4.

ünite FERMANTASYON YÖNTEMLERİ ve ÖLÇEK BÜYÜTME Mikrobiyal Büyüme Kinetikleri: Biyoteknolojide fermantasyonlar kesikli (batch), kesikli beslemeli (fed-batch) veya sürekli (continous) yöntemlerle yürütülmektedir. Kesikli Fermantasyon: Kesikli fermantörler kapalı sistemler olarak düşünülebilir. Ticari olarak penisilin ve bira üretiminde kullanılır. Kesikli sistemlerde fermantasyon ortamı hazırlanır ve mikroorganizma aşılanır. Sistemin pH, sıcaklık ve diğer değerleri ayarlandıktan sonra ortama yeni substrat veya mikroorganizma ilavesi olmaz. Fermantasyon, ortamdaki besin elementleri tükeninceye kadar veya çevresel koşullarda gözlemlenen değişikliklere göre sonlandırılır. Fermantasyon boyunca fermantöre oksijen, köpük önleyici ve pH ayarı için ilave edilen asit ve bazlar hariç herhangi bir madde ilave edilmez. Kültür ortamı, biyomas ve metabolit konsantrasyonu hücre metabolizmasının bir sonucu olarak sürekli olarak değişiklik gösterir. Kesikli fermantasyonda steril besiyerine inokule edildikten sonra, uygun koşullar altında inkübasyona bırakılan mikroorganizmada dört temel büyüme fazı görülür. Şekil 4.1.

Şekil 4.1. Kesikli kültürde hücre büyümesinin kinetiği. Lag Faz: Sterilize edilmiş büyüme ortamına aşı kültürünün ilavesinden hemen sonra lag faz boyunca mikroorganizma sayısında artış olmaz. Lag fazın uzunluğu veya kısalığı hücrelerin inokulum öncesi hangi fazda olduklarına bağlıdır. Hücrelerin inokulum ortamı ile fermantasyon ortamı arasında farklılığa göre de bu süre uzun veya kısa olabilir. Log Faz: Lag fazın sonunda hücre yeni kültür ortamına adapte olmuş olarak hızla üremeye başlar. Hücre kütlesi bu aşamada hızla artar. Hücre sayısı logaritmik olarak

Büyüme oranını tanımlayan iki sabit kullanılmaktadır.2. Ks sabiti ise µ = µ m/2 olduğu zaman Substrat konsantrasyonudur (kütle /hacim) Şekil 4. kültürün spesifik büyüme hızı sabit kalmaktadır. µ= spesifik büyüme hızı sabiti olup substrat konsantrasyonu (S) nun fonksiyonudur. µm (mg/L) Maksimum büyüme hızı olup substrat konsantrasyonunda herhangi bir sınırlama olmadığı durumlarda elde edilen değerdir. Monod Eşitliği . Spesifik büyüme hızı matematiksel olarak ifade edilebilmekte ve bazı tahminler yapılabilmektedir. şu üç parametrenin bir fonksiyonu olarak bulunabilir: S: sınırlayıcı substrat konsantrasyonu. Substrat konsantrasyonunun büyüme hız sabitine etkisi Burada x: Mikrobiyal biyokütlenin konsantrasyonu (mg/lt) µ= spesifik büyüme hızı t:= zaman Spesifik büyüme hızı µ. X (mg/L) substratın biyomas tarafından kullanılmasıyla zamana bağlı olarak artar. Şöyle ki: Biyomasın konsantrasyonu. Ks: Substrat spesifik sabiti. Buna göre aşağıdaki eşitlik çıkarılabilir.2. Şekil 4.artarken. µmax: Maksimum büyüme hızı.

1. coli’de glikoz için 1. Bu fazların ayrımı mikroorganizmanın katabolik represyonu na dayanır.7 1. Ve Kültür log fazında maksimum büyüme oranına sahip olacaktır. Maksimum spesifik büyüme hız sabitinin endüstriyel önemi çok büyüktür.46 1.73 7.1 mg/l olarak ölçülmüştür. Bu faz biyoteknolojide bazı ürünlerin eldesinde önemlidir. Ör.41 0.148 0. triptofan için1.0mg/l.72 4. µ m organizmaya ve fermantasyon koşullarına bağlı bir sabittir. Aşağıdaki tabloda bazı funguslara ait µ m değerleri verilmiştir. Örneğin E.1 1.5µ max) elde edilen substrat konsantrasyonudur. ortamda bol miktarda substrat varsa µ=µ m olacaktır. Eğer substrat bileşenlerinden her hangi biri tükenirse ve diğer bileşenler hala mevcutsa bu durumda mikroorganizma kalan substratlara göre ikinci bir log fazı yaşayacak ve buna bağlı ikinci bir µ değerine sahip olacaktır.68 3. Tablo 4. Çünkü sekonder metabolitlerin sentezi bu dönemde yapılmaktadır.61 0. Mikroorganizma kolay kullanabileceği (genellikle glikoz) şekeri parçalamak için enzimlerini sentezlerken diğer kaynağı kullanacak enzimlerin üretimini baskılar.215 Jenerasyon zamanı(h) 3. Ks değeri genellikle çok düşüktür. Antibiyotikler .1 Tablo 4. Bu durumda monod eşitliğini genişletmek gerekir. Bu fazda net büyüme gözlenmez. Durgun Faz: Bu fazda ortamdaki karbon kaynağı gibi kritik bir maddenin tükenmesi veya metabolik son ürünlerin birikmesi ile hücre kütlesindeki hızlı artış durmakta ve hücre durgun faza girmektedir.Bu eşitlikte Ks maksimum büyüme oranının yarısına ulaşıldığı anda (µ=0. Monod eşitliğinde.20 0. biyomas miktarı sabit kalır. Örneğin mikroorganizma kompleks besin ortamlarında çoğaltılırsa genellikle birden fazla log fazı görülebilir.090 0.40 0. Bazı fungusların glikozda maksimum büyüme hızı değerleri Organizma Aspergillus niger Geotricum candidum Geotricum candidum Neurospora sitophila Aspergillus nidulans Aspergillus nidulans Aspergillus nidulans T°C 30 25 30 30 20 25 30 µ m (h-1) 0.23 Monod denkleminin geçerli olmadığı durumlar da vardır.

Ticari işlemlerde ölüm fazının hiçbir değeri yoktur.3 ‘de tipik bir kesikli beslemeli proseste biyomasın zamana bağlı olarak değişimi gösterilmiştir. Bu hem biyomas hem de sekonder metabolit miktarının protein artmasına üretiminde neden kesikli olur. Besin elementleri tükenmeye başlayınca substrat. Bu aşamaya gelir gelmez fermantasyon kesilir. fermantasyon sırasında çeşitli zamanlarda azar azar ortama ilave edilir. Oksijen transferi ve . Şekil 4. Başlangıçta fermantöre konan substratın mümkün olduğu kadar konsantre olması istenir. Kesikli Beslemeli (Fed-Batch) Fermantasyon: Kesikli beslemeli fermantörler kesikli ve sürekli sistemlerin avantajlarını beraberce taşıdığı için endüstride yaygın olarak kullanılırlar. Kesikli beslemeli proseste biyomasın zamana bağlı olarak değişimi. Böylece reaktör hacminin neden oluğu problemler de aşılmış olur.Ölüm Fazı: Hücrenin enerji rezervlerinin tamamen tükendiği ve metabolik aktivitenin durduğu dönemdir. Özellikle rekombinant tipi mikrorganizmalardan beslemeli fermantasyon benimsenmektedir. Kesikli beslemeli fermantasyonun en önemli avantajı hem reaksiyon oranının hem de metabolik reaksiyon hızının substratın ilave oranına göre kontrol edilebilmesidir. Proses başlangıçta kesikli olarak başlar. (Penisilin üretiminde) Katabolik represyona açık olan substratların sisteme kontrollü verilmesine olanak tanıyan bir yöntemdir. İlave besin eklenmesi hem logaritmik hem de durgun faz sırasında yapılır. Ancak kritik öneme sahip besin elementinin konsantrasyonu çok iyi takip edilmelidir.3. Şekil 4.

Tapa akışlı reaktörlerde ise kültür solüsyonu silindirik yapıda bir reaktörde karıştırma olmaksızın ilerler.4.soğutma gibi fermantasyona etki eden parametreler kontrol altında tutulabilir. eşit miktarda ürün ve onunla birlikte mikroorganizma sistemden alınır (Şekil 4. reaksiyon oranı kontrol edilerek Sürekli (Continuous) Fermantasyon: Açık sistemlerdir. Homojen karışımın sağlandığı reaktörlerde kemostat veya türbidostat olarak çalışabilir. reaktördeki hücre bölünmesiyle dengelenir. Silindirik tüpün kesitlerinde hücre sayısı veya ürün konsantrasyonu farklılık gösterir. Kemostat sisteminde fermantasyonunun kararlılığı substratlardan bir tanesinin konsantrasyonu ayarlanarak hücre büyümesi kontrol edilerek sağlanır. Türbidostat yöntemine ise fermantasyonda biyomas konsantrasyonu türbidimetrik olarak ölçülür ve elde edilen verilere göre besin ilave edilerek kararlılık sağlanır. Sürekli fermantasyonda kararlı hal durumunda . Bu sistemde steril besin biyoreaktöre ilave edilirken. Şekil 4. Homojen karışımın sağlandığı biyoreaktörler ve tapa akışlı reaktörler.4). Sürekli fermantörün genel yapısı Ürünün alımı sırasında kaybedilen mikroorganizmalar. Sürekli fermantasyon yönteminde iki temel uygulama vardır.

biyoreaktörden alınan mikroorganizmalardan dolayı sistemden ayrılan mikroorganizmalar reaktör içinde hücrelerin bölünmesi ile dengelenir. Ancak eğer dilüsyon oranı µmax değerini aşarsa hücreler çoğalmak için yeterince zaman bulamayacaklardır besinin sistemi hızla terk etmesinden dolayı Bu ndan kaçınmak için kritik dilüsyon oranını aşmamak gerekir. Kemostatta mikrobiyal büyüme monod denklemini sürekli sisteme uyarlarsak sistemin kararlı halinde µ=D olduğu için monod denklemine uyarlarsak: D=µmax S/Ks+S . (Şekil 4. Veya µ=D olacaktır dolayısıyla sabit akış oranı ve sabit dilüsyon oranında sistemde fiziksel ve kimyasal koşullarda sabit olacaktır.5. Reaktöre giren taze besininin dilüsyon oranı (D) ayarlanırsa reaktör içinde çoğalan hücrelerle reaktörden ayrılan hücreler dengeye ulaşır ve sistemde birim zamanda net mikroorganizma değişimi sıfır olur Yani Dx/dt =µx. Şekil 4. Sistem kararlı hale ulaştığı zaman spesifik büyüme oranı dilüsyon oranına bağlı olacaktır.5).Dx (monod denklemine göre) Kararlı hale ulaşıldığında üreme oranı sitemden çıkan mikroorganizmalarla dengeleneceği için dx/dt=0 olacaktır. D=F/V D= dilüsyon oranı F= volümetrik akım (l/s) V= reaktör hacmi (l) D değeri mikroorganizmanın reaktöre giren taze substratı kullanabilmesi için substratın reaktörde ne kadar alıkonacağı hakkında bize bilgi verir. sonuç olarak µx= Dx olacaktır.

subtilin. Büyük ölçekli kesikli fermantasyonlar tamamlandıktan sonra hücrelerin hasadı. Dm değeri üzerine çıkıldığı zaman reaktörde kararlı halin oluşması mümkün değildir. Asetik asit. Maksimum büyüme hız sabiti endüstriyel üretimlerde en çok verim ve en küçük fermantör hacmini karşılayacak şekilde ayarlanmalıdır. Dilüsyon oranındaki herhangi bir değişiklik yeni dilüsyon oranının sağladığı substart elde etme olanağına göre mikroorganizmanın büyüme oranını değiştirecektir. glukonik asit. Sadece tek bir fermantörün kullanıldığı sistemler. kesikli kültürlere göre daha küçük ölçekli biyoreaktörler gerekmektedir. geri beslemeli sürekli fermantörler (sistemden uzaklaştırılan kütlenin bir kısmı sisteme yeniden verilir). parçalanması. kesikli fermantasyona göre daha düşüktür.Bu denklemde S kararlı halde sabit dilüsyon oranında reaktörde kalan substrat miktarını göstermektedir. Endüstriyel fermantasyonlarda temel konu maliyetlerin minimuma. Eğer akış oranı Dm in hemen altında olursa sistem dış etkilere karşı çok hassas bir duruma gelir ve hücre veya sistemden ayrılan kültür üzerinde hafif bir değişiklik biyomas üzerinde çok büyük değişiklikler meydana getirebilir. Sürekli kültürde ise ürün ortama azar azar alındığı için bu işlemler için daha az ekipman gerekmektedir. ve iki veya daha fazla fermantörün beraberce kullanıldığı sürekli sistemler gibi. bütanol. ürün veriminin maksimuma çıkarılmasıdır. Sürekli fermantasyon sistemlerinde akış hızı çok yavaş veya çok hızlı olursa monod denklemi uygulanamaz. sürekli kültürlerde. Sürekli fermantasyon çok çeşitli şekillerde uygulanabilir. . Sürekli kültürlerde elde edilen hücre biyomasının üretim maliyeti. ekmek mayası. Denklem S değerini elde edecek şekilde tekrar düzenlenirse: S= D Ks/µmax-D bulunur. laktik asit. veya metabolitlerin izolasyon ve saflaştırılması için büyük ölçekli ekipmana ihtiyaç vardır. etanol. Sonuç olarak reaktörde kalan substratın miktarı dilüsyon oranı (D) ile kontrol edilebilir. bira gibi ürünler bu sistemle ticari olarak üretilmektedir. Ticari olarak aynı miktardaki ürünü üretmek için. Bu amaç için her proses için en etkili fermantasyon yöntemlerinin belirlenmesi gerekmektedir.

Buda ürün veriminin azalmasına yol açabilir. Yüzey/hacim oranı nedeniyle oksijen transferini büyük ölçekte sağlanması çok zordur. Küresel bir mikroorganizmanın hacmi 4/3µr3’tür. Bunun bir çok nedeni vardır. Ölçek Büyütme (Scale Up) Laboratuar koşullarında yapılan küçük ölçekli bir biyoteknolojik işlemin endüstriyel boyuta dönüştürülmesi işlemine ölçek büyütme denir. bazı solventlerin üretildiğini görüyoruz. Alan/Hacim= 3/r’dir. Sonuç olarak küçük bir hücre büyük bir hücreye göre daha etkin çalışabilmektedir. Sürekli fermantasyon süresi 500-1000 saat arasında değişmektedir. Endüstride karşılaşılan en önemli problem biyoreaktörlerin temizliği ve sterilizasyonudur.  Ekipman Hacmi: Ekipman hacmi büyüdükçe yüzey/hacim oranı değişecektir. Alanı ise 4µr2’dir. ayrıca kültür ortamının hep aynı kalitede sağlanması güçtür ve verimliliği etkiler. Bu zaman kaybına yol açmakta sürekli fermantasyonda ise fermantasyon daha uzun süre gerçekleştirildiği için temizlik vs. Havalandırma iyi yapılamazsa verim düşer. Bu sürenin uzun olması rekombinant teknolojisi ile protein üretiminde dezavantaj oluşturur.  Havalandırma ve karıştırma: Laboratuar ölçeğinde yapılan fermantasyonlarda havalandırma ve karıştırma kolaydır.Sürekli fermantasyonda kesikli kültürlerdeki gibi biyoreaktörün yeniden kullanımı için hazırlanması gibi bir zaman kaybı yoktur. Dolayısıyla hacim arttıkça yüzey alanının (mikroorganizmanın) küçüldüğünü görürüz. için daha az zaman gerekmektedir. Sürekli fermantasyonda hücrelerin fizyolojik durumu uniform olduğundan ürün verimi daha tutarlıdır. Endüstriyel ölçekte uzun zaman boyunca sterilitenin korunması. Havalandırma çok kısa süreli dahi kesilse fermantasyon içinde kısmi anaerobik koşullar oluştuğu için verimi büyük oranda etkiler. Bu yüzden organizma belli bir süre sonra plazmitlerini atma eğilimi göstermektedir. Çünkü rekombinant organizmaya yeni gen ilavesi hücrenin enerji ihtiyacını artırır. Karıştırmanın daha az . Laboratuar ölçeğinde yapılan denemelerde saptanan değerler çoğu kez endüstriyel ölçekte aynı başarı ile uygulanamaz.  Gaz Transferi: Fermantör hacminden çok maruz kalınan yüzeye bağlı olduğu için karıştırma çok büyük önem kazanmaktadır. ancak endüstriyel çapta yapılan üretimlerde havalandırma ve karıştırma zor olmaktadır. Sürekli fermantasyon yöntemi ile ticari olarak bazı antibiyotiklerin.

Ör: oksijenin sıvıda transportu. Ölçek büyütme çalışmalarında en önemli şey fermantörde oksijen oranının fermantör boyutu arttıkça sabit tutulmasıdır. Ör: Bir hücre ekstraselular proteinaz sentezliyorsa sıvının vizkositesini artıracaktır. . Transport prosesleri ölçeğe bağlıdır. Ölçek büyüdükçe ısı artmakta ve süratle soğutma gerekmektedir. karıştırma hızı ve pervane geometrisi önemlidir. sıvıdaki besinin ve oksijenin hücreye transportu gibi. Bunun için karıştırmanın hızlı olması ve daha güçlü hava üflenmesi gerekmektedir. Transport prosesi için ölçek arttıkça zaman sabiti işin içine girmektedir. Ölçek büyütme işlemlerinde önerilen yöntemler kısaca aşağıdaki gibidir. Transport işlemleri iyi bir şekilde yapılmazsa zaman uzar. Bilgisayar desteği ile. Burada artık hiçbir sorunun ortaya çıkmaması gerekmektedir. reaktörün boyutuna bağlı değildir. Bu iki fenomen ölçekten bağımsızdır. Ölçek büyütme ekip çalışmasını gerektirir. mikrobiyolog. Ama karıştırma zamanı. Mikroorganizmanın sahip olduğu bazı özellikler ölçek büyütmede sorun oluşturur. Ör: Oksijenin sıvıda çözünürlüğü. Bunun uzamaması için karıştırmanın çok iyi yapılması gerekir. gıda mühendisi gibi. Buradaki koşullar ticari hacme oldukça yakındır. faktörler önemlidir). Ölçek büyütmede rol oynayan üç olay vardır. Kimya mühendisi. mikrokinetik fenomen ve transport fenomenler. laboratuar koşullarında elde edilen değerlere yakın değerler elde edilir. biyokimya. Ölçek büyütmede ilk çalışmalar laboratuar erlenlerinde yapılır. Mikroorganizmaların mikrokinetik davranışları fermantör boyutuna bağlı değildir (besin konsantrasyonu. Ör: Küçük bir fermantörde optimum verim elde etmek için 200mmol/saat oksijen gerekiyorsa ölçek ne kadar büyürse büyüsün aynı oranın temin edilmesi gerekir. Termodinamik fenomen. Üçüncü basamakta pilot bazda denemeye geçilir. sıcaklık vb. Birde aşı kültürünün kararlılığı önemlidir. Bu üç fenomen dışında ısı transferi önemlidir. Burada başarı elde ediliyorsa küçük hacimli bir laboratuar fermantörüne (5-10lt) geçiş yapılır. pH. Son safha 10000-400000 lt hacimli fermantörlerin kullanıldığı endüstriyel basamaktır.etkili olduğu bölgelerde cep denilen bölgeler oluşmakta ve mikroorganizma böyle ceplere girerse fermantasyon koşullarından farklı çevresel koşullara maruz kalacağı için verim düşmekte amaç dışı şeyler gelişebilmektedir. Ama maliyet yine düşüktür. Bu aşamalarda kullanılan denemenin maliyeti düşük işlem parametrelerini test etmek kolay olduğu için avantajlıdır. Genellikle 300-3000lt hacimli bir fermantörde çalışmalar devam ettirilir.

Diğerleri Laboratuvar ölçekli fermantörde ise şu parametreler optimize edilmeye çalışılır: • • • • • • Karıştırma Soğutma ve ısıtma Hava giriş ve çıkışı pH kontrol Besin ilavesi Inokulasyon Laboratuar ölçekli denemelerde kesikli proses. Elde edilen parametreler bir sonraki adımda ticari ölçeğe yakın bir pilot fermantöre uyarlanarak ölçek biraz daha büyütülür.000-500. Substrat konsantrasyonun optimizasyonu 6. Substrat seçimi 5. enerji girişinin sabit kabul edildiği çalışmalar  karıştırma zamanının sabit kabul edildiği çalışmalar  oksijen transfer katsayısının sabit kabul edildiği çalışmalar  çevresel koşulların (çözünmüş oksijen gibi) sabit kabul edildiği çalışmalar. sürekli proses veya yarı sürekli proses uygulanabilir. Sıcaklık 3. Son adım endüstriyel boyutta fermantör uygulaması olup bu aşama da sorun çıkması istenmez. kesikli beslemeli proses. pH 2. Kaynaklar:  Rengin Eltem Mikrobiyal fizyoloji ders notları .000 L) ticari fermantöre taşınması Çalkalamalı erlen denemelerinde hedeflenen optimizasyon parametreleri şunlardır: 1. • • • • Çalkalamalı erlen denemeleri Laboratuvar ölçekli fermentor (5-10 L) Pilot ölçekli fermentor (300-3000 L) Ticari fermentor (10. Oksijenin çözünürlüğü 4. Endüstriyel bir biyoprosesin laboratuar ortamından aşağıdaki aşamalardan sonra gerçekleşir.

John Bu’lock. Bjorn Kritiansen. second edition. Florida. Basic Biotechnology. Control Engineering Laboratory Report A No.  Lesson 1: Fermentation processes. Wulf Crueger. A Textbook of Industrial Microbiology. June 2003 . 1989.  Biotechnology. Orlano. Academic Press.  Modelling of a fed betch fermentation process. 21. Anneliese Crueger.types and stages of fermentation process. Sinauer press. Rai University. University of Oulu. 1987.