Universidade Federal do Paran Qumica Bacharelado e Licenciatura CQ 019 Cromatografia

Separao de pigmentos de folhas de beterraba por cromatografia em coluna (CLS)

Nomes: Alex Vinicius Skrzypiec Alessandra Vieira de Assis Trabalho apresentado disciplina de Cromatografia ministrada pelo Prof: Luiz Ramos Pereira

Curitiba 2013

1 Introduo:
As tcnicas cromatogrficas no se restringem apenas a uma anlise qualitativa dos componentes de uma mistura, elas tambm permitem a purificao e a quantificao dos mesmos. Como exemplo, podemos separar a matriz bioqumica de plantas, atravs de cromatografia, em diversos componentes, que podem constituir um conjunto de molculas com caractersticas semelhantes. Podemos separar, ento, o analito atravs de polaridade (cromatografia em camada delgada, cromatografia em coluna), atravs do tamanho da molcula (cromatografia de excluso) e pela carga inica (cromatografia de troca inica). Um dos principais mtodos de separao, devido a sua eficincia, a cromatografia em coluna, que consiste, basicamente, em uma coluna recheada com a fase estacionria por onde passa a fase mvel e conforme a interao dos componentes com a fase estacionria, estes sero retidos por maior ou menor tempo. A tcnica de cromatografia em coluna mais simples ocorre quando utilizamos uma fase mvel muito pouco ou pouco polar, e esta eluda atravs de uma coluna recheada com slica. Nesse caso, o eluente deve ser colocado aos poucos para que se obtenha um fluxo e o arraste das molculas seja constante. As molculas que sero separadas, se pouco polares sero menos retidas, se muito polares, tero interao maior com a slica e, portanto, sero retidas por um maior tempo.[1] A qualidade da separao da cromatografia em coluna depende de trs fatores principais: o fator de tortuosidade, a difuso longitudinal e resistncia a transferncia de massa [2]. Para o primeiro fator, se as partculas da fase estacionria forem relativamente grandes, o espao entre elas tambm ser grande e os componentes da mistura tero seu contato, com a fase estacionria, prejudicado. Para a minimizao deste fenmeno e maior eficincia na separao, deve se utilizar como fase estacionria, preferencialmente materiais de partculas finamente divididas e bem empacotadas na coluna, isso diminui os caminhos mltiplos e a separao dos componentes ser otimizada. A difuso longitudinal um problema que consiste no aumento da largura da banda de eluio ao longo da corrida cromatogrfica, que pode ser evitada aumentando-se o fluxo de fase mvel pela coluna. A resistncia a transferncia de massas ocorre quando as molculas penetram na fase estacionria e dela so gradualmente dessorvidas para novamente interagir com a fase estacionria subseqente e o resultado disso uma corrida cromatogrfica muito longa. A tcnica de cromatografia em coluna pode ser utilizada para separao de matrizes de plantas, como a da beterraba, utilizada nesta prtica que na cromatografia se separa em vrias manchas verdes e amarelas. Esses pigmentos vegetais so respectivamente a clorofila e os carotenides. A clorofila responsvel pela fotossntese vegetal, ela absorve as cores azul e vermelha do espectro eletromagntico, transformando a energia da luz em energia qumica, e por isso se apresenta com a colorao verde. Existem duas formas de clorofila presentes nas plantas, a clorofila a e b, as formas c e d so encontradas principalmente em algas e cianobactrias. A clorofila a difere da clorofila b por apresentar na posio 3 do grupo tetrapirrlico o radical -CH3 (metila) no lugar do CHO (aldedo), possuem portanto polaridades diferentes[3]. Os carotenides so uma classe de compostos que englobam pigmentos naturais de colorao amarela ao vermelho, sua estrutura qumica bsica o caroteno, caracterizam-se por serem antioxidantes naturais e quando ingeridos so os

precursores da sntese da vitamina-A. Dentre os mais importantes esto o betacaroteno, o alfa-caroteno e as xantofilas[4]. O beta-caroteno pode ser encontrado em grandes quantidades em vegetais de cor amarelada e alaranjada como a abbora, cenouras, batata-doce e tambm em vegetais de folhas verdes escuras como o espinafre e a beterraba. O alfa-caroteno um ismero primrio do beta-caroteno com a diferena apenas da posio de uma dupla ligao no anel de seis carbonos. As xantofilas, so mais polares do que as carotenos por apresentarem grupos hidroxila ligados ao anel, so portanto espcies qumicas mais oxidadas que os carotenos[5].

(Figura 1 - Beta Caroteno)

(Figura 3 - Alfa Caroteno)

(Figura 4 Xantofila)

(Figura 2 Clorofila)

2 Objetivos:
Separar os pigmentos da folha de beterraba por cromatografia em coluna.

3 Metodologia:
Primeiramente, extraiu-se os pigmentos de 3 gramas de folhas secas da beterraba. Pesou-se a massa numa balana, em seguida as folhas j modas foram transferidas para um bquer de 50mL, adicionou-se 10mL de diclorometano e ento durante 5 minutos a mistura foi agitada, com auxilio de um basto de vidro, para que os pigmentos fossem extrados. A soluo foi filtrada num funil simples com um algodo, o sobrenadante foi coletado num bquer pequeno e em seguida concentrado em banho maria at cerca de 2mL. Simultaneamente, preparou-se uma coluna cromatogrfica colocando em sua extremidade um pequeno pedao de algodo e em aos poucos foi adicionada a slica, vertendo dentro da coluna um bquer que continha a slica junto com diclorometano. Nessa etapa tomou-se o cuidado para que a coluna no ficasse com bolhas de ar e para que no secasse. Em seguida foi feita a eluio distribuindo o extrato das folhas sob a superfcie da coluna com o auxilio de uma pipeta de Pasteur e ento, correu-se a coluna com a fase mvel de diclorometano. Coletaram-se quatro fraes eludas na coluna e estas foram concentradas em banho maria.

4 Resultados:
Aps a eluio da coluna coletou-se quatro pigmentos presentes nas folhas de beterraba, um amarelo correspondente ao caroteno dois verdes que so da clorofila a e b alm de outro pigmento amarelo que provavelmente seja a xantofila. Abaixo segue umas imagens da cromatografia em si, alm de uma tabela contendo os tempos que cada pigmento levou para ser extrado.

Fotos 5 e 6. (Cromatografia em coluna)

Fotos 7 e 8. (Pigmentos coletados)

Pigmento Carotenos (alfa e beta) Clorofila a Clorofila b Xantofilas

Tempo de Reteno 2:55 1:25 2:40 13:00

Tabela 1. (tempo de reteno dos pigmentos)

O primeiro pigmentos retirado, como foi dito, corresponde aos carotenos (alfa e beta) que so os compostos mais apolares, ou seja, com menor interao com a fase estacionria, no caso a slica. Os outros pigmentos verdes que foram logo aps retirados so clorofilas a e b, a menos polar a clorofila a que possui um grupo tetrapirrolico o radical metila, o outro a clorofila b que possui o mesmo grupo um radical carbonila correspondente a um aldedo e sendo mais polar tem maior interao com a fase estacionaria. O ultimo pigmento amarelado retirado uma xantofila, as xantofilas so mais polares que os carotenos, assim ficam na extremidade da coluna cromatogrfica devido a forte interao com a slica. O ideal aps a retirada dos componentes seria fazer uma corrida em CCD pare que se observa-se a presena ou no de interferentes, afim de saber se a extrao foi boa ou no, mas por falta de tempo o mesmo no pode ser feito. Mas mesmo assim outros efeitos da cromatografia em coluna puderam ser observados como caminhos mltiplos, difuso longitudinal e resistncia a transferncia de massa. Durante a eluio da coluna a difuso longitudinal foi facilmente observada. Neste fenmeno as bandas se alargam no decorrer do tempo da anlise cromatogrfica e possvel notar que os pigmentos se apresentam em manchas de grandes propores medida que chegam ao final da coluna. A difuso longitudinal o fator que mais influenciou neste tipo de cromatografia, visto que a cromatografia em coluna muito demorada se no for pressurizada ou submetida ao vcuo. Durante o tempo em que a amostra exposta as bandas so alargadas demasiadamente, como conseqncia disso pode haver sobreposio das mesmas, fato que ocorreu na coleta da segunda frao, a banda referente xantofila passou por um tempo de reteno maior e parte dela saiu junto com as clorofilas. Os caminhos mltiplos dependem da granulometria da fase estacionria utilizada na cromatografia. Nesse experimento foi utilizada uma slica-gel prpria para coluna, no entanto no s a granulometria que um fator importante, o empacotamento da coluna tambm deve ser levado em conta. Eram visveis algumas bolhas na coluna e apesar da tentativa de remove-las surgiam outras, provavelmente oriundas do algodo. Aos poucos elas subiram na coluna e racharam a slica, criando

um caminho preferencial para a fase mvel e comprometendo a qualidade da eluio.

5 Concluso:
A cromatografia em coluna mostrou-se muito eficiente na separao dos pigmentos do espinafre, apesar do problema com o empacotamento da slica, que devido a bolhas implicou, visivelmente, no fenmeno de caminhos mltiplos, que comprometeram a qualidade da separao. Porm, os pigmentos tm suas polaridades com diferenas suficientes para que interajam com a fase mvel e estacionria de maneiras bem distintas. O ideal seria verificar a pureza dos pigmentos atravs de uma CCD para analisar quo eficaz foi a separao.

6 Bibliogafia:
[1] COLLINS, C.H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. (Coord.). Fundamentos de Cromatografia. Campinas : UNICAMP, 2006; [2] SKOOG, et. al. Fundamentos de Qumica Analtica. Traduo da 8 edio norte americana, Rio de Janeiro: Editora Thomson, 2006; [3] [4] [5] Carotenos - http://en.wikipedia.org/wiki/Carotene; Clorofilas - http://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll; Xantofilas - http://en.wikipedia.org/wiki/Xanthophyll;