ANALISIS KUANTITATIF ANDROGRAFOLID DALAM EKSTRAK SAMBILOTO (Andrographis paniculata Ness) SECARA KLTKTDENSITOMETRI

Awal P, Mujahid R, Yuli W. Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional Badan Litbang Kesehatan Kem Kes RI

ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian penetapan kadar andrografolide dalam ekstrak sambiloto (Andrographis paniculata Ness). Penelitan ini bertujuan untuk mengetahui kadar andrografolide dalam ekstrak sambiloto dengan menggunakan metode KLTKTDensitometri. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan etanol 90%. Ekstrak etanol dan baku senyawa andrografolide ditotolkan pada plat KLTKT Silika gel-F254, dengan menggunakan Linomat 5, kemudian dieluasikan dalam chamber yang berisi campuran CHCl3: MeOH (9:1), sebagai fase geraknya. Setelah proses eluasi, plat kemudian dikeringkan. Deteksi noda serta kuantifikasi dilakukan dengan Densitometer Scanner Camag- Wincat 4. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa panjang gelombang serapan maksimal antara noda ekstrak dan larutan baku adalah sama, yaitu pada panjang gelombang 230 nm. Kadar andrografolide pada ekstrak adalah 15,54 + 0,16 % b/b dengan KV 1,01%. Kata kunci: Ekstrak sambiloto, KLTKT-Densitometri, adrografolid

PENDAHULUAN
Sambiloto merupakan salah satu bahan penyusun ramuan jamu antidiabetes, dan dibuat sediaan bersama-sama simplisia yang lain dalam bentuk serbuk simplisia, pil, kapsul ataupun kaplet (Anonim, 2008). Sambiloto memiliki rasa yang sangat pahit. Rasa pahit ini disebabkan oleh senyawa andrografolid (Arshia dkk., 2007). Rasa pahit sambiloto 2,8 kali rasa pahit dari kuinin HCl (Ameh dkk., 2007). Andrografolid merupakan senyawa aktif utama dalam sambiloto, dan berkhasiat sebagai antidiabetes (Subramanian dkk., 2008). Andrografolid ditemukan pada bagian akar (Kardono dkk., 2003), batang dan daun (Farnsworth & Bunyapraphatsara, 1992) serta herba (Kulyal dkk., 2010). Andrografolid merupakan kristal tidak berwarna larut dalam metanol, etanol, aseton, piridine, etil asetat, kloroform dan asam asetat, namun sedikit larut dalam air dan tidak larut dalam dietil eter (Qiang, 2007). Uji kualitatif andrografolid dalam ekstrak dilakukan dengan jalan melarutkan andrografolid ataupun ekstrak dalam etil asetat (Chao & Lin, 2010). Hal ini dilakukan karena etil asetat mampu melarutkan andrografolid, namun tidak melarutkan klorofil yang masih tersisa dalam ekstrak, sehingga dapat meminimalisir kemungkinan terganggunya pengamatan karena adanya klorofil. Uji kualitatif selanjutnya dilakukan dengan jalan membandingkan nilai Rf kromatogram dari andrografolid baku dan ekstrak, serta mengamati panjang gelombang maksimumnya. Uji kuantitatif andrografolid dapat dilakukan secara titrimetri, spektrofotometri, HPLC maupun KLTKT (Mamatha, 2011). Namun metode penetapan kadar andrografolid secara spektrofotometri, memiliki kelemahan yaitu pada saat penambahan KOH etanolat

90

1 mm. cukup teliti dan sensitive. 1998.1 mg baku andrografolid.1 mg andrografolid dalam 50 ml etil asetat. 1992).042 µg/µL. dieluasikan pada fase gerak. Fase diam menggunakan plat KLTKT Silikagel F254.. dkk. Etil asetat (EMerck). Densitometri dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. 4. Larutan baku andrografolid dalam etil asetat (larutan 1) ditotolkan pada Plat KLTKT ukuran 5 x 20 cm. aluminium sheet (E-Merck). Penyiapan larutan baku andrografolid. sehingga larutan baku andrografolid memiliki konsentrasi 0. 20x5. Pembuatan kurva linearitas. Metanol (E-Merck). Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil ini menyebabkan semakin banyak jumlah lempeng pemisah. 2. Bercak yang diukur dengan system fluoresensi. serta seragam dengan ketebalan 0. 2004). dan dieluasikan dalam fase gerak CHCl3:MeOH (9:1).. Jarak 91 . dkk. 10. dari bulan Juni 2010 hingga November 2010. METODOLOGI Bahan dan Alat Penelitian Penelitian dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional. CHCL3 (E-Merck). sehingga pemisahan menjadi lebih efisien (Gandjar & Rohman. serapan ultraviolet atau sinar tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi warna (Gandjar dan Rohman. mudah dilakukan. dibandingkan dengan standar. 2008). KLT-Densitometri.. Larutan baku dibuat dengan melarutkan 2. diamati harga Rf kromatogram. 2000. Metode ini sederhana. menggunakan Linomat-5. Fase diam pada KLTKT memiliki ukuran pori-pori yang sangat halus. serta memerlukan banyak tahap ekstraksi dan purifikasi (Saxena. Jalannya Penelitian 1. Linomat 5. Pada penetapan kadar andrografolid secara HPLC memakan waktu relative lama. Tawangmangu-Jawa Tengah. Fase gerak menggunakan campuran CHCL3:MeOH (9:1). Ditimbang seksama 2. KLTKT merupakan salah satu metode penetapan kadar yang cukup luas digunakan dengan hasil yang cukup memuaskan. Penotolan larutan standart sebanyak 5. cepat memudar (Maiti dkk. aluminium sheet 20x5. Plat Silikagel F254 KLTKT.30 dan 35 µL. Penyiapan fase diam dan fase gerak. Sharma. Uji Kualitatif andrografolid dalam Ekstrak Sambiloto. Sistem fluoresensi biasanya lebih disukai karena kelinieran respon dan selektifitasnya lebih tinggi serta gangguan fluktuasi latar belakang lebih rendah (Gandjar dan Rohman. ditotolkan pada plat KLTKT. Penjenuhan chamber dilakukan selama 20 menit. Wincat 4.pada larutan andrografolid akan terbentuk warna merah. 2008). Srivasta dkk. 2008). Uji kualitatif andrografolid dalam ekstrak dilakukan dengan jalan melarutkan andrografolid ataupun ekstrak dalam etil asetat.. jarak eluasi 3. Pada analisis kuantitatif.20. bercak pada fase diam dapat langsung diukur menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri. deteksi kromatogram dilakukan pada 230 mn. tetapi warna merah tersebut tidak stabil. serta dapat diterapkan untuk ekstrak kasar (Bhutani.25. sehingga dapat diterapkan untuk penetapan kadar andrografolid dalam ekstrak. 3.5 cm. 1959). dilarutkan dalam 50 ml etil asetat. KLTKT dimaksudkan untuk mendapatkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih baik dibandingkan KLT biasa. Baku andrografolid (Sigma-Aldrich).15.

5 cm. dihomogenkan. Ditimbang ekstrak sambiloto + 80. divorteks selama 3 menit. divorteks selama 3 menit. ditambah dengan 2. Ditimbang baku andrografolid dengan konsentrasi 80-120%. Uji akurasi dilakukan dengan menghitung perolehan kembali analit dalam rentang konsentrasi 80-120% (Harmita. 5. Ekstrak dimasukkan dalam labu takar 200 ml.0 mg. kemudian didiamkan hingga kedua lapisan memisah. 2004).5 ml etil asetat. Dibuat grafik konsentrasi vs luas area. Semakin tinggi prosen perolehan kembali. ditambah dengan 1. ditambah dengan 1 ml SLS 0. dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Sebagai parameter adanya hubungan linier.5 ml larutan 1. Dihitung perolehan kembali andrografolid . Dipipet fraksi etil asetat. Profil Kromatogram Baku andrografolid (S) dan ekstrak sambiloto (E). kemudian ditotolkan pada plat KLTKT silikagel GF254. menunjukkan efisiensi proses ekstraksi yang dilakukan. Dipipet 1 ml larutan 1. Dipipet 2.5. 2008). bergantung pada arah garis persamaan. Uji presisi dilakukan dengan menghitung nilai standar baku relatif atau koefisien variasi (KV). Perolehan kembali baku andrografolid dalam etil asetat setelah diekstraksi dengan dapar asetat pH 4. intersep (a) dan koefisien korelasi (r). dilarutkan dalam 50 ml etil asetat (larutan 1). ketelitian dan linearitas yang dapat diterima. Dipipet fraksi etil asetat. dimasukkan dalam labu takar 5 ml.5 ml etil asetat. 6. ditambah larutan dapar asetat pH 4. Rentang konsentrasi sampel menunjukkan batas terendah dan tertinggi analit yang dapat ditetapkan dengan ketepatan. sebanyak 15 µL. kemudian ditotolkan pada plat KLTKT silikagel GF254. Penetapan Kadar Andrografolid dalam ekstrak sambiloto. Syarat akseptabilitas akurasi dan presisi adalah nilai perolehan kembali 98-102% dan KV= 2% (Nash & Wachter. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Hasil analisa kualitatif andrografolid dalam ekstrak sambiloto ditampilkan pada gambar 1 sebagai berikut: S1 S2 E1 E2 Andrografolid Gambar 1. 2004). Penentuan Akurasi dan Presisi Abdrographolide. semakin efektif proses ekstraksi. Hubungan linier ideal dicapai jika a = 0 dan r = +1 atau r = -1. 2003.1. ditambah dengan dapar asetat hingga garis tanda (larutan 1). digunakan koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier Y= a + bx. Deteksi dilakukan pada λ 230 nm (Aulia. diamati pada UV254 nm 92 . Dihitung perolehan kembali andrografolid. kemudian didiamkan hingga kedua lapisan memisah.eluasi 3.5. Data yang ada kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi hingga diperoleh nilai slope (b). Harmita.

Seng silikat ini akan berfluoresensi saat terpapar sinar UV 254 nm (Gandjar & Rohman. Nilai Rf baku Andrografolid dan ekstrak sambiloto. serta harga Rf spot yang sama antara baku andrografolid dan ekstrak sambiloto pada nilai Rf = 0. Keterangan: S1 & S2 = Standar andrografolid E1 & E2 = Ekstrak sambiloto S2 S1 E2 E1 Gambar 2. ditampilkan pada Gambar 2. sehingga akan tampil sebagai bercak-bercak berwarna gelap. menunjukkan adanya pemadaman noda. Berdasarkan data scanning panjang gelombang larutan baku andrografolid dan ekstrak sambiloto yang berhimpit pada λ 230 nm.38. dengan latar belakang pendar hijau muda dari cahaya UV254 nm (Sherma & Fried.Pada gambar 1 terlihat bahwa pengamatan KLTKT dibawah sinar UV254 nm. 2003). Hal ini terjadi. Hasil pengamatan spectrum panjang gelombang maksimal antara baku andrografolid dan ekstrak sambiloto. 4 Rf = 0. Spektrum baku Andrografolid dan ekstrak sambiloto pada  230 nm Dari gambar 2 terlihat bahwa panjang gelombang maksimal baku andrografolid dan ekstrak sambiloto berimpit pada panjang gelombang 230 nm. 2008).51 Rf = 0. maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak sambiloto positif mengandung senyawa andrografolid. 93 . Adapun hasil pencatatan Rf kromatogram ditampilkan pada Gambar 3.38 (Andrografolid) 1 Rf = 0.82 3 2 Rf = 0. karena adanya senyawa seng silikat yang ditambahkan pada fase diam KLTKT. akan menghalangi masuknya sinar UV menembus plat.11 Gambar 3. Sedangkan senyawa yang ditotolkan di atas plat.

3009 0. Hasil uji linearitas metode densitometri berdasarkan luas area untuk pembuatan kurva baku Andrografolid (0. setelah dieluasikan dengan CHCl3:MeOH (9:1) C andrografolid (µg) Luas Area Luas area/10000 Persamaan Regresi 0.01 102.80 Rata-rata + SD = 99.4302 120% 1 2 3 2450 2423. dilihat dari nilai r hitung lebih besar dari r tabel pada p = 0.08 2095.78 Perolehan kembali (%) 100.44 = 100.1194 menunjukkan korelasi yang baik.14+1. dilarutkan dalam etil asetat.15 1663. 4406 µg/µL. Hasil terlihat pada Tabel I.85 +1.2058 µg/µL sampai 1.754 (Muhidin & Abdurahman. 1988).07 100% 1 2 3 0.81 0.3832 2058 0. kemudian 94 .93 1699.95+0.50 = 101.4195X + 0.4195X + 0.9901 Persamaan garis regresi (konsentrasi vs luas area) Y = 0.4881 0.38 KV (%) 80% 1 2 3 1.4406 1653 3009 4055 4881 5568 6461 6906 0.4244 0.67 99.6461 0.3305 Kadar tesoritis (µg) 1666 Kadar pengamatan (µg) 1677.05 99.0290 1. Uji akurasi (ketepatan) dalam penelitian ini digunakan untuk mengetahui efektifitas proses ekstraksi yang dilakukan.3333 1666 Rata-rata + SD 0. Jika r hitung lebih besar dari r tabel pada p dan db tertentu. dapat ditentukan.5568 0.Hubungan linier antara konsentrasi andrografolid baku dengan luas area ditentukan dengan membuat seri pengenceran baku andrografolid hingga diperoleh rentang konsentrasi 0.95 1.3288 1666 0. apakah linearitasnya memenuhi syarat atau tidak. yang didasarkan pada nilai r hitung hasil regresi dibandingkan dengan r tabel pada taraf kepercayaan dan derajat bebas tertentu.258-1.4281 2450 0. Tabel II.1653 0. Tabel I. maka dikatakan bahwa linearitasnya baik dan dapat digunakan untuk perhitungan selanjutnya (Miller & Miller. Hasil yang diperoleh berupa konsentrasi vs luas area dan selanjutnya dibuat persamaan garis regresi linier serta ditentukan koefisien korelasinya.98 2100.2348 1.4116 0.11 2048.39 2452.3837 0.61 2450 2469.8232 1.6174 0.3772 2058 2058 Rata-rata + SD 0. Baku andrografolid konsentrasi 80-120%.95 Hasil akurasi & presisi dapat dilihat pada Tabel II.98 102.1194 r = 0.92 100. Hasil uji akurasi dan presisi baku Andrografolid Konsentrasi Replikasi Luas Area teoritis/1 0000 0.4406 µg/µL). Dengan nilai koefisien korelasi tersebut.4055 0.05. 2007).2058 0.11 98.01 101.54 100.6906 Y = 0. db = n-2 = 5 yaitu r = 0.

jika nilai perolehan kembali andrografolid mendekati nilai sebenarnya.5 divorteks 3 menit. nilai perolehan kembali 98-102%. 2003. Profil kromatogram pada sinar UV 366 dan UV 254 dapat dilihat pada Gambar 4. maka kedekatan nilai analisis kadar andrografolid dalam etil asetat setelah proses ekstraksi akan berbeda jauh dengan kadar andrografolid dalam etil asetat sebelum proses ekstraksi. untuk memastikan nilai presisinya. Namun. dilakukan 9 replikasi. 2004). Nilai perolehan kembali yang relatif tinggi ini. sedangkan profil kromatogram hasil scanning menggunakan densitometri ditampilkan pada Gambar 5. nilai KV= 2% (Nash & Watcher. Pada penetapan kadar andrografolid dalam ekstrak.. Profil kromatogram baku andrografolid dan ekstrak berdasarkan densitometry 95 .07% masuk dalam rentang penerimaan data akurasi dan presisi.92 -102. Jika etil asetat tidak mampu melarutkan andrografolid. menunjukkan bahwa proses ekstraksi yang dilakukan berjalan efektif. Berdasarkan Tabel II dapat dilihat bahwa prosen perolehan kembali dari proses ekstraksi pada rentang 98. yaitu untuk konsentrasi analit >10%.951.05% dengan nilai KV berkisar pada rentang 0. didiamkan hingga terpisah 2 lapisan Selanjutnya lapisan etil asetat ditetapkan kadarnya. Gambar 4. Harmita. maka proses ekstraksi berjalan efektif.ditambah dengan dapar asetat pH 4. Profil kromatogram baku andrografolid dan ekstrak pada λ 254 nm dan 366 nm Gambar 5.

J.&Res.54 KV (%) 1. Sci.754 (Muhidin & Abdurahman. K.. Unair (ABSTRAK). 2007. hal:43-45. Manna.G.4631 0. yang berarti bahwa sebaran data hasil analisis tidak saling berjauhan..P.4640 Kadar (%) 15. Skripsi.222.. 1992. Anonim.. Chin Med.54 + 0. terlihat bahwa kadar andrografolid dalam sampel memiliki nilai presisi yang tinggi. W.45 15. Abubakar.4613 0. Prachachon Co. Vo.L. and Bunyapraphatsara.47 15.74 15.. Hasil penetapan kadar Andrografolid dalam ekstrak sambiloto Replikasi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Bobot ekstrak (µg) 80200 80100 80100 80000 79000 80100 80200 79000 80000 Luas area/10000 0.... N.F.4621 0. Entrapment of Andrografolid in Cross-Linked Alginate Pellet: 1. N.1318 .57.01 Berdasarkan Tabel III.Densitometri. 2008.4608 0. sedangkan hasil penetapan kadarnya ditampilkan pada Tabel 3. dan Rohman. Tabel III..W and Lin.. 5:17.01%. http://210.3794X + 0. Semarang Arshia. S. db = n-2 = 5 yaitu r = 0. Makaji.57 15. menunjukkan korelasi yang baik.4626 0. dengan nilai r = 0. hal 57-62. 2000. serta kadar andrografolid pada ekstrak adalah 15. Int.27 15. R. Bhutani KK. dilihat dari nilai r hitung lebih besar dari r tabel pada p = 0.K. Vol 291): 1-9 Aulia.5:21-24. Paranjothy. Farnsworth. Daftar Obat Alam (DOA) Ed. M. Gandjar.4625 0. Fingerprintings of Ayurvedic drugs. DAFTAR PUSTAKA Ameh. Penetapan Kadar Andrografolida dan Kurkumin dalam Ekstrak campuran Herba Sambiloto dan Rimpang Kunyit dengan Metode KLT. 2007). Isolation and Identification of Bioactive compounds in Andrographis paniculata (Chuanxinlian). Kimia Farmasi Analisis.55 15. Yogyakarta. 353377.php?id=gdlhub-gdl-S1-2008-nuraniaulia-9207 .Drug Dev. Garba. A. Pustaka Pelajar.Pharm.4605 0. 2010.J. 2008. Obodozie. dengan panjang gelombang serapan maksimal adalah 230 nm.4562 0.13. disitasi: November 2009. I.K. Manjula. 96 . Eastern Pharmacist. Obiageri.9830. KESIMPULAN Hasil penelitan yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai Rf noda ekstrak dan larutan baku adalah sama yaitu 0.38. Thai Medicinal Plants. 2007.3.. Vol 2(2): 291-299. 2008. Ltd. Chao. Uford.05. Inyang.. Formulation and evaluation of Associates Release Kinetic.16 % b/b dengan KV 1.64 Ratarata (%) 15.45 15.. ditunjukkan dengan nilai KV < 2%. A Normative Study of Nigerian Grown “Maha Tita” (King of Bitters) Andrographis paniculata Nees. B.76 15. Pak.Dari hasil pengamatan diatas diperoleh persamaan regresi sbb: Y = 0..58/go. Sunday. Mujibata..

Revised & Expanded.M. hal 391-398. Gupta MM.. 3:129-131 Sherma. Gupta. Analysis of diterpenoid andrografolid from Andrografolid peniculata. Chemical finger printing of Andrographis paniculata using HPLC. A.L..B. 1992. handa.N. Studies in Kalmegh Extract. In vitro a-glucosidase and a-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and andrografolid. Indian Journal of Chemistry. 49B. Shukla. Artanti. Z.. and Miller.D. A. A.1. Handbook of Thin-Layer Chromatography 3ed.. lal.. 108-112. Phytochemical Analysis. 97 .. S. Azmawi. 2003. 1959. Phytochemical Analysis. 2003.. S. 3(2): 42-44 Miller. R..S.55.S. Kulyal. Jakarta. Gaur. 27-123. New York Srivasta.. Vol. Verma. Sadikun.Z. hal 356-359.. 2004. J liq chromatogr. Chemical Constituent isolated from Andrographis paniculata. Tiwari. A..A dan Abdurahman. Chatterje. A. Muhidin. 2nd Edition. 15: 280-285 Subramanian. J. R. 2008. Analisis Korelasi.C. Quantitative KLTKT Analysis of Andrografolid in Andrographis paniculata Obtained from Different Geographcal Sources (India). Indian Journal of Pharmacy. 2007. 1988. and Wachter. R.. Majalah Ilmu Farmasi.M.N. page 109-120. H.. 2010. Jain DC. KLTKT and Densitometry.. Sharma. Standardization of The Indian Crude Drug Kalmegh by High Pressure Liquid Chromatographic Determination of Andrografolid. J...K. J and Fried. City University of Hong Kong Saxena S. 2007. I..K. A. P. 2.K. Regresi and Jalur dalam 89-130. Dewiyanti. Hari O. Penelitian.A.. Selected Indonesian Medicinal Plants: Monograph and Descriptions Vol. Basuki. New York Qiang.B. Pustaka Setia Bandung Nash. 226-234. S. 2003. U. Vol. 1998 . Bhakuni RS. Kanji.. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Desertation.Harmita. Maiti. Statistics for Analytical Chemistry. 2004... Grasindo.Z... Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode and Cara Perhitungannya.C.. T. K. 21:169-171 Mamatha.. 117-153. Vol 1(3): 117-135 Kardono...K. M. Misra.. P. M. Reactions and Computational Studies of Andrografolid Anagoues with Glutathione and Biological Nucleophiles. Marcel Dekker. Marcel Dekker. 2011. Pharmaceutical Process Validation. Acta Biochimica Polonia..

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful