sabiti Fe-SODlerde dier tip SODlerden hafife daha dktr.

30

1.GR

Hasan KARADA

Fe-SODlerin amino asit dizilileri, Mn-SODlere benzerdir ve Cu-Zn SOD diziliinden farkldr. Bu E.Colide hibrid SODnin nasl var olduunu aklar.

1.5.3.1. Fe-SODlerin Yerleimi

Baz bakteriler rnein E.Coli, Fe-SOD ve Mn-SODnin her ikisini ierirken, bazlar yalnzca bir enzim ierirler (Fridovich, 1995). rnein Bacillus cereus yalnzca Fe-SOD ierirken, Streptococcus sanguis yalnzca Mn-SOD ierir. Photobacterium leiognathi Cu-Zn SOD yannda Fe-SOD ierirken, ortak yaamayan, serbest yaayan Photobacterium sepia Fe-SOD ierir fakat Cu-Zn SOD iermez. Hibir hayvan dokusu Fe-SOD iermez, fakat baz yksek bitki dokular ierir. Hardal yapraklarndaki mitokondride, membran boluklar arasnda Cu-Zn SOD ve matrikste Mn-SOD ierir. Fakat Fe-SOD kloroplastlarda yerlemitir (Halliwell ve Gutteridge, 1999).

1.6. Projenin Yeri Ve nemi

Serbest radikaller; hcrelerde elektron transfer reaksiyonlaryla meydana gelebildii gibi, radyasyon, alkol ve uyuturucular, hava kirlilii yapan fotokimyasal maddeler, pestisitler, sigara duman, anestezikler v.b. nedenlerle oluabilmektedirler. Doal endojen enzim olan speroksit dismutaz enzimi, hcrelerdeki speroksit radikallerinin H2O2e dntrlmesinden sorumludur. Bu almada insan eritrositlerinden Cu-Zn SOD enzimi saflatrlm, saflatrlm enzim direkt olarak Cyprodinil ve Fludioxonil pestisitleri ile etkiletirilmitir. Enzim aktivitesi

incelenmitir. Ayrca enzimin kinetik parametreleride belirlenmitir.

31

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

2. NCEK ALIMALAR

Bartkowiak ve ark. (1979), domuz karacier ve eritrositlerinden SODn saflatrma koullarn tespit etmilerdir. ki dokudan alnan enzimlerin elektroforetik hareketliliini, pI deerini, amino asit bileimlerini, spektrofotometrik grafiklerini incelemilerdir. Enzimin ayrma artlarn aratrmlar ve her iki dokudan elde edilen SODlerin alt nitelerinin molekl arlnn yaklak 16 000 dalton olduunu bulmulardr. Enzimin aktivitesi zerine snn ve pHn etkisini test etmilerdir. ki enzimin bal olarak termokararllk gsterdiini belirtmilerdir. Inouye ve ark. (1985), sr eritrositlerinden Cu-Zn SODnin (E.C.1.15.1.1) saflatrlmas iin etkili bir metod gelitirmilerdir. Aseton ile ktrlm homojenat 20 mM tris HCl tamponunda (pH=7,5) zmler ve yksek performansl iyon deitirici, TSK-GEL DEAE-5PW kolonuna uygulamlardr. TSK-GEL DEAE-5PWyi kullanarak kk miktarlardaki yabanc proteinleri uzaklatrmlar ve byk aplarda saf protein hazrlamlardr. Enzimi, NaCln 0 dan 0,3 Ma deien konsantrasyonuyla ele etmilerdir. Cu-Zn SODnin, SDSPAGEde ve iyon deitirici yksek performansl sv kromatorafisinde tek bant gsterdiini ve 3800 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip olduunu belirtmilerdir. Asano ve ark. (1986), bal olarak basit ve tekrar edilebilir bir ilemi, insan eritrositlerinden katalazn (E.C.1.11.1.6) ve bakr-inko speroksit dismutazn (E.C.1.15.1.1) bakr elat ilgi kromatorafisi ile izolasyonu iin gelitirmilerdir. Bu metodu kullanarak iki enzimi kolaylkla ve katalaz % 23,4 verimle 565 kez; Cu,ZnSODyi %35 verimle 2190 kez saflatrmlardr. Poliakrilamid jel elektroforezi ile yrttklerinde bu enzimlerin homojen olduklarn grmlerdir. SODnin molekler arln 17 000 1000, katalazn molekler arln 240 000 bulmulardr. Weselake ve ark. (1986), Cu-Zn SODyi insan krmz hcrelerinden DEAESefaroz ve bakr elat afinite kromatorafisi kullanarak izole etmilerdir. Enzimin 3400den 3800 nite/mg proteine deien spesifik aktivitesine ulamlardr. SODyi krmz hcre hemolizatndan % 58 verimle, 2000 kez saflatrmlardr.

32

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

SODnin alt nitesinin molekl arln SDS-PAGE ile 18 000-19 000 arasnda bulmulardr. Stepanik ve Ewing (1990), glutatyon peroksidaz, katalaz ve speroksit dismutaz insan eritrositlerinden DEAE-selloz kullanarak saflatrmlardr. Glutatyon peroksidaz, speroksit dismutaz ve katalazdan tiyol-dislfid deitirici kromatorafi ile ayrtrmlar, molekler eleme ve boya-ligand ilgi kromatorafisi ile % 90 homojenlie saflatrmlardr. Katalaz ve speroksit dismutaz birbirinden jel eleme kromatorafisi ile ayrp saflatrmlardr. Katalaz amonyum slfat ktrmesi ile yaklak % 90 orannda saflatrmlardr. Speroksit dismutaz ise ayn homojenlie hidrofobik etkileim kromatorafisi ile saflatrmlardr. 820 ml ykanm eritrositlerden 45 mg SOD ve 232 mg katalaz elde etmilerdir. Kumagai ve ark. (1994), bakr inko speroksit dismutaz (Cu-Zn SOD) sr eritrositlerinden pH kontroll amonyum slfat methanol ekstraksiyonu ile izole etmilerdir. % 90 amonyum slfat doygunluunda paralanm krmz hcre sspansiyonun pHn 5,0a ayarlamlardr. Eit miktardaki methanol eklenmesi ile enzim spesifik aktivitesi 2000 nite/mg protein den daha byk deere ulamtr. DEAE-Selloz kolon kromatografisi kullanlarak yaplan ileri saflatrmada, olduka saflam Cu-Zn SOD, Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (SDS-PAGE) bir tek band gstermitir. Bu ilemi kullanarak 1 litre sr kanndan 4728 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip 14 mg saf Cu-Zn SOD elde etmilerdir. Zhenfei ve ark. (1996), Cu-Zn SODyi bakla tohumlarndan

saflatrmlardr. Enzimi 2852 nite/mg protein spesifik aktivite elde etmiler ve enzimin KCN ve H2O2 tarafndan gl bir ekilde inhibe edildiini bulmulardr. Enzimin pH=5-9da 70 Cye kadar kararl olduunu, molekl arlnn 31 kDa ve alt nitesinin 14 kDa olduunu belirtmilerdir. Suwalsky ve ark. (1997), heptaklorun, su yaam iin zehirli olan bir organoklorlu pestisit olduunu belirtmilerdir. Bu pestisitin bebekler iin anlaml kaynann anne st olduunu belirtmilerdir. Heptaklorun lipofilik karakterinden dolay, lipidce zengin hcre zarlarnn pestisidin etkileimi iin olas hedefler olduunu belirtmilerdir. Pestisidin krmz hcrelerle etkileimini aratrmak iin,

33

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

heptakloru insan eritrositleri ve krmz hcre zarlarnn molekler modelleriyle etkiletirmilerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC)in ve dimiristil fosfatidil etanolamin (DMPE)in oklu tabakalarndan olutuunu belirtmilerdir. Bunlarn srasyla eritrosit zarlarnn d ve i tabakasnda yerlemi fosfolipid eitleri olduklarn belirtmilerdir. Elektron mikroskobu ile yaptklar taramada, 10 mM heptaklorun eritrositlerde ekil deiiklii yaptn belirtmilerdir. te yandan X-nlar krnm ile DMPC ve DMPE zerine yaptklar deneylerde, heptaklor ile DMPC tabaka yapsnn DMPE tabaka yapsndan daha ok etkilendiini gzlemlemilerdir. Floresans spektroskopisi ile DMPC zerine yaptklar lmler, X-nlar krnm sonularn kuvvetlendirmitir. DMPCnin hidrokarbon zincirinin ve polar ba blgelerinin heptaklor tarafndan bozulduunu belirtmilerdir. Suwalsky ve ark. (1998), Lindanenin d parazitlenme ve bitlenmeye kar veterinerlik ve insan ilalarnda genie kullanlan organoklorlu pestisit olduunu belirtmilerdir. Lindanenin lipofilik karakterinden dolay, lipidce zengin hcre

zarlarnn pestisidin etkileimi iin olas hedefler olduunu belirtmilerdir. Lindanenin krmz hcrelerle etkileimini aratrmak iin, lindaneyi insan eritrositleri ve krmz hcre zarlarnn molekler modelleriyle etkiletirmilerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC)in ve dimiristil fosfatidil etanolamin (DMPE)in tabakalarndan olutuunu belirtmilerdir. Bunlarn srasyla eritrosit zarlarnn d ve i tabakasnda yerlemi fosfolipid eitleri olduklarn belirtmilerdir. Floresans spektroskopisi ile yaptklar deneylerde lindanenin DMPC ile etkiletiini gstermilerdir. Bu sonular X-n krnm ile dorulamlardr. Bununla beraber DMPE tabakasnda daha byk bozulmalar gzlemlemilerdir. Elektron mikroskobu ile, lindane ile etkiletirilen insan eritrositlerinin disk eklinin bozulduunu gstermilerdir. ift tabaka hipotezine gre, bu sonular ile, eritrosit zarnn i tabakasna lindanenin girdiini gstermilerdir. Buradan pestisitin toksik etkisinin, pestisitin hcre zarnn lipid ksm ile etkileim kapasitesi ile ilgili olduu sonucunu karmlardr. Tarhan ve Tuzmen (2000), speroksit dismutaz koyun eritrositlerinden izole etmilerdir. SOD aktivitesini, optimize edilmi deney koullar altnda 6hidroksidopamin (6-OHDA)in otooksitlenme hzndaki deiimi ile incelemilerdir.

34

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

Enzimin Cu ve Zn ierdiini, kloroform-etanol karmna duyarl olmadn, siyanr ve hidrojen peroksit ile inhibe edildiini bulmulardr. Koyun eritrosit Cu-Zn SODsi iin optimum pH 9,4; optimum scakl 30C olarak belirtmilerdir. Enzimin 2,5 saat inkbasyonla ntral pHda 37 Cye kadar termal kararllk gsterdiini belirtmilerdir. melekolu ve ark. (2000), el ili ve evresi tarm alanlarnda alan (16,52 6,92 yl) ve pestisitlerin kronik etkisine maruz kalan tarm iilerinden (n=40) kan rneklerini almlar ve bu rneklerden elde edilen eritrositlerde antioksidan savunma enzimlerinden speroksit dismutaz (SOD) ve katalaz(CAT) aktivitelerini spektrofotometrik olarak lmlerdir. Ayn lmleri pestisitlere dorudan maruz kalmayan kiilerdede yapmlardr (n=30). Tarm iilerinde eritrosit SOD dzeyini kontrol grubuna oranla daha yksek bulurken (p<0,001), CAT aktivitesinde anlaml bir azalma gzlemlemilerdir (p<0,001). zdem ve ark. (2000), bu alma ile 4-klorofenoksiasetik asit ile ykadklar domates homojenatlarnn antioksidan enzimler olan glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, katalaz, selenyum bal glutatyon peroksidaz ve Cu-Zn speroksit dismutaz zerine olan etkilerini incelemilerdir. Domatesleri, sprey kullanarak 1, 10, 20 ppm 4klorofenoksiasetik asit ile ykamlardr. 1 veya 10 ppm 4-klorofenoksiasetik asit ykadklar domates homojenatlarn 1 ml/100 g vcut arl dozunda farelere rnga ile verdiklerinde, fare eritrosit antioksidan enzimlerinde belirgin bir deime grmemilerdir. Fakat 20 ppm 4-klorofenoksiasetik asit ykadklar domates homojenatlarn ayn dozda verdiklerinde, selenyum bal glutatyon peroksidaz aktivitesinde belirgin azalma (p<0,05), katalaz aktivitesinde artma (p<0,05) grrken, glukoz-6-fosfat dehidrojenaz ve Cu-Zn speroksit dismutaz aktivitesinde belirgin bir deime olmadn kaydetmilerdir. Osatomi ve ark. (2001), Cu-Zn SODyi Japon dil balnn pankreasndan saflatrmlardr. Enzimi, etanol / kloroform muamelesi, aseton ktrmesi ve QSefaroz, S- Sefaroz, Ultrajel AcA 54 kolon kromatorafileri kullanarak saflatrmlardr. ndirgeyici koullar altnda SDS-PAGEde 17,8 kDa molekler arlkta tek bant elde ederken, indirgeyici olmayan koullarda eit miktarlarda 17,8 ve 36 kDa molekler arlkta iki bant elde etmilerdir. Saflatrlm enzimin N-

35

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

terminal amino asit srasn 25 amino asit iin belirlemi ve bu sray dier Cu-Zn SODlerle karlatrmlardr. Kl balndan elde edilen SODde N-terminal alanin artklarnn asetillenmediini belirtmilerdir. 60 Cnin zerinde enzimin termo kararlnn sr Cu-Zn SODsinden daha dk olduunu belirtmilerdir. ztrk ve Tarhan (2001), tavuk karacierinden SODyi saflatrm ve ksmen karakterize etmilerdir. nce karacieri homojenize edip, hemoglobini karmlardr. Takiben protein keleini, (NH4)2SO4, metanol, (NH4)2SO4-metanol ve polietilen glikol ile etkiletirmilerdir. Polietilen glikolu, PD-10 kolonu kullanarak kromatorafi ile uzaklatrmlardr. Enzim aktivitesi olan fraksiyonlar ultrafiltreden geirip, DEAE-iyon kromatorafisi ve Sefhadeks G-75 jel filtrasyon kromatorafisi ile % 7,3lk verimle 286 kez saflatrmlardr. 4818,2 U/mg spesifik aktivitesine ulamlardr. Enzimin her biri 16.000 500 molekler arlna sahip, Cu ve Zn ieren iki alt niteye sahip olduunu belirtmilerdir. SODnin, DTT ve merkaptoetanol ile inhibe edilmediini CN- ve H2O2 ile inhibe edildiini belirtmilerdir. Ayrca SODnin 2 mM iyodoasetamid ile % 40 aktivite kaybettiini gzlemlemilerdir. Aydemir ve Tarhan (2001), SODyi tavuk eritrositlerinden saflatrm ve ksmen karakterize etmilerdir. Eritrosit membranlarn Triton X-100n varlnda dondurup-zme metodu ile paralamlardr. Etanol ktrmesinden sonra, SOD ieren zeltiyi DEAE-Selloz ve ardndan Sephadex G-100 jel kolonlarna uygulamlardr. Tavuk eritrosit SODsini % 26 verimle 508 kez saflatrmlardr. 8 480 U/mg spesifik aktivitesine ulamlardr. Molekler arl jel filtrasyon ile 30,6 0,4 kDa olarak bulmulardr. Enzimin yksek termal kararlla sahip olduunu belirtmilerdir. Hidayat ve ark. (2003), emlsiyon tekniini kullanarak almina

paracklarn agaroz ile kaplayarak yksek younluklu destek hazrlamlardr. minodiasetik asit ve Cibacron Mavi 3 GAy destek zerine immobilize etmilerdir. Bu destei inko ile yklyerek maya alkol dehidrojenaznn saflatrlmas iin kullanl bir kromatorafi destei elde etmilerdir. Enzimin yksek geri kazanmn ve yksek saflatrma faktrn elde etmek iin elsyon stratejisini aratrmlardr. 0,5 M NaCl ieren 4 mM EDTA kullanarak bir basamakta elsyon ile % 66 enzim

36

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

geri kazanm ve 4,7 saflatrma faktr elde etmilerdir. NaCl ieren imidazol kullanarak 2 basamakta elsyon ile daha yksek saflatrma faktr elde etmilerdir. 1 M NaCl ieren 5 mM imidazol kullanarak ilk basamakta elsyon ile enzimi iermeyen dier proteinlerin ounu serbest brakmlardr. kinci basamakta 1,5 M NaCl ieren 150 mM imidazol kullanarak yaplan elsyonda % 40,7 enzim geri kazanm ile 6,5 saflatrma faktr elde etmilerdir. Altuntas ve ark. (2003), organofosfat tarafndan retilen reaktif oksijen trlerinin (ROS) eitli pestisitlerin toksitesine yol atn belirtmilerdir. Bu almada, in vitro koullarda, organofosfat insektisit fosalonun lipid

peroksidasyonu (LPO) ve antioksidan savunma sistemine nasl etki ettii aratrlmtr. Bu amala fosalonun eitli dozlarn LPO, speroksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-PX) ve katalaz (CAT) aktivitesi zerine etkisini eritrositlerde almlardr. Her fosalon dozunu, daha nceden hazrlanm eritrosit rnekleriyle + 4 Cde 0, 60, 180 dakika inkbe etmilerdir. nkbasyondan sonra, malondialdehid (MDA) dzeyini, SOD, GSH-PX, CAT aktivitesini belirlemilerdir. Fosalonun MDA oluumunda art ve SOD, GSH-PX, CAT aktivitesinde azalma meydana getirdiini belirtmilerdir. Bukowska (2003), insan eritrositlerine, 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) ve 2,4-diklorofenoln (2,4-DCP) farkl konsantrasyonlarnn etkisini in vitro

koullarda incelemilerdir. Speroksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSHPX) aktivitesini ve indirgenmi glutatyonun (GSH) dzeyini belirlemilerdir. Eritrosit SOD aktivitesinin artan 2,4-D ve 2,4-DCP dozu ile azaldn buna karn GSH-PX aktivitesinin arttn belirtmilerdir. 500 ppm 2,4-Dnin eritrositlerdeki indirgenmi glutatyonun dzeyini % 18 azalttn ve 250 ppm 2,4-DCPnin ise indirgenmi glutatyonun dzeyini % 32 azalttn belirtmilerdir. Lie ve ark. (2004), amonyum slfat ile ktrp, DEAE-Sefaroz iyon deitirici ve Sephacryl S-200 jel filtrasyon kromatorafisi ile italyan ii arsndan SODyi 53,05 U/mg protein spesifik aktivitesi ile 104 kez saflatrmlardr. Elde edilen enzim SDS-PAGEde tek band gstermitir. Scakln SOD aktivitesi zerine etkisini incelemi ve enzimin olduka kararl olduunu bulmulardr. Cu. Zn, Fe ve Mn ieriini almlar ve enzimin Cu, Zn ierdiini bulmulardr. Dairesel

37

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

dikroizm spektrumunu aratrmlar ve proteinin % 26,1 -heliks, % 53,8 -tabaka ve % 22,0 rastgele halka ierdiini bulmulardr. SODnin izoelektrik odaklanmas ile enzimin zincir ii dislfid ba ierdiini gstermilerdir. Amino asit bileimini aratrmlar ve enzimin 402 amino asit ierdiini bulmulardr. Enzimin greceli olarak yksek miktarda aspartik asit, glisin, lsin, alanin, glutamik asit ve valin ierdiini bulmulardr. renin enzimi inhibe ettiini, ultraviyole absorpsiyonunda deime yaptn ve floresans emisyonunda azalma meydana getirdiini bulmulardr. DTTnin enzim aktivitesinde deime, ultraviyole absorpsiyonunda artma, floresans emisyonunda azalma meydana getirdiini bulmulardr. Sivaprakasam ve ark. (2004), Speroksit dismutaz amonyum slfat fraksiyonlamas, jel szme ve iyon deiim kromatorafisi kullanarak guavann ham yeil meyvelerinden % 47 geri kazanm ile saflatrmlardr. Saflatrlm enzimin 40 kDa molekler arlna sahip olduunu ve 20 kDaluk iki eit alt niteye sahip olduunu belirtmilerdir. Enzimi pH=7,8de maksimum aktivite gstermesi iin 45 dakika a maruz brakmlardr. Tipik Michaelis-Menten kinetii

gzlemlemilerdir. Nitrobenzen tetrazolium ve riboflavin substratlar iin Km deerlerini srasyla 15 ve 2,3 mM bulmulardr. Enzimin 40Cye kadar kararl olduunu ve % 76 inhibisyona kadar nitroblue tetrazoliumun inhibisyonunda dorusal art gzlemlemilerdir. Mg2+nin enzim aktivitesini % 48 arttrdn, Mn+2nn aktiviteyi % 55 inhibe ettiini, Cu2+, Co2+ ve Ca2+ iyonlarnn aktivite zerinde hibir etkiye sahip olmadn belirtmilerdir. KCN, H2O2 ve NaN3 in enzimi srasyla % 36, % 71 ve % 33 inhibe ettiini bulmulardr. Bununla birlikte SDS, kloroform:etanol (1:1) karmnn, -merkaptoetanoln aktivite zerinde herhangi bir etki gstermediini belirtmilerdir. Seatovic ve ark. (2004), Speroksit dismutaz Srbistann termal kaplca sularnda bulunan Thermotrix sp.dan saflatrmlardr. SODyi hcre ekstrakndan amonyum slfat ktrmesi, Sefhadeks G 75 Jel Eleme Kromatorafisi ve QAESefhadeks iyon deiim kromatorafisi ile saflatrmlardr. Saflatrlm enzimin spesifik aktivitesini 9191 U/mg protein bulmulardr. Saflatrlm enzimi analiz etmiler ve ksmen karakterize etmilerdir. Enzimin molekl arln, jel kromatorafisi ile 37 kDa bulmulardr. SDS-PAGE ile enzimin iki eit alt niteden

38

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

olutuunu belirtmilerdir. zoelektrik noktasn, izoelektrik odaklama ile 5,3 olarak bulmulardr. Enzim aktivitesinin optimum pHn 8-10 dzeyinde bulmulardr. SOD aktivitesi iin optimum scakl 60 C olarak bulmulardr. 40, 50, 60 Cde bir saat inkbasyonla SOD aktivitesinin artn belirtmilerdir. Fakat 80 Cde SODnin denatre olduunu belirtmilerdir. 25 Cde 24 saat inkbasyonla SOD aktivitesinde hafife azalma olduunu belirtmilerdir. Ren ve ark. (2004), immobilize bakr (II) ilgi kromatorafisini, proteinlerin paralanmasndan oluan histidin ieren peptidlerin seimi ile rnek karmn sadeletirmek iin organizma ierisindeki btn proteinleri izole etmek iin kullanmlardr. Bu almada, histidin ieren peptidleri tek basamakta tutuklanp salverilmesinde iminodiasetik asiti (IDA) duraan faz olarak kullanan 4 farkl destein spesifikliini aratrmlardr. Yksek Tutuklayc elatlatrc HP (agaroz), TSK elat-5PW ve Gzenekli 20 MCnin ticari olarak mevcut olduunu belirtmilerdir. IDAy ayn zamanda CIM diskleri (gliysidilmetakrilat-etilen dimetakrilat) zerine immobilize etmilerdir. Bu destekleri deerlendirmek iin transferin ve -galaktozidazn paralanm rneklerini kullanmlardr. TSK elat5PWnin histidin ieren peptidleri balayan en gl destek olduunu Gzenekli destein ise yksek spesifik olmayan balanmalara sahip olduunu belirtmilerdir. Agaroz temelli kolonun ise bal olarak yksek spesifiklie ve seicilie sahip olduunu belirtmilerdir. Zunsheng ve ark. (2005), Cordyceps Militaristen Cu-Zn SOD retmilerdir. Cu-Zn SODnin kltr szntsnde var olduunu ve protein oran olarak hcreleraras Cu-Zn SOD aktivitesinin, kltrn byme devresinde yksek olduunu belirtmilerdir. Cu2+, Zn2+, Mn2+ ve Fe2+nin enzim biyosentezi zerine etkisini aratrmlardr. Cu-Zn SODyi Cordyceps Militaristen izole etmiler ve ksmen karakterize etmilerdir. Saflatrmay (NH4)2SO4 ktrmesi, DEAE-Sefaroz hzl akan anyon deiim kromatorafisi, CM-650 katyon deiim kromatorafisi ve sefhadeks G-100 jel szme kromatorafisi olmak zere 4 basamakta gerekletirmilerdir. Saflatrlm enzimin 35070 400 Da molekler arlna sahip olduunu ve her biri bir Cu, Zn elementine sahip iki eit alt niteden olutuunu belirtmilerdir. Saflatrlm enzimin izoelektrik noktasn 7,0 olarak

39

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

bulmulardr. Saflatrlm enzimin N-terminal amino asit dizisini 12 amino asit iin belirlemiler ve bu diziyi dier Cu-Zn SODlerinkiyle karlatrmlardr. Optimum pHI 8,2-8,8 olarak bulmulardr. Saflatrlm enzimin pH 5,8-9,8de kararl kaldn ve pH 7,8de 25 Cden 50 Cye kadar 1,5 saat inkbasyonla yine kararl kaldn belirtmilerdir. Saflatrlm enzimin H2O2 ve KCNe duyarl olduunu bulmulardr. Saflatrlm enzim zerine 2,5 mM NaN3, PMSF, Triton x-100, merkaptoetanol ve DTTnin 5 saat inkbasyonu ile herhangi bir inhibisyon etkisininin olmadn bildirmilerdir. Vyas ve Kumar (2005), kn yetien ay filizlerinden mangan ieren speroksit dismutaz saflatrmlardr. Enzimi amonyum slfat ktrmesi, DEAEselloz kolon kromatorafisi ve HPLC sistemi ile silika temelli molekler dlama kromatorafisi ile saflatrmlardr. 51 kez saflatrma yapmlar ve 56,66 U/mg protein spesifik aktiviteye ulamlardr. Denatre PAGE ile tek band elde etmilerdir. Enzimin 169 kDa molekler arlna sahip olduunu belirtmilerdir. Buna karn SDS-PAGE ile monomer arln 43 kDa bulmulardr. Bylece enzimin homotetramer olduunu nermilerdir. Saflatrlm enzim iin optimum pHI 8,0 olarak bulmulardr. Optimum scakl ise 0 C olarak bulmulardr. Enzimin geni bir scaklk aralnda aktivite gsterdiini belirtmilerdir. Mavi ve ark. (2006), baz ilalarn, insan eritrosit ve lkosit hcrelerindeki speroksit dismutaz enzim aktivitesi zerine inhibisyon ve aktivasyon etkilerini incelemilerdir. lkin, Cu-Zn SOD enzimini insan eritrositlerinden, hemoglobini uzaklatrmak iin etanol-kloroform ile etkiletirmiler, ardndan iyon deiim kromatorafisi (DEAE-Sefaroz) ve bakr elat ilgi kromatorafisi tekniklerini kullanarak % 12 verimle 837 kez saflatrmlardr. 1085 U/mg prot. spesifik aktivitesine ulamlardr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arln 18 900 bulmulardr. 14 ilacn Cu-Zn SOD zerine inhibisyon veya aktivasyon etkisini aratrmlardr. 5-florourasil dnda hi bir ila enzim zerine etki yapmamtr. 5florourasilin 3,33 mg/ml ve 4 mg/ml konsantrasyonlar enzim zerinde srasyla % 33 ve %32 aktivasyon salamtr. Lkositleri, salkl insan kanndan izole etmiler, sv azot ierisinde paralamlar ve 5-florourasilin SOD aktivitesi zerine etkisini

40

2. NCEK ALIMALAR

Hasan KARADA

incelemilerdir. 5-florourasilin 2 mg/ml ve 4 mg/ml konsantrasyonlar total lkosit SOD aktivitesi zerine srasyla % 42 ve % 62 inhibisyon gstermitir. Wedge ve ark. (2007), Hammond aratrma merkezi, 16 fungisid uygulamasn, 2002, 2003 ve 2005 meyve verme mevsiminde, Louisiana ve Mississippide, ilek meyva hastalnn kontrol iin sonulandrmtr. Hasatta en sk grlen meyva kflerinin, Colletotrichum acutatumun sebep olduu anthracnose meyva kf, Gnomonia comarinin sebep olduu gvde kf ve Botrytis cinereann sebep olduu, Botrytis meyva kf olduunu belirtmilerdir. Bu denemelerde fungisidlerin ilek meyva kf hastalnn kontrol iin etkili olduunu

gzlemlemilerdir. Ticari fungisid bileimlerinin ise sk sk daha etkili olduklarn belirlemilerdir. Yaptklar en az iki denemede, fungisid uygulamam kontrollerle karlatrdklarnda, pyraclostrobin+boscalid, cyprodinil+fludioxonil, azoxystrobin, fenhexamid+captan ve captan ile muamele ettikleri ileklerde toplam meyva kfn daha az bulmulardr. Cyprodinil+fludioxonil, fenhexamid, fenhexamid+captan, pyraclostrobin+boscalid, captan, pyrimethanil ve azoxystrobin ile muamele ettikleri ileklerde Botrytis meyva kfne en az rastlamlardr.

41

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

3.1.1. Kimyasallar

Ksantin EDTA Nitro Blue Tetrazolium Na2CO3 Sr Serum Albumin Ksantin Oksidaz (NH4)2SO4 CuCl2.2 H2O NaOH CuSO4.5 H2O Tri Sodyum Sitrat. 2 H2O Folin Ciocalteu NaCl AgNO3 DEAE-Selloz K2HPO4 KH2PO4 minodiasetik Asit-Agaroz KI Tris Baz Tris Asit Akrilamid NN-Bis-Methylene-Akrilamid SDS Gliserol

42

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Bromofenol Mavisi -Merkaptoetanol Glisin Amonyum Perslfat Coomassie Brilliant Blue R-250 Metanol Asetik Asit Ovalbumin -Chymotrypsin Sitokrom C Cyprodinil Fludioxonil

3.1.2. Kullanlan Cihazlar

UV-Vis Spektrofotometre (UNICAM) pH Metre (Hana 8417) Elektroforez (Bio Rad) Magnetik Kartrc (Are) Girdap Kartrc (Velp Scientifica) Kromatorafi Kolonlar Su trompu Santrifj (Jouan MR 23i) Kriyostat (Poly Science) Etv (ES 500) Otomatik Pipet (Eppendorf) Elektrikli Terazi (Sartorius) Deriikletirici (Christ AVC 2-18)

43

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

3.2. Metod

3.2.1. Enzimin Saflatrlmas

3.2.1.1. Hemoliz, Diyaliz Ve Santrifjleme

almada

sitrat-fosfat-dekstroz

zeltisi

iine

alnan

insan

kan

kullanlmtr. Eritrositler, dk hzlarda 10 dakika, 3000 r.p.mde santrifjlenip, serum fizyolojik ile ykanmtr. Ardndan 40 ml eritrosit alnp, zerine 4 Cdeki saf su eklenerek 100 mlye getirilip, hemoliz edilmitir. Hemolizat diyaliz keselerine konulup saf suya kar diyaliz edilmitir. Keselerden kan Cl-, 0,1 M AgNO3 ile test edilmitir. Cl- keseden kana kadar diyaliz edilmitir. Diyaliz edilmi hemolizat rnei 10 000 r.p.mde 20 dakika santrifj edilmitir. Supernatanlar toplanmtr.

3.2.1.2. DEAE-Selloz Kromatorafisi

25 g DEAE-selloz tartlp, 400 ml 1,5 mM pH=6.8 fosfat tamponunda dengeye getirilmitir. Trompta szlp, yine ayn tampon ile ykanmtr. DEAEselloz, 400 ml 1,5 mM pH=6,8 fosfat tamponuunda tekrar dengeye getirilip, toplanan spernatanlar (98 ml hemolizat) ilave edilmitir. Oda scaklnda 1 saat magnetik kartrcda kartrlp, 4 Cde bir gece bekletilmitir. Bu sre ierisinde speroksit dismutaz, DEAE-selloz zerine adsorbe olmutur. DEAE-selloz-enzim kelei 2,6 10,5 cmlik kolona doldurulmutur. Yani 56,2 mllik kelek elde edilmitir. Kolon balang tamponu ile ykanarak, hemoglobinin ou uzaklatrlmtr. Speroksit dismutaz, DEAE-sellozdan 20 mM pH=6.8 fosfat tamponu kullanlarak ele edilmitir. 3,1 ml/dakikalk ak hz ile 10 mllik fraksiyonlar toplanmtr. Aktivitesi yksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmtr (Asano ve ark, 1986).

44

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

3.2.1.3. Bakr-minodiasetik Asit-Agaroz Kromatorafisi minodiasetik 2,3 4,4

asit-agaroz

sspansiyonu

cmlik

kolona

doldurulmutur. Yani 18,2 mllik jel elde edilmitir. Kolon 3 yatak hacmi saf su ile ardndan 3 yatak hacmi 1 mg/ml CuSO4.5 H2O ile yklenmitir. Kolon 5 yatak hacmi kromatorafi tamponu (500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu) ile ykanmtr (Bollag ve ark, 1996). Cu2+ nin jelden ayrlp ayrlmad 3 M KI ile test edilmitir. Enzim zeltisi, kromatorafi tamponu ile 1:1 orannda seyreltilmitir. 10 ml enzim zeltisi Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yklenmitir. Kolona kromatorafi tamponundan 20 ml eklenip, kolonun altndan 2 mllik fraksiyonlar toplanmtr. Bu ilemden sonra speroksit dismutaz 500 mM NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 ile ele edilmitir (Asano ve ark, 1986). 1 ml/dakikalk ak hz ile 2 mllik fraksiyonlar toplanmtr. Aktivitesi yksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmtr.

3.2.2. Speroksit Dismutaz Tayini

3.2.2.1. Prensip

SOD, oksidatif enerji retimi srasnda oluan toksik speroksit radikallerinin (O2 -) hidrojen peroksit ve molekler oksijene dismutasyonunu hzlandrr. Bu yntem, ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) kullanlarak oluturulan speroksit radikallerinin (1), nitro blue tetrazolium (N.B.T) ile meydana getirdii mavi renkli formazan boyasnn 560 nm dalga boyunda verdii optik dansititenin (OD) okunmas esasna dayanmaktadr. rnekte bulunan SOD, speroksit radikallerini ortamdan uzaklatrarak 2 numaral formazan reaksiyonunu inhibe eder. SODnin bir nitesi deneme koullar altnda N.B.T indirgenme hznn % 50 inhibisiyonudur (Sun ve ark, 1988).

45

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Ksantin XOD rik asid + O2 - (1) N.B.T.+ O2 - formazan boyas (2) O2 - + O2 + 2H+ SOD O2 + H2O2 (3)

3.2.2.2. Aktivite lm

Reaktif: 1. Ksantin* (0,3 mM) 9,13mg 2. EDTA (0,6 mM ) 22,3 mg 3. N.B.T. (150 g/L) 12,3 mg 4. Na2CO3 (400 mM) 2,544g 5. Sr serum (1g/L) 30 mg 200 ml saf suda zlr. 100 ml saf suda zlr. 100 ml saf suda zlr. 60 ml saf suda zlr. 30ml saf suda zlr.

- Ksantin oksidaz (167 u/L) enziminden 18 l alnp , 3 ml 2 M (NH4)2SO4 da zlr; - 2 M (NH4)2SO4 2,643 g - CuCl2.2H2O (0,8 mM) 13,6 mg Kr Reaktif Numune Ksantin oksidaz (XOD) 2,85 ml (1425 L) ----------50 L (25 L) 10 mlye saf su ile tamamlanr. 100 mlye saf su ile tamamlanr. Numune 2,85 ml (1425 L) 0,1 ml (50 L) 50 L (25 L)

25C de oda scaklnda 20 dakika beklet 0,1 ml (50 L) 0,1 ml (50 L) 0,1 ml (50 L) --------

CuCl2 Numune

560 nm de destile suya kar okunur Kr OD Numune OD x 20 U/ml SOD Kr OD

46

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

*nce birka damla 1N NaOH de zlr. Ksantin oksidaz iyice kartrlmaldr.

3.2.3. Protein Tayini

Protein tayini metodu Lowry ve ark (1951), tarafndan nerilen ynteme gre yaplmtr. Protein tayini iin aada ierikleri bildirilen A, B ve C zeltileri hazrlanmtr. 1)zelti A: Bu zelti 2 g. Na2CO3, 0,1 M NaOH zeltisinde zlerek ve ayn zelti ile son hacim 100 mlye seyreltilerek hazrlanmtr. 2)zelti B: 0,5 g.CuSO4.5H2O, % 1lik tri sodyum sitrat. 2 H2O zeltisinde zlerek son hacim ayn zelti ile 100 mlye tamamlanarak hazrlanmtr. 3)zelti C: 50 ml A zeltisi ile 1 ml B zeltisi kartrlarak hazrlanmtr. (Kullanlaca an hazrlanmasna dikkat edilmitir.) 4)Folin-Ciocalteu zeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:1 orannda seyreltilerek hazrlanmtr. 5)Standart protein zeltisi: 1 mlsinde 0,25 mg. sr albmini olacak ekilde % 0,9luk NaCl (serum fizyolojik ) zeltisiyle hazrlanmtr. 6) Standart protein erisinin izimi; 6 adet deney tp alnarak tplere srasyla standart protein zeltisinden ( 0,25 mg./ml ) 0; 20; 100 ; 200; 500; 1000 l eklenip serum fizyolojik ile 1 mlye tamamlanmtr. Bu tplerin protein deriimleri srasyla 0 ; 0,005 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,125 ; 0,25 mg/mlye karlk gelir. Her tpe 5 ml C zeltisi ilave edilip, 10 dakika oda scaklnda bekletildikten sonra her tpe 1:1 orannda seyreltilmi Folin-Ciocalteu zeltisinden 0,5 ml eklenmitir. 30 dakika oda scaklnda bekletilip tp ieriklerinin absorbanslar kre kar 750 nmde okunmutur. Okunan bu absorbanslar standart protein deriimlerine kar grafie geirilmitir.

47

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Standart protein erisi


0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,05 y = 3,2592x R2 = 0,9891

Adsorbans (A)

0,1

0,15 Deriim (mg/ml)

0,2

0,25

0,3

ekil 3.1. Standart protein grafii.

3.2.4. Pestisit Etkisi

Etil alkol ierisinde zlm cyprodinil ve fludioxonil pestisitleri ile eritrositler ve saflatrlm speroksit dismutaz, oda scaklnda 1 saat etkiletirilerek aktivitedeki deiim incelenmitir.

3.2.5. Optimum Scaklk Enzimin 5-35 C arasndaki scaklklardaki aktiviteleri llerek optimum scaklk belirlenmitir.

3.2.6. Depolama Kararll Enzimin, 5 Cde, pH=6,8 fosfat tamponu , % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserol ve 20 Cde % 50 gliseroldeki 28 gne kadar aktivitedeki deiim incelenmitir.

48

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

3.2.7. Molekler Arlk tayini

Laemmli (1970), tarafndan bildirilen yntem kullanlmtr.

3.2.7.1. Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

Stok zeltiler Ve Tamponlar

1.Akrilamid/Bis akrilamid (% 30 T, % 2,67 C) 29,2 g akrilamid 0,8 g NN-bis-methylene-akrilamid deiyonize suda zlp 100 mlye tamamlanr.Szlp, 4Cde karanlkta saklanr. 2. % 10 (w/v) SDS 10 g SDS, 90 ml deiyonize suda zlp, hafife alkalanp, 100 mlye tamamlanr. 3. 1,5 M Tris-HCl, pH=8,8 15,125 g tris baz 3,94 g tris asit zlp pHna baklr pH=8,8e asit yada baz ile ayarlanr, 100 mlye saf su ile tamamlanr, 4Cde saklanr. 4. 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8 0,291 g tris baz 7,502 g tris asit zlp pHna baklr pH=6,8e asit yada baz ile ayarlanr, 100 mlye saf su ile tamamlanr, 4Cde saklanr. 5. rnek Tamponu 3,55 ml deiyonize su 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8 2,5 ml gliserol 2,0 ml % 10 (w/v) SDS + 0,2 ml % 0,5(w/v) bromofenol mavisi 9,5 ml Toplam hacim

49

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Oda scaklnda bekletilir. Kullanl: 25 l -merkaptoetanol kullanlaca zaman 475 l rnek tamponuna eklenir. rnek bu karm ile en az 1:2 orannda seyreltilip 95 Cde 4 dakika stlr. 6. Yrtc Tampon, pH=8,3 3,03 g Tris baz 14,4 g Glisin 1 g SDS zlp 1000 mlye deiyonize su ile tamamlanr. pH asit veya baz ile ayarlanmaz. 4Cde saklanr. kelme gzlenirse, kullanlmadan nce oda scaklna kadar stlr. 7. % 10 APS (taze gnlk) 0,1 g amonyum perslfat 1 ml deiyonize suda zlr. Jelin Hazrlanmas (10 ml) 1. TEMED ve % 10 APS hari tm ayralar kartrlarak monomer zeltisi hazrlanr (izelge 3.1). 15 dakika degaze edilir.

izelge 3.1. % jel konsantrasyonlarna kar eklenmesi gereken maddeler. * Ayrma Jeli (Alt Jel) (%15) Tamponu=1,5 M Tris-HCl, pH=8,8 *Konsantrasyon Jeli (st jel) (%5) Tamponu= 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8
% jel %4 %5 %6 %7 %8 %9 % 10 % 11 % 12 % 13 % 14 % 15 % 16 % 17 Deiyonize su(ml) 6,1 5,7 5,4 5,1 4,7 4,4 4,1 3,7 3,4 3,1 2,7 2,4 2,1 1,7 % 30 akrilamid/bis(ml) 1,3 1,7 2,0 2,3 2,7 3,0 3,3 3,7 4,0 4,3 4,7 5,0 5,3 5,7 Jel Tamponu* (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 % 10 (w/v) SDS(ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

2. Jel dkmeden nce 10 ml monomer zeltisi iin:

50

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Ayrma Jel (Alt Jel) (%15) iin: 50 l % 10 APS 5 l TEMED Konsantrasyon Jel (st jel) (%5) iin: 50 l % 10 APS 10 l TEMED eklenip polimerlemenin balamas iin hafife alkalanr. lk nce alt jel hazrlanarak elektroforez plakalar arasna boaltlr 45 dakika polimerizasyona braklr. Polimerizasyonun hzlanmas iin jelin st ksmna su eklenerek hava ile temas nlenir. Jelleme gerekletikten sonra jelin stndeki su alnr. st jel iin ayralar hazrlanp, alt jel stne dklr. Elektroforez tara st jel polimerlemeden yerletirilir. Elektroforez tara ile monomer zeltisi arasnda hava kabarc kalmamasna dikkat edilir. 45 dakika polimerizasyona braklr. Polimerlemeden sonra tarak jelden dikkatlice karlr. Kuyucuklar oluur. rneklerden 10 l (20 g protein) eppendorf tplerine alnp zerine 20 l merkaptoetanol, rnek tamponu eklenip, 95 Cde 4 dakika stlr. Elektroforez plakalar karlp, jel kasetinin ierisine yerletirilip, tankn iine konur. Eppendrof tplerindeki rnekler, kuyucuklara konulur. Jel kasetinin iine ve dna yrtc tampon eklenir. Elektroforez cihaz, 200 Va ayarlanp elektroforeze balanr. Bromofenol mavisi jelin sonuna geldiinde akm kesilir. SDS-PAGE iin elektroforez yaklak 35 dakika srer. Jel kasetinin iinden elektroforez plakalar karlr. Cam plakalardan k karlr. Jel, byk cam plaka ile birlikte boyama zeltisine konur. Boyama zeltisi (Coomassie Blue): % 0,05 (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250nin % 45 metanol (v/v), % 45 destile su (v/v), % 10 asetik asit (v/v) karmndan hazrlanr. Boyama iin gerekli sre, jelin kalnl ve poliakrilamit konsantrasyonuna baldr. % 10 T deerinde bir jelin (0,5-1 mm kalnlkta) yaklak 2 saat boyanmas gerekirken, daha kaln ve/veya daha konsantre jeller iin boyama sresi artrlmaldr. Boyanan proteinler artma (destaining) zeltisine alnr. Artma zeltisi % 45 metanol (v/v), % 45 destile su (v/v), % 10 asetik asit (v/v) karmndan hazrlanr. Boyann geri alnma ilemi 24 saat srebilir.

51

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Artma zeltisinin birka kez deitirilmesi ile bu ilem hzlandrlabilir. Artma zeltisinden karlan jel, % 10 gliserol zeltisinde bekletilir.

3.2.8. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn (Vmax) Grafiksel Yntemle Belirlenmesi

Sabit

konsantrasyondaki

pek

ok

enzimin

reaksiyon

hz

substrat

konsantrasyonuna bal olarak artmaktadr. Eer enzimin reaksiyon hz (V), substrat konsantrasyonuna [S] kar grafie geirilirse ekil 3.2.de olduu gibi hiperbolik

bir eri ortaya kar. 1913 ylnda Leonard MICHAELIS ve Malid MENTEN bu hiperbolik erinin matematiksel olarak nasl ifade edileceini bir formle balamlardr (Rawn,1989). V max [S ] Km + [S ]

V=

(3.1)

Vmax = Doygun substrat konsantrasyonunda enzimin ulaabilecei maksimum hz. Km = Michaelis-Menten sabiti.
V Vmax

Vmax/2

Km

[S]

ekil 3.2. Michaelis-Menten grafii.

52

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

Michaelis-Menten eitlii bir hiperbolik erinin denklemidir. Vmaxn deerini grafikten tam olarak tespit etmek zordur.Eer Michaelis-Menten eitlii her iki taraf 1e blnrse Lineweaver-Burk eitlii olarak adlandrlan bir doru denklemi elde edilir. 1/[S]ye kar 1/V grafie geirilirse ekil 3.3.de grld gibi Km ve Vmax. deerleri kolaylkla belirlenebilir. Km + [S ] 1 = V V max [S ]

(3.2)

1 Km = V V max

1 1 + [S ] V max

(3.3)

1/V

-1/Km

1/Vmax

1/[S]

ekil 3.3. Lineweaver-Burk grafii.

3.2.9. Aktivasyon Enerjisinin Hesaplanmas 1889 ylnda sveli kimyac S. Arrhenius tarafndan, bir reaksiyon hz (V) ile ortam scakl (T) arasnda; V = A . e - Ea / R.T

(3.4)

53

3. MATERYAL VE METOD

Hasan KARADA

denklemiyle gsterilen bir ilikinin olduu gsterilmitir (Telefoncu,1997). Ea aktivasyon enerjisi, R ideal gaz sabiti, A ise Arrhenius sabitidir. Bu denklemin lni alnp, 1 / T ye kar ln V grafie geirilirse, ordinat eksenini lnA deerinde kesen, eimi Ea/R olan bir doru elde edilir (ekil 3.4).

ln V = -

Ea 1 . + ln A R T

(3.5)

Ayrca T1 ve T2 scaklklarnda elde edilen V1 ve V2 arasnda ise aadaki denklem karlabilir.

ln

V2 Ea T 2 T1 = .( ) V1 R T 1.T 2

(3.6)

ln V ln A

Eim = -

Ea R

1 T ekil 3.4. Aktivasyon enerjisinin bulunmas iin Arrhenius grafii.

54

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

4. BULGULAR VE TARTIMA

4.1. Bulgular 4.1.1. Speroksit Dismutazn Saflatrlmas le lgili Bulgular Materyal ve metod blmnde 3.2.1.1de belirtilen ekilde eritrositler hemoliz ve diyaliz edilmitir. Ardndan santrifjlenip, elde edilen spernatanlar (98 ml), DEAE-Selloz kolonuna yklenmi, 1,5 mM pH=6,8 fosfat tamponu ile ykanmtr. Speroksit dismutaz, DEAE-selloz kolonundan 20 mM pH=6,8 fosfat tamponu kullanlarak ele edilmitir. 50 tpe 10 mllik fraksiyonlar toplanmtr. DEAE-Selloz kolonundan alnan her bir fraksiyonda 280 nmde protein miktar iin, 405 nmde hem grubu iin absorbans deerleri okunmu ve bu deerler ekil 4.1de gsterilmitir.

4,5 4 3,5 Absorbans (A) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 10 20 30 Fraksiyon No 40 50 60 280 nm 405 nm

ekil 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans deerleri. Kolon Boyu: 2,6x10,5 cm Kolondan Ak Hz: 3,1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 1,5 mM pH=6,8 fosfat tamponu Elsyon Tamponu: 20 mM pH=6,8 fosfat tamponu

55

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

DEAE-Selloz kolonundan alnan 10 mllik fraksiyonlarda aktivite ve protein tayin ilemleri materyal ve metod blmnde (3.2.2 ve 3.2.3) anlatld ekilde yaplmtr. U/ml olarak bulunan aktivite deerleri ile birlikte proteinin neden olduu absorbans deerleri ekil 4.2de, U/mg protein olarak ifade edilen spesifik aktivite deerleri ise ekil 4.3de gsterilmitir. Aktivitesi yksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmtr.

250

Aktivite(/ml)

Absorbans,280 nm

4,5 4

200

3,5

Aktivite (U/ml)

150

2,5 2 1,5

100

50

1 0,5

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Fraksiyon No

ekil 4.2. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nmdeki absorbans deerleri.

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 Fraksiyon No

ekil 4.3. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik aktivite deerleri.

Spesifik Aktivite (U/mg)

56

Absorbans

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.1de DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm, 405 nmdeki absorbanslar, protein deriimleri, aktivitesi ve spesifik aktivite deerleri verilmitir. izelge 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite deerleri.
Fraksiyon No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Absorbans 280 nm 0,895 0,884 0,846 3,554 4,180 3,886 3,511 3,798 3,440 3,181 2,641 2,180 1,815 1,562 1,442 1,878 1,801 1,641 2,493 3,241 2,521 1,381 0,896 0,746 0,652 0,611 0,559 0,519 0,499 0,490 0,458 0,422 0,404 0,392 0,377 0,351 0,329 Absorbans 405 nm 2,208 2,212 2,132 3,138 3,446 3,841 3,115 3,273 3,170 3,200 3,100 2,802 2,461 2,195 1,949 1,921 1,857 2,000 2,942 3,148 2,942 2,356 1,208 0,890 0,775 0,704 0,611 0,563 0,528 0,514 0,473 0,434 0,417 0,406 0,387 0,352 0,334 Protein (mg/ml) 1,994 8,975 3,805 2,295 1,669 1,350 1,098 0,782 0,647 0,549 0,460 0,417 0,399 0,365 0,442 0,699 1,105 0,936 0,460 0,227 0,184 0,169 0,159 0,143 0,130 0,129 0,132 0,152 0,107 0,078 0,094 0,087 0,081 0,081 Aktivite (U/ml) 0 0 0 19,57 209,66 235,51 236,53 223,44 203,07 202,08 177,28 162,50 117,16 86,45 69,34 57,88 69,12 81,59 81,31 62,39 31,68 26,09 29,32 32,33 30,08 43,68 37,31 39,16 35,84 35,48 29,39 27,69 26,25 23,28 23,24 36,05 28,79 Spesifik aktivite (U/mg) 0 0 0 9,81 23,36 61,89 103,06 133,88 150,42 184,04 226,70 251,16 213,41 187,93 166,28 145,06 189,37 184,59 116,32 56,46 33,85 56,72 129,16 175,71 177,99 274,72 260,91 301,23 277,83 268,79 193,36 258,78 336,54 247,66 267,13 445,06 355,43

57

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

0,322 0,317 0,313 0,295 0,282 0,275 0,268 0,249 0,238 0,23 0,225 0,215 0,200

0,326 0,321 0,322 0,302 0,285 0,278 0,267 0,246 0,235 0,232 0,241 0,233 0,221

0,067 0,064 0,072 0,063 0,060 0,055 0,052 0,048 0,048 0,049 0,037 0 0

23,18 24,31 25,48 18,24 19,58 16,80 13,20 12,74 8,81 13,68 2,91 0 0

345,97 379,84 353,89 289,52 326,33 305,45 253,85 265,42 183,54 279,18 78,65 0 0

DEAE-Selloz kolonundan alnan yksek aktivite gsteren enzim zeltisi, kromatorafi tamponu (500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu) ile 1:1 orannda seyreltilip, 10 mlsi Cu2+ ile yklenmi iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yklenmitir. Kolonun az alp, kromatorafi tamponundan 20 ml eklenip, alttan 2 mllik fraksiyonlar alnmtr. Bu ilemlerden sonra speroksit dismutaz 500 mM NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 ile ele edilmitir. Cu-iminodiasetik asitagaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans deerleri ekil 4.4de gsterilmitir.

0,35 0,3 Absorbans (A) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 10 20 30 Fraksiyon No 40 50 60 280 nm 405 nm

ekil 4.4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans deerleri. 10 mllik fraksiyona kadar kolon 500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu ile ardndan 500 mM

58

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 ile ykanmtr. Kolon Boyu: 2,3x4,4 cm Kolondan Ak Hz: 1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu Elsyon Tamponu: 500 mM NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 tamponu Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan 2 mllik fraksiyonlarn aktiviteleri llp, 280 nmde verdikleri absorbanslarla grafie geirilmitir (ekil 4.5). Ayrca her fraksiyonun protein ierii belirlendikten sonra spesifik aktiviteler hesaplanp grafie geirilmitir (ekil 4.6).

60 50

Aktivite (/ml)

Absorbans,280 nm

0,35 0,3 Absorbans 0,25 0,2 0,15

Aktivite (U/ml)

40 30 20 10 0

0,1 0,05 0 0 5 10 15 20 Fraksiyon No 25 30 35 40

ekil 4.5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nmdeki absorbans deerleri. 10 mllik fraksiyona kadar kolon 500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu ile ardndan 500 mM NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 ile ykanmtr.

59

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 Fraksiyon No 25 30 35 40

ekil 4.6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik aktivite deerleri. 10 mllik fraksiyona kadar kolon 500 mM NaCl ieren 50 mM pH=7,0 fosfat tamponu ile ardndan 500 mM NaCl ieren 50 mM Tris HCl pH=8,0 ile ykanmtr. izelge 4.2de Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm, 405 nmdeki absorbanslar, protein deriimleri, aktivitesi ve spesifik aktivite deerleri verilmitir.

izelge 4.2. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite deerleri.
Fraksiyon No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Absorbans 280 nm 0,223 0,231 0,321 0,234 0,148 0,166 0,268 0,235 0,100 0,016 0,009 0,007 0,057 0,071 0,008 Absorbans 405 nm 0,068 0,076 0,104 0,071 0,033 0,025 0,040 0,021 0,019 0,016 0,052 0,011 0,011 0,031 0,013 Protein (mg/ml) Aktivite (U/ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Spesifik aktivite (U/mg) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Spesifik Aktivite (U/mg)

60

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

0,046 0,014 0,020 0,039 0,061 0,081 0,088 0,056 0,053 0,055 0,073 0,069 0,073 0,055 0,061 0,053 0,046 0,056 0,064 0,033 0,040 0,029 0,017 0,019 0,040 0,019 0,058 0,059 0,051 0,031 0,028 0,040 0,029 0,028 0,037

0,028 0,021 0,019 0,034 0,023 0,021 0,017 0,015 0,022 0,012 0,009 0,008 0,013 0,018 0,021 0,009 0,015 0,031 0,009 0,016 0,018 0,014 0,006 0,009 0,003 0,026 0,030 0,023 0,020 0,030 0,012 0,007 0,012 0,005 0,012

0,026 0,029 0,033 0,032 0,032 0,031 0,028 0,027 0,028 0,028 0,028 0,027 -

0 0 0 9,88 20,82 45,53 55,23 51,43 42,06 14,26 3,25 4,81 4,98 3,97 3,22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 380,00 717,93 1379,69 1725,94 1607,19 1356,77 509,28 120,37 171,78 177,86 141,78 119,26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan yksek aktivite gsteren proteinler biraraya toplanm, hacim lm, protein tayini, aktivite lm yaplmtr. Saflatrma basamaklar izelge 4.3de gsterilmitir.

61

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.3. Saflatrma tablosu.


Saflatrma Basama Hemolizat Ultrasantrifj DEAESelloz Kolonu Bakr elat Kolonu 532 0,031 16,5 46,74 24866 1507,74 33,8 196,3 380 0,687 261,1 106,77 40573 155,41 55,1 20,2 VT (ml) 100 98 C protein (mg/ml) 95,852 89,593 Toplam protein (mg) 9585,2 8780,1 Aktivite (U/ml) 735,95 747,39 Toplam Aktivite (U) 73595 73244 Spesifik Aktivite (U/mg) 7,68 8,34 Verim (%) 100 99,5 Saflatrma Oran 1 1,1

4.1.2. Speroksit Dismutazn Karakterizasyonu le lgili Bulgular

4.1.2.1. Optimum Scaklk Enzimin 5-35 C arasndaki scaklklardaki aktiviteleri llp, aktivite deerleri izelge 4.4de verilmi, aktivite scaklk grafii ekil 4.7de gsterilmitir.

izelge 4.4. Speroksit dismutazn farkl scaklklarda llen aktivite deerleri.


T (C) 5 10 15 20 25 30 35 Aktivite(U/mg) 1456,3 21,3 1631,3 18,5 1876,3 6,3 1519,3 26,7 697,6 40,4 227,8 55,6 80,4 46,3

izelge 4.4de grld gibi speroksit dismutazn en fazla aktivite gsterdii scaklk (optimum scaklk) 15 C (288 K) olarak belirlenmitir.

62

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 Scaklk (C) 25 30 35 40

ekil 4.7. Speroksit dismutaz iin aktivite-scaklk grafii.

4.1.2.2. Aktivasyon Enerjisinin Ve Denatre Olmaya Balanan Scakln Hesaplanmas

Aktivite (/mg)

278-308 K arasndaki scaklklardaki aktiviteler llp, 1/Tye kar, ln V deerleri izelge 4.5de verilmi, Arrhenius grafii ekil 4.8de gsterilmitir. ekil 4.8deki Arrhenius grafiinden speroksit dismutaz iin 278-288 K arasndaki aktivasyon enerjisi:

Eim= -Ea/R= -2027,4= -Ea/8,314 Ea= 16 856 j/mol Ea= 16,856 kj/mol olarak bulunmutur. Denatre olmaya balanan noktay bulmak iin ise ekil 4.8deki y denklemleri eitlenmitir. Denatre olmaya balanan scaklk 19 C (292 K) olarak hesaplanmtr.

63

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.5. Speroksit dismutazn 1/Tye kar, ln V deerleri.


T (K) 278 283 288 293 298 303 308 V (U/mg prot.) 1456,3 1631,3 1876,3 1519,3 697,6 227,8 80,4 1/T (K)-1 3,60.10-3 3,53.10-3 3,47.10 3,41.10 3,36.10 3,30.10 3,25.10
-3 -3

Ln V (U/mg prot.) 7,28 7,40 7,54 7,33 6,55 5,43 4,39

-3 -3 -3

Ln V( /mg prot.)

9,00 8,00 7,00 6,00 5,00

y = 17915x - 53,715 R2 = 0,9928

y = -2027,4x + 14,571 R2 = 0,9951

4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 3,20E- 3,25E- 3,30E- 3,35E- 3,40E- 3,45E- 3,50E- 3,55E- 3,60E- 3,65E03 03 03 03 03 03 03 03 03 03 1/T(K)

ekil 4.8. Speroksit dismutaz iin Arrhenius grafii.

4.1.2.3. Geri Dnm Says Ve Katalitik Etkinliin Hesaplanmas Geri Dnm Says (Turnover Says): Bir enzim moleklnn (veya tek bir katalitik blgenin) birim zamanda rn haline evirdii substart saysna o enzimin geri dnm says denir. Vmax=5000 U/mg protein iin, geri dnm says (kcat) = 1667 s-1 Km=3.10-3 mM Ksantin iin, Katalitik etkinlik= kcat / Km = 1667 s-1/3.10-3 mM = 555 667 s-1. mM-1 Ksantin-1

64

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

4.1.2.4. Depolama Kararllnn Aratrlmas Enzimin, 5 Cde, pH=6,8 fosfat tamponunda, % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserol ve 20 Cde % 50 gliseroldeki 28 gne kadar aktivitedeki deiim incelenmitir. Bu lmler ile ilgili spesifik aktivite deerleri ve % kalan aktiviteler izelge 4.6da verilmi, ekil 4.9da grafii gsterilmitir. 5 Cde, pH=6,8 fosfat tamponunda bekletilen enzim 14 gn sonra aktivitesini kaybederken, 5 Cde % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserolde bekletilen enzim 28 gn sonra srasya balang aktivitesinin, %78,5 4,1; % 83,8 8,5; % 79,5 6,1ini korumutur. 20 Cde % 50 gliserolde ise bekletilen enzim 28 gn sonra balang aktivitesinin, 93,6 7,6sn korumutur. izelge 4.6. Speroksit dismutazn depolama kararll ile ilgili bulgular.
SPESFK AKTVTELER (/mg) Fosfat GN tamponu, +5C 0 2160,8 76,7 1 3 7 14 21 28 1736,4 47,4 1694,9 0 1094,1 0 57,5 0 0 0 0 0 Fosfat tamponu, +5 C 100 3,5 80,4 2,2 78,4 0 50,6 0 2,7 0 0 0 0 0 % 30 gliserol, +5C 2160,8 76,7 1974,1 60,3 1356,8 136,9 1664,2 80,5 1631,2 130,6 1601 47,1 1695,5 87,5 % 30 gliserol, +5 C 100 3,5 91,4 2,8 62,8 6,3 77 3,7 75,5 6 74,1 2,2 78,5 4,1 % 40 gliserol, +5C 2311,3 321,2 2266,7 102,2 1565,8 75,8 1475,1 104,7 1680 129,6 1810,8 183,9 % 40 gliserol, +5 C 100 3,5 107 14,7 104,9 4,7 72,5 3,5 68,3 4,8 83,8 8,5 77,7 6 2160,8 76,7 % 50 gliserol, +5C 2456,7 230,5 1845,4 184,3 1389,8 68,6 1534,2 75,9 1635,6 98,1 1718,9 130,9 % 50 gliserol, +5 C 100 3,5 113,7 10,7 85,4 8,5 64,3 3,2 71 3,5 79,5 6,1 75,7 4,5 2160,8 76,7 %50 gliserol, -20 C 2160,8 76,7 1948,9 58,8 2263,1 338,3 1846,9 226,8 1881,8 278,3 1882,7 99,2 2022,7 165,2 %50 gliserol, -20 C 100 3,5 90,2 2,7 104,7 15,7 85,5 10,5 87,1 12,9 87,1 4,5 93,6 7,6

% KALAN AKTVTE GN

0 1 3 7 14 21 28

65

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

140 120 % Kalan Aktivite 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 Saklama Zaman (Gn) fosfat tamponu,+5 C % 30 gliserol,+5 C % 40 gliserol,+5 C % 50 gliserol,+5 C %50 gliserol,-20 C

ekil 4.9. Speroksit dismutazn depolama kararll grafii.

4.1.2.5. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn (Vmax) Grafiksel Yntemle Belirlenmesi

Speroksit dismutaz iin farkl substrat (ksantin) deriimlerinde llen aktivite deerleri izelge 4.7de verilmi, ekil 4.10 ve ekil 4.11de ematik olarak gsterilmitir.

izelge 4.7. Speroksit dismutaz iin farkl substrat deriimlerinde llen aktivite deerleri.
[S] mM 4,08.10
-4

V (U/mgprot) 573 93 1013 82 1993 62 2707 116 3539 25 3813 29

1/[S] (mM)-1 2451 980,4 490,2 245,1 98 49

1/ V (U/mg prot.)-1 1,75.10-3 9,87.10-4 5,02.10


-4

1,02.10-3 2,04.10-3 4,08.10-3 1,02.10-2 2,04.10-2

3,69.10-4 2,83.10-4 2,62.10-4

66

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

4500 4000 Aktivite (/mg prot.) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02

Substrat ( mM)

ekil 4.10. Speroksit dismutaz iin Michaelis-Menten grafii.

-1000

2,00E-03 1,80E-03 1,60E-03 1,40E-03 1,20E-03 1,00E-03 8,00E-04 6,00E-04 4,00E-04 2,00E-04 0,00E+00 -500 0

y = 6E-07x + 0,0002 R2 = 0,9873

1/V(/mg prot.)

500

1000 1/S( mM)

1500

2000

2500

3000

ekil 4.11. Speroksit dismutaz iin Lineweaver-Burk grafii. ekil 4.11de grld gibi elde edilen doru 1/V eksenini 0,0002 deerinde,1/[S] eksenini -333,33 deerinde kesmektedir. Bu deerlerden speroksit dismutaz iin Vmax=5000 U.mg-1 prot-1 ve Km=3.10-3 mM Ksantin olarak hesaplanmtr.

67

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

4.1.2.6. Speroksit Dismutazn Molekler Arlnn Tayini

DEAE-Selloz kolonundan ve bakr-iminodiasetik asit agaroz kolunundan geirilerek saflatrlm olan speroksit dismutaz enziminin Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yaplmtr. Ayn artlarda sr albumini (68 000 g/mol), ovalbumin (45 000 g/mol), -Chymotrypsin (25 000 g/mol), sitokrom C (12 500 g/mol)nin elektroforezi yaplmtr. Enzimin elektroforez sonular ekil 4.12de verilmitir.

ekil 4.12. Speroksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonular. 1. Sr albumini (68 000 g/mol), 2. Ovalbumin (45 000 g/mol), 3. -Chymotrypsin (25 000 g/mol), 4. Sitokrom C (12 500 g/mol), 5. merkaptoeteanoll ortamda SOD, 6. -merkaptoeteanolsz ortamda SOD. Standart proteinlerin g hzlarna kar log Molekl arlklar izelge 4.8de verilmi ve grafie geirilerek ekil 4.13. elde edilmitir. izelge 4.8. Standart proteinlerin g hzlarna kar log Molekl arlklar.
Standart protein Sr albumini Ovalbumin -chymotrypsin Sitokrom C Ma 68 000 45 000 25 000 12 500 Rf 0,17 0,31 0,5 0,8 log Ma 4,83 4,65 4,4 4,1

68

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

4,9 4,8 Log Molekl Arl 4,7 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4 0 0,2 0,4 G Hz 0,6

y = -1,1597x + 5,0111 R2 = 0,995

0,8

ekil 4.13. SDS-PAGE jel elektroforezinde standart olarak kullanlan sr albumini, ovalbumin, -Chymotrypsin ve sitokrom cnin molekl arlklarnn logaritmasna kar yrme hzlar. -merkaptoeteanoll ve -merkaptoeteanolsz ortamda speroksit

dismutazn g hz 0,6 olarak llm, bu veriden yararlanlarak molekl arl 20.000 g/mol olarak hesaplanmtr.

4.1.3. Cyprodinil Ve Fludioxonilin Speroksit Dismutaz Aktivitesine Etkisi 4.1.3.1. Cyprodinil le Salatrlm Speroksit Dismutazn Etkileimi

eitli Cyprodinil deriimleri ile saflatrlm enzim etkiletirilerek, enzim aktivitesi llp veriler izelge 4.9da verilmi olup, grafii ekil 4.14de gsterilmitir.

69

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.9. eitli Cyprodinil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz aktivitesi zerine olan etkisi.
Deriim (ppm) 0 10 50 100 250 500 Aktivite (U/mg) 2178 19 1956 17 1866 35 1812 39 1725 58 1660 30

2500 Aktivite (/mg) 2000 1500 1000 500 0 0 100 200 300 Deriim (ppm) 400 500 600

ekil 4.14. Cyprodinil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda aktivite grafii. izelge 4.9daki verilere ve ekil 4.14e bakldnda artan Cyprodinil deriimleri ile saflatrlm enzimin inhibisyona urad saptanmtr. 4.1.3.2. Cyprodinil le Eritrositlerin Etkileimi

0,4 ml eritrosit alnp 1 mlye serum fizyolojik ile tamamlanm, bu zelti ise tekrar serum fizyolojik ile 50 mlye tamamlanmtr. Etil alkol iinde zlm Cyprodinilin farkl deriimleri ile eritrositler oda scaklnda 1 saat etkiletirilmi ve aktivitedeki deiim incelenmi, veriler izelge 4.10da verilmi olup, grafii ekil 4.15de gsterilmitir.

70

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.10. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite deerleri.
Deriim (ppm) 0 10 50 100 250 500 Aktivite (U/mg) 7,85 0,38 6,96 0,04 6,3 0,24 6,37 0,77 5,48 0,3 5,39 0,15

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 100 200 300 Deriim(ppm) 400 500 600

ekil 4.15. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite grafii. izelge 4.10daki verilere ve ekil 4.15e bakldnda artan Cyprodinil deriimleri ile eritrosit speroksit dismutazn inhibisyona urad saptanmtr. 4.1.3.3. Cyprodinilin nhibisyon Tr

Aktivite(/mg)

Yaplan

almalar,

Cyprodinilin

Speroksit

dismutaz

yarmal

(kompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur. Speroksit dismutaz iin farkl substrat deriimlerinde (4,08.10-4 -2,04.10-2 mM) ve farkl Cyprodinil deriimlerinde (50-100 ppm) llen aktivite deerleri izelge 4.11de verilmi, ekil 4.16da grafii izilmitir.

71

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

izelge 4.11. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Cyprodinil deriimlerinde llen aktivite deerleri.
1/S (mM)-1 2451 980,4 490,2 245,1 98 49 1/ V (U/mg prot.)-1 1,75.10-3 9,87.10-4 5,02.10-4 3,69.10 2,83.10 2,62.10
-4 -4 -4

1/ V (50 ppm Cyprodinil) (U/mg prot.)-1 2,02.10-3 1,56.10-3 4,78.10-4 3,45.10 2,50.10 2,34.10
-4 -4 -4

1/ V (100 ppm Cyprodinil) (U/mg prot.)-1 2,55.10-3 1,83.10-3 5,98.10-4 3,55.10 2,66.10 2,36.10
-4 -4 -4

3,00E-03 2,50E-03 1/V (/mg prot) 2,00E-03 1,50E-03 1,00E-03 5,00E-04 0,00E+00 -350 -5,00E-04 650 1650 1/S ( mM)

y = 1E-06x + 0,0002 R2 = 0,91

y = 8E-07x + 0,0002 R2 = 0,8797 y = 6E-07x + 0,0002 R2 = 0,9873

0 ppm cyprodinil 50 ppm cyprodinil 100 ppm cyprodinil Dorusal (0 ppm cyprodinil) Dorusal (50 ppm cyprodinil) Dorusal (100 ppm cyprodinil)

2650

ekil 4.16. Cyprodinil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii. ekil 4.16daki verilerden yararlanlarak Vmax, Km ve Ki (inhibisyon sabiti) bulunmutur. Yarmal (kompetitif) inhibisyon iin Lineweaver-Burk eitlii: 1 Km [ I ] 1 1 = + 1 + . V Vm Ki [S ] Vm Km [ I ] 1 + den Ki bulunabilir (Erarslan, 2000). Vm Ki

Eim =

72

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

[I ] Km gzlenen =Km . 1 + dir. Ki

0 ppm cyprodinil iin Vmax ve Km deerleri, Vmax=5000 U/mg, Km=3.10-3 mM ksantin 50 ppm cyprodinil iin Vmax ve Km deerleri, Vmax=5000 U/mg, Km gzlenen =4.10-3 mM ksantin

100 ppm cyprodinil iin Vmax ve Km deerleri, Vmax=5000 U/mg Km gzlenen =5.10-3 mM ksantin Ki=0,666mM 4.1.3.4. Fludioxonil le Salatrlm Speroksit Dismutazn Etkileimi

eitli Fludioxonil deriimleri ile saflatrlm enzim etkiletirilerek, enzim aktivitesi llp veriler izelge 4.12de verilmi olup, grafii ekil 4.17de gsterilmitir.

izelge 4.12. eitli Fludioxonil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz aktivitesi zerine olan etkisi.
Deriim (ppm) 10 50 100 250 500 Aktivite (U/mg) 523 2 493 6 440 5 306 7 213 16

73

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

600 500 Aktivite (/mg) 400 300 200 100 0 0 100 200 300 Deriim (ppm) 400 500 600

ekil 4.17. Fludioxonil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda aktivite grafii. izelge 4.12deki verilere ve ekil 4.17ye bakldnda artan Fludioxonil deriimleri ile saflatrlm enzimin inhibisyona urad saptanmtr. 4.1.3.5. Fludioxonil le Eritrositlerin Etkileimi

0,4 ml eritrosit alnp 1 mlye serum fizyolojik ile tamamlanm, bu zelti ise tekrar serum fizyolojik ile 50 mlye tamamlanmtr. Etil alkol iinde zlm Fludioxonilin farkl deriimleri ile eritrositler oda scaklnda 1 saat etkiletirilmi ve aktivitedeki deiim incelenmi, veriler izelge 4.13de verilmi olup, grafii ekil 4.18de gsterilmitir.

izelge 4.13. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite deerleri.
Deriim (ppm) 10 50 100 250 500 Aktivite (U/mg) 8,27 0,27 5,75 0,33 5,6 0,27 4,17 0,14 2,8 0,39

74

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

9 8 7 Aktivite (/mg) 6 5 4 3 2 1 0 0 100 200 300 Deriim (ppm) 400 500 600

ekil 4.18. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki SOD aktivite grafii. izelge 4.13deki verilere ve ekil 4.18e bakldnda artan Fludioxonil deriimleri ile eritrosit speroksit dismutazn inhibisyona urad saptanmtr. 4.1.3.6. Fludioxonilin nhibisyon Tr

Yaplan almalar, Fludioxonilin Speroksit dismutaz yarmasz (nonkompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur. Speroksit dismutaz iin farkl substrat deriimlerinde (4,08.10-4 -2,04.10-2 mM) ve farkl Fludioxonil deriimlerinde (100250 ppm) llen aktivite deerleri izelge 4.14de verilmi, ekil 4.19de grafii izilmitir.

izelge 4.14. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Fludioxonil deriimlerinde llen aktivite deerleri.
1/S -1 (mM) 2451 980,4 490,2 245,1 98 49 1/ V -1 (U/mg prot.) 1,50.10-3 9,17.10
-4

1/ V (100 ppm Fludioxonil) (U/mg prot.)-1 4,15.10-3 3,45.10


-3

1/ V (250 ppmFludioxonil) (U/mg prot.)-1 4,44.10-3 3,30.10


-3

7,87.10-4 5,59.10-4 4,61.10-4 4,50.10


-4

1,73.10-3 1,58.10-3 1,11.10-3 9,40.10


-4

2,79.10-3 2,00.10-3 1,44.10-3 1,16.10


-3

75

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

5,00E-03 1/V(/mg prot.) 4,00E-03 3,00E-03 2,00E-03 1,00E-03 0,00E+00 -1000 0

y = 1E-06x + 0,0016 R2 = 0,8767

0 ppm Fludioxonil 100 ppm Fludioxonil

y = 1E-06x + 0,0012 R2 = 0,867

250 ppm Fludioxonil Dorusal (0 ppm Fludioxonil) Dorusal (100 ppm Fludioxonil) Dorusal (250 ppm Fludioxonil)

y = 4E-07x + 0,0005 R2 = 0,9781

-2000

1000

2000

3000

1/ S (mM)

ekil 4.19. Fludioxonil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii. ekil 4.19daki verilerden yararlanlarak Vmax, Km ve Ki (inhibisyon sabiti) bulunmutur. Yarmasz (non-kompetitif) inhibisyon iin Lineweaver-Burk eitlii: 1 Km [ I ] 1 1 [I ] = . 1 + + . 1 + . V Vm Ki [S ] Vm Ki [I ] 1 + den Ki bulunabilir (Erarslan, 2000). Ki

Eim =

Km Vm

1 1 [I ] = . 1 + dir. Vm.gzlenen Vm Ki 0 ppm Fludioxonil iin Vmax ve Km deerleri, Vmax= 2000 U/mg, Km=8.10-4 mM ksantin 100 ppm Fludioxonil iin Vmax ve Km deerleri, Vm gzlenen = 833 U/mg. Km= 8.10-4 mM ksantin.

76

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

250 ppm Fludioxonil iin Vmax ve Km deerleri, Vm gzlenen = 625 U/mg Km= 6.10-4 mM ksantin Ki= 0,269 mM 4.2. Tartma

Inouye ve ark. (1985), yaptklar almada sr eritrositlerinden Cu,ZnSODyi (E.C.1.15.1.1) saflatrmlardr. Aseton ile ktrp, yksek performansl iyon deitirici, TSK-GEL DEAE-5PW kolonuna yklemilerdir. Enzimi, NaCln 0 dan 0,3 Ma deien konsantrasyonuyla ele etmilerdir. 3800 nite/mg prot. spesifik aktivitesine sahip saf protein elde etmilerdir. Bizim yaptmz almada SOD, DEAE-Selloz ve bakr-iminodiasetik asit-agaroz kolonlar kullanlarak

saflatrlmtr. DEAE-Selloz kolonundan elsyon iin tampon deriimi arttrlm, bakr-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan elsyon iin ise ligand deiimi yaplmtr. Saflatrma basamaklar sonunda 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesine sahip enzim elde edilmitir. Asano ve ark. (1986), bal olarak basit ve tekrar edilebilir bir ilemi, insan eritrositlerinden katalazn (E.C.1.11.1.6) ve bakr-inko speroksit dismutazn (E.C.1.15.1.1) bakr elat ilgi kromatorafisi ile izolasyonu iin gelitirmilerdir. Bu metodu kullanarak iki enzimi kolaylkla ve katalaz % 23,4 verimle 565 kez; Cu,ZnSODyi %35 verimle 2190 kez saflatrmlardr. SODnin molekler arln 17 000 1000, katalazn molekler arln 240 000 bulmulardr. Bizim yaptmz almada, insan eritrositlerinden SOD % 33,8 verimle 196,3 kez saflatrlmtr. SODnin molekler arl 20 000 bulunmutur. Weselake ve ark. (1986), Cu,Zn-SODyi insan krmz hcrelerinden DEAESefaroz ve bakr elat afinite kromatorafisi kullanarak izole etmilerdir. Enzimin 3800 nite/mg protein spesifik aktivitesine ulamlardr. SODyi krmz hcre hemolizatndan % 58 verimle, 2000 kez saflatrmlardr. SODnin alt nitesinin molekl arln SDS-PAGE ile 18 000-19 000 arasnda bulmulardr. Bizim yaptmz almada, insan krmz hcrelerinden SOD, DEAE-Selloz, bakr elat afinite kromatorafisi kullanlarak % 33,8 verimle 196,3 kez saflatrlmtr.

77

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

SODnin molekler arl 20 000 bulunmutur. 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesi elde edilmitir. Kumagai ve ark. (1994), bakr inko speroksit dismutaz (Cu-Zn SOD) sr eritrositlerinden pH kontroll amonyum slfat methanol ekstraksiyonu, DEAE-

Selloz kolon kromatografisi ile izole etmilerdir. 1 litre sr kanndan 4728 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip 14 mg saf Cu-Zn SOD elde etmilerdir. Bizim yaptmz almada 100 ml insan kanndan 1507,74 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip 16,5 mg protein elde edilmitir. Suwalsky ve ark. (1997), Heptaklorun lipofilik karakterinden dolay, lipidce zengin hcre zarlarnn pestisidin etkileimi iin olas hedefler olduunu belirtmilerdir. Pestisidin krmz hcrelerle etkileimini aratrmak iin, Heptakloru insan eritrositleri ve krmz hcre zarlarnn molekler modelleriyle

etkiletirmilerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC)in ve dimiristil fosfatidil etanolamin (DMPE)in oklu tabakalarndan olutuunu belirtmilerdir. Bunlarn srasyla eritrosit zarlarnn d ve i tabakasnda yerlemi fosfolipid eitleri olduklarn belirtmilerdir. Elektron mikroskobu ile yaptklar taramada, 10 mM Heptaklorun eritrositlerde ekil deiiklii yaptn belirtmilerdir. te yandan X-nlar krnm ile DMPC ve DMPE zerine yaptklar deneylerde, Heptaklor ile DMPC tabaka yapsnn DMPE tabaka yapsndan daha ok etkilendiini gzlemlemilerdir. Floresans spektroskopisi ile DMPC zerine yaptklar lmler, X-nlar krnm sonularn kuvvetlendirmitir. DMPCnin hidrokarbon zincirinin ve polar ba blgelerinin Heptaklor tarafndan bozulduunu belirtmilerdir. Bizim yaptmz almada, suda az znen, etanolde zlm, Cyprodinil ve Fludioxonilin eritrositlerle etkileimi SOD aktivitesinde inhibisyona neden olmutur. Benzer inhibisyon hemoliz edilmi eritrositlerden saflatrlan SOD enziminin Cyprodinil ve Fludioxonil ile etkileimi ile elde edilmitir. zdem ve ark. (2000), bu alma ile 4-klorofenoksiasetik asit ile ykadklar domates homojenatlarnn antioksidan enzimler olan glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, katalaz, selenyum bal glutatyon peroksidaz ve Cu-Zn speroksit dismutaz zerine olan etkilerini incelemilerdir. Domatesleri, sprey kullanarak 1, 10, 20 ppm 4klorofenoksiasetik asit ile ykamlardr. 1 veya 10 ppm 4-klorofenoksiasetik asit

78

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

ykadklar domates homojenatlarn 1 ml/100 g vcut arl dozunda farelere enjekte ettiklerinde, fare eritrosit antioksidan enzimlerinde belirgin bir deime grmemilerdir. Fakat 20 ppm 4-klorofenoksiasetik asit ykadklar domates homojenatlarn ayn dozda verdiklerinde, selenyum bal glutatyon peroksidaz aktivitesinde belirgin azalma (p<0,05), katalaz aktivitesinde artma (p<0,05) grrken, glukoz-6-fosfat dehidrojenaz ve Cu-Zn speroksit dismutaz aktivitesinde belirgin bir deime grmemilerdir. Bizim yaptmz almada, domateste kuruni kf (Botrytis cinerea) hastalnn mcadelesinde kullanlan Cyprodinil ve Fludioxonilin 0 dan 500 ppme deien konsantrasyonlar ile SOD enzimi etkiletirildiinde, SOD aktivitesinde azalma olduu grlmtr. ztrk ve Tarhan (2001), tavuk karacierinden SODyi saflatrm ve ksmen karakterize etmilerdir. SODyi DEAE-iyon kromatorafisi ve Sefhadeks G75 jel filtrasyon kromatorafisi ile % 7,3lk verimle 286 kez saflatrmlardr. 4818,2 U/mg spesifik aktivitesine ulamlardr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arln 16.000 500, jel filtrasyon ile 32 000 1000 bulmulardr. SODnin, DTT ve -merkaptoetanol ile inhibe edilmediini CN- ve H2O2 ile inhibe edildiini belirtmilerdir. Ayrca SODnin 2 mM iyodoasetamid ile % 40 aktivite kaybettiini gzlemlemilerdir. Bizim yaptmz almada, SOD insan eritrositlerinden % 33,8 verimle 196,3 kez saflatrlmtr. 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesine ulalmtr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arl 20 000 olarak bulunmutur. Cyprodinil ve Fludioxonilin SODyi inhibe ettii bulunmutur. Aydemir ve Tarhan (2001), SODyi tavuk eritrositlerinden saflatrm ve ksmen karakterize etmilerdir. Eritrosit membranlarn Triton X-100n varlnda dondurup-zme metodu ile paralamlardr. Etanol ktrmesinden sonra, SOD ieren zeltiyi DEAE-Selloz ve ardndan Sephadex G-100 jel kolonlarna uygulamlardr. Tavuk eritrosit SODsini % 26 verimle 508 kez saflatrmlardr. 8 480 U/mg spesifik aktivitesine ulamlardr. Molekler arl jel filtrasyon ile 30,6 0,4 kDa olarak bulmulardr. Enzimin yksek termal kararlla sahip olduunu belirtmilerdir. Bizim yaptmz almada, SOD insan eritrositlerinden % 33,8 verimle 196,3 kez saflatrlmtr. 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesine ulalmtr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arl 20 000 olarak bulunmutur.

79

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

5 Cde, pH=6,8 fosfat tamponunda bekletilen enzim 14 gn sonra aktivitesini kaybetmitir. Sivaprakasam ve ark. (2004), Speroksit dismutaz amonyum slfat fraksiyonlamas, jel szme ve iyon deiim kromatorafisi kullanarak guavann ham yeil meyvelerinden % 47 geri kazanm ile saflatrmlardr. Saflatrlm enzimin 40 kDa molekler arlna sahip olduunu ve 20 kDaluk iki eit alt niteye sahip olduunu belirtmilerdir. Tipik Michaelis-Menten kinetii gzlemlemilerdir. Nitrobenzen tetrazolium ve riboflavin substratlar iin Km deerlerini srasyla 15 ve 2,3 mM bulmulardr. Bizim yaptmz almada, kandan SOD % 33,8 geri kazanm ile saflatrlmtr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arl 20 000 olarak bulunmutur. Yaplan almalarda Michaelis-Menten kinetii gzlemlenmitir. Ksantin substrat iin Km deeri, 3.10-3 mM bulunmutur. Ren ve ark. (2004), immobilize bakr (II) ilgi kromatorafisini, proteinlerin paralanmasndan oluan histidin ieren peptidlerin seimi ile rnek karmn sadeletirmek iin organizma ierisindeki btn proteinleri izole etmek iin kullanmlardr. Bu almada, histidin ieren peptidleri tek basamakta tutuklanp salverilmesinde iminodiasetik asiti (IDA) duraan faz olarak kullanan Yksek Tutuklayc elatlatrc HP (agaroz), TSK elat-5PW, Gzenekli 20 MC ve CIM diskleri (gliysidilmetakrilat-etilen dimetakrilat) desteklerinin spesifiklii

aratrlmtr. Agaroz temelli kolonun bal olarak yksek spesifiklie ve seicilie sahip olduu belirtilmitir. Bizim yaptmz almada, iminodiasetik asit-agaroz kolonu kullanlmtr. Mavi ve ark. (2006), Cu-Zn SOD enzimini insan eritrositlerinden, hemoglobini uzaklatrmak iin etanol-kloroform ile etkiletirmiler, ardndan iyon deiim kromatorafisi (DEAE-Sefaroz) ve bakr elat ilgi kromatorafisi tekniklerini kullanarak % 12 verimle 837 kez saflatrmlardr. 1085 U/mg prot. spesifik aktivitesine ulamlardr. SDS-PAGE ile SODnin molekl arln 18 900 bulmulardr. Bizim yaptmz almada, SOD insan eritrositlerinden DEAESelloz ve bakr elat ilgi kromatorafisi teknikleri kullanlarak % 33,8 verimle 196,3 kez saflatrlmtr. 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesi elde edilmitir. SDS-PAGE ile SODnin molekl arl 20 000 olarak bulunmutur.

80

4. BULGULAR VE TARTIMA

Hasan KARADA

Bu almada, SOD, DEAE-Selloz ve bakr-iminodiasetik asit-agaroz kromatorafisi kullanlarak saflatrlmtr. % 33,8 verimle 196,3 kez

saflatrlmtr. 1507,74 nite/mg prot. spesifik aktivitesi elde edilmitir. MichaelisMenten kinetii gzlemlenmitir. Vmax= 5000 U/mg prot, Km=3.10-3 mM ksantin olarak bulunmutur. Optimum scaklk, 15 C (288 K) olarak belirlenmitir. Aktivasyon enerjisi 16,856 kj/mol, denatre olmaya balanan scaklk 19 C (292 K) olarak hesaplanmtr. Geri dnm says, 1667 s-1, katalitik etkinlik (kcat / Km ), 555 667 s-1. mM-1 Ksantin-1 bulunmutur. SODnin molekler arl 20 000 dalton olarak hesaplanmtr. Cyprodinilin Speroksit dismutaz yarmal (kompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur. Cyprodinil molekl speroksite benzememesine ramen radikal oluturduu ve bu radikalerin enzimin aktif blgesine balanmak iin yart dnlmektedir. Fludioxonilin ise Speroksit dismutaz yarmasz (nonkompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur.

81

5. SONULAR VE NERLER

Hasan KARADA

5. SONULAR VE NERLER

5.1. Sonular

Yaplan deneyler dorultusunda aadaki sonular bulunmutur. 1) SOD, DEAE-Selloz ve bakr-iminodiasetik asit-agaroz kromatorafisi kullanlarak saflatrlmtr. % 33,8 verimle 196,3 kat saflatrlma

gerekletirilmitir. 2) Optimum scaklk, 15 C (288 K) olarak belirlenmitir. 3) Vmax = 5000 U.(mg prot)-1, Km=3.10-3 mM ksantin olarak bulunmutur. 4) Aktivasyon enerjisi 16,856 kj/mol, denatre olmaya balanan scaklk 19 C (292 K) olarak hesaplanmtr. 5) Geri dnm says, 1667 s-1, katalitik etkinlik (kcat / Km ), 555 667 s-1. mM-1 Ksantin-1 bulunmutur. 6) 5 Cde, pH=6,8 fosfat tamponunda bekletilen enzim 14 gn sonra aktivitesini kaybederken, 5 Cde % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserolde bekletilen enzim 28 gn sonra srasya balang aktivitesinin, %78,5 4,1; % 83,8 8,5; % 79,5 6,1ini korumutur. 20 Cde % 50 gliserolde ise bekletilen enzim 28 gn sonra balang aktivitesinin, 93,6 7,6sn korumutur. 7) SODnin molekler arl 20 000 dalton olarak hesaplanmtr. 8) 0 dan 500 ppme artan Cyprodinil deriimleri ile etkiletirilen saflatrlm SOD aktivitesinde azalma grlmtr. 9) 0 dan 500 ppme artan Cyprodinil deriimleri ile etkiletirilen eritrositlerde SOD aktivitesinde azalma grlmtr. 10) Cyprodinilin SODyi yarmal (kompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur. Cyprodinilin inhibisyon sabiti (Ki); 0,666mM olarak hesaplanmtr. 11) 0 dan 500 ppme kadar Fludioxonil deriimleri ile etkiletirilen saflatrlm SOD aktivitesinde azalma grlmtr. 12) 0 dan 500 ppme kadar Fludioxonil deriimleri ile etkiletirilen eritrositlerde SOD aktivitesinde azalma grlmtr.

82

5. SONULAR VE NERLER

Hasan KARADA

13) Fludioxonilin SODyi yarmasz (non-kompetitif) olarak inhibe ettii bulunmutur. Fludioxonilin inhibisyon sabiti (Ki); 0,269 mM olarak hesaplanmtr.

5.2. neriler

1) SOD baka kaynaklardan saflatrlabilir. 2) SOD ile baka pestisitler etkiletirilebilir. 3) SOD anti-inflamatuar ila olarak kullanlmaktadr. SOD daha ucuz kaynaklardan (bitkilerden) saflatrlp ila olarak kullanlabilir.

83

KAYNAKLAR AKKU, ., 1995. Serbest Radikaller Ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Yaynlar, Konya, 157s. ALTUNTAS, I., DELIBAS, N., DOGUC, D.K., OZMEN, S., GULTEKIN, F., 2003. Role Of Reactive Oxygen Species In Organophosphate Insecticide Phosalone Toxicity In Erythrocytes In Vitro. Toxicology In Vitro, 17: 153 157. ASANO, M.M., ITO K., IKEDA H., SEKIGUCHI, S., 1986. Purification Of Copper-Zinc-Superoxide Dismutase And Catalase From Human Erythrocytes By Copper-Chelate Affinity Chromatography. Journal Of Chromatography A, 370: 501-507. AYDEMR T., TARHAN L., 2001. Purification And Partial Characterisation Of Superoxide Dismutase From Chicken Erythrocytes. Turkish Journal Of Chemistry, 25: 451-459. BARTKOWAK, A., LEYKO, W. AND FRED R., 1979. A Comparative Characterization Of Cytosolic Superoxide Dismutase (SOD) From Hog

Liver And Erythrocytes. Comparative Biochemistry And Physiology Part B: Biochemistry And Molecular Biology, 62 (1): 61-66. BATTISTONI, A. FOLCARELLI S., GABBIANELLI R., CAPO C., ROTILIO G., 1996. The CuZnSOD From E. Coli Retains Monomeric Structure At High Protein Concentration. Biochem. J. 320: 713-716. BERTINI, I., MANGANI, S., VIEZZOLI, M. S., 1998. Structure And Properties Of CuZnSODs. Adv.Inorg.Chem. 45:127. BOLLAG D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN,S.J., 1996. Protein Methods. Willey-Liss, Inc., New York, 415s. BOYER, R.F., 1993. Modern Experimental Biochemistry, 2nd Ed, The Benjamin/Cummings Publishing Co. Inc., California., pp 75-80. BUKOWSKA, B., 2003. Effects Of 2,4-D And Its Metabolite 2,4-Dichlorophenol On Antioxidant Enzymes And Level Of Glutathione In Human Erythrocytes. Comparative Biochemistry And Physiology Part C, 135: 435441.

84

MELEKOLU, ., MAZMANCI, B., ARPACI, A., 2000. Erythrocyte Superoxide Dismutase And Catalase Activities In Agriculture Workers Who Have Been Chronically Exposed To Pesticides. Turk J Biol 24: 483488. DE ROSA, G. KEEN, C. L., LEACH, R. M., HURLEY, L. S., 1980. Regulation Of SOD Activity By Dietary Manganese. J. Nutr. 110: 795-804. ERARSLAN, A., 2000. Enzim Kinetii Notlar. TBTAK, Marmara Aratrma Merkezi, Kocaeli, 84s. FRIDOVICH, I., 1995. Superoxide Radical And Superoxide Dismutases. Annu. Rev. Biochem. 64: 97. HALLIWELL B., GUTTERIDGE J. M. C., 1999. Free Radicals In Biology And Medicine. Third Edition, Oxford University Press Inc., New York, 936s. HALLIWELL B, GUTTERIDGE J.M.C., 1984. Lipid Peroxidation, Oxygen Radicals, Cell Damage And Antioxidant Therapy. Lancet 23: 1396-1397. HALLIWELL B, GUTTERIDGE J.M.C., CROSS C.E.,1992. Free Radicals, Antioxidants And Human Disease: Where Are We Now? J Lab Clin Med 119: 598-620. HIDAYAT, C., NAKAJIMA M., TAKAGI M., YOSHIDA T., 2003. Development Of New Dye-Metal Agarose-Coated Alumina Matrix And Elution Strategy For Purification Of Alcohol Dehydrogenase. Journal Of Bioscience And Bioengineering 95(2): 133-138. INOUYE,K., NAKAMURA, K., MITOMA, Y., MATSUMOTO, M.,

IGARASHI, T., 1985. Application Of A New Ion Exchanger TSK-GEL DEAE-5PW, To The Purification Of Cu,Zn-Superoxide Dismutase Of

Bovine Erythrocytes. Journal Of Chromatography A, 327: 301-311. JOHNSTONE, A., THORPE, R., 1982. Immunochemistry In Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp 9-16. KUMAGAI Y., SHINYASHIKI M., SUN G.F., SHIMOJO N., SAGAI M., 1994. An Efficient Method For Purification Of Cuprozinc Superoxide-Dismutase From Bovine Erythrocytes. Experientia 50 (7): 673-676. LAEMMLI U.K., 1970. Cleavage Of Structural Proteins During The Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

85

LIE, M., JIA, L., KEWU, L.,YAN J., WEN, L.X., XIN, L., 2004. Isolation, Purification And Characterization Of Superoxide Dismutase From Royal Jelly Of The Italian Worker Bee, Apis Mellifera. Acta Entomologica Sinica 47(2): 171-177. LOWRY O.H, ROSEBROUGH N.J, FARR A.L., RONDALL, R.J., 1951. Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem., 193: 261-275. LUNEC J., 1990. Free radicals: their involvement in disease processes. Ann Clin Biochem, 27: 173-182. MAVI, A., KFREVIOLU, .., YILDIRIM A., 2006. Effects Of Some Drugs On Purified Human Erythrocyte Cu,Zn SOD And n Vitro nhibitiory Effect Of 5-Fluorouracil On Leukocyte Total SOD Activity. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 21(2): 235239. ONEILL, P. FIELDEN E.M., COCCO D., ROTILIO G., CALABRESE L., 1982. Evidence For Catalytic Dismutation Of Superoxide By Cobalt(II) Derivatives Of Bovine SOD In Aqueous Solution As Studied By Pulse Radiolysis. Biochem. J. 205(1): 181-187. OSATOMI, K., MASUDA, Y., HARA, K., ISHIHARA, T., 2001. Purification, NTerminal Amino Acid Sequence And Some Properties Of Cu, Zn-Superoxide Dismutase From Japanese Flounder (Paralichthys Olivaceus) HepatoPancreas. Comparative Biochemistry And Physiology Part B, 128: 751-760. NCER, C., 2000. Tarmsal Zararllarla Sava Yntemleri Ve lalar. Adnan Menderes niversitesi Yaynlar No: 13, Geniletilmi 4. Bask, Aydn, 379s. ZDEM, S., ZDEM, S.S., ALICIGZEL, Y., 2000. The Effects Of 4Chlorophenoxyacetic Acid-Raised Tomato Homogenate On Rat Erythrocyte Antioxidant Enzymes. Pesticide Biochemistry And Physiology, 67: 134136. ZTRK REK, R., TARHAN L., 2001. Purification And Characterization Of Superoxide Dismutase From Chicken Liver. Comparative Biochemistry And Physiology Part B 128: 205-212. PETERSON E. A., SOBER H. A., 1956. Chromatography Of Proteins. I. Cellulose Ion-Exchange Adsorbents. J. Amer. Chem. Soc. 78: 751-755.

86

PHARMACIA FINE CHEMICALS AB,1980. Ion Exchange Chromatography: Principles And Methods, Rahmsi Lund, Sweden, pp 4-8. POREKAR, V.G., MENART,V., 2001. Perspectives Of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. J. Biochem. Biophys. Methods, 49: 335360. RAWN, D., 1989. Biochemistry. Biological Supply Company, Caroline,1106s. REN, D., PENNER, N.A., SLENTZ, B.E., INEROWICZ, H.D., RYBALKO, M., REGNIER F.E., 2004. Contributions Of Commercial Sorbents To The Selectivity n mmobilized Metal Affinity Chromatography With Cu(II). Journal Of Chromatography A, 1031: 8792. SEATOVIC S., GLIGIC L., RADULOVIC Z., JANKOV R.M., 2004. Purification And Partial Characterization Of Superoxide Dismutase From The Thermophilic Bacteria Thermothrix sp. J.Serb.Chem.Soc. 69(1): 9-16. SHATZMAN, A.R., KOSMAN, D.J., 1979. Biosynthesis And Cellular Distribution Of The Two SODs Of Dactylium dendroides. J. Bacteriol. 137: 313. SIVAPRAKASAM, G., SINGH, D., DHILLON, S., MALHOTRA, S.P., AHLAWAT, T.R., SINGH, R., 2004. Purification And Characterization Of Superoxide Dismutase From Guava (Psidium Guajava L.). Physiology and Molecular Biology of Plants, 10(1): 59-64. SLOT J.W. GEUZE H.J., FREEMAN B.A., CRAPO J.D., 1986. Intracellular Localization Of The Copper-Zinc And Manganese SODs In Rat Liver Parenchymal Cells. Lab.Invest. 35: 363-371. STEPANIK, T.M., EWING,D.D., 1990. Coisolation Of Glutathione Peroxidase, Catalase And Superoxide Dismutase From Human Erythrocytes. Journal Of Biochemicial And Biophysicial Methods, 20(2): 157-169. SUN Y., OBERLEY L.W., LI Y., 1988. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin. Chem., 34: 497-500. SUWALSKY, M., BENITES, M., VILLENA, F., AGUILAR, F.,

SOTOMAYOR, C.P., 1997. The Organochlorine Pesticide Heptachlor Disrupts The Structure Of Model And Cell Membranes. Biochimica Et Biophysica Acta, 1326: 115123.

87

SUWALSKY,

M.,

RODRIGUEZ,

C.,

VILLENA,

F.,

AGUILAR

F.,

SOTOMAYOR, C.P., 1998. The Organochlorine Pesticide Lindane Interacts With The Human Erythrocyte Membrane. Pesticide Biochemistry And Physiology 62: 8795. TARHAN L., TUZMEN M.N., 2000. Some Properties Of Cu, Zn-Superoxide Dismutase From Sheep Erythrocyte. Turkish Journal Of Chemistry 24 (2): 109-116. TELEFONCU, A., 1996. Protein Saflatrlmas Ve Karakterizasyonu. Ege niversitesi, zmir, 272s. TELEFONCU, A., 1997. Enzimoloji. Ege niversitesi, zmir, 446s. VYAS, D., KUMAR S., 2005. Purification And Partial Characterization Of A Low Temperature Responsive Mn-SOD From Tea (Camellia Sinensis (L.) O. Kuntze). Biochemical And Biophysical Research Communications, 329: 831838. WEDGE, D.E., SMITH B.J., QUEBEDEAUX, J.P., CONSTANTIN, R.J., 2007. Fungicide Management Strategies For Control Of Strawberry Fruit Rot Diseases n Louisiana And Mississippi. Crop Protection, 1-10. WESELAKE R.J., CHESNEY S.L., PETKAU A. AND FRIESEN A.D., 1986. Purification Of Human Copper, Zinc Superoxide Dismutase By Copper Chelate Affinity Chromatography. Analytical Biochemistry, 155(1):193-197. YILMAZ H., 2002. Yeni Pestisitlerin (Fludioxonil Ve Cyprodinil) Kalnt Analizleri. Kimya Anabilim Dal, Adana, 53s. ZHENFEI, G., YUN, L.S., MINGQI, L., 1996. Purification And Characterization Of Superoxide Dismutase From Broad Bean Seeds. Journal of Tropical and Subtropical Botany 4(3): 60-64. ZUNSHENG, W., ZHUOJING, H., SUXIA, L., QINSHENG, Y., 2005. Purification And Partial Characterization Of Cu, Zn Containing Superoxide Dismutase From Entomogenous Fungal Species Cordyceps Militaris. Enzyme And Microbial Technology 36: 862-869.

88

ZGEM 1974 ylnda Adyamanda dodum. lk ve ortaokulu Adyaman okpnar lkokulu ve Adyaman Gazi Ortaokulunda, liseyi Gaziantep ehit ahin Lisesinde tamamladm. 1993de kazandm Dicle niversitesi Eitim Fakltesi Kimya Blmnden 1997 ylnda mezun oldum. 1997 gz dneminde ukurova niversitesi Fen Edebiyat Fakltesi Kimya Blmnde yksek lisansa baladm. YADMde 1 yl ingilizce hazrlk grdm. 2001 ylnda yksek lisans bitirdim. Ayn yl .. F.E.F Kimya blmnde doktoraya baladm. 1999-2007 yllar arasnda .. F.E.F Kimya blmnde aratrma grevlisi olarak grev aldm. Evli ve bir ocuk babasym.

89