TD2 : Le transport

Rappel sur les différents types de transport :

1 - Deux souches d'E.coli MC4100 (sauvage) et MKH13 (mutant) sont cultivées dans le milieu de base M63 glucose 10 mM final (M63 0M), additionné de NaCL 0,5 M final (M63 0,5 M) et de Glycine Bétaine 1 mM final (M63 0,5 M + GB) ou de proline 1 mM final (M63 0,5 M + Pro). La glycine bétaine est un composé dérivé de l'acide aminé glycine. la croissance est suivie par mesure de densité optique à 600 nm pendant 6 heures. Interpréter les résultats obtenus.

1 sur 6

E.coli MC4100 • M63 0 M • M63 0,5 M

g = 0,7 h g = 2 h

(sans NaCl) (avec NaCl)

Avec NaCl, le temps de génération est plus élevé (3fois plus lent). (En TP : Chapman milieu avec beaucoup de NaCl -> E.Coli ne pousse pas) E.coli n'est pas halotolérante ou halophile. g = 0,7 h • M63 0,5 M + GB g = 0,9 h • M63 0,5 M + Pro Pour GB, on récupère une croissance normale. Pour Pro, on récupère une croissance presque normale. La GB est donc un osmo-protecteur. La pro est également un osmo-protecteur mais moins efficace.

E.Coli MKH13 g = 1h -> croissance un peu plus lente • M63 0 M g = 3h • Les 3 autres -> après ajout de NaCl : pousse 3 fois plus lentement également. -> ajout de GB et Pro :aucun effet. La GB et la Pro ne jouent plus leur rôle de mutant. Hypothèse : le mutant n'arrive pas à faire entrer la GB et la Pro. Mutation au niveau des transporteurs.

2 - Aux bactéries MC4100 (1 mg de protéines correspond à un volume interne 2,2 microlitres), on ajoute de la GB marquée au carbone 14 à la concentration de 0?5 mM dans 5 ml de milieu M63 0,5 M. Aux temps indiqués dans le tableau qui suit un petit volume de bactéries est prélevé. Les cellules sont récupérées par filtration et la radioactivité incorporée est mesurée au compteur à scintillation. D'autres mesures non décrites ici ont permis de déterminer que 56,4 dpm correspondaient à 1 nmol de [GB] intracellulaire/mg de protéines. Trancher parmi diffusion passive, diffusion facilitée ou transport actif.

Min
Dpm

0 0

1 1410

2 2190

4 3019

8 3843

15 4831

30 5820

45 6204

60 6204

2 sur 6

L'afflue de la courbe permet d'éliminer la diffusion simple. Pour la suite, on se place à l'équilibre : • Si diffusion facilitée : [GB]int = [GB]ext. • Si transport actif : [GB]int >> [GB]ext (50 à 1000 fois plus)

[GB]int : 54,4 dpm -> 1nmol [GB]intracellulaire / mg de protéine -> 2,2 microlitres 6204 dpm -> 110 nmol [GB] : 2,2 microlitres

-> 50 nmol/microlitre 50 micromole/mL 50 mmol/L

-> [GB]int = 50 mM

A l'équilibre : 100 fois plus de [GB]int que de [GB]ext donc transport actif (mais on ne sait pas quel type primaire, secondaire ou tertiaire) 3 - Cette même expérience réalisée sur la souche MKH13 montre qu'aucune radioactivité n'est détectée dans les cellules. Commenter

La GB ne rentre pas donc les transporteurs sont mutés

4 - On réalise une série d'expériences avec la souche MC4100 en faisant varier la concentration en GB afin de déterminer les vitesses initiales (exprimées en unités arbitraires). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit. Interpréter. Concentra tion en 0 GB en mM

0,013 714

0,025

0,050

0,250

Vitesse en unités 0 arbitraire

1112
3 sur 6

1444

2209

Plus la concentration augmente, plus la vitesse augmente jusqu'à une vitesse max qui correspond à la saturation du transporteur. -> détermination de l'affinité du transporteur pour GB (Km)

V 714 1112 1144 2209 1/Vi 0,00140 0,00089 0,00069 0,00045 0,013 0,025 0,050 0,250 [S] 76,4 40 20 4 1/[S]

-> Voir courbe
- 1/Km = - 30 mM^(-1) Vmax = 2500 UA Km = 0,033 mM = 33 microlitres

MC4100 -> Km = 33 microM
4 sur 6

5 - Cette expérience réalisée sur des cellules de 2 autres souches d'E.coli GM50 et BK32 (mutants) a permis de déterminer le Km de la glycine bétaine. Il est estimé à 1 microM pour la souche GM50 et 40 microM pour la souche BK32. Interpréter.

GM50 -> BK32 ->

Km = 1 microM Km = 40 microM

-> affinité forte -> affinité plus faible

Hypothèse : • changement de conformation du transporteur. - une mutation donne une meilleur affinité - une mutation donne une affinité plus faible • modification de l'expression du transporteur - quantité plus ou moins forte de transporteurs

5 sur 6

Chez E.coli, il y a 5 types de transporteurs pour le galactose.

• Dans la souche sauvage : 2 systèmes de transports pour la GB. BK32 -> 1 seul transporteur GM50 -> 1 seul transporteur (un autre) GM50 : les transporteurs de faible affinité sont mutés. BK32 : les transporteurs de forte affinité sont mutés

-> Quantité transporteurs faible >> quantité transporteur forte affinité. MKH13 -> les 2 système sont mutés.

6 sur 6

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