You are on page 1of 62

Universidad Nacional de Ingeniería

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE CIENCIAS

Escuela Profesional de Química

1

Universidad Nacional de Ingeniería

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

2

Universidad Nacional de Ingeniería

1. INTRODUCCIÓN

3

demostración que las características de dicho procedimiento cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los resultados. INTRODUCCIÓN Establece mediante estudios sistemáticos de laboratorio.Universidad Nacional de Ingeniería 1. 4 .

el procedimiento utilizado para la validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto.4.Universidad Nacional de Ingeniería 1. INTRODUCCIÓN La NTP-ISO/IEC 17025:2006 5. 5 .5.5 Validación de los métodos 5.4. a través del examen y el aporte de evidencias objetivas.5. de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto.2 El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos. 5.4.1 La validación es la confirmación.

Universidad Nacional de Ingeniería 1. INTRODUCCIÓN ¿CUÁNDO VALIDAR?  Métodos No normalizados  Métodos Desarrollados por el propio laboratorio  Métodos Normalizados usados fuera de su alcance  Métodos Normalizados modificados 6 .

INTRODUCCIÓN SECUENCIA DE ACTIVIDADES EN LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO Transformar la necesidad del cliente en requisitos analíticos específicos Selección de la metodología Revalidación Evaluación de los parámetros de validación Selección de los parámetros de validación Caracterizar la metodología 7 .Universidad Nacional de Ingeniería 1.

Universidad Nacional de Ingeniería 2. OBJETIVOS DE LA VALIDACIÓN Evaluar las características de desempeño del método. 8 . Demostrar que un método es equivalente a otro. de tal manera que se obtenga resultados confiables. Demostrar que las modificaciones realizadas a un método no afectan su desempeño. Demostrar que el método desarrollado por un laboratorio es útil para la aplicación propuesta.

TIPOS DE VALIDACIÓN 3. RETROSPECTIVA Proceso de validación para métodos utilizados a diario no validados anteriormente y de los cuales se dispone de suficiente documentación para probar los atributos del método. PROSPECTIVA Proceso de validación para metodologías nuevas.Universidad Nacional de Ingeniería 3.1.2. 3. 9 .

Universidad Nacional de Ingeniería 3. TIPOS DE VALIDACIÓN 3. REVALIDACIÓN Repetición total o parcial de una validación.3. 10 . por la introducción de algún cambio que se espera afecte a un método ya validado.

11 .Universidad Nacional de Ingeniería 4. • Verificación. calibración y control de los instrumentos de medición y material de vidrio utilizado. REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN • Calificación del personal en el uso de los métodos a validar.

REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN • Utilización de reactivos apropiados y disoluciones de trabajo valoradas. ESTÁNDARES 12 .Universidad Nacional de Ingeniería 4. • Procedimiento normalizado de operación del método de ensayo.

Universidad Nacional de Ingeniería 4. REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN • Observación de las medidas de seguridad y BPL. 13 .

PROTOCOLO DE LA VALIDACIÓN Describe las etapas de validación de un método y establece la elaboración de un plan de validación. 14 .Universidad Nacional de Ingeniería 5.

estar suficientemente soportada para ser utilizada por los analistas y producir resultados consistentes. DOCUMENTACIÓN DE LA VALIDACIÓN La documentación de un método tiene efecto directo sobre la consistencia de su aplicación. tiene también influencia en su reproducibilidad y en la estimación de la incertidumbre asociada. Se debe generar un informe de la validación del método con información clara y sin ambigüedades.Universidad Nacional de Ingeniería 6. en consecuencia. 15 .

Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 16 .

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. ● 17 . VERACIDAD ● Es la proximidad de concordancia entre el valor promedio obtenido de una serie de resultados de prueba y un valor de referencia aceptado.Universidad Nacional de Ingeniería 7. La medida de la veracidad se expresa por lo general en términos de sesgo.1.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.1. 18 .Universidad Nacional de Ingeniería 7. VERACIDAD Se define dos componentes del sesgo: ● Sesgo del método: Errores sistemáticos ● inherentes al método Sesgo de laboratorio: Errores sistemáticos característicos del laboratorio y de la interpretación del método.

1. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.Universidad Nacional de Ingeniería 7. VERACIDAD Sesgo del método Sesgo del laboratorio medida δ + B Variabilidad aleatoria m = μ + ∆ + e Valor de referencia 19 .

Universidad Nacional de Ingeniería 7. VERACIDAD Se estima el sesgo combinado (sesgo del método y sesgo de laboratorio) y debe ser comparado con cualquier sesgo proveniente del método de referencia.1. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. 20 . la incertidumbre en la medición y la exactitud requerida. Debe ser medido contra los materiales o métodos de referencia apropiados tomando en cuenta la precisión del método.

 Revisión empleando un método alternativo caracterizado. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.Universidad Nacional de Ingeniería 7.1.  Revisión empleando el método analítico con respecto a valores de referencia de un material certificado (MRC). trazable a estándares internacionales. 21 . VERACIDAD Determinación de la veracidad.

Universidad Nacional de Ingeniería

7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO
7.1. VERACIDAD

Determinación de la veracidad.

 Analizando

muestras fortificadas (Ensayos de Adición y Recuperación).

 Comparando los resultados obtenidos en
un Ensayo de Aptitud.

22

Universidad Nacional de Ingeniería

7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO
7.1. 1. DETERMINACION DE LA VERACIDAD

 Utilizando

Material Certificado (MRC).

de

referencia

MRC

Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 Repetición n

Se determina por:  Prueba t-Student de una muestra  Prueba de Wilconson de una muestra

23

Universidad Nacional de Ingeniería

7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO
7.1. 1. DETERMINACION DE LA VERACIDAD

Criterio de decisión
P valor (α =0.05)
P valor > α

Conclusión
El método es veraz al 95% de confianza

P valor ≤ α

El método no es veraz al 95% de confianza

24

608 4.631 4.635 4.624 4. 1.623 4. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.626 4.631 4.634 4.622 4. DETERMINACION DE LA VERACIDAD Ejemplo: Determinar la veracidad en los siguientes resultados de ensayo de un MRC que contiene 4.Universidad Nacional de Ingeniería 7.625 25 .621 4.627 4.640 4.627 4.621 4.627 4.639 4.628 4.631 4.620 4.617 4.623 4.1.608 4.629 mg/mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4.621 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 4.622 4.634 4.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.1. Procedimiento Analítico Muestra Repetición 1 Repetición 1 Repetición 2 Método de Referencia Repetición 2 Repetición n Repetición n Se determina por:  Prueba t-Student de dos muestras  Prueba de Mann Whitney 26 . 1. DETERMINACION DE LA VERACIDAD  Comparando con un Método de Referencia.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

51 22.25 23.62 25. 1.09 21.62 22.Universidad Nacional de Ingeniería 7.54 27 .02 Método nuevo 21. Método de referencia 21. Ejemplo: La veracidad de un método para la vigilancia de la concentración de SO2 en el aire.1.54 24. DETERMINACION DE LA VERACIDAD  Comparando con un Método de Referencia.54 20.72 21.31 21. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.30 24.27 23. fue determinada por comparación de los resultados obtenidos del método a validar con los resultados de un método de referencia.20 24.

Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.2. PRECISIÓN Grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento experimental repetidas veces bajo las condiciones establecidas Nivel de variabilidad Repetibilidad Precisión intermedia Reproducibilidad 28 .

PRECISIÓN La precisión depende sólo de la distribución de los errores aleatorios y no se relaciona con el valor verdadero. 29 .2.Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. La medida de la precisión generalmente se expresa en términos de imprecisión y se evalúa en base a la desviación estándar de los resultados de la prueba.

sobre objetos de prueba idénticos. usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempos cortos. por el mismo operador. en el mismo laboratorio. condiciones según las cuales los resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo método. PRECISIÓN Repetibilidad Precisión en condiciones de repetibilidad.2.Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. 30 . es decir.

es decir.Universidad Nacional de Ingeniería 7. por diferentes operadores. sobre objetos de prueba idénticos. 31 . condiciones según las cuales los resultados de prueba se obtienen con el mismo método. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. en diferentes laboratorios.2. PRECISIÓN Reproducibilidad Precisión en condiciones de reproducibilidad. usando diferentes equipos.

Universidad Nacional de Ingeniería 7.1. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN  Repeticiones Muestra.2. independientes Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 en Muestra Repetición n Se determina por:  Comparación con RSD de Horwitz 32 .

2. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN  RSD experimental:  RSD Horwitz: Criterio de decisión s RSDexperimental  100 x ión RSDHorwitz  2(10.Universidad Nacional de Ingeniería 7.1.5log(Concentrac )) Conclusión RSDexperimental < RSDHorwitz RSDexperimental ≥ RSDHorwitz Metodología Precisa Metodología No Precisa 33 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.

5logC 34 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO Ecuación de Horwitz Valores aceptables de precisión en función de la concentración para reproducibilidad (aceptados por AOAC) %RSD  210.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

21 0.18 0.21 0.19 0.19 0.Universidad Nacional de Ingeniería 7.16 0.16 Repetición 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 mg/kg 0.17 0. Repetición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mg/kg 0. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN Ejemplo: Para determinar la precisión en un método se evaluó la dispersión de los resultados en una muestra.17 0.21 Repetición 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 mg/kg 0.17 0. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.19 0.20 0.18 0.21 0.19 0.22 0.20 0.21 0.17 0.2.19 35 .20 0.18 0.19 0.1.22 0.19 0.18 0.20 0.21 0.23 0.

20 0. DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN Resultados Concentración Desviación promedio (mg/kg) estándar (S) 0.Universidad Nacional de Ingeniería 7.39 Conclusión: La metodología es Precisa 36 .15 %RSD Horwitz 20. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.2.1.0183 %RSD Experimental 9.

Universidad Nacional de Ingeniería 7. 37 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. 1987). SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD Selectividad Caracterización cuantitativa de la presencia de interferencias en la determinación de un analito mediante un procedimiento determinado (IUPAC Compendium of Chemical Terminology.3.

 Selectividad cuantitativa: Caracterización cuantitativa de interferentes.Universidad Nacional de Ingeniería 7. 38 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.3. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD  Selectividad cualitativa: Indicación de la presencia de sustancias interferentes.

39 . etc).Universidad Nacional de Ingeniería 7.3. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD Especificidad Capacidad de un método para determinar el contenido de un analito inequívocamente en presencia de otros componentes (impurezas. matriz.

o Contribuir a la señal del analito produciendo un aparente incremento en su concentración.3. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD Si las Interferencias están presentes y no pueden ser separadas del analito o no son conocidas pueden tener varios efectos en el análisis: o Distorsionar la señal. o Suprimir la señal del analito.Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. 40 .

3. DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD La prueba consiste en verificar que las interferencias no afecten significativamente la señal.Universidad Nacional de Ingeniería 7. Se realiza muy frecuentemente en técnicas instrumentales como: espectrofotometría de UV o cromatografía liquida. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.1. gaseosa. 41 .

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD Ejemplo: Para técnicas cromatográficas. se debe de comparar visualmente los cromatogramas en los diferentes parámetros importantes como: resolución.1. tiempo de retención. etc.Universidad Nacional de Ingeniería 7. Se analizan: Blancos reactivos Blanco de matriz Analito puro Patrón del Analito Matriz adicionada con concentración conocida de analito puro 42 .3.

43 . DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD Ejemplo: Se debe comparar los resultados obtenidos en los distintos registros.Universidad Nacional de Ingeniería 7. y debe observarse:  La señal correspondiente a la matriz sea despreciable frente a la del analito. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.  La señal del analito en la matriz fortificada debe seguir el mismo patrón que la señal del analito puro.  En el mejor de los casos. que no se detecte señal en el blanco de matriz.3.1.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. “El límite de detección. expresado como concentración cL. LÍMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN Límite de Detección (LoD) La menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas. 44 .4.Universidad Nacional de Ingeniería 7. se deriva de la medición mas pequeña xL que puede ser detectada con certeza razonable para un procedimiento analítico dado.

LÍMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN XL = Xbl + k Sbl Es la medida de las mediciones del blanco (10). PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. Es la desviación estándar de las mediciones del blanco.Universidad Nacional de Ingeniería 7. 45 .4. valor positivo o cero. Es un factor numérico elegido de acuerdo al nivel de confianza deseado.

Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. LÍMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN Límite de Cuantificación (LoQ) Menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas. 46 .4. Se obtiene multiplicando por el factor el valor obtenido en el calculo del límite de detección correspondiente.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 47 .Universidad Nacional de Ingeniería 7.

12 cPb + 0.312 Siendo cPb la concentración de plomo en ppm y S la señal de la intensidad relativa de la línea de emisión de plomo. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN Ejemplo Los datos obtenidos en la calibración para determinar plomo a partir de su espectro de emisión de llama se analizaron por mínimos cuadrados y la ecuación obtenida fue: S = 1. 48 .1.Universidad Nacional de Ingeniería 7.4.

49 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN Ejemplo Se obtuvieron los siguientes resultados en los replicados:  Determine el límite de Detección y el límite de Cuantificación.1.4.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

ICH Harmonized Tripartite Guideline) 50 . PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.5. RANGO DE TRABAJO  Es el intervalo entre las mas baja y alta concentración del analito de la muestra. (Text on validation of analytical procedures. para la cual se ha demostrado que el método de ensayo tiene un nivel apropiado de precisión y exactitud.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

51 .5.  Dentro de rango de trabajo puede existir un rango de respuesta lineal. RANGO DE TRABAJO  El rango se expresa en las mismas unidades que los resultados obtenidos por ese método. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.  Los rangos son establecidos por las normativas.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

que estaría dada por los valores del límite de detección o límite de cuantificación.Universidad Nacional de Ingeniería 7.  La mayor concentración estaría establecida por efectos que dependerán de la técnica analítica y del sistema de respuesta del instrumento. 52 .1.5. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. OBTENCIÓN DEL RANGO DE TRABAJO Dicho intervalo esta definido por:  La menor concentración del intervalo.

Universidad Nacional de Ingeniería 7.1. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. OBTENCIÓN DEL RANGO DE TRABAJO 53 .5.

6. LINEALIDAD Es la relación entre la concentración del analito y la respuesta del método. 54 . Esta relación denominada generalmente como “Curva de Calibración” no siempre es lineal.Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. La linealidad define la capacidad del método para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito. en estos casos se debe determinar la ecuación adecuada.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.  Mediante evaluación del intervalo de trabajo realizando cálculos según la teoría regresión lineal por mínimos cuadrados. 55 .Universidad Nacional de Ingeniería 7. LINEALIDAD Verificación  Mediante inspección visual.6. además de su confirmación mediante revisiones de linealidad empleando al menos 10 diferentes concentraciones.

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7.  La mayor concentración estaría establecida por efectos que dependerán de la técnica analítica y del sistema de respuesta del instrumento. que estaría dado por el valor del límite de cuantificación.1. 56 .6. OBTENCIÓN DE LA LINEALIDAD Obtención  La menor concentración del intervalo.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

Concentración (ug/mL) 0 2 Intensidad de fluorescencia 0.1 8. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. OBTENCIÓN DE LA LINEALIDAD Ejemplo Analice el intervalo de calibración lineal del siguiente experimento de fluorescencia.2 31.Universidad Nacional de Ingeniería 7.1.0 57 .7 24.0 4 6 8 10 15.6.5 33.

Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. también puede aplicarse al método analítico como un todo.7. SENSIBILIDAD Cambio de la respuesta del sistema de medición en función del cambio de la concentración del analito. O es la capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias de concentración del analito. Nota: Aunque esta definición se aplica claramente a un instrumento de medición. 58 .

59 . DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Obtención Se evalúa mediante la sensibilidad de calibración. el gradiente de la respuesta de la curva.7. si la respuesta es lineal con respecto a la concentración. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. es decir.1. que es la pendiente concentración/ unidades de intensidad de los datos de la curva de calibración a la concentración de interés.Universidad Nacional de Ingeniería 7.

Universidad Nacional de Ingeniería 7. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD 60 .1.7.

8.Universidad Nacional de Ingeniería 7. ROBUSTEZ La robustez es una medida de la resistencia de un método al cambio de respuestas cuando se introducen pequeñas variaciones en el procedimiento. PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. (EURACHEM – Guide The fitness for purpose of analytical methods) 61 .

PARÁMETROS DE DESEMPEÑO 7. INCERTIDUMBRE La incertidumbre es un parámetro asociado con el resultado de una medida que caracteriza la dispersión de los valores.Universidad Nacional de Ingeniería 7.9. 62 . que podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando el cual comprende varios componentes.