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Les ARN catalytiques - L’édition - La virologie
Sommaire

Introduction! I. Les introns du groupe I (IG1)!
I.A. Distribution! 1.B. Structure primaire et secondaire! I.C. Analyses phylogénétiques des structures secondaires et tertiaire! I.D. Les ions métalliques! I.E. La réaction d’autoépissage! I.F. Des IGI codent des endonucléases! I.G. Histoire évolutive de la mobilité des IG1!

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II. Les introns du groupe II (IG2)!
II.A. Formation d’un lasso! II.B. Structure des IG2!

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III. Les ARN catalytiques ou ribozymes!
III.A. La RNase P! III.B. Les viroïdes - virusoïdes!

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IV. L’édition des ARN!
IV.A. Les fonctions d’éditions! IV.B. Mécanismes d’insertion-délétion! IV.C. Mécanisme d’édition par conversion de bases! IV.D. Implications évolutives!

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V - La virologie!
V.A - Le bactériophage ƛ! V.B - Le bactériophage MS2!
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Introduction
On pensait initialement que seule les protéines été doué d’une activité catalytique, car : Les structures tridimensionnelles sont extrêmement variées Variabilité importante de groupes réactifs liés à la nature même des acides aminés Les possibilités dans les sites catalytiques sont aussi très variées (dues à la structure tridimensionnelle justement)

Mais il se trouve que les protéines ne sont pas les seules molécules du vivant à porter des capacités catalytiques. Ceci a été montré par l’étude de système de maturation des ARN Certains ARN peuvent être porteurs de différentes réactions catalytiques : ribozymes Ces ribozymes sont qualifiés comme des enzymes protéiques - Activité dirigée contre une molécule différente (activité intermoléculaire) - Activité dirigée contre eux-mêmes (activité intramoléculaire) Les exemples les plus frappants sont les introns des groupes 1 et 2 qui sont doués d’autoépissage. On a réussi in vitro à modifier leurs actions catalytiques. C’est le cas de la ribonucléase P : enzyme qui intervient dans le clivage de certain ARNt, c’est une ribonucléoprotéique. C’est un complexe formé d’une protéine, mais aussi d’une molécule d’ARN. Les 2 sont liées de manière covalente et dans ce complexe c’est l’ARN qui porte l’activité catalytique. La protéine a juste un rôle indirect dans le maintien de la conformation Il y a un socle commun à toutes ces réactions catalytiques : ce sont toujours des réactions de clivage/formation de liaisons phosphodiester. La plupart des réactions ne nécessitent que l’ARN, mais souvent in vivo il faut une protéine pour que l’ARN maintienne sa conformation afin que l’action catalytique se passe bien Les phénomènes d’édition de l’ARN : Dans les cellules eucaryotes, il y a maturation de l’ARN sous forme d’épissage, mais il existe un autre processus dans la modification de la séquence d’ARN, c’est l’édition. Il peut y avoir des phénomènes d’additions ou de délétions. Cette édition se fait de manière individuelle. Dans la majorité des cas, ce sont des additions d’uridine (pour des gènes mitochondriaux). Donc cela implique 2 choses : Une trame, un modèle qui indique ou doit avoir lieu la modification Le clivage et la formation de liaisons phosphodiester

I. Les introns du groupe I (IG1)
Les introns sont des séquences nucléotidiques spécifiquement retirées de leur ARN qui sont formées par le processus de transcription. A priori, ce n’est pas de l’information génétique
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Il existe des introns du groupe I, II, III et splice osomaux On les classe selon : - Leurs propriétés - Leurs structures - Leurs activités catalytiques Ces IG1 sont capables d’épissage, mais représentent aussi des éléments génétiques mobiles (un peu comme des transposons)

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I.A. Distribution

On en a détecté dans différents compartiments cellulaires : Nucléaire Plastidiale Mitochondriale

Les IG1 sont présents chez une large majorité d’eucaryotes, mais on en a trouvé chez certains virus et Eubactéries, mais pas chez les Archae. Ils ont été découverts en quantité importante dans l’ADN mitochondrial des champignons. Ils sont plutôt représentés chez les eucaryotes inférieurs, mais pas chez les animaux (sauf pour les anémones et les coraux) Au niveau du génome, on les trouve insérés dans différents groupes de gènes. Il n’y a pas de préférence apparente au niveau de ces insertions néanmoins ils sont plutôt inséré dans des régions conservées des gènes Les IG1 sont observés dans les gènes nucléaires eucaryotes, mais seulement dans les gènes d’ARNr. Chez les eubactéries sont retrouvé dans les boucles anticodons des ARNt

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1.B. Structure primaire et secondaire

La plupart de ces éléments sont composites. On trouve donc : ! Une phase ouverte de lecture (ORF) qui code la synthèse d’une protéine Une séquence ARN qui encadre cette ORF Tous les IG1 possèdent la même structure secondaire alors qu’il ne possède pas la même structure primaire (structure primaire = séquence nucléotidique). Cela dit la structure primaire possède des régions tout de même conservées. À chaque extrémité, on retrouve des nucléotides identiques pour tous les IGI (commence par un T et fini toujours par un G). On a une conservation de la localisation de certaines adénosines. Les régions P,Q,R et S sont les 4 régions principales qui participe, en se rejoignant, à la formation de la structure secondaire
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3 types de structures (régions) : - Tiges (Px) Boucles (Lx) Jonctions (Jx/y)

Les tiges P1 et P10 ont besoin de séquences exoniques pour se former. Ces tiges sont formées par des bases complémentaires selon les règles de Watson et Crick. Mais on trouve aussi des associations entre bases non complémentaires (G-U) qui sont relativement bien conservées dans la tige P1. Les tiges PI et P10 sont des tiges transitoires qui permettent un rapprochement de leurs espaces et qui aide au processus d’épissage Les parties d’introns associés aux exons sont appelées  : IGS. On pensait que ces régions avaient un rôle important dans les IG1 et donc dans la réaction catalytique, mais apparemment elles ne sont pas si importantes que ça, car quand on modifie leurs séquences, la réaction se fait tout de même La structure P7 est la structure la mieux conservée dans tous les IG1, elle s’étend sur 6 pb, un nucléotide saillant n’est associé à aucun nucléotide. À l’intérieur on trouve une paire de base GC qui est présente universellement dans tous les IGI Les tiges sont observées dans toutes les régions. Le corps est formé de toutes les tiges sauf P2 et P10
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I.C. Analyses phylogénétiques des structures secondaires et tertiaire
La structure secondaire est fondamentale pour l’activité catalytique des Introns et pour confirmer le modèle, on fait des analyses de mutation en cis (on modifie directement la séquence de l’intron) On prend le gène de la β-galactosidase dans lequel on ajoute l’intron de type I (on fait cette construction dans un plasmide)

Une fois dans la cellule bactérienne, on lui donne un substrat (X-Gal) incolore et des que la βgalactosidase coupe la liaison, le X devient bleu. Donc on voit que l’intron de type I fonctionne. Si on mute l’intron et qu’on modifie sa structure secondaire, les colonies seront blanches et donc il n’y aura plus d’activité catalytique On peut refaire des mutations jusqu’à ce que l’une d’entre elles permette de récupérer l’activité catalytique normale, mais avec une séquence en nucléotide différente (ceci est très informatif) Les structures secondaires interagissent entre-elles aussi pour former des structures tertiaire. Elles font intervenir les boucle de l’intro qui interagissente entre-elles. A l’interieur des boucles,
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on trouve des tétraboucles (tetralogs) constitué de 4 nucléotides (-G N R A - ) c’est au travers de ces séquences que les interaction tertiaire se forment à l’interieur de l’intron. Il y a des interactions hydrogène comme si qu’il s’agssait de pair de base classique avec parfois des interactions boucles-tiges qui conduit à la formation de triplets (3 bases qui s’associent). Ceci permet à l’intron de se replier sur lui-meme. Analyse de covariance : on fait varier la séquence d’une tetraboucle et on regard avec qu’elle région elle interagit normalement Structures secondaire et tertiaire sont essentielles pour l’activité catalytique de l’intron

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I.D. Les ions métalliques

Les introns de types I sont qualifié de métallo enzymes. Ces structures ont besoin d’ions métallique pour pouvoir fonctionner correctement, ce sont nottament des ions divalents Role des ions divalents : - Il intervienne dans la stabilisation de la structure de l’intron lui-meme Cations interagissent avec le squelette ribose phosphate chargé negativement et on stabilise les répulsion électrostatique Pour le maintient de la structure secondaire et tertiaire, 3 ions essentiels : - Mg++ - Mn++ - Ca++ - Il intervienne dans la chime de la réaction catalytique Seul le Mg et le Mn ont une activité maintenus (pas le Ca). Le plus efficace est le Mg

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I.E. La réaction d’autoépissage

Elle a été découvert initialement chez Tétrahymena thermophila (protozoaire cillié). C’est un modèle en biologie. Il possède un ARNr qui provient d’un ADN qu’on qualifie d’ADNr (= épisome). Cette ADNr est completement autonome. Ces ARNr sont synthétisé sous forme de précurseur premièrement (pré-ARNr) Schéma Dans la partie 26 S, on trouve une région IVS = intervening sequence qui doit sortir du préARNr pour donner un ARNr mature Cette réaction d’apissage fait intervenir aussi une guanosine qui est externe à l’intron. C’est un cofacteur nécessaire à la réaction d’épissage. Aucun autre base ne peut substituer la guanosine. Néamoins toutes les formes de guanosine fonctionnent (GMP, GDP, GTP) pour la réacton
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d’apissage de l’intron de type I. La réaction ne nécessite donc pas d’énergie (on n’a pas hydrolyse des groupements phosphates). Ce sont les grouement hydroxyle de la guanosine qui vont être utilisé pour la réaction de catalyse (hydroxyle en 2’). L’implication de cette guanosine peut être suivi grace à de la guanosine radioactive 3 réactions de transfert succesifs au cours de la réactions d’épissage (réactions de trans estérification) : 1ère réaction : l’attaque nucléophile de la guanosine sur l’extrémité 5’ de l’intron. Cela conduit à la formation d’une structure intermédiaire dans laquelle on trouve la guanosine incorporé dans l’intron de type I 2ème réaction : Cela conduit a libérer un groupement 3’ OH qui va attaquer le coter 3‘ de l’intron. Cela implique la cassure d’une liaison phosphodiester et à la reformation d’une liaison phosphodiester entre les 2 exons Ces 2 première réactions sont interconnécté, elles ont lieu en meme temps et dans un espace relativement restreint. On a jamais été capable d’observer les 2 réactions séparément. On trouve jamais les 2 exons formé sous forme libre, on les observe directement attaché On libère donc un intron sous forme linéaire et sa guanosine supplémentaire 3ème réaction : circularisation de l’intron de type I. L’extremité 3’ OH attaque l’extremité 5’ ce qui conduit à la reformation d’un liaison phosphodiester et on obtient une boucle. On a pas besoin de formation de liaison phosphodiester supplémentaire, c’est pourquoi cela ne demande pas d’energie (c’est juste des transformations) Si la reaction n’a pas besoin d’energie, en générale cette réaction se termine par un nucléaire entre les substrat et les produits finaux. Or ici, pas d’équilibre, la réaction est totale. Car : - Désiquilibre........ - Au final, on perd les produits finaux de la réaction car l’intron tire la production vers ces strucure cyclique de l’intron In vitro, cette réaction d’excision peut avoir lieu avec l’ARN seul (juste l’intron, du Mg et de la guanosine). Il n’y a donc aucun intervention de protéine dans ce processus. Néanmoins, in vivo, ce n’est pas le cas, on a besoin de protéines. Les protéines sont juste impliqué dans la stabilisation de la structure de l’ARN mais n’intervienne pas dans la réaction L’intron est toujours catalytique, meme quand il est excisé du site dans lequel il se trouvé

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2 types de réactions de cyclisation : - Soit extremité guanosine attate ...... - Soit la guanosine attaque l’uridine en position 20 Ces réactions de cyclisation ne sont pas définitive, on peut les rendre à nouveau linéaire avec de l’eau. On peut avoir d’autres types de réactions. Après l’obtention d’une structure circulaire, on peut avoir des réaction avec des triplet d’uridine. Addition de triplet sur l’intron. Réaction de polymérisation, il ajoute des nouveaux nucléotides à sa séquence. Tout ça sans intervention de protéine Tout ça montre que les ARN été les précurseur des molécules de la vie car elles portent l’information génétique et sont capable d’activité catalytique
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In vitro, l’activité de l’intro est intrinsèque In vivo, l’activité à besoin de protéines Quelles est l’implications de ces protéines ? Neurospora crassa. On a isolé des mutant cyt 18. Ils sont défectueux pour l’épissage de plusieurs introns de types I de la mitochondrie. Le produit du gène cyt 18 est une tyrosyl t-RNA synthétase mitochondriale. C’est une protéine impliqué d’une t........... La mutation pour cette protéine est importante pour les introns de types I

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I.F. Des IGI codent des endonucléases

Certains IGF possèdent des ORF qui vont être traduite en protéine. Ces protéines vont être implqiué dans le processus de mobilité de l’intron Comment on a pue montre que les IGI été mobiles ? Saccharomyces cerevisiae. On a observé des croisements polaires Gène du grand ARNr : - Forme omega + (possède l’intron) - Forme omega - (possède pas l’intron) alpha omega + ! x! a omega -

On obtient des descendance tous omega + -> bizzard Dans une segregation de type mendelien, on devrait obtenir 50 % d’omega + et 50 % d’omega Il y a donc un processus de mobilité de l’intron. L’allèle omega + va envahir l’allèle omega Un certian nombre d’experience ont été ensuite réalisé : omega + (transgénèse avec UV dessus)! On obtient 50 % ω! x! x! omega -

50 % omega - (UV dessus)

on obtient 50% ω + et 50% ω -

Selon l’individu muté, on a des informatins differentes sur ce qu’il se passe chez ces individus : * Si mutagénèse sur oméga + indique qu’on a une perte de la mobilité de l’intron. La mutagénèse a induit des modification de la séquence de l’intron. Ou alors il y a une ORF qui contient un gène et la mutagénèse UV entraine la modification de cette phase ouverte de lecture et empeche la mobilité
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* SI on fait de la mutagénèse sur des individus qui ne possède pas l’intron, on perd tout de meme la capacité de mobilité de l’intron. Ceci est peut etre due à la modification du site cible

Lendonucléase a une fonction de clivage et une activité de revers transcriptase. On a alors une coupure dans le site cible (gène sans intron). On laisse libre une extrémité 3’OH libre. L’endocucléase utilise l’ARN (qui est l’intron a inserer) comme matrice et allonge à partir de l’extremité 3’OH. .......... C’est un mécanisme qui ressemble fort à celui des rétrotransposons La séquence cible est relativement longue (18 pb) et c’est dans cette séquence que l’intron va être incorporé. L’endonucléase se comporte comme une enzyme de restriction. On a des extremité débordante qui sont produite. La particularté de ce mécansime semble etre universel et ça quelque soit la sequence cible et meme si il n’y a pas d’homogie entre les séquence codante dans les introns

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La longueur (relativement grande) des séquences cibles permet une grande spécificité. On va parler de domiciliation de l’intron. L’ORF code l’endonucléase (Homing Endonuclease Gene)

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I.G. Histoire évolutive de la mobilité des IG1

Les IG1 sont repartis de manière sporadique dans tout les classes d’être vivants. Donc cela suggère que les IG1 ont plus subit des transferts horizontaux entre les espèces. Si l’IG1 été apparu très tot et qu’il été transmis de manière verticules, on aurait une répartition homogène dans toutes les classes d’espèces

Plus la lettre est grande, plus l’IG1 est fortement représenté Il est très difficile de reconstitue l’origine d’un IG1 dans une espèce donnée surtout si il est transmis de manière stable de descendant en descendant. Cette transmission de descendant en descendant conduit à la fixation de l’intron ou a une perte de celui ci

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2ème difficulté : il s’agit d’élément mosaique, présence d’ORF à l’interieur de l’intron (l’ORF et l’intron n’ont pas la meme histoire évolutive). L’intron existait avant l’ORF. Au depart les IG1 n’été donc pas mobile D’autre part, on obeserve l’insertion de l’intron dans une séquence hétérologue et en particulier lorsqu’il vient se placer dans une espèce diferente (transfert horizontaux) ceci est due à la variabilité de l’ORF entre les espèces. Il y a une sorte de d’independance entre l’ORF et l’intron

La mobilité de l’intron, au cours du temps envahis toute la population. L’endonucléase n’a donc plus besoin de fonctionner, elle subit donc des mutations qui s’accumulent au fil du temps, elle fini par n’être plus fonctionnel. Et donc parfois elle est perdu. Donc encore après d’autre individu pourront ensuite ne pas posséder l’intron et il ne pourra plus être transféré chez eux car l’endonucléase est perdue, jusqu’a ce quelle revienne -> on obtient des cycles

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II. Les introns du groupe II (IG2)
Les IG2 s’autoexcise par la formation d’un lasso

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II.A. Formation d’un lasso

On trouve ces IG2 dans les génomes bactériens et dans les génomes des organelles (plastes et mitochondrie) Génome bactérie : cyanobactérie et protéobactérie Ces IG2 s’autoexcise selon un processus different des IG1 Le groupements nucléophyle va permettre à l’opeartion d’excision. L’attaque nucléo............... snRNA qu’on trouve dans le splicosome laisse penser qu’il dérive d’un IG2 L’intron commence par une séquence de type GU et fini par une séquence AG. On retrouve à l’interieur de cet intron, un site de branchement qui est une adénosine impliqué dans la réaction d’épissage (il se trouve dans un bloque de pyrimidine). Ces introns classque n’ont pas de structures secondaires particulières............

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La structure secondaires est très conservé quelque soit l’IG2 mais la structure primaire est très différentes. Ils sont capable de sé....

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II.B. Structure des IG2

Structures avec 6 domaines (le plus important est le 6) : - Domaine D6 : contient l’adénosine non apparié qui permet l’attaque nucléophile de l’extrémité 5’ de l’intron -> transesterification - Domaine D4 : domaine dans lequel on retrouve fréquemment une ORF (un gène qui permet de synthétiser une protéine qui a une activité d’endonucléase de de transcriptase invers comme les IG1 snRNA -> ce qu’on retrouve dans le spliceosome. Petit ARN qu’on retrouve chez les IG2 et les processus d’épissage dARNm donc cela nous laisse penser que cela est lié à l’évolution Chez les IG2, il s’agit d’une réaction en trans, il n’agisse pas sur eux meme

Au dela des structures secondaires, on retrouve aussi des structures tertiaires (boucle qui se lient entres-elles pour se replier dans l’espace) Ce type de réaction est aussi neutre en énergie et conduit à une structure en lasso Les ORF conduit à la production d’une protéine qui a une activité d’endonucléases et transcripase inverse qui permette la domiciliation de ces IG2, meme principe que précedemment
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La protéines produite possède 3 domaines (N-ter -> transcriptase inverse ; maturase au milieu ; C-ter -> endonucléase) Maturase : impliqué dans les processus d’épissage de l’ARN -> aide à l’ARN de prendre sa forme mature par les diverses repliements Certains IG2 ne posède pas le gène qui permet la production de la maturase L’activité maturase permet le maintient de l’ORF

III. Les ARN catalytiques ou ribozymes
! ! III.A. La RNase P

Complexe ribonucléoprotéique constitué de protéines et d’ARN -L’ARN -> 375 nucléotides - Polypeptdide -> 20 kDa Activité d’endonucléase dirigé contre les ARNt chez E.Coli. Permet de produire la structure finale de ces ARNt. In vitro, on pensait au départ que les 2 partie été necessair pour la réaction catalytique mais en fait non, seul l’ARN est nécessair pour avoir l’activité catalytique. Cela dit la vitesse de la réaction augment très fortement si la protéine est présente

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III.B. Les viroïdes - virusoïdes

On les appels les small plant RNA qu’on retrouve dans les plantes. Taille environ de 350 nt. Ils sont capables de réactions d’autoclivages (réaction en cis) 2 classes : dans tout les cas ARN monocaténaire circulaire : - viroides : molécule d’ARN infectieuse et qui sont fonctionnelement indépendante (elles ne codent aucun protéines et pas associé à des protéines in vivo) - virusoides : en général encapsidé dans les capside des virus qui infecte la plante. Ils ne peuvent pas se répliquer de maniere independante, ils ont besoin d’un virus helper

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Ils ont des processus de réplication un peu particulier dit en Rolling circle (= cercle tournant) 2 manière de procéder à la réplication en rolling circle : - A gauche de l’image rolling circle asymétrique : formation d’un ARN complémentaire de manière concatémère forme (-) (qui ne s’arrete pas). Transcription de ce concatémère pour redonner une forme (+) complémentaire qui va se cliver et se refermer sur elle meme pour redonner les viroides. Cette réplication a lieu dans le noyau et s’effectue probablement par l’ARN polII car plusieur evidences : * L’ARN typII purifié peut transcrire l’ARN + in vitro * Ce processus est sensible à l’alpha amanitine * Experiene de coimmunoprécipitation (CEVD). Les sous unité de l’ARN polII vienne .... A droite, Autre réplication symmétrique : L’ARN + est transcrit en ARN - produit sous la forme de concatémaire. L’ARN - va être autoclivé, se referme pour produire des négatif de l’ARN de départ qui sert de matrice pour refaire un rolling circle et qui recréra la meme séquence d’origine Pour cette famille, la réplication est permis par 2 polymérase dans le plaste (NEP et PEP) soit c’est un pol synthétisé par le génome nucléaire (NEP) ou par le génome plastidiale (PEP) Les formes concatémère de ces ARN ont une capacité d’autoclivage donc qui les classes dans la catégorie des ribozyme. Ceci a été montré de manière sur définitive. Cette réaction nécessite
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la présence d’ions métalliques (comme IG1 et IG2) et ce qui est particulier cest que la réaction de clivage qui intervient après un cycle de dénaturation renaturation. Cela indique que la structure secondaire est particulièrement importante pour que la réaction se fasse Structure en tete de marteau (hammerhead) :

Ce repliement est justé nécessaire pour que la relation de clivage est lieu. On a pue commencer à manipuler les séquences de ces ARN pour produire d’autres ARN capable d’autocliva afin de traiter des pathologies, cancers ...

IV. L’édition des ARN
! ! IV.A. Les fonctions d’éditions

Il y a encore une trentaine d’années, le dogme de la biologie moléculaire. ADN -> ARN -> Protéine directement entres toutes ces molécules. Cela a été remis en cause par l’épissage des ARNm mais aussi on a découvert des modifications post-transcriptionnel (coiffe du coté 5’ et queue poly A du coté 3’). Dans les Années 80, il y a a un autre processus post-transcriptionnel a été découvert. On a découvert que des résidus d’uridine été soit additionné, soit délété, en particulier dans l’ARN mitochondrial et qui ne Edition concerne les 3 grandes classes d’ARN : ARNr, ARNm et ARNt

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Pour les ARNm, création de nouveaux codons START ou STOP par insertion d’uridine ou de convertion de cytidine en uridine, obersvé chez certains protozoaires, les organelles de plantes et meme chez l’homme
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On peut avoir spécifiquement des suppression de codon STOP par remplacement d’uridine par ... création d’ORF par insertion de nucléotide. on peut avoir des décalages en ORF altérnative (chez paramyxovirus) Substitution d’acides aminées par des changement de C en U et de U en C. Ou par de A par inosine Ces evenements d’édition concerne des nucléotides très conservé dans les ARNm ou concerne des codons qui sont essentiel à l’activité de la protéines. L’édition est très rare dans les parties 5’ ou 3’ UTR ou dans les introns. Pour les ARNt : - Réactions d’édition qui peuvent concerner les 4 types de nucléotides. Certaines réaction change l’identité de l’ARNt, il ne reconnait plus le meme AA à transporter Pour les ARNr : Très peu de cas pour ces ARN mais dans tout les cas, ces réactions d’éditions sont importantes, en particulier, elles sont impliqué dans les réaction catalytiques de polymérisation de peptides Différents types d’évenements d’éditions :

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IV.B. Mécanismes d’insertion-délétion

* Insertion ou délétion post-transcriptionnelle de nucléotide (a gauche A) Quelle est la matrice qui permet de remplacer le nucléotide de manière précise (ciblage?) On a trouvé des ARNg (= ARN guides), ils permettent de cibler le site de modification de la séquence d’ARN. Processus de transestérification ou clivage ligation Finalement c’est le processus de clivage ligation qui intervient :

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* Délétion puis insertion de nucléotide (a droite B) C’est ce qu’on trouve principalement chez les ARNt. C’est un processus de remplacement. Cela implique d’abord une activité nucléasique (on ne sais pas si elle est endo ou exonucléase) L’enzyme qui est nécessaire à la reformation est plutot particulière. Activité pol 3’ -> 5’ (c’est le contraire en temps normal) Ce qui sert de guide est la tige qui dépasse du coté 3’. Il sert de modèle pour modifier la séquence de l’ARNt ! ! * Insertion de nucléotide pendant la transcription

Observé chez paramyxovirus, pour une protéine particulière (protéine P); On rajoute des résidu de guanise, jusqu’à 4 ou 5 résidus pendant la transcription. Modification de l’ORF dans tout les cas, cela est due à la polymérase stuttering (= begaiement) cela se deroule dans le cytoplasme. C’est l’ARN polymérase du virus qui est responsable de cette réaction et nécessite une matrice ribonucléoprotéique. Cette insrtion de G supplémentaire est lié àune insertion réitérrative des meme bases de la matrice. Cela arrive a des endroits ou elle s’arrete de faire une pause, revenir en arrière. Il va y avoir un décalage entre les brins complémentaire et on aura la formation de boucle

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* Insertion mixte de nucléotide Observé dans le cas du protiste chez Physarium. Processus qui se déroule pendant la transcription et qui conduit à l’insertion de nucléotide. L’insertion se fait toujours sur l’extrémité 3’ OH et la aussi c’est toujours lié à une pause de l’ARN polymérase. Mais cette fois ci, les 4 types de nucléotide peuvent être incorporé (mais on ne sais pas encore ou et comment la pol doit avoir lieu la modification)

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IV.C. Mécanisme d’édition par conversion de bases

Observé dans les transcrit d’organelle de plante. Au niveau des ARNt d’organisme eucaryotes unicellulaire et ARNm chez vertébrés et inertébrés
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Cest phénmène de convertion sont due à des désamination (A -> I ou C -> U) ou aminations (U -> C) * Conversion de C en U Observé chez les vertébrés en particulier au niveau de l’ARNm de l’apolipoprotéine B (protéine qui intervient dans la formation des lipoprotéine plasmatique -> transport lipide dans le sang). On a un changement d’un codon de type CAA -> UAA (codon stop). On a un arret préoce de la traduction. L’évenement de désamination est nucléaire

Cette réaction a besoin de l’intervention d’une séquence tripartite (on retrouve 3 domaine dans cette séquence qui permet l’édition dans l’ARNm) Le complexe protéique «Editosome» qui contient une protéine cytidine desaminase intervient sur ce site tripartite et permet l’édition Cette désamination n’est pas spécifique à l’apolipoprotine B mais dans d’autres séquence chez les certaines plante et l’Homme On a pue montrer de manière formelle que ce n’est pas un remplacemet de la base mais une de desamination

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* Conversion de U en C Observé chez quelques plantes terrestres inférieur, famille des hépatiques. Obervé chez mammifères dans le cas des tumeurs de Wilms (tumeur rénal qui se développe chez l’enfant. On ne connait pas encore les mécnismes d’édition de U en C. Cela doit être un processus similaire à celui que fait la CP synthétase (elle synthétise la cytidine triphosphate) -> Elle produit le CTP à partir de CDP par un mécanisme d’amination * Conversion de A en I Découvert dans les ARNt de levure et certains........ L’inosine s’apparie avec un cytidine 50 % de conversion d’adénosine en inosine Ce type d’édition peut avoir aussi lieu dans les introns (chose assez rare) Ce phénomène d’édition se fait dans des régions très conservé en terme de structure secondaire cela suggère que ce type d’édition est fait par des adénosine désaminase et que c’est enzymes sont spécifiques des dsRNA (double stranded RNA)
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Les enzymes concernent les meme que celles qui contiennent l’APOBEC1 vue précedement. ADAR (adénosine désaminase that act on RNA)

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IV.D. Implications évolutives

Comment quand et pourquoi ce phénomène a t’il lieu ? Comment l’évolution de ce gène est t-elle affecté par le processus d’édition ?

Tout ces mécanismes sont très différents, il est donc peu probable que l’ensemble de ces mécanismes proviennent d’un seul mécanisme ancestral qui aurait divergé au cours du temps Par ailleurs la distribution de cette édition est sporadique. Argument pour dire que ces mécanismes sont apparu relativement tard dans l’évolution D’autre part, on le retrouve pas chez les archées ni chez les bactéries Il faut pouvoir imaginer un modèle coévolutif qui pourrait expliquer l’origine de l’édition de l’ARN Le mécansime d’édition permet de corriger un probleme dans la séquence de l’ARN (décalage de l’ORF, absence d’un codon STOP...) mais on peut pas imaginer en terme d’évolution que l’édition apparait en meme temps que l’erreur. Il faut penser que l’édition commence à appareitre alors qu’il n’est pas requit, lié au processus de la duplication d’un gène (desaminase) et puisqu’on a 2 copies d’un désaminase (une normale, et l’autre qui évolue et qui a des propriétés nouvelle qui agit sur des polynucléotide au lieu de nucléotide) au fil du temps, cette désami-

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nase va permettre au gène concerné de lui meme commencer à évoluer et de produire plusieurs forme........................ Le cas de l’apolipoprotéine B : un gène code cette enzyme qui fait 100 kDa et à l’interieur de l’ARNm de cette protéine, il y a un site éditable qui conduit à la production d’une protéine de 48 kDa et c’est 2 protéines sont nécessaire pour l’organisme L’édition de A en I s’explique par les meme processus ....................

V - La virologie
On s’interesse aux cycles de réplication, de développement de bactériophages Caractéristiques générales des virus : Caractéristiques biologiques : capable de se multiplier uniquement dans des cellules vivantes (virus-hôte). Les hotes peuvent êtres soient des cellules eucaryotes pour procaryotes Caractéristique chimiques et physiques : nombre restreint de constituant ➠ protéines et acides nucléiques. Les particules virales qui permette à l’infection de se transmettre de cellule à cellules = virion. Tout les virion d’une famille sont identiques entre eux. Définition d’un virus (par André Lwoff 1953) : - Le virion ne possède qu’un seul type d’acide nucléique (soit ARN, soit ADN) - Le virion se multiplie à partir de son seul acide nucléique - Le virion est incapable de croitre et de subir des division binaire - Le virion n’a aucune informations génétique concernant le métabolisme intermédiaire - La multiplication du virion implique l’utilisation de la cellule hote et en particulier les ribosomes (parasitisme absolue) Terminologie : ✓ Virion : produit ultime du développement viral, constitué de matériel génétique (ADN ou ARN) et se matériel génétique et protégé par une ou plusieurs structure spécifiques, les plus simples coques protéiques (capside) ✓ Capside : construite à partir de sous unité protéique multiple ou un seul type de protéines. La capside lorsque est associé à l’acide nucléique on l’appel nucléocapside 2 types de nucléocapside : - Nue : association de la capside et du matériel génétique seulement suffit - Enveloppée : embarque des éléement de la membrane de la cellule hote, formation d’une enveloppe autour de la capsude, se ne sont pas des éléments viraux

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V.A - Le bactériophage ƛ

Il est qualifié aussi de bactériophage tempéré. Virus de bactérie (E.Coli) qui est constitué d’une nucléocapside nue, d’ADN double brin de 48 000 pair de bases 2 mode de développement possible : - Cycle non productif intégratif : cycle de développement qui conduit à ne pas produire de nouvelles particules virale et integrative dans la mesure ou le génome de phage vient s’integrer dans celui de la bactérie - Cycle productif lytique : production de nouvelle particule virale et lytique car il conduit à la lyse de la bactérie infectée L’état integré de lambda dans la bactérie n’est pas définitif, cela veut dire que certains signaux vont faire reprendre au virus un cycle productif lytique La bactérie qui possède 1 copie du génome lambda = bactérie lysogène Le virus integré est quant à lui appelé provirus/prophage Le processus de dvp de lambda est devenue un modèle très tot car on maitrisé bien les cycles lié au dvp de ce phage et la séquence complete du phage a été obtenue dans les années 80 (grace à Sanger) Quand il est à l’interieur de sa capside, le genome de lambda est sous forme linéaire. Le phage vient se fixer à la surface de Coli par l’intermédiaire de récepteur. Il va injecter son ADN bicaténaire linéaire dans le cytoplasme. La première chose : l’ARN se circularise grace à l’existence de séquence «cos» (extrémités cohésives) qui possèdent des bouts débordants qui avec un ADN ligase va fermer les liaisons phosphodiester. C’est une réaction qui nécessite de l’énergie Lorsqu’il est sous cette forme circulaire, c’est la que le choix entre les 2 cycles va se faire Si le virus choisis le cycle non productif, il s’integre dans le génome au travers de site spécifique «att P» = attachement et un site similaire dans la bactérie «att b» une recombinaison entre les 2 permet l’integration. La recombinaison se fait par la recombinase de lambda Les sites d’attachement font à peu pret 200 pb mais il y a une partie central qui est strictement identique, c’est à se niveau qu’il y a recombinaison. Cela ne necessite pas d’énergie et réversible. Donc si le phage veut reprendre un cycle lytique, il doit impérativement sortir de l’ADN de la bactérie -> c’est le phénomène d’excision Phénomène d’excision : Effectué aussi par l’intégrase + l’excisionase (protéine) etant elle aussi une protéine codé par le génome de lambda

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Lorsqu’il est sous la forme circulaire, des le début d l’infection, on va avoir l’expression de gènes viraux à travers 2 promoteur (PL et PR) synthèse d’un certains nombre de transcrit PL -> Left (controle opéron de gauche) PR -> right (controle opéron de droite) .......ARN pol E.Coli
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Opéron de gauche : Le 1er gène rencontré est le gène N : il code un anti-terminateur de transcription (protéine N) -> Protéine qu empeche d’arreter la transcription de manière précoce car entre N et C3, on trouve une séquence qui est un terminateur de transcription (terminateur à la fin de chaque gène). Cette antiterminateur a un autre effet sur le gène cro sur l’opéron de droite, et permet d’ampecher la synthèse Tout les gènes présent dans l’opéron, sont appelé gènes précoces O et P : produisent des protéines qui vont être des régulateur de la réplication du génome de lambda Q : protéine Q -> antiterminateur de la transcription qui va permettre l’expresion des gène tardifs (entre N et J) qui vont permettre la synthèse des protéine de la capside ...... Lorsque c’est la voie lytique : le produit du gène Q va augmenter pour permettre l’expression des gènes tardifs Les gènes qui vont décider l’un ou l’autre cycle de dvp vont etre cro et C2. Les protéines correspondant à ces 2 gènes la s’accumule des le début de l’infection. Ces protéines ont des effets oposés essentielle au choix du dvp du virus (lytique ou integratif)
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Comment s marche ? : C2 active transcription de C1. C1 se trouve entre les 2 opérons, il est transcrit à partir du promoteur PRE. La protéine C1 est le represseur de lambda qui favorise le cycle intégratif. Lorsque la concentration de cette protéine C1 est importante, elle peut régulé sa propre régulation grace au promoteur CRM. C1 va bloquer les promoteur des fonctions lytiqu et en particulier la transcription du régulateur Q cro va favoriser le développement lityque du phage,

La protéine C2 est nécessaire pour synthétiser C1 à partir du promoteur PRE C1 réprime les gènes tardifs La protéine cro favorise le dvp lytique du phage. Elle va ralentir la production d'ARNm à partir des promotteur PR et PL On empeche l'ARN polymérase d'allé vers C2 et ...... On réduit la synthèse de O, P et Q mais il y en a assez pour maintenir un développement lytique(c'est un choix définitif) cro bloque aussi la synthèse de C1 à partir du promotteur PRM utilisé par C1 lui meme pour sa propre production cro et C2 ont des effets oposés et à priori, on ne sait toujours pas pourquoi, on peut allé d'un coté ou de l'autre Comment se fait ce choix ? PR et PL -> les protéine cro et C1 se fixe sur ces promotteurs. Elles se fixe sur des régions qu'on appel : opérateurs. - Opérateurs OL (gauche) - Opérateurs OR (droite)

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3 opérateurs : elles ont des séquences qui se ressemble mais qui ne sont pas identiques. Du coup cro et C1 auront des affinités différentes pour ces 3 opérateurs cro a plus d'affinité plus l'opérateur OR3 qu'avec OR1 et OR2. De ce fait en se fixant sur l'opérateur OR3, elle masque le promotteur PL ce qui empeche la synthese des gene par la polymerase. Du coup, la polymérase synthétise plus de protéine cro qui peuvent après se fixer sur OR1 et OR2 C1 a plus d'affinité avec OR1 que les 2 autres. On bloque alors le promotteur PR et du coup C1 réprime la synthèse de cro. Association en trimère de C1 qui recouvre OR2. Ceci permet de recruter l'ARN polymérase sur le promotteur PRM pour favoriser sa propre production. Lorsque la concentration de C1 augmente en concentration, C1 interagit avec OR3, elle masque PRM et réprime sa propre synthèse (système d'auto-régulation -> maintient du taux de concentration uniforme) Cela se passe de la même manière au niveau de l'opérateur PL Au début de l'infection, la concentration de C1 et cro sont primordiale pour le choix du développement du phage. C1 est dépendant de C2. C2 est requis pour permettre la synthèse de C1 à partir du promotteur PRE. L'importance de la protéine C2 a été montré par des analyse de mutation. Toute les mutation de C2 donnent des phages lytiques
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En fait il existe une activité de régulation de C2 en fonction des conditions physiologique de la cellule bactérienne affecté Si les conditions de croissance bactériennes sont idéales (milieu gélosé en laboratoire par exemple) : concentration en AMPc plutôt basse dans les cellules -> messager secondaire qui indique les conditions physiologique dans laquelle se trouve la cellule. L'AMPc provient de l'AMP -> ADP -> ATP et plus la croissance est idéal, plus on a d'ATP. Dans ces conditions, l'activité de C2 baisse SI les conditions sont défavorables (milieu minimum) : dans ce cas la concentration en AMPc augmente. Dans ces condition, la concentration de l'activité de C2 augmente La concentration de C2 est due à la sensibilité des protéases. En faisant du recyclage lorsque les conditions sont bonne, elle dégrade C2. La bactérie peut entamer un cycle lytique afin d'en tirer bénéfice Lorsque les conditions sont faible, le métabolisme est faible, l'activité des protéase est faible, donc pas de dégradation de C2 qui va alors activer C1 D'autres conditions : le nombre d'infection par les phage : Plus le niveau d'infection est élevé, plus le cycle lysogène va être choisi et vice versa Qu'est ce qui fait qu'on a la production de C1 à partir du promoteur PRE PRE : il possède une région -10 et -35, dans sa configuration normal il n'est pas reconnu pas l'ARN polymérase (ce n'est pas un vrai promoteur). La protéine C2 vient se fixer autour de la région -35, ce qui rend lisible le promoteur visible par l'ARN polymérase C2 agit aussi sur le promoteur PI. Il s'agit d'un promoteur qui se trouve à l'interieur du gène de l'excisionnase, il favorise l'expression de l'integrase

LE role des protéine N et Q : Ce sont des antiterminateur de transcription. Ce sont des protéines qui agissent pour empêcher une terminaison précoce de la transcription La protéine N agit sur 3 sites d'actions La protéine Q régule l'expression des gènes tardifs. PR' -> 26 kb -> polycistronique Séquence nut -> permet la fixation de l'antiterminateur sur l'ARN qui vient s'associer à l'ARN polymérase.
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Le phénomène de rétro-régulation : concerne le gène de l'Int donc le gène de l'intégrase. On a vu que C2 activé la synthèse d'ARNm a partir de PRE pour la synthèse de C1. C2 est aussi necessaire pour la synthese de l'integrase à partir de Pi.Le probleme c'est que l'integrase peut etre produite à partir de la transcription qui débute au promoteur PL. DOnc la protéine peut être produite de 2 manière. En fait ce n'est pas le cas, elle peut l'être mais pas en meme temps L'ARNm produit à partir de PL ne permet pas la production de l'intégrase, il est spécifiquement dégradé au niveau des séquences de l'intégrases. Seul celui qui est produit à partir de Pi sera efficace Pourquoi cette différence ? cela est due à la structure de l'ARNm du coté 3' :

Pour PL : l'association de l'ARN polymérase avec l'antiterminateur conduit a la production de nucléotide surnuméraire qui sera sensible par la nucléase et donc elle sera dégradé Pour Pi : la structur est resistante aux nucléase Quand le phage est integré, on a que C1. Si le phage decide de reprendre un cycle lytique et il doit utilisé l'integrase de lambda. Le seul promoteur qu'on peut utiliser c'est le promoteur PL pour produire l'integrase. Et à l'état integré, le fait que le genome viral est coupé pour etre integré, la séquence terminateur ne sera plus actif et donc l'ARN produit ne presentera plus le defaut d'instabilité qu'on observe lorsqu'il est circulaire
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La réplication de l'ADN phagique : 2 protéine importantes : O et P. La protéine O reconnait l'origine de replication de lambda (ori lambda) et vient s'y fixer, un fois fixer, il y a recrutement de la protéine P. Le role de la protéine P est de recruter la protéine bactérienne dna B qui est une hélicase. Elle sert à ouvrir la double hélice. L'origine de replication de lambda se trouve dans le gène O lui-meme.

Fixation de dimère de la protéine O sur la structure bicaténaire Pour qe cela est lieu, il faut que l'ARN pol soit dans une région toute proche car pour transcrir, l'ARN pol ouvre la double hélice et c'est en ouvrant que l'on obtient les épingles à cheveux et qu'on obtient les structure bicaténaires Le mode de réplication est variable selon le stade de développement : Au début de l'infection : quelques cycles de réplications par les forme teta -> augmente le nombre de copie de lambda dans la cellule infecté Rolling circle (cercle tournant) : mode de réplication pour les nouvelles particules virales. Il explique pour l’ADN phagique est sou forme linéaire dans la capside et pourquoi les régions cos sont trouvé à chaque extrémité du phage lambda. Il est basé sous l’utilisation des formes circulaire. On va avoir un seul complexe de régulation Mettre schéma ADN pol (bactérienne) ori lambda Obtention d’un concatémère. Il pourra y avoir alors encapsidation. Les capsides se forme de manière autonome. L’encapsidation de l’ADN se fait à partir d’une séquence cos Coupure de la séquence cos par Prot A + Nu1 (protéines virales) La linéarisation de l’ADN bicaténaire est due à la coupure des sites cos L’integration de lambda dans la bactérie est un processus stable mais qui n’est pas définitif. Il peut arriver à un moment que les phages reprenent un cycle lytique. Cela implique le processus
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d’excision, l’activité de l’intégrase (intégrase et excisionase). Quel type de signal va induire le cycle lytique ? Il faut une chose : inactiver la protéine C1 -> répresseur du phage lambda. Lorsque le phage est integré, c’est la seul qui est produite à partir du phage. C1 bloque du coup la capacité à produire cro et bloque le promoteur PL C’est la qu’intervient le système SOS : système qui est mit en place par les bactéries lorsqu’elles subissent des agressions de hautes fréquence de leurs ADN (Système de réparation). Le meilleur moyen de déclancher ce système est de soumettre les bactéries aux UV (on induit des dimères de thymine qui ne sont plus reconnus pas l’ADN polymérase). Le seul moyen de réparer, il faut enlever les dimères. On se retrouve alors avec des parties monocaténaires de l’ADN qui va permettre l’introduction du phage lambda. Rec A = protéine bactrienne -> elle devient protéase lorsque l’ADN est monocaténaire, elle agit sur la protéine lex A qui est le represseur du système SOS Rec A a aussi pour cible C1 -> réresseur de lambda -> permet donc la reprise du cycle lytique (logique pour la bactérie car si la bactérie va mal, il vaut mieux se reproduire et quitter la cellule bactérienne)

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V.B - Le bactériophage MS2

Virus de bactérie. Bactériophage à ARN. ARN monocaténaire qualifié d’ARN (+) car il est directement codant. Taille de l’ARN : 3600 nucléotides. Virus le plus simple qui soit connu. Seulement 4 gènes (4 phases de lectures) décrites. Bactériophage particulièrement prolifique

1 gène de l’enveloppe : correspond aux gènes de l’enveloppe (protéine de la capside -> 129 aa -> 180 exemplaire/virion) Gène A : Gène de maturation de la protéine A (protéine de 393 aa -> 1 seul exemplaire/virion) nécessaire à l’attachement à la cellule bactérienne, on la retrouve au niveau de la capside

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Gène de la réplicase : protéine de 544 aa , impliqué dans la réplication du génome phagique Gène du lysozyme : protéine de 75 aa, nécessaire à la lyse de la bactérie pour la libéraprotéine de lyse (tion des nouveaux virions Pas de système de régulation aussi sophistiqué que lambda car il n’y a 4 gènes

L’ARN du phage MS2 est monocaténaire, il a la capacité de se replier sur lui-meme et qui forme des structures secondires particulièrement développé. Les repliments observé au niveau de ces ARN permettent d’expliquer comment le phage régule les différent gènes qu’on trouve à l’intérieur de ce génome. C’est l manière dont l’ARN est replié et la formation de ces structures secondaire qui va expliquer la manière dont le phage controle et régulé les différent gènes que l’on trouve à l’interieur de ce génome. On a besoin de régulation car on a besoin de 180 exemplaire de protéines de l’enveloppe par particule virale alors qu’on a besoin seulement d’un seul exemplaire de la protéine de maturation, donc il n’est pas nécessaire d’allé produire de protéine de maturation que de protéine de l’enveloppe. On a besoin une régulation, cela ne sert a rien de mobiliser les ressources pour allé produire une protéine dont on a pas besoin, on a en besoin du moins que de seulement quelques exemplaire. C’est pareil pour la réplicase car une seul molécule de réplicase est capable de répliquer plusieurs millier de molécule à elle-seule.
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Ce qui est important c’est de mobiliser les resources pour aller produire cette protéine de l’enveloppe. Cet ARN est replié sur lui meme aves des structures un peu particulière. Sur l’ARN, toutes les séquences du coté 5’ sont des séquences qui sont non traduites en protéines, elles forment en quelques sortent une région 5‘UTR. Le premier codon de traduction que l’on trouve et qui permet d’initier la synthèse de la protéine A (codon GUG). Le gène de la protéine A est représenté par un trait jusqu’au codon de terminaison, puis on continue, on retrouve des structures secondaires particulièrement développé. On va retrouvé ensuite le codon d’initiation de la capside de l’enveloppe, on continue jusqu’au codon de terminaison de la capside, ensuite on trouve le codon d’initiation de la réplicase jusqu’au codon. La protéine de lyse est chevauchante avec le gène d l’enveloppe et celle de la réplicase et enfin, tout le reste jusqu’à la terminaison 3’OH n’est pas traduit. On a donc une 5’ UTR et une 3‘UTR. Ces régions non traduites sont des régions qui sont certainement nécessaire à la stabilité de l’ARN, pour maintenir sont intégrité, les repliements empechent les attaques par les nucléases et en particuliers les nucléases de la bactérie qui sont les seules armes de la bactéries fasse aux intruions de matériel génétique comme le font les enzyme de restriction Ces repliements au niveau de l’ARN vont être particulièrement important pour le controle de l’expression de ces différents gènes Comment controle t-on l’expression de ces différents gènes ? Les carrés noirs repreesente les sites d’initiation de la synthèse des 3 protéines majeures (protéine A, de la capside et la réplicase). Dans ce contexte et suite aux différents repliement, le seul site qui est accéssible aux ribosomes, est le site d’initiation de la synhèse de la capside. C’est le seul site qui lorsque l’ARN est replié à l’interieur du cytoplasme dans la bactérie est accéssible par les ribosomes. Les 2 autres sites d’initiation (protéine A et réplicase sont dit fermé), c’est a dire que les ribosomes n’arrivent pas à les reconnaitre parce qu’ils sont impliqué dans des structures secondaires. Du coup si les ribosomes reconnaissent uniquement le site d’initiation de la synthèse de la capside, et bien ils vont venir se fixer dessus et commencé la traduction du gène correspondant jusqu’au site de terminaison. C’est un système qui produit en continue des protéines de l’enveloppe et cela est nécessair car le virus a besoin de 180 protéines de l’enveloppe pour formé une particule viral. Lorsque les ribosomes commence à lire l’ARN et bien forcement, ils sont obligé de casser les structures pseudo bicaténaire pour pouvoir lire correctement cette ARN et cela a une conséquence c’est du coup le site d’initiation de la synhèse de la réplicase va s’ouvrir. C’est les ribosomes qui sont entrain de lire le gène qui est a coté qui vont casser ses structures secondaire et ouvrir le site d’initation d la réplicase qui va être traduit. Le probleme c’est qu’on a pas besoin d’allé produire autant de réplicase que de protéine de l’enveloppe donc le système doit continué de manière pour l’enveloppe mais pas pour la réplicase. Le site d’initiation de la synthèse de la réplicase va se refermer très rapidement, en fait, comme la structure s’est fait ouvrir, la structure a tendance à se replier sous une forme particulière en forme d’épingle à cheveux qui n’est pas la meme que la structure initial. Cela va conduire a refermé le site qui va redevenir illisible pour les ribosomes qui vont être incapable de reconnaire le codon AUG. Si cela ne tenait qu’à ça, cela ne permettrait pas d’expliquer pourquoi le site du coup est fermé de manière très forte et ne plus réaccéssible par la suite. Il se trouve
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que les protéines de l’enveloppe qui elles sont produites de manières importantes et qui s’accumulent de manière importante dans le cytoplasmes vont être capables d’interagir avec les structures secondaire dans l’ARN au nveau de séquence consensus. Les protéines de l’enveloppe s’y fixent de manière très stable. C’est ce repliement en épingle à cheveux plus les protéines qui bloque de manière de manière définitive le codon d’initation de la réplicase. Comment marche le système de réplication de ce virus ? La réplicase ne fonctionnent pas toute seule, elle est impliqué dans un complexe qui implique 3 sous unité protéines bactérienne qui vont s’associé à la réplicase pour favoriser la réplication du génome phagique. C’est ce qui fome le complexe de la réplicase. Initialement, on a à l’intérieur de la bactérie, un seul exemplaire de l’ARN+. Cet ARN+ va servir de matrice pour allé synthétiser un ARN- complémentaire. Tout les acides nucléiques synthétsé in vivo sont des acides nucléques synthétisé de 5’ vers 3’ donc du coup, on doit lire la matrice dans l’autre sens, on lie la matrice de 3’ vers 5’ pour pouvoir synthétiser le brin complémentaire. On a la réplicase qui va venir se fixer sur l’extrémité 3’ de l’ARN+ pour migrer vers l’extrémité 5’ et donc allé synthétiser le brin complémentaire. Un fois l’ARN- synthétisé, il sert à rien d’autre que de servir de matrice pour allé servir de matrice pour allé produire des ARN+ et du coup, le complexe de la réplicase à la propriété de venir se fixer sur l’extrémité 3’ de cet ARN- pour synthétiser un ARN+. On a système qui produit des ARN- dont la seul fonction est d’allé synthétisé des ARN+. On a donc besoin de synthétiser beaucoup plus d’ARN+ que d’ARN- car les ARN+ servent à traduire les protéines et les nouvelles particules virales. On a un système qui favorise formtement la synthèse des ARN+ tout simplement parce que la réplicase a plus d’affinité pour l’extrémité 3’OH des ARN- que l’extrémité 3’OH des ARN+ Pendant le processus de réplication, on pourrait imaginer que comme les 2 brins d’ARN sont complémentaire forment des structures bicaténaires, après tout, ils sont tout à fait complémentaire mais en fait, on observe jamais ces structures et c’est surement la réplicase qui est responsable de cette situation, la présence de la réplicase empeche les 2 ARN de se refermrer l’un sur l’autre. Cela a été observé in vitro, lorsqu’on dégrade la réplicase, on retrouve un appariement bicaténaire Il reste la synthèse de la protéine de maturation (A) celle dont on a besoin d’un seul exemplaire par particule virale, quand a lieu la synthèse de ces protéine la ? Elle dépend de l’ouverture du site d’initiation de la traduction. Le seul moment qui permet la synthèse de la protéine A est le moment ou on est entrain d’allé répliquer les ARN- en ARN+. le site d’initiation de la réplicase va être ouvert quand on est entrain de répliquer des ARN- en ARN+. Au début de la synhtèse de l’ARN+, il n’a pas encore eu le temps d’adopter un repliement secondaires que les ribosomes ont reconnus le codon d’initiation de la traduction (GUG) et du coup il initie la traduction de la protéine de maturation mais cela ne peu se passer que pendant un brève instant, ensuite il y a un repliement

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