目录

第一章 样品制备

2

1.1

一般性原则

2

1.2

样品制备程序

3

1.2.1 培养细胞样品处理方法

3

1.2.2 组织样品处理方法

3

1.2.3 文献报道较多的裂解液配方

4

第二章 第一向等电聚焦(IEF)

7

2.1

IPG 胶条的水化和电泳

7

2.1.1 仪器

7

2.1.2 试剂

7

2.1.3 实验步骤

7

2.2

IPG 胶条的平衡

9

2.2.1 仪器

10

2.2.2 试剂

10

2.2.3 实验步骤

10

第三章 第二向 SDS 电泳

12

3.1

垂直 SDS-PAGE

12

3.1.1 溶液

12

3.1.2 灌胶步骤

12

3.1.3 电泳步骤

14

第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测

15

4.1

考马斯亮兰染色

15

4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序

15

4.1.2 Neuhoff 胶体考染法

15

4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法

16

4.2 硝酸银染色

16

Appendix I Troubleshooting

18

Appendix II Solutions

23

2DE 分析流程:

样品制备(Sample preparation)

 
固相 pH 梯度胶条的水化(IPG strip rehydration)

第一向等电聚焦 (IEF)

第一向胶条的平衡( IPG strip equilibration)

第二向 SDS 电泳(SDS-PAGE)

检测染色(Detection/Staining)

1

第一章 样品制备(Sample Preparation)

1.1 一般性原则:

样品制备是双向电泳中最为关键的一步, 这一步处理的好坏将直接影
响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法 ,尽管处理方法是多种多
样, 但都遵循几个基本的原则:1 )尽可能的提高样品蛋白的溶解度 ,抽
提最大量的总蛋白,减少蛋白质的损失;2)减少对蛋白质的人为修饰;3 )
破 坏 蛋 白 质 与 其 他 生 物 大 分 子 的 相 互 作 用 , 并使蛋白 质 处 于 完 全 变 性 状
态。
根据这一原则,样品制备需要四种主要的试剂:离液剂 (chaotropes),
主要包括尿素( Urea )和 硫 脲( thiourea);表面活性剂 (sufactants),
也称去垢剂,早期常使用 NP -40 、TritonX -100 等非离子去垢剂,近几年
较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂 ;还原剂
(reducing agents ), 最常用的是二硫苏糖醇 (D T T ), 也有用二硫赤藓
糖 醇 ( DTE ) 以 及 磷 酸 三 丁 酯 ( TBP ) 等 。 当 然 , 也 可 以 选 择 性 的 加 入
Tris -b a s e , 蛋 白 酶 抑 制 剂 ( 如 EDTA 、 PMSF or Protease inhibitor
cocktails ) 以及核酸酶 。
样品的来源不同, 其裂解的缓冲液也各不相同。 通过不同试剂的合理
组合,以达到对样品蛋白的最大抽提。 在对样品蛋白质提取的过程中,必
须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质 ,比如核酸、 脂、
多糖等大分子以及盐类小分子。 大分子的存在会阻塞凝胶孔径,盐浓度过
高会降低等电聚焦的电压,甚至会损坏 I P G 胶条 ;这样都会造成 2 -DE 的
失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸 酶处理 ,超声处理应控制好条件, 并防
止产生泡沫;而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上 。脂类和多
糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度, 但时间太长;也可以
采取凝胶过滤或沉淀 /重悬法脱盐,但会造成蛋白质的部分损失。
因此, 处理方法必须根据不同的样品 、所处的状态以及实验目的和要
求来进行选择。

2

1.2 样品制备程序:
1.2.1 培 养 细 胞( culture cell) 样品处理方法 :
培养动物组织细胞由于没有细胞壁, 因此可以将细胞收集下来, 直接
加入裂解缓冲液 ( Lysis buffer)抽提总蛋白 。裂 解缓冲液有多种配方,
本实验室主要采用如下成份:
(A) 7M Urea,2M Thiourea,4%( w / v)CHAPS ,40mM Tris- Base ,
40mM DTT,2 % Pharmalyte pH 3- 1 0 .
其他常用的裂解缓冲液如下 :
(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,
1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;
(C) 加 入 0.3 -1% SDS 在 95 o C 煮样 品 5mins ,冷却后加入至少 5
倍体积的 (A)或 (B)裂解液。
总蛋白抽提程序:
(1) 培养细胞的收集 ;
(2) 用磷酸缓冲液(PBS )洗 细 胞 3 次(室 温,1000g, 各 2 m i n);
(3) 将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管 中,吸干残留的 PBS;
(4) 加入裂解缓冲液 (1.5x10 6 个细胞大约加入 100µL 裂解液 ), 在室
温振荡 1 h, 使其充分溶解 ;
(5) 4 o C,40 ,000g, 离心 1 h;
(6) 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白,然后分装至 Eppendof 管里
保存在 -78 o C 备用。

1.2.2 组织样品处理方法 :
对大多数 从动物或植物组织里提取总蛋白质而言 ,同样没有一种通用
的程序 。但遵循的原则基本相同 。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法 。

3

三氯醋酸 -丙酮沉淀法( TCA/acetone precipitation)提取植物树叶总
蛋白程序 :
(1) 在液氮中研碎叶片;
(2) 悬浮于含 1 0%三氯醋酸 ( TCA)和 0.07% ß- 巯基乙醇( 可用 D T T
替代) 的丙酮溶液在 -20 o C 的 冰 浴;
(3) 让蛋白质沉淀过夜然后离心( 4 o C,40,000g, 1h), 弃上清 ;
(4) 重悬沉淀 浮 于 含 0.07%β -巯基乙醇的 冰预 冷丙酮溶液里 ;
(5) 离心(4 o C,40,000g, 1 h) 后真空干燥沉淀;
(6) 用(A)或 (B)裂解液溶解沉淀 ,离心 (4 o C ,40,000g, 1h)。
(7) Brandford 法定量蛋白 ,然后分装至 Eppendof 管里保存在- 78 o C
备用。
超速离心法:
(1)取材;
(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每 1g 样品加入 0.5ml 裂解液,
使用组织匀浆器匀浆 30 s;
(3)组织悬液 15℃,10 000×g 离心 10 min;
(4)上清液 4℃,150 000×g 超速离心 45 min;
(5)小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清 6℃ 40,000g 再次离心 50 min;
(6)取离心上清。Bradford 法定量,分装后置–75℃保存。

1.2.3 文献报道较多的裂解液配方
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease
inhibitors)
Final concentration
Urea (FW 60.06, Sigma, 9 M
>99.5%)
CHAPS
(FW
614.89, 4% (w/v)
Sigma, >98%
Ultrapure H2 O
4

Amount
10.8 g
0.8 g
to 20 ml

prepare fresh or store in aliquots at –20℃
A cocktail of protease
inhibitors
DTT(FW 154.25, Promega) 1%

13 µL/200 µL Lysis
buffer (15.5×stock), -20

Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of
protease inhibitors)

Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2 O

Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
Final concentration
Urea (FW 60.06)
8M
CHAPS
4% (w/v)
Tris base (FW 121.1)
Ultrapure H2 O
prepare fresh or store in aliquots at –20℃
A cocktail of protease
inhibitors
DTT
(FW
154.25, 1%
Promega)

Amount
9.6 g
0.8 g
to 20 ml

13 µL/200 µL Lysis
buffer (15.5×stock), -20

5

Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a
cocktail of protease inhibitors)
Final conc.
5M
2M
2%
2%
to 10 ml

Urea
Thiourea (FW 76.12)
SB 3-10 (FW 307.5)
CHAPS
Ultrapure H2 O
A cocktail of protease
inhibitors
DTT
(FW
154.25, 1%
Promega)

Amount
3.0 g
1.52 g
0.2 g
0.2 g

13 µL/200 µL Lysis
buffer (15.5×stock), -20

Lysis buffer F
100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT,
25% v/v glycerol
注:CA、蛋白酶抑制剂混合物和 DTT 在临用前加入。
广谱蛋白酶抑制剂混合物(如加 tris 可不用此混合物)
成分
蛋白酶抑制剂混合物 PMSF

终浓度
35 µg/ml or 1 mM

EDTA

0.3 mg/ml (1 mM)
抑肽素 0.7 µg/ml
亮肽素 0.5 µg/ml

其中 C-F 是分步法提取的 4 种裂解液配方, C 适于提取水溶性蛋白,D 是经典配
方,E 适于提取膜蛋白配方,F 适于提取难溶的沉淀蛋白。
欲了解更详细的样品制备信息,可参考:  
http://us.expasy.org/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.
6

第二章 第一向等电聚焦(IEF)

双向电泳的第一向 IEF 电 泳 采 用 IPGphor ,实验将变得很简 单。
IPGphor 包括半导体温控系统 (18 °C- 25 °C)和程序化电源 (8000V,
1.5 m A )。可采用普通型胶条槽一步 完成胶条的 水化、 上样和电泳, 大大
减少操作步骤 。IPGphor 一次可进行 12 个胶条槽的电泳 (7, 11, 13 ,1 8 ,
24cm), 因采用高电压 (8000V),可缩短聚焦时间。最新推出 的通用型杯
上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极,适合任何长度的 I P G 胶条 ,尤
其适合极性等电点蛋白的分离 。

2.1 IPG 胶条的水化和电泳
2.1.1 仪 器 :
IPGphor
2.1.2 试 剂 :
水化液( 8M 尿素 ,2%CHAPS, 15 mM DTT 和 0 .5%IPG 缓冲液 ) :
水化液需当天新鲜配制 (可配成储液分装- 20 度保存 ,但不可反复冻融 )。
尿素溶液加热温度不能超过 37° C, 否 则 蛋 白 会 发 生 氨 甲 酰 化。

2.1.3 实验步骤:
一. 加样品水化 
1. 用 样 品 溶 解 缓 冲 液 (9M 尿 素 , 4%CHAPS , 2% I P G 缓 冲 液 , 40mM
DTT,40mM Tris- b a s e )溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过 10mg/ml,否
则会造成蛋白质的集聚或沉淀 。
2.吸取适量 (见 表 2 . 1 )含有样品的水 化液放入标准型胶条槽中, 为确 保样
品充分进入胶条中,不要加入过量的 水化液 。

7

表 2.1IPG 胶 条 所 需水化 液体积

胶条长度 (cm)

每条需水 化液 体 积* ( µ l )

7

125

11

200

13

250

18

350

24

450

*如果 水化时 加 入 样 品, 此体积是加入样品后的终体积

3.从酸性端 (尖端 )一侧剥去 I P G 胶条的保护膜 ,胶面朝下, 先将 I P G
胶条尖端(阳 性 端 )朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中 ,慢慢下压胶
条,并前后移动 ,避免生成气泡,最后放下 I P G 胶条平端 (阴极 ) ,使 水化
液浸湿整个胶条 ,并确保胶条的两端与槽的两端的电极 接触。
4.IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆 盖 油,盖上盖子 。
5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触;胶条
槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触 。
6.设 置 IPGphor 仪器运行参数 :IPG 胶 条水化 的电压 ,温度和时间;等电
聚焦电泳时的梯度电压和温度 。电泳参数见表 2.2 。
表 2.2 IPGphor 运行条件

温度

20°C

最大电流

0.05 mA per IPG strip

样品体积

350 µl (180 mm 长 IPG strip)

电压

时间

30 V

10-12 hours(水化 ) ,

200 V

1 hour

500 V

1 hour,

500 - > 8000 V 30 min
8000 V

3 hours (IPG 4 - 7); 2 hours (IPG 4- 9, 3 -10L, 3-10NL)

低电压时 水化, 有利于高分子量蛋白进入胶中,并 减 少 蛋 白 形 成 聚 集 体。

7.IPG 胶条水 化后可自动进行等电聚焦电泳。
8.暂时不进行第二向的 I P G 胶条可夹在两层塑料薄膜中于- 80 °C 保存几个

8

月。
注 意:不推荐每条 IPG 胶条的电流超过 50µA,因为这有可能产生过多的
热量且有可能损坏胶条和槽 ,IPG 胶条甚至会烧胶。
 

二.不加样品水化 
(一) 标准型胶条槽:
1.用适量的 水化液进行胶条水化 ,方法同步骤 3 -5, 水化过 夜。
2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。 每个加样孔的一侧可加入 7.5µ l
样品 (每个加样孔分别有两侧可加样 ) ,采用此种方法上样, 每个胶条槽最
多可加入 30 µl 样品 。
3.设 置 IPGphor 仪器运行参数 :等电聚焦电泳时的梯度电压和温度,电泳
参数见表 。
4.进行等电聚焦电泳。
5.暂时不进 行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于 -8 0°C 保存几个
月。
(二 )通用型杯上样胶条槽:
1.采 用 Immobiline DryStrip 水 化盘或标准型胶条槽进行 IPG 胶 条 的水
化,加入适量的 水化液进行胶条水化 ,方法同步骤 3 -4,水 化过夜 。
2.将 通用型杯上样 胶条槽的尖端与 IPGphor 仪器的阳极平台接触 ;胶条槽
的平端与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。
3.将已 水化 的 IPG 胶条转移到通用型杯上样胶 条 槽。胶面朝上,先将 I P G
胶条尖端(阳 性 端 )朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中 ,胶条必需横跨胶条
槽的与 I P Gphor 仪器的两个电极板接触的区域。 对于 7 c m 和 11cmIPG
胶条,需将 I P G 胶条的平端距离胶条槽平端大约 1.5cm 处 放 置,并确保
胶 条 位 于 胶 条 槽 的 中 央 (通 用 型 杯 上 样 胶 条 槽 内 四 对 凸 起 可 用 于 指 导 胶 条
放置的位置) 。
4.在 I P G 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油 (3 -5ml), 充满
整个胶条槽 。
5.取两个 IEF 电极片 ,用去离子水浸湿后放在滤纸上, 去除多余的水 。
6.分 别 将两个 IEF 电极片放在 IPG 胶条胶的两端 ,分别将电极压在两个电
极片的外缘。
7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸 起外任何位置,对于碱性分离
范围的 I P G 胶条 ,尽量将样品杯靠近阳极放置。
9

8.在样品杯中加入少量不含样品的水 化液检查是否漏液 。上样前吸走 水化
液。
9.上样前将样品离心去掉不溶物 ,每个样品杯最多可加样 100 μl。
10.盖上胶条槽的盖子, 再盖 IPGphor 仪器的盖子。
11.设 置 IPGphor 仪器运行参数: 等电聚焦电泳时的梯度电压和温度 。电
泳参数见表。

2.2 IPG 胶条的平衡:
I P G 胶条平衡两次,每次 15 分钟 。平衡缓冲液包括 6 M 尿 素 和 3 0 % 甘
油,会减少电内渗, 有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在
平衡液中加入 D T T ,使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态;第二步平衡
步骤中加入碘乙酰胺,使蛋白质巯烷基化,防止它们在电泳过程中重新氧
化,碘乙酰胺并且能使残留的 D T T 烷基化 (银染过程中,D T T 会导致点拖
尾"point streaking") 。将 I P G 胶条轻轻润洗 ,并去除多余的平衡缓冲液 ,
然后放入第二向 SDS 胶中 。
如果缩短平衡时间,会影响一部分蛋白从 IPG 胶条转移到 SDS 胶的效率。这种情况下建议在蛋
白从 IPG 胶条转移到 SDS 胶后,将 IPG 胶条染色,以检查是否所有蛋白都已离开 IPG 胶条。

2.2.1 仪 器 :
玻璃管 (200 mm 长 , 20 mm i . d .), Parafilm, 振荡仪
2.2.2 试 剂 :
1. 4x 分离胶缓冲液 (1.5M Tris- H C l , p H8 .8 和 0.4%( w / v)SDS ):
45.5 g Tris 和 1 g SDS 溶 于 200 ml 去离子水中,用 6N HC l 调 节 p H 到 8.8 ,
最后用去 离子水将体积补足到 250 ml,加入 25 mg 叠氮钠并过滤。此溶液
可于 4°C 储存两周。
2. 平衡缓冲液 (0.05 M Tris -HCl , pH 8.8 , 6 M 尿素 , 30% (w/v) 甘油
和 2% (w/v) SDS ):180 g 尿 素, 150 g 甘油 , 10 g SDS 和 16.7 ml 分离
胶缓冲液溶于去离子水中,最 终 将 体积补足到 500ml。此种缓冲液可于 室
温下保存两周。
3. 溴 酚 蓝溶液: 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中
25 mg 溴酚蓝溶于 10 ml 分离胶缓冲液中, 4°C 储存。

10

2.2.3 实 验 步 骤:
1. 使用前每 10ml 平衡缓冲液中加入 1 0 0 m g D T T (相当于平衡缓冲液 I) ,
根据表 2.3 加入适量平衡缓冲液 I 和溴酚蓝溶液。取 出 IPG 胶条分别放入
玻 璃 管 中 ( 支 持 膜 贴 着 管 壁 , 每 个 玻 璃 管 中 放 入 一 条 IPG 胶 条 ) ,用
Parafilm 封口, 在振荡仪上振荡 15 分钟, 倒掉平衡缓冲液 I。
2. 每 10ml 平衡缓冲液加入 400mg 碘乙酰胺 (相当于平衡缓冲液 II) 。根
据下表加入适量平衡缓冲液 II 和溴酚蓝溶液。 用 Parafilm 封 口,在振荡
仪上振荡 15 分 钟,倒掉平衡缓冲液 II。
表 2.3 IPG 胶 条 平 衡 液 用 量

胶条长度 (cm)

建议平衡液体积 (ml)/条

溴酚蓝溶液( µl)

7

2.5 -5

12.5 -2 5

11

5-10

25-5 0

13

5-10

25-5 0

18

10

50

24

15

70

3.用去离子水润洗 IPG 胶条一秒钟,将胶条的边缘置于滤纸上几分

钟,

以去除多余的平衡缓冲液。
4. IPG 胶条的转移: 将 IPG 胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上, 使胶
条支持膜贴着其中的一块玻璃板,用一薄尺将 I P G 胶条轻轻地向下推 ,使
整个胶条 下部边缘与板胶的上表面完全接触 。确保在 I P G 胶条与板胶之间
以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。
5. 可选操作 :加入分子量标准蛋白
分子量标准蛋白溶液与等体积的 1 %琼脂糖溶液混合后, 加 入 到 IEF
上样纸片上能得到很好的效果 。终浓度为 0.5%的琼脂糖会凝聚,在施加
电压前可以防止标准蛋白的扩散。
其他可选的方法是,将标准蛋白以 15- 20 µl 的体积加入到 IEF 上样
滤纸片。如要减少加样量将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放
在玻璃板上,将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上,然后用镊子将
上样滤纸片放置在 I P G 胶条末端一侧,与 板胶的 凝胶表面接触 。
6. 最后用琼脂糖密封液进行封顶 ,用少量的密封液( 约 1 -1.5ml) 使 IPG
胶条被完全覆盖住,在此过程中不要产生气泡。

11

第三章 第二向 SDS 电泳
目前由于更多的 使用垂直的系统来进行第二向 SDS- PAGE,故这里不
再介绍水平的 MultiphorII 系 统。

3.1 垂直 SDS -PAGE:
3.1.1 溶 液 :
1. 丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰胺溶液 (30.8%T,2.6%C ):
30%( W/V)丙烯酰胺和 0 . 8 %甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将 300 g 丙烯酰
胺和 8 g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中,最后用去离子水将体积补足
到 10 00 ml。过滤后可于 4°C 储存两周。
2. 分离胶缓冲液( 1.5M Tris- H C l , p H8 .6 和 0 . 4 %( w / v) SDS ):
90.85gTris 和 2 gSDS 溶于 400 ml 去离子水中,用 6N HC l 调 节 p H 到 8.6 ,
最后用去离子水将体积补足到 50 0 ml, 加 入 5 0 m g 叠氮钠并过滤。此溶液
可于 4°C 储存两周。
3. 1 0% ( w/v)过硫酸铵溶液:
1g 过硫酸铵溶于 10ml 去离子水中。 此溶液需使用前新鲜配制 。
4. 覆盖液( 缓冲液饱和的异丁醇 ):
混合 2 0 ml 上述分离胶缓冲液和 30 ml 异丁醇, 等几分钟后去掉异丁醇层。
5. 取代液( 50%(v/v) 甘 油 和 0.01%溴酚蓝水溶液 ):
混合 250 ml 甘 油( 100%) 和 250 ml 去离子水, 再 加 入 50 mg 溴酚蓝 ,搅
拌几分钟 。
6.低熔点琼脂糖溶液 :含 有 0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。
3.1.2 灌 胶 步 骤:
根据第一向 IEF 电 泳 时 IPG 胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽 。最
新推出的 Ettan DALT II 是为大规模、高通量、 高重复性双向电泳第二向
SDS- PAGE 专门设计的。 同 时 进 行 12 块 26 x 20cm 板胶电泳 ,适于长至
24cmIPG 胶条。其灌胶模具每次最多可 灌制 14 块胶 。通常不需要浓缩胶 。

12

表 3.1 凝胶浓度与其对应的分离范围

胶浓度

分离范围 (KD)

5%

36- 200

7.5 %

24- 200

10%

14- 200

12.5%

14- 100

15%

14- 60

表 2.3 灌制垂直 S D S 胶 的 配 方

10%T,2.6%C

12.5%T, 2.6%C

15%T,2.6%C

33.3 ml
25ml
1ml
40.2ml

41.7ml
25ml
1ml
31.8ml

50ml
25ml
1ml
23.5ml

过硫酸铵 *(10% )

33µl
500 µl

33 µl
500 µl

33 µl
500 µl

最终体积

100ml

100ml

100ml

单体贮存液
4x 分离胶缓冲液
10%SDS
去离子水
TEMED*

*TEMED 和 过 硫 酸 铵 在 灌 胶 前 再 加

胶的组成 :
分 离 胶:10%T、12.5%T 或 15%T 的均匀胶, 2.6%C , 0.1%SDS, 37 5mM
Tris- HCl PH8.8

垂直电泳仪器类型

配制凝胶溶液体积(ml)

MiniVE or SE260(10X10.5cm 玻 璃
板)
1mm 厚的胶

10

1.5mm 厚 的 胶

15

SE600(18X16cm 玻璃板 )
1mm 厚的胶

30

1.5mm 厚 的 胶

45

Ettan DALT II(26x20cm 胶 )
950

14 块 1mm 厚的胶

13

1.按仪器说明书装好灌胶模具,倒入凝胶溶液 (在 Hofer DALT 和 Ettan
DALT II 的灌胶模具中 ,拔掉灌胶的胶管后,取代液会把管道中剩余的凝
胶 溶 液 压 入 模 具 中)。 在每块胶的上面加入覆盖液以得到平的凝胶上样平
面。
2.灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层用水饱和的正丁醇或异丁醇 ,以减少
凝胶暴露于氧气 ,形成平展的凝胶面 。
3.同时灌制多块凝胶时,室温下至少聚合 3 小时 。聚合后倒掉覆盖在凝胶
上的正丁醇溶液 ,并用凝胶储存液冲洗凝胶表面 。
4.暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于 4°C 保存 1- 2 天。 将整个凝胶模
具完全浸没在凝胶储存液中可 4°C 条件下保存 1- 2 周。
3.1.3 电 泳 步 骤:
1.电泳槽中装满电泳缓冲液,并打开温控系统,调节温度为 1 5 °C。
2.将 平 衡好的 I P G 胶条浸入电极缓冲液中几秒钟。
3.将 I P G 胶条小心的放置于 SDS 胶面上, 并轻压使 I P G 胶 条 与 SDS 胶
面充分结合,上面覆盖 2 m l 热的琼脂糖溶液 (75°C),使琼脂糖在 5 分钟内
凝固。其余的 I P G 胶条重复上述操作。
4.将胶盒插入电泳槽中, 开始电泳。采用垂直的 SDS 胶电泳 ,不必象水
平电泳一 样,电泳过程中去除 IPG 胶条。
6. 当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。
7. 跑好的胶转移到染色盒里固定, 准备染色。

附 1: SE600 系统电泳参数 :
Constant current, 15 o C
Phase
Current
1
10mA per gel
2
20mA per gel

Duration
15 min
Approximately 5 h

附 2: Ettan Dalt II 系统电泳参数:
Constant power, 20o C
Phase
Current
1
5w per gel
2
20w per gel
14

Dura t i o n
45 min
Approximately 6 h

第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测
2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有:1)考马斯亮兰染色法;2 )银 染
法;3 )负染法; 4) 荧光染色法 ;5 )放射性同位素标记法等。 这几种检
测方法的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和考染法。 由于银染的
灵敏度是考染的 50 倍 ,故一般用银染法进行分析处理 ,再用考染法来进
行样品微量制备 。

4.1 考马斯亮兰染色 :
4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序:
1 固定

20 % TCA

1h

2 染色

0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid

2h

3 脱色

40% EtOH&10% acetic acid

2x 30 min

4 强化

1% acetic acid

overnight

5 清洗

deionized H2 O

30 min

局限:灵敏度低 (≈1 μg protein/spot)
4.1.2 Neuhoff 胶 体 考 染 法:
1 固定:12%(w/v)三氯醋酸(TCA)

2h

2 染色:200ml 染色液混合 50ml 甲醇

16-24h

染色液:在 490ml 含 2%(w/v)的 H3PO4 中加 50g (NH4 )2SO4 直至完全溶解,
再加 0.5g CBB G-250(已溶于 10mlH2O 中),搅拌混合。无需过滤,使用前摇
匀。
3 漂洗:
1)0.1 mol/L Tris-H3PO4 缓冲液(pH 6.5)漂洗两分钟;
2)25%(v/v)甲醇漂洗不超过 1min

15

4 稳定:在 20%的(NH4)2SO4 中稳定蛋白质-染料复合物。
优点:背景低, 灵敏度高,可达到 200ng protein/spo t .
4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法:
1 染色( 0.025%(w/v) 考马斯亮兰 R350 ): 将 1 片 Phast Gel Blue 药
片 溶 入 1.6L 10%醋 酸 ,将染色液加热到 90 o C 倒 入 凝 胶 染 色 盘 , 振荡
10m i n;
2

脱色:1 0 %醋酸室温振荡脱色 2 h,期间需多次更换脱色液 ,脱色液可

通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收;
脱色液和染色液可重复使用。
脱色后的凝胶可进行扫描分析 ,选中的点可用 Spot Picker 自动切胶
仪挖出,再进行后续的硝酸银染色可得到更多的蛋白点。用考马斯亮兰预
染过的胶再进行银染灵敏度比单独银染更高 ,且热染过程迅速 。
二次染色
待考马斯亮兰染色后的背景完全脱除后,可用以下的银染法进行二次
染色。因为蛋白点已经经过固定,可直接从敏化步骤开始染色 。
4.2 硝 酸 银染色 :
银染的方法种类很多 ,目前有文献报道的就有 100 多 种。但是其准确
的染色机制还不是特别的清楚 。大致的原理是银离子在碱性 p H 环境下被
还原成金属银, 沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高 ,可染出胶上低于 1 ng /蛋白质点, 故广泛的
用在 2D 凝胶分析上。 待找到自己感兴趣的蛋白质点后 ,再通过考染富集
该目的点 ,然 后 做进一步的肽段指纹图谱分析(PMF )或序列测定。随着
质谱技术的不断完善和发展, 对银染后的 f m o l 级的蛋白质点直接测定已
非难事。 这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法,实验程序如下:
Step

Solution (250ml per gel)

Gel Type
1mm
unbacked

固定

25ml acetic acid, 100ml methanol 2 x15 min
16

1mm on film or glass
support or 1.5 unbacked

2x60 m i n

漂洗

125ml milli-Q water
75ml methanol, 0.5g Na2 S2O3, 17g 30 m i n
NaAc, milli-Q water to 250ml
250ml milli-Q water
3 x5 m i n

银染

0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml

20 min

60 min

漂洗

250ml milli-Q water

2x1 m i n

4x1 min

显色

6 min

终止

6.25g Na2 CO3 , 100µl formaldehyde, 4 min
milli-Q water to 250ml
3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml
10 min

漂洗

250ml milli-Q water

2x30 min

敏化

3x5 min

60 m i n
5x8 min

40 min

银染注意事项 :
1). 很多银染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde ),它能提高银染的
灵敏度和染色结果的重复性,但是因为戊二醛会修饰蛋白质, 从而会影响
对蛋白质点的质谱鉴定和分析 ;
2). 保证所有的染色器皿绝对的干净 ,可使用玻璃或塑料做染色器皿;
3). 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的, 至少要用双蒸水(导电率 <2
μS), 有条件的可使用 Millipore water ;
4). 染色过程中避免手去接触凝胶,必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套 ;
5). 所

用 的 化 学 试 剂 一 定 是 要 分 析 纯 ( AR ) 。

17

Appendix I: Troubleshooting
1. 总的策略
• 化学试剂纯度要高 ,至少是分析级, 目前国产试剂达不到纯度要求
• 使用去离子水( 电导 <2uS)
• 尿素和丙烯酰胺 /甲叉丙烯酰胺需新鲜配制
• Deionize urea prior to use
• 包含尿素的溶液加热温度不超过 3 7°C ,否则会发生蛋白质氨甲酰化
• 过滤所有的溶液 ,使用干净无灰尘的容器

2. 样品制备
• 样品提取缓冲液 (裂解缓冲液 )必须新鲜配制 。或者分装成 1ml, 于- 78 °C
冷冻保存 , 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻
• 如有必要 ,在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂 。注 意 :几种蛋白酶抑制剂
在 DTT 或β - 巯基乙醇存在时失 效
• 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物

3. 灌胶
• 过硫酸铵溶液需新鲜配制 。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2- 3
天,低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用
• TEMED 需在氮气下储存 ,每 6 个月换一次
• 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理,避免胶聚合后与玻璃板粘连
• 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油 (37.5%)的目的是为了减少电内渗
• 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上 , GelBond PAG 膜需用去离子水
洗 6 次, 每次 10 分钟 , 以避免银染过程中产生点托尾
胶聚合不完全的可能原因
解决办法
TEMED 或过硫酸铵时间太长

替换 TEMED 和过硫酸铵

SDS 胶 : Tris 缓冲液的 pH 值

用 H C l 调 Tris 缓冲液的 pH6.8 或 8.8

胶从塑料支持膜上脱落的可能原因

解决办法

胶聚合于 GelBond PAG 膜的疏水面

胶必须聚合于 GelBond PAG 膜的亲水面

塑料支持膜选择错误 (如:用于琼脂糖胶 ) 选择专门用于聚丙烯酰胺胶的支持膜

18

GelBond PAG 膜 过 期

不要使用超过一年的 GelBond PAG 膜

胶结合于玻璃板上的原因

解决办法

玻璃板没有疏水处理

玻璃板用疏水硅烷处理

4. IPG 胶条的水化
• IPG 胶条需水 化到 0.5mm 厚
• IPG 胶条的的 水化时间取决于水化 缓冲液的组成。如果尿素 (>8M)和去污
剂(>1%)浓度过高 ,至 少 需水 化 6 小时 ,最好过夜
• 采用 Multiphor II 做第一向电泳时,水 化后的 I P G 胶条需用去离子水清
洗,否 则 IPG 胶条表面会有尿素结晶, 干 扰 IEF。 ( 使 用 I P G p h o r 时 ,I P G
胶条水化 后不必清洗)

• IPG 胶 条水化 时,其胶面与 水化盘或胶条槽之间避免产生气泡 。采用胶条
槽水化时 ,胶条上需覆盖硅油以防水 化液 挥 发

5. 第一相 IEF
5.1 采用样品杯上样
• 样品体积不能少于 20 μ l
• 样品在阴极或阳极附近上样,未知样品需检查在何处上样 ,结果更好
• 样品浓度不能过高 (最 大 10mg/ml) ,以避免在上样位置生成蛋白沉淀 。如
果怀疑, 最好用裂解缓冲液稀释,增大上样体积
• 样 品 溶 液 中 不 能 含 高 浓 度 的 盐。 脱 盐 或 用 裂 解 缓 冲 液 稀 释, 低电压使样
品慢慢进入胶中
5.2 水 化 时加入样品
• 样品溶液体积需根据 I P G 胶条大小调整 (18cm 长 I P G 胶条约需 400 μ l 样
品溶液 ),以保证水 化后没有多余的样品留在 水化盘 中。
最好检查高分子量蛋白 、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 I P G 胶中
5.3 等电聚焦
• 使用 I P G 胶 条 时,不要进行预聚焦,否则会因为胶的电导非常低导致样
品很难进入胶条
• 为使样品进入胶的效率增加,采 用 30V 低电压 水化; 继续以低电压梯度
( 2 0 0 V,5 0 0 V,1000V 各 1 小时 )进行电泳 ,最后达到 8000V 的进行电泳
• 聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、p H 范围有关。短 的 I P G 胶 条 或 宽 pH 梯度
19

范围 IPG 胶条, 聚焦时间短
• IEF 结束后 ,如 果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳 ,可 于- 78 °C 冷冻保存
• 上 样 附 近 有 水 析 出 是 因 为 样 品 盐 浓 度 过 高, 可 脱 盐 或 稀 释 样 品, 低电压
上样,延长样品进入胶的时间

6. IPG 胶条平衡和第二相 (SDS-PAGE)
• 平衡时间应该充分长( 至少 2 x 10 分 钟)
• 平 衡 缓 冲 液 包 括 Tris - HCl(pH8.8),SDS(1%),高 浓 度 尿 素 (6M)和 甘 油
(30%) 提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使
蛋白去折叠; 第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 D T T (银染过程中,
DTT 会导致点拖尾 )
• 对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白 ,相对于 D T T 和 碘 乙 酰 胺,
tributylphosphine 更 有 效
• 水平的 SDS -PAGE :浓缩胶中加入大量的甘油 (37%)是为了减少电内渗
• 水平的 SDS -PAGE :浓缩胶的长度至少超过 25mm
• 蛋白从一向( I P G 胶条 ) 到二向 (SDS 胶 )的转移为避免点拖尾和损失高分
子量蛋白 ,应缓慢进行 (场 强<10V/cm)
SDS 胶垂直拖尾的可能原因
解决办法
水平 SDS -PAGE :浓缩胶长度太短

有效的浓缩胶长度>25mm

蛋白没有被 SDS 充分包裹

平衡缓冲液 SDS 浓度 >1% ,平衡 2 x 15
分钟
• 用硼酸缓冲液代替 Tris 缓冲液

糖蛋白

• 用宽范围小孔梯度胶
• 蛋白去糖基化
部 分 自 由 的 巯 基 再 次 氧 化 生 成 二 硫 • 平衡缓冲液中加入充足的 D T T,使蛋白 烷
键聚合物

基化
• 用 tributylphosphine 代替 D T T 和碘乙酰

• 含有尿素的溶液加热温度不能超过 3 7°C

蛋白发生氨甲酰化

• 使用前,尿素去离子化 (deionize urea)
样品制备时,内源的蛋白酶没有被抑 • TCA- 丙酮处理使蛋白酶失活

• 加 SDS 或蛋白酶抑制剂一起煮沸

GelBond PAG 膜使用前没有清洗

使用前, 用去离子水洗 6 x 10 分钟

灰尘或多余的 D T T

• 过滤所有的缓冲液

20

• 第二步平衡缓冲液中加入碘乙酰胺去除多
余的 D T T
双向电泳图谱部分变形的可能原因

解决办法

IPG 胶 条 中 NP- 40 或 Triton X -1 0 0 • 如果可能减少 NP -40/Triton 的 量
• 用 CHAPS 代 替 NP -40/Triton

浓度过高

蛋白从一向到二向转移完成后 ,I P G • 第 二 向 采 用 水 平 SDS-PAGE 时 ,蛋 白 从
胶条没有从水平的 SDS 胶上取走

一向到二向转移完成后 ,取 走 IPG 胶条

缓冲液条没有覆盖 SDS 胶上原 I P G 第二向采用水平 SDS-PAGE 时,取 走 IPG
胶条结合的位置

胶 条 后, 将 缓 冲 液 条 前 移, 恰好覆盖 I P G
胶条与 SDS 胶结合位置的前沿

溴酚蓝迁移前沿不平的可能原因
水 平

解决办法

SDS -PAGE : 冷 却 板 和 去除气泡

GelBong PAG 膜之间有气泡
水平 SDS-PAGE : 缓冲液条和胶面 轻压缓冲液条, 使其与胶面充分结合
结合不好
SDS 小 孔 梯 度 胶 灌 胶 和 聚 合 时 不 水 采用水平台灌胶

7. 银染

• 使用纯度高 (分析级 )的化学试剂
• 使用高纯去离子水或双蒸水( 电导 <2uS)
• 使用干净无灰的容器
• 不要用手去碰胶, 带手套或使用镊子
SDS 胶 上 只 能 看 见 很 少 (或 没 有 )蛋白的 解决办法
可能原因
样品制备方法不合适 (蛋白浓度低 )

做双向电泳前, 估计样品中蛋白浓度

蛋白进入 IPG 胶条不 充分

采用低电场强度开始 IEF

IPG 胶 条 和 SDS 胶之间结合不好

轻压 IPG 胶 条,使其与 SDS 胶充分结

蛋白从一向到二向转移效率低

采用低电场强度进行蛋白转移; 用 去 污
剂提高蛋白的溶解度
21

IPG 胶条 GelBond 面 与 SDS 胶 结 合

水平 SDS -PAGE : IPG 胶条胶面朝下

银染方法不正确

检查方法

甲醛氧化

用新的甲醛

显色液 pH 值不正确

检查显色液 p H 值

SDS 胶上丢失低分子量或高分子量蛋白 解决办法
的 可 能原因
低分子量蛋白没有被充分固定

用 20%TCA 或戊二醛代替 4 0 %乙 醇 和
10%乙 酸

蛋白酶降解高分子量蛋白

使样品中内源性蛋白酶失活

高分子量蛋白从一向到二向转移效率低

采用低电场强度进行蛋白转移

胶 的 背景脏

解决办法

样品中内源性蛋白酶没有失活

使样品中内源性蛋白酶失活

银染中清洗步骤不充分

进行足够次数的清洗步骤

两性电解质和 SDS 或其它去污剂形成的

胶固定的时间 >3 小时或过夜,充分清洗

复合物

去除复合物

试剂质量差

使用分析级或更好的试剂

水的质量差

电导<2uS

水化盘或胶条槽被蛋白污染

彻底清洗 水化盘或胶条槽

22

Appendix II: Solutions
常用试剂的配方:
A.裂 解 液 (lysis solution)
(8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pha rmalyte3- 10 , 40 ml)
Final concentration

Amount

Urea(Fw 60.06)

8M

19.2g

CHAPS

4%(w/v)

1.6g

Pha rmalyte3- 10

2%

800µl

Double distilled H2O

To 40ml

新鲜配制或者分装贮存于- 20℃ 
1.如果需要, 尿素的浓度可以调高到 9 或 者 9.8M,也 可 用 7M Urea ,2M 
Thoiurea. 
2.其他的去垢剂( 如 Triton X -100, NP- 40, 还有其它的非离子去垢剂
或者双性离子去垢剂) 可以取代 CHAPS.
3.如果需要, 蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。
 
B .水化 液  
(不 含 有 IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG
(8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25ml)
Final concentration

Amount

Urea (FW 60.06)

8M

12g

CHAPS

2%(w/v)

0.5g

Bromophenol blue

0.002%(w/v)

50µl

Double distilled H2O

buffer)

To 25ml

分装贮存于- 20℃ 
1.DTT 和 IPG buffer 在用之前加入 :每 2.5ml 水化 液加 7mg DTT.如 果
胶内上样 ,则样品液在用之前加入到 2.5ml 的 水化液 中。 
0. 如果需要 ,尿素的浓度可以调高到 9 或 者 9.8M. 
3.其他的去垢剂( 如 Triton X -100, NP- 40, 还有其它的非离子去垢剂
23

或者双性离子去垢剂) 可以取代 CHAPS. 
溴酚蓝储液  

Final concentration

Amount

Bromophenol blue

1%

100 mg

Tris- base

50 mM

60mg

Double distilled H2O

To 10ml

 

C .水化 液  
(含有 IPG buffer, Rehydration stock solution with IPG buffer)
(8M Urea, 2% CHAPS, 0 .5% or 2% IPG buffer, bromophenol blue,25ml)
 
Final concentration

Amount

Urea (FW 60.06)

8M

12g

CHAPS

2%(w/v)

0.5g

IPG buffer(same pH range 0.5%or 2%(v/v)
as the IPG strip)
Bromophenol blue
0.002%(w/v)

125 or 500µl

Double distilled H2O

To 25ml

50µl 1% solution

 
分装贮存于- 20℃ 
1.DTT 和 IPG buffer 在用之前加入 :每 2.5ml 水化 液加 7mg DTT.如 果
胶内上样 ,则样品液在用之前加入到 2.5ml 的 水化液 中。 
2.IPG buffer 的浓度取决于所用的等电聚焦系统和 IPG 胶 条 的 pH 范围 。 
3.如果需要, 尿素的浓度可以调高到 9 或 者 9.8M 。 
4.其他的去垢剂( 如 Triton X -100, NP- 40, 还有其它的非离子去垢剂
或者双性离子去垢剂) 可以取代 CHAPS.
5.浓 度 为 0.5% 的 IPG buffer 用 125 μ l IPG buffer ,浓 度 为 2 %则 用 500
μl。 
D.平衡液 (SDS equlibration buffer)
(50mM Tris- cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol
blue, 200ml)
Final concentration
24

Amount

1.5M Tris- cl,pH8.8(see
solution F)
Urea(Fw 60.06)

50mM

6.7ml

6M

72.07g

Glycerol(87% v/v)

30%(v/v)

69ml

SDS(Fw 288.38)

2%(w/v)

4.0g

Bromophenol blue

0.002%(w/v)

400µl 1% solution

Double distilled H2 O

To 200ml

分装 40ml 贮存于 -20 ℃ 
这是一个贮存液 。用之前在加 D T T 或者碘乙酰胺 。 
 
E .单体贮存液 (Monomer stock solution)
(30% acrylamide,0.8% N,N ’- methylenebisacrylamide,200ml)
F inal concentration

Amount

Acrylamide(Fw 71.08)

30%

60.0g

N,N’- methylenebisacrylamide (Fw
154.17)
Double distilled H2O

0.8%

1.6g
To 200ml

用 0.45 微米的滤纸过滤 
4℃避光保存 
 
F . 4 x 分离胶溶液 (4x Resolving gel buffer)
(1.5M Tris - Cl pH8.8, 1000 ml)
 
Tris- base(Fw 121.1)

Final concentration

Amount

1.5M

181.5g

Double distilled H2O

750ml

HCl(Fw 36.46)

Adjust to pH8.8

Double distilled H2O

To 1000ml

用 0.45 微米的滤纸过滤 
4℃保存 
 

25

G . 1 0 %   S D S 溶液  
 

SDS(Fw 288.38)

Final concentration

Amount

10%(v/v)

5.0g

Double distilled H2O

To 50 ml

用 0 . 45 微米的滤纸过滤 
室温保存 
 
H . 1 0 %过硫酸铵 (10% Ammonium persulphate ) 
 
Ammonium persulphate(Fw
228.20)
Double distilled H2O

Final concentration

Amount

10%

0.1g
To 1ml

当加入水时,新鲜的过硫酸铵会发出“ 咔嚓” 声音。如果没有声音, 则需
要换新的药品。 用之前配制。 
 
I .凝胶贮存液 (Gel storage solution)
(0.375M Tris- Cl pH 8.8, 0.1% SDS 200ml)

4x Resolving gel buffer(see
solution F)
10% SDS(see solution G)

Final concentration

Amount

1x

50ml

0.1%

2ml

Double distilled H2O

To 200ml

4℃保存 
 
J .电泳缓冲液 (SDS electophoresis buffer)
(25mM Tris,192 mM glycine, 0.1%SDS,5 liters) 
 
Final concentration

Amount

Tris base(Fw 121.1)

25 mM

15.1g

Glycine (Fw 75.07)

192mM

72.1g

26

SDS(Fw 288.38)

0.1%(w/v)

Double distilled H2O

5.0g
Too 5000ml

室温保存 
因为该溶液的 pH 值不需要校准 ,所以可以直接在大试剂瓶种配制溶液 。
一次可以配制 2 0 L 于室温保存 。 
 
K .琼脂糖封顶液(Agrose sealing solution) 
 
Final concentra tion

Amount

SDS electophoresis
buffer(see solution J)
Agrose (NA or M)

100ml
0.5%

0.5g

Bromophenol blue

0.002%(w/v)

200µl

把所有的药品都加入到一个 500ml 的锥形瓶中。摇动混匀。在微波炉中加
热直到琼脂糖完全溶解 。不要让溶液沸腾。 2 m l 分 装,室温保存 。 

27

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