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Daniel Soutullo 1. Introduccin 2. Definicin y tipos de terapia gnica 3. Condiciones de aplicabilidad de la terapia gnica 4.

Pasado y presente de la terapia gnica 5. Problemas de la terapia gnica y de sus aplicaciones 6. Conclusin 1. Introduccin En el captulo anterior hemos comentado algunas implicaciones de la concurrencia de intereses econmicos en el desarrollo del Proyecto Genoma Humano y en algunas de sus aplicaciones en el terreno biosanitario, con especial atencin a los tests de diagnstico de enfermedades genticas en general y de las multifactoriales en particular. El presente captulo estar dedicado a la terapia gnica, otro de los campos que mayores expectativas ha levantado en los ltimos aos ya que, a diferencia de los tests de diagnstico comentados, la terapia gnica est orientada no al diagnstico sino a la curacin de las enfermedades, curacin que, mediante su aplicacin, se pretende que pueda llegar a ser definitiva. Aunque la investigacin en terapia gnica se ha desarrollado paralelamente al Proyecto Genoma Humano y no puede ser considerada una consecuencia directa del mismo, no cabe duda de que el conocimiento de la secuencia completa del genoma humano, en la medida en que permita el conocimiento de todos los genes, puede suponer un impulso muy importante para las posibilidades de la terapia gnica[1]. En este captulo describiremos en qu consiste la terapia gnica, los principales pasos que ha dado hasta ahora desde su puesta en marcha y algunas de sus aplicaciones presentes y futuras. Tambin discutiremos las dificultades ms importantes con las que se encuentra y por qu a pesar de stas constituye uno de los focos de mayores esperanzas sanitarias que ha abierto la revolucin biotecnolgica de los ltimos 25 aos. 2. Definicin y tipos de terapia gnica No existe una nica definicin satisfactoria de terapia gnica. Lacadena presenta dos, una ms estricta y otra ms amplia: En un sentido estricto, por terapia gnica humana (TG) se entiende la administracin deliberada de material gentico en un paciente humano con la intencin de corregir un defecto gentico especfico. Otra definicin ms amplia considera la terapia gnica como una tcnica teraputica mediante la cual se inserta un gen funcional en las clulas de un paciente humano para corregir un defecto gentico o para dotar a las clulas de una nueva funcin.[2] La primera de las definiciones, la ms estricta, se corresponde con lo que fueron los primeros protocolos de terapia gnica a comienzos de los aos 90, es decir, ensayos dirigidos a corregir los efectos de algunas enfermedades monognicas recesivas. Sin embargo, esta definicin no engloba una buena parte de los procedimientos que, a nivel experimental, estn empezando a ser ensayados en modelos animales e incluso en humanos. Adoptar la segunda de las definiciones puede ayudar a resolver este problema pero presenta la contrapartida de que al extender excesivamente los lmites del concepto aparecen nuevos problemas,

quizs de mayor trascendencia social. Algunos autores han prevenido contra una utilizacin demasiado laxa del concepto de terapia gnica ya que puede abrir la puerta a tratamientos que no son propiamente teraputicos pero que se presentan disfrazados de tales. Apuntan, adems, que esa utilizacin amplia del concepto no suele ser inocente y puede ser considerada una forma de hacer ms aceptables procedimientos de ingeniera gentica humana que de otro modo podran contar con una mayor oposicin social. En este sentido, Miguel Moreno opina que: No deberamos considerar terapias gnicas las destinadas a prevenir el desarrollo de enfermedades hereditarias, conforme a los datos derivados de un anlisis gentico revelador de propensiones a las mismas; ni las de carcter preventivo, contra infecciones generalizadas de origen viral; o las transferencias gnicas destinadas a identificar los fenmenos (genticos, fisiolgicos, cromosmicos, etc.) implicados en la etiologa de una enfermedad especfica (su fin primero es el diagnstico, que en muchas ocasiones de poco sirve para la terapia).[3] (vase artculo original) Teniendo presentes estos problemas, aunque no resulte totalmente satisfactoria para los propsitos de nuestra discusin, emplearemos a lo largo de este captulo la definicin genrica de que la terapia gnica consiste en la modificacin gentica de clulas de un paciente a fin de combatir alguna enfermedad[4]. Aunque no elimina totalmente los problemas antes apuntados, circunscribe los usos de la terapia gnica a unos fines teraputicos y deja fuera de la misma otras utilidades diagnsticas, preventivas o eugensicas no propiamente curativas. Adems, una definicin tan general como sta presenta la ventaja de que permite englobar estrategias muy distintas encaminadas a la curacin, mediante tcnicas genticas, de enfermedades no solamente genticas sino tambin infecciosas. Otro problema que conviene tener presente cuando nos referimos a la terapia gnica es su carcter fundamentalmente experimental. En este sentido, definirla como una terapia no deja de ser una proyeccin de sus potencialidades futuras cuando stas lleguen a convertirse en una realidad, cosa que de momento solamente se ha producido en un nico caso[5]. Exceptuando este caso, los ensayos ms exitosos realizados hasta ahora deben ser considerados ms un tratamiento, que ha conducido a una mejora temporal, que una curacin propiamente dicha[6]. Dependiendo del tipo de clulas a las que se aplique podemos distinguir entre terapia gnica somtica y germinal[7]. La primera dirige la modificacin gentica a cualquiera de los tejidos corporales del paciente y, aunque llegase a tener efectos duraderos a largo plazo, stos se circunscriben al individuo tratado. En ningn caso pasan a la descendencia pues los genes que se transmiten de padres a hijos son aqullos presentes en los vulos y espermatozoides. Una intervencin gentica sobre clulas pulmonares, nerviosas, musculares, sanguneas o hepticas, por poner solamente unos pocos ejemplos, podra corregir defectos genticos en estos tejidos u rganos, pero estas clulas no se transmiten a la progenie por lo que, por importante que pueda llegar a resultar para el paciente en cuestin, carece de consecuencias hereditarias. La terapia germinal, por el contrario, ira encaminada a la modificacin gentica de las clulas reproductoras, de sus clulas precursoras de la lnea germinal o de las clulas embrionarias en las primeras etapas del desarrollo. En el caso de las

clulas germinales los efectos teraputicos se manifestaran sobre los descendientes, aqullos que se originan a partir de las clulas germinales tratadas, pero no sobre los individuos productores de dichas clulas. Por afectar a la lnea germinal, todas las clulas de los individuos de la generacin emergente sometida a terapia incorporaran la modificacin que, de este modo, podra propagarse hereditariamente a las generaciones siguientes descendientes de ese linaje. De momento la terapia germinal no est autorizada en ningn pas y todos los protocolos en marcha hasta el momento en seres humanos son de terapia somtica[8]. Sin embargo, como las consecuencias ticas y sociales de la aplicacin de estos dos tipos de terapias son muy distintas el debate sobre la utilizacin futura de la terapia germinal tiene una relevancia notable por lo que nos ocuparemos de l, aunque brevemente, en la parte final del captulo. En cuanto a los mtodos de aplicacin hay que distinguir la terapia ex vivo, cuando los genes se transfieren a clulas en cultivo extradas del paciente que posteriormente son reincorporadas al organismo, y la terapia in vivo, cuando los genes se transfieren directamente al paciente[9], por ejemplo, a travs del torrente circulatorio. Una variante de esta ltima es la modalidad de terapia in situ, si el tratamiento es realizado directamente en el rgano afectado[10]. Desde un punto de vista terico se pueden concebir distintas estrategias de terapia gnica dependiendo de los objetivos que se persigan[11]. La ms comn y simple consiste en la insercin gnica, la introduccin en las clulas tratadas de una copia de un gen normal. Esta tcnica, conocida tambin como terapia de aumento gnico (GAT) por el efecto que produce[12], se aplica a enfermedades recesivas en las cuales no se produce el producto gnico normal. La introduccin de una copia de la variante no mutada del gen persigue la produccin de la protena funcional en una cantidad suficiente para restablecer el fenotipo normal. En este procedimiento los genes recesivos mutantes no interfieren con el producto gnico normal por lo que no es necesario proceder a su eliminacin. La insercin gnica es especialmente apta para enfermedades recesivas que no requieren una regulacin estricta de la cantidad de producto gnico producido para que el fenotipo normal pueda ser recuperado. Es por esto que es la tcnica de terapia gnica ms empleada y prcticamente la nica ensayada en los protocolos con clulas humanas afectadas por dolencias hereditarias. Sin embargo, es inservible para la casi totalidad de enfermedades producidas por genes de efecto dominante. Una segunda modalidad, ms difcil desde el punto de vista tcnico, es la correccin dirigida de mutaciones (gene targeting) mediante algn procedimiento de modificacin o ciruga gnica que sustituya o bien el gen defectuoso por una copia normal del mismo o tan slo sustituya la secuencia mutada del gen por la secuencia normal, recomponindose de este modo la funcin original del gen. El mecanismo concreto para realizar esta sustitucin sera la recombinacin homloga[13], que ya ha sido ensayada en ratones pero que debido a su dificultad y escasa fiabilidad actual an no ha sido nunca ensayada en humanos. Tambin sera posible realizar la correccin a nivel del ARN mediante el empleo de ribozimas. De llegar a ser aplicada esta modalidad podran ser tratadas enfermedades dominantes. Existen otras estrategias de terapia gnica como la supresin dirigida de clulas especficas insertando genes suicidas o genes estimuladores de la respuesta

inmune o la inhibicin dirigida de la expresin gnica bloqueando el ADN, el ARN o la protena producida por el gen. Existen diversos procedimientos posibles para conseguir este objetivo, como puede ser el uso de ADN antisentido o la formacin de hlices triples mediante el uso de oligonucletidos de ADN. Los mtodos basados en la supresin de clulas ya se han ensayado para la eliminacin de tumores cancerosos, mientras que los basados en la inhibicin de la expresin gnica podran ser tiles para el tratamiento de ciertos cnceres, algunas enfermedades infecciosas y para enfermedades hereditarias de efecto dominante. Con un catlogo tan grande de tcnicas de terapia gnica el espectro de enfermedades que podran ser tratadas es tericamente bastante amplio. Entre ellas se encuentran enfermedades infecciosas, cnceres, enfermedades hereditarias recesivas y dominantes y trastornos del sistema inmune, como alergias y enfermedades autoinmunes[14]. Sin embargo, en la prctica, las dificultades para aplicar con xito la mayor parte de las estrategias de terapia gnica son numerosas y los resultados obtenidos hasta ahora han sido mucho ms modestos de lo que en un principio se esperaba. Los problemas pueden surgir por la naturaleza de enfermedad a tratar, por el tipo de tejido en el que se localice la dolencia, por el mtodo empleado para transferir los genes a las clulas o, tambin, por el nivel de control de la expresin gnica necesario para que las clulas tratadas funcionen con normalidad. Incluso, se han dado algunos casos de reacciones inmunitarias contra el producto gnico normal producido por el gen introducido mediante terapia que el organismo ha tratado como extrao. 3. Condiciones de aplicabilidad de la terapia gnica Aunque, como acabamos de ver, la terapia gnica tericamente podra ser aplicable a enfermedades muy distintas, existen varios factores que condicionan su aplicabilidad y que han reducido enormemente las posibilidades concretas de actuacin. El primero de estos factores hace referencia al tipo de herencia. En general, las enfermedades mendelianas, determinadas por la accin de un nico gen, son mejores candidatas que las enfermedades multifactoriales que, adems de depender de la accin conjunta de varios genes, estn influidas por factores ambientales. Una excepcin a este criterio general lo constituye el cncer que, pese a que puede ser catalogado como una enfermedad tpicamente multifactorial, ha sido objeto en los ltimos aos del mayor nmero de protocolos de terapia gnica. El segundo factor a considerar es el patrn de herencia. Las enfermedades recesivas son mejores candidatas a ser tratadas mediante terapia gnica que las dominantes. En las primeras, debido a su carcter recesivo, podra ser suficiente aadir una copia del gen sano para recuperar el fenotipo normal, mientras que en las segundas esto no es suficiente en la mayora de los casos y sera necesario recurrir a algn tipo de modificacin dirigida del gen daado, lo que complica enormemente las posibilidades de intervencin. El tercer factor se refiere ms especficamente a la naturaleza de la mutacin causante de la enfermedad. Por ejemplo, cuando la mutacin es de prdida de funcin, es decir, el gen afectado deja de producir la protena codificada por l o sta no es funcional, como es el caso de la mayora de enfermedades recesivas, el defecto podra ser corregido por terapia de aumento gnico, la ms sencilla de

todas pues, en principio, bastara con la introduccin de una copia normal del gen que produjese la protena funcional para que la correccin se llevase a efecto. Por el contrario, las mutaciones de ganancia de funcin, como la aparicin de una nueva protena mutante o de un producto txico, que son caractersticas de algunas dolencias dominantes, no pueden ser tratadas aadiendo genes normales y necesitaran de otras estrategias ms difciles de llevar a cabo, como el bloqueo especfico del gen mutado o la correccin dirigida de la mutacin. El cuarto factor a tener en cuenta es el control de la expresin gnica. Aquellos genes que no necesitan un excesivo control de su expresin, manteniendo un fenotipo funcional con niveles variables de producto gnico, son los ms fciles de tratar. Por el contrario, cuando la expresin gnica requiere un control estricto los problemas que se presentan son mucho mayores. Este ha sido el caso, por ejemplo, del tratamiento mediante terapia gnica de la enfermedad de los glbulos rojos -talasemia. La expresin del gen de la -globina insertado requiere, para curar la enfermedad, un control exacto de su produccin, que debe ser igual al de la -globina. Esto es necesario para que las molculas de hemoglobina resultantes, formadas por dos cadenas proteicas de -globina y otras dos de globina, desempeen su funcin con normalidad. Esta necesidad de control de la expresin gnica ha impedido hasta el momento la consecucin de progresos significativos en la aplicacin de la terapia gnica a esta enfermedad sangunea. El quinto factor de importancia en la aplicabilidad de la terapia gnica es el tamao del ADN codificante del gen a insertar. Los genes con secuencias de pequeo tamao son siempre mejores candidatos, mientras que los genes con un ADN codificante de gran tamao pueden ser difciles de transferir al interior de las clulas debido a la dificultad de encontrar vectores adecuados. Por ltimo, la enfermedad ser ms fcilmente tratable si se manifiesta en un tejido cuyas clulas puedan ser extradas, cultivadas con facilidad in vitro, resistentes a la manipulacin y reintroducidas sin dificultad en el organismo. Adems, sera deseable que fuesen clulas de larga vida, a ser posible que permaneciesen durante toda la vida del paciente. Las clulas que ms se aproximan a estas condiciones tisulares son, sobre todo, las de la mdula sea, la piel y el hgado por lo que, en principio seran las mejores candidatas. El procedimiento estndar ms utilizado de terapia gnica sigue, de modo muy esquemtico, los siguientes pasos[15]: 1) Identificacin, aislamiento y amplificacin del gen que va a ser utilizado para el tratamiento; 2) Extraccin y cultivo in vitro de las clulas del tejido del paciente a tratar; 3) Transferencia del gen teraputico al interior de las clulas mediante un vector. El gen transferido debe llevar alguna secuencia promotora que permita su expresin y debe ir acompaado tambin de algn marcador que permita identificar las clulas a las que se ha incorporado el gen, por ejemplo, un gen de resistencia a algn frmaco. De esta manera al ser expuesto el cultivo al frmaco en cuestin, nicamente sobrevivirn aquellas clulas resistentes, es decir, las que hayan incorporado el gen de resistencia y el gen teraputico asociado al mismo. A continuacin se transfieren las clulas seleccionadas con el gen incorporado al paciente a la espera de que ejerzan su funcin fisiolgica normal lo que conllevara la eliminacin de la patologa.

Uno de los pasos cruciales y que mayores problemas ha planteado hasta ahora ha sido el de seleccionar el vector adecuado para la transferencia gnica. Los principales tipos de vectores son virus (retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus y lentivirus, un familia particular de retrovirus), aunque tambin se han realizado ensayos con liposomas, conjugados moleculares y con ADN desnudo[16]. El uso de virus como vectores en terapia gnica para introducir genes en clulas se realiza destruyendo la actividad patognica del virus y su capacidad de multiplicacin dentro de las clulas. Para ello, se eliminan de su ADN los genes responsables de estas funciones, que son sustituidos por los fragmentos de ADN teraputico que se desean transferir. Cada tipo de vector presenta ventajas e inconvenientes distintos y hasta el momento no se ha encontrado ninguno que resulte idneo[17]. Los retrovirus y los adenovirus son los vectores que ms se han utilizado hasta ahora y, debido al carcter no tcnico de esta exposicin, sern los nicos sobre los que realizaremos un breve comentario. Los retrovirus presentan una eficacia alta de trasferencia gnica y tienen la ventaja de que integran el ADN transferido en los cromosomas de la clula tratada por lo que ofrecen estabilidad a largo plazo. Sin embargo, presentan algunos inconvenientes de importancia. Los ms destacados son que la integracin del ADN trasferido en los cromosomas de la clula se realiza al azar por lo que podra interferir el funcionamiento de un gen sano. Incluso podra llegar a transformar una clula en cancerosa si la insercin se realiza en un protooncogen o en un gen supresor de tumores. En segundo lugar, solamente pueden transferir ADN a clulas que se dividan activamente por lo que no son aptos para aquellos tejidos en los cuales las clulas habitualmente no se dividen, como el tejido nervioso o el muscular. En tercer lugar, no pueden ser utilizados para terapia in vivo ya que, normalmente, son eliminados por el sistema inmune del complemento. Y, finalmente, el ADN transferido no puede superar el tamao de 8 kb (8.000 nucletidos) por lo que no sirven para transferir genes demasiado grandes. Por su parte los adenovirus, virus que en estado natural provocan resfriados comunes, tienen como principales ventajas que tambin presentan una eficacia alta de transferencia gnica, pueden transportar genes grandes, de hasta 35 kb, y pueden infectar clulas que no se dividan. Adems, son aptos para realizar terapia in vivo, ya que pueden transferirse directamente a los tejidos del paciente. Los principales inconvenientes radican en que no integran el ADN en los cromosomas por lo que su efecto no es duradero, ya que los genes se pierden cuando las clulas se dividen. En algunos casos este problema podra convertirse en una ventaja si el efecto que se pretende conseguir es transitorio, como en el caso de algunos protocolos de terapia gnica contra ciertos tipos de cnceres. Otro problema que presentan es que suelen provocar una importante respuesta inflamatoria e inmunolgica, que puede provocar complicaciones en el paciente. Adems, esta respuesta inmunitaria reduce la eficacia de la terapia, al eliminar una buena parte de los virus que se usan para la transfeccin. Actualmente la cuestin de los vectores de transferencia de genes es uno de los problemas tcnicos ms importantes que presenta la terapia gnica y que hasta ahora ms ha limitado la obtencin de resultados satisfactorios, hasta el punto de que hay investigadores que creen que las estrategias futuras tendrn que cambiar sustancialmente: Casi con toda seguridad, las herramientas del futuro no van a

ser los prototipos que se estn ensayando hoy en los laboratorios. Y no habr una tcnica ideal para cada enfermedad, sino que existirn muchas opciones[18] 4. Pasado y presente de la terapia gnica El primer ensayo de terapia gnica realizado en humanos se remonta a 1980, cuando Martin Cline realiz un intento de curacin mediante esta tcnica, sin autorizacin previa, de dos enfermos de talasemia [19]. El intento no tuvo xito y se sald con la prdida del puesto de trabajo de Cline. La aprobacin del primer protocolo clnico para un ensayo que implicaba la insercin de un gen en un ser humano fue realizada en enero de 1989. La solicitud fue presentada por los Dres. Anderson, Blaese y Rosenberg y no era propiamente una terapia gnica[20]. En septiembre de 1990, los mismos Blaese, Anderson y sus colaboradores realizaron el primer ensayo clnico de terapia gnica con resultado exitoso. La paciente era una nia de 4 aos con deficiencia en adenosina desaminasa, una enfermedad recesiva muy rara que provoca una inmunodeficiencia combinada grave[21]. El tratamiento consisti en introducir el gen ADA en linfocitos T cultivados, extrados de la paciente y reintegrarlos posteriormente a su organismo. Dado que los linfocitos no son clulas madre y tienen una duracin temporal limitada se saba que, an en el caso de que el ensayo tuviese xito, la curacin no sera definitiva por lo que tendra que ser repetida a intervalos regulares. Aunque los resultados fueron positivos y la nia pudo llevar desde entonces una vida normal, el tratamiento hubo de ser repetido, primero cada 1-2 meses y posteriormente cada 3-6 meses. Sin embargo, es difcil hacer una evaluacin precisa del mismo ya que la paciente fue tratada simultneamente con PEG-ADA, un frmaco que incluye la protena ADA normal y que es utilizado en los tratamientos convencionales de esta enfermedad[22]. Desde entonces ms de 3.000 pacientes han recibido terapia gnica para diversas afecciones en todo el mundo. En 1992, los ensayos aprobados incluan, adems de la transferencia del gen ADA a linfocitos, las transferencias para seis genes distintos ms, algunos de ellos relacionados con tumores[23]. En los ltimos aos se han realizado ensayos para algunos trastornos hereditarios como la fibrosis qustica, hipercolesterolemia familiar, enfermedad de Gaucher y la distrofia muscular de Duchenne. Hasta agosto de 2000, haba registrados en los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos 431 ensayos de terapia gnica, de los cuales 393 (91 por ciento) correspondan a los propios Estados Unidos y 38 (9 por ciento) al resto del mundo[24]. De todos ellos, 271 (64 por ciento) estaban dedicados al cncer, 33 (9 por ciento) al sida, 28 (7 por ciento) a enfermedades cardiovasculares, 25 (6 por ciento) a fibrosis qustica y los 52 restantes a otras enfermedades, ninguna de las cuales superaba por separado el 2 por ciento del total de ensayos[25]. Se observa en estos datos un predominio muy grande de los ensayos dirigidos a tratar el cncer y, en bastante menor proporcin, al sida. Diversos autores[26] coinciden en afirmar que las razones de esta preponderancia de ensayos de terapia gnica sobre el cncer tienen relacin con varios factores entre los que se cuentan, adems de la gravedad del mismo, la mayor facilidad de tratamiento que otras enfermedades mediante terapia gnica ya que siempre es ms fcil programar una estrategia destructiva dirigida a la eliminacin de clulas que otra constructiva encaminada a restaurar su correcto funcionamiento, la gran

experiencia existente en investigaciones sobre tumores desde el punto de vista clnico, la elevada financiacin que recibe la investigacin sobre el cncer y el inters de la industria farmacutica sobre un problema que afecta a un gran nmero de enfermos. Sin embargo, a pesar de todos estos esfuerzos, y como se prevea debido a su complejidad, el cncer est revelndose como una enfermedad difcil de corregir y los progresos han sido modestos[27]. Hasta el da de hoy el nico caso registrado de curacin (provisionalmente) definitiva mediante terapia gnica ha sido el conseguido por Marina CavazzanaCalvo y Alain Fischer en el hospital Necker de Pars[28] al tratar a cinco nios aquejados de una inmunodeficiencia combinada severa. A diferencia de otros casos anteriores, en ste fueron cultivadas clulas madre extradas de su mdula sea a las que se les insert, mediante un retrovirus, el gen funcional. Las clulas fueron reinyectadas en el torrente sanguneo de los pacientes cinco das despus. A los tres meses los nios tratados haban recuperados sus defensas y cuatro de ellos pudieron volver a vivir con sus familias sin ningn tratamiento adicional[29]. El hecho novedoso de haber realizado el tratamiento sobre clulas madre hematopoyticas y no sobre clulas ya diferenciadas ha permitido que el efecto teraputico sea permanente, ya que la renovacin celular se realiza a partir de las clulas madre corregidas mediante la terapia gnica. 5. Problemas de la terapia gnica y de sus aplicaciones Pese a este logro, los avances en los ensayos de terapia gnica realizados hasta ahora han sido limitados y los resultados bastante modestos. Adems, en los ltimos tres aos se ha generado una cierta sospecha sobre la seguridad de los ensayos realizados a raz de que en 1999 se hiciese pblica la noticia de la muerte de un paciente (Jesse Gelsinger, de 18 aos), como consecuencia del tratamiento de terapia gnica al que estaba sometido para intentar curar la deficiencia de la ornitina transcarbamilasa que padeca[30]. Segn la investigacin oficial realizada los investigadores ocultaron informacin crucial que hubiera evitado el incidente [...]. Adems los cientficos haban ocultado a la FDA que otros dos voluntarios sometidos previamente al mismo ensayo haban sufrido unos efectos secundarios tan graves que, de haber sido notificados, hubieran supuesto la inmediata suspensin del ensayo, segn las normas acordadas con anterioridad por los cientficos de la FDA[31]. Con posterioridad a este caso, y como consecuencia de la alarma desatada por el mismo, fueron hacindose pblicas otras noticias de ocultamientos de problemas y de hasta nueve fallecimientos no notificados[32]. La directora de la Oficina de Poltica Cientfica de EE.UU. comunic que en 1999 se produjeron 1.070 sucesos adversos en los ensayos, de los cuales slo se notificaron 39 a los NIH[33]. Parece ser que en la mayora de estos casos de ocultamientos hay motivos puramente econmicos. Los cientficos callan para no perder la financiacin de las empresas farmacuticas, y stas a su vez exigen silencio sobre sus productos[34]. De ser cierta esta relacin causal entre el ocultamiento de resultados adversos (incluyendo riesgos graves para las personas) e intereses empresariales estaramos en presencia de una las consecuencias ms negativas que se pueden derivar de la presin de los intereses econmicos privados sobre algunas investigaciones biosanitarias potencialmente beneficiosas para la poblacin pero que, en la prctica, se pueden convertir no solamente en

perjudiciales por sus consecuencias directas sobre los afectados, sino tambin por el descrdito que ejercen sobre el conjunto de la investigacin en gentica molecular humana. En este sentido la Sociedad Americana de Terapia Gnica ha propuesto que los cientficos no deberan tener responsabilidad en proyectos en los que tengan intereses econmicos[35]. Es por estos motivos que resulta necesario abordar los problemas de la terapia gnica con transparencia y un estricto control sobre los protocolos a ensayar, dejando a un lado el exceso de propaganda triunfalista que, de forma interesada, ha caracterizado la informacin pblica relacionada con la terapia gnica. Existe un amplio acuerdo sobre que, si se toman las precauciones exigidas a todo nuevo tratamiento teraputico en fase experimental, la terapia gnica somtica no plantea problemas ticos distintos a otros tratamientos ms convencionales[36], como pueden ser los trasplantes de rganos. Miguel Moreno resume esta valoracin ampliamente compartida: La terapia por transferencia gnica en tejidos somticos plantea cuestiones ticas muy limitadas, puesto que el xito o el fracaso en el intento afectar slo al paciente enfermo. El asunto entra dentro de las preocupaciones tpicas en torno a cualquier tipo de experimentacin con humanos, exactamente dentro del clculo de beneficios y riesgos para el individuo. Existe unanimidad en exigir una evaluacin cuidadosa del riesgo que implica el uso de vectores virales, incluyendo su capacidad para infectar las lneas celulares del progenitor y el potencial dao colateral de la insercin.[37] Los problemas denunciados hasta ahora, que han puesto en entredicho la fiabilidad de la terapia gnica, estn relacionados precisamente con la exigencia de evaluacin cuidadosa del riesgo apuntada en la cita precedente, con la transparencia en la notificacin de los resultados y con el necesario control por parte de las comisiones cientficas y ticas de evaluacin. Siguiendo parcialmente a Lacadena[38], podemos resumir las exigencias ticas actuales de la terapia gnica somtica en los siguientes puntos: 1) La terapia gnica slo debera ser aplicada para tratar pacientes con enfermedades graves; 2) Debera intentarse solamente cuando no haya otras alternativas teraputicas o cuando, habindolas, suponen un mayor riesgo o una menor accin beneficiosa; 3) Su aplicacin a una enfermedad humana debera requerir la evidencia de que es segura, beneficiosa, tcnicamente posible y ticamente aceptable; 4) Con las condiciones precedentes, la terapia gnica somtica para el tratamiento de enfermedades graves puede considerarse aceptable ticamente porque puede ser apoyada por los principios fundamentales de autonoma, beneficencia y justicia. En mi opinin es positivo que, pese a los problemas apuntados y con las salvaguardas necesarias, la investigacin sobre la terapia gnica y sus potencialidades teraputicas siga desarrollndose porque en el futuro se pueden obtener resultados beneficiosos desde el punto de vista sanitario para un cierto nmero de enfermedades, difcilmente alcanzables por otras vas. Sin embargo, an aceptando plenamente esa necesidad de desarrollo de la terapia gnica somtica, no est de ms que nos preguntemos por qu se han exagerado sus posibilidades a corto plazo y se han depositado en ella esperanzas excesivas o simplemente infundadas. Este exceso de confianza no consiste solamente en una creencia popular procedente de un desconocimiento de la verdadera problemtica

de la terapia gnica. La propia comunidad cientfica se ha encargado de cultivar esa confianza en su capacidad teraputica inminente. Ya hemos apuntado que uno de los motivos subyacentes podra ser la necesidad de financiacin de los equipos de investigacin y los intereses econmicos de las empresas que los sostienen. Pero tambin existen razones de tipo ideolgico que refuerzan esta tendencia a volcarse en la bsqueda de tratamientos genticos, en algunos casos de dudosa utilidad, menospreciando o relegando al olvido otras lneas de investigacin importantes. En este sentido, hemos comentado en otro sitio cmo el peso de la ideologa del determinismo biolgico predominante se pona de manifiesto en las aplicaciones de los tests de diagnstico gentico y en las estrategias de lucha contra el cncer, por ejemplo, en la poca importancia relativa de los fondos dedicados a estudios epidemiolgicos en comparacin con los destinados a estudios genticos[39]. Esta misma tendencia a dar una importancia predominante a las investigaciones que se orienten directamente a la accin sobre los genes se pone de manifiesto en las expectativas depositadas en la terapia gnica, como si siempre y en todo tipo de enfermedades esa accin teraputica fuese ms eficaz que cualquier otra estrategia alternativa. De esta manera el estudio de las causas no solamente genticas que propician la aparicin de muchas enfermedades, y que podran contribuir a reducir su incidencia es, en la prctica, menospreciada. No debemos olvidar que cuando nos referimos a las causas de las enfermedades, en la mayora de ellas los genes constituyen uno de los elementos causales, pero rara vez son el nico. El caso de las enfermedades multifactoriales, como el cncer, en el que interaccionan de forma compleja genes y ambiente es el ms notorio. Pero incluso en algunas enfermedades metablicas provocadas por la mutacin en un nico gen los factores que influyen para que la enfermedad se manifieste pueden ser variados. El caso de la fenilcetonuria es, sin duda, el ms conocido. Esta dolencia es producida por un gen recesivo que se expresa en los individuos homocigticos, que reciben ambos genes de sus padres portadores sanos. Los individuos fenilcetonricos son incapaces de metabolizar el aminocido fenilalanina y convertirlo en tirosina. La fenilalanina se acumula en las clulas provocando alteraciones, entre ellas retraso mental. Pero si desde el momento mismo del nacimiento hasta el final del perodo de crecimiento se les suministra una dieta casi carente en fenilalanina[40] y suplementada con tirosina, el desarrollo puede ser normal. Este caso ilustra cmo los factores internos (genes) y externos (la dieta en esta ocasin) contribuyen a determinar el desarrollo o la ausencia de la enfermedad. Existen otras dolencias genticas en las que la accin de los genes resulta mucho ms influyente o, incluso, completamente determinante. En la distrofia muscular de Duchenne o en la enfermedad de Huntington, por citar dos casos bien conocidos, la accin de los genes deletreos no puede ser contrarrestada mediante otros tratamientos y la terapia gnica, en la medida en que llegue a ser posible en el futuro, puede representar la nica esperanza de curacin de las personas que las padezcan. Sin embargo, en otros casos la terapia gnica, aunque llegase a ser posible, no tendra por qu ser siempre la mejor estrategia a emplear, sobre todo si se trata de enfermedades multifactoriales.

En primer lugar, porque la actuacin sobre los factores ambientales, adems de eficaz, puede contribuir a una accin preventiva importante, lo que reducira los casos en los que la enfermedad llegase a desarrollarse. En segundo lugar, porque una vez manifestada la enfermedad puede ser que otros tratamientos distintos de la terapia gnica sean ms recomendables, aunque la enfermedad tenga una base gentica bien establecida. Pero hoy en da, a pesar de su escaso potencial teraputico actual, es habitual que los investigadores en gentica humana se dirijan hacia la terapia gnica, incluso antes de evaluar otras vas esperanzadoras ms convencionales. Este hecho fue puesto de manifiesto en el informe encargado por Harold Varmus, director de los NIH, a un comitad hoc de catorce expertos en el que se deca que los investigadores saltan inmediatamente, en algunos casos, del descubrimiento del gen de una enfermedad a intentar una terapia gnica, sin utilizar previamente el hallazgo como base de trabajo para tratamientos ms convencionales[41]. Este estado de cosas en relacin con las ilusiones despertadas por la terapia gnica sera una manifestacin de lo que algunos autores han llamado la genetizacin de la sociedad o la mistificacin de lo gentico. Jacques Testart, uno de los ms crticos en este sentido, considera que la terapia gnica aparece tal vez como un bluff gigantesco, alimentado por el apetito econmico de los industriales, por el orgullo de los investigadores, por la infelicidad de las familias afectadas y, sobre todo, por el inmenso deseo de vencer al destino por parte de todos los humanos[42]. La valoracin precedente, pese a su dureza, contiene, a mi entender, elementos justos que inciden en la orientacin de la que es deudora la investigacin en gentica molecular humana en sus distintas reas de desarrollo, como son el proyecto genoma humano que analizamos en el captulo anterior y la terapia gnica que comentamos en ste. A pesar de esto, como ya he apuntado, la terapia gnica somtica contiene potencialidades teraputicas para combatir muchas causas de padecimiento humano en forma de enfermedades de momento incurables, que sera absurdo negar. Por ello, la investigacin en este campo y su aplicacin prudente en ensayos clnicos bien controlados debe ser aceptada. No ocurre lo mismo con la terapia gnica germinal. Aunque no es posible en la extensin de este captulo que desarrollemos una discusin sobre la misma, conviene que hagamos notar que presenta muchos ms problemas que la terapia somtica y casi ninguna de sus ventajas potenciales. Para las personas interesadas remito a mi ensayo O pensamento euxensico na actualidade[43], en el que realizo un anlisis crtico de la terapia gnica germinal y de la llamada ingeniera gentica de mejoramiento. Me limitar pues a resumir muy brevemente mi punto de vista sobre esta modalidad de terapia gnica. Muchas de las crticas dirigidas a la terapia gnica germinal se centran en que produce la modificacin permanente del patrimonio gentico hereditario del linaje de las personas sometidas a la misma. Aunque esto es cierto no me parece una razn suficiente para rechazar la intervencin germinal desde un punto de vista moral, siempre y cuando tenga una clara finalidad teraputica. Desde mi punto de vista, la terapia germinal es rechazable porque los objetivos teraputicos que pretende cubrir pueden ser logrados por otros medios, sin los peligros que

acompaaran al uso de esta tcnica. Entre estos otros medios podra incluirse la terapia gnica somtica que ya hemos comentado. Frente a esta ltima, los defensores de la terapia germinal suelen argumentar que los efectos teraputicos de la terapia somtica no pueden ser transmitidos a los descendientes de la persona tratada, objetivo que s podra lograrse con la terapia germinal, si sta funcionase correctamente. Pero, incluso en este ltimo supuesto, la seleccin de embriones obtenidos mediante fecundacin in vitro, previo diagnstico preimplantatorio de los mismos, cubre prcticamente todos los supuestos (salvo algunas excepciones muy raras) en los que sera de aplicacin la terapia germinal, sin las dificultades tcnicas y los riesgos iatrognicos asociados al uso de la misma. Tngase en cuenta que la aplicacin de la terapia germinal tambin hara necesario el diagnstico preimplantatorio de los embriones (o en su caso de los vulos), para detectar aqullos portadores del gen deletreo que debe ser corregido mediante la terapia. Siempre ser ms sencillo seleccionar los embriones sanos que intentar modificar los genes de los embriones portadores de la enfermedad. No existen, pues, justificaciones teraputicas para optar por la terapia germinal, aceptando los peligros asociados a la misma, ya que no aporta ninguna ventaja suplementaria a las posibilidades de las tcnicas que ya existen. Si el objetivo fuese realizar ingeniera gentica de mejoramiento, introduciendo alguna caracterstica gentica nueva antes no presente, como la resistencia gentica a algn agente infeccioso (como el VIH), la intervencin germinal s sera la nica forma de lograrlo. Pero en este caso ya no estamos en presencia de una intervencin teraputica y, aunque no forma parte de los objetivos de esta discusin, los problemas ticos y sociales asociados a este tipo de intervencin, que podramos etiquetar como propiamente eugensica, en mi opinin hacen rechazable el recurso a la misma[44]. 6. Conclusin La terapia gnica somtica comenz a principios de los aos 90 del siglo que acaba de terminar con unas enormes expectativas, que en el trascurso de los aos siguientes se vieron parcialmente defraudadas debido a las dificultades y problemas que impidieron el logro de avances significativos. Parte de estas expectativas fueron potenciadas por los intereses de los propios grupos de investigacin, necesitados de encontrar fuentes de financiacin para sus ensayos. Esas mismas necesidades llevaron en algunas ocasiones a realizar protocolos de investigacin con pocas garantas, en los que se ocultaron a los organismos responsables de su control algunos de los resultados adversos que se produjeron. Esta situacin lleg a provocar una crisis de confianza en los ensayos de terapia gnica cuando se dio a conocer que se haba ocultado la muerte de una persona como consecuencia del tratamiento al que haba sido sometida. Pese a estos problemas las tcnicas de terapia gnica somtica se han ido desarrollando y siguen siendo una va muy prometedora, aunque no tan inminente como en un principio se pensaba, para la lucha contra un buen nmero de enfermedades genticas. Existe un amplio acuerdo sobre la idea de que la terapia gnica somtica no plantea problemas ticos distintos de los de cualquier otro tratamiento teraputico nuevo en fase experimental. Pero se considera muy necesario, sobre todo a la luz de las experiencias negativas ocurridas, que los protocolos que se pongan en

prctica se desarrollen con mucha prudencia y con un control estricto por parte de las comisiones cientficas y ticas destinadas a tal fin. Asimismo, es necesario que los intereses econmicos de las empresas privadas con inversiones en este campo no interfieran negativamente en lo que debe ser una buena y segura prctica de experimentacin clnica. Por lo que se refiere a la terapia germinal, resulta rechazable porque sus supuestas ventajas no compensan los peligros asociados a la misma, toda vez que existen alternativas teraputicas con el mismo potencial y que no comportan los mismos riesgos. nicamente en la perspectiva de una ingeniera gentica de mejoramiento humano, que nosotros rechazamos, tendra sentido la modificacin gentica de las clulas germinales. [1]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, Arbor, CLXVIII, 662 (Febrero de 2001), p. 255. [2]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, 1999, http://www.cnice.es/tematicas/genetica/1999_04_01.html, p. 1. [3]. Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas y clonacin, Septiembre de 1997. (en este sitio web) [4]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, Ediciones Omega, S. A., Barcelona, 1999, p. 591. [5]. El Pas, 28 de Abril de 2000, p. 38. [6]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 617. [7]. Carlos Alonso BEDATE, Terapia gentica, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Gentica Humana. Fundamentos para el estudio de los efectos sociales de las investigaciones sobre el genoma humano, Ctedra de Derecho y Genoma Humano, Fundacin BBV-Diputacin Foral de Bizkaia, Universidad de Deusto, Bilbao, 1995, pp. 260-261. [8]. Para una revisin sobre la regulacin jurdica de la terapia gnica, tanto somtica como germinal, en Europa vase Herman NYS, Terapia gnica humana, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Biotecnologa y Derecho. Perspectivas en Derecho Comparado, Ctedra de Derecho y Genoma HumanoEditorial Comares, S. L., Granada, 1998, pp. 89-98; la legislacin espaola es revisada por Amelia MARTN URANGA, El marco legal de la terapia gnica en Espaa, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Biotecnologa y Derecho. Perspectivas en Derecho Comparado, op. cit., pp. 112-113. [9]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 599. [10]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 2. [11]. David SUZUKI y Peter KNUDTSON, Gentica. Conflictos entre la ingeniera gentica y los valores humanos, Editorial Tecnos, S. A., Madrid, 1991, pp. 163-164. [12]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 597. [13]. Ibid., pp. 577-578. [14]. Ibid., p. 596.

[15]. Lydia FEITO GRANDE, El sueo de lo posible. Biotica y terapia gnica, Universidad Pontificia Comillas, Madrid, 1999, pp. 105-111. [16]. Philip L. FELGNER, Terapia gnica sin virus, Investigacin y Ciencia, n 251, Agosto de 1997, pp. 52-57. [17]. Theodore FRIEDMANN, Problemas de la terapia gnica, Investigacin y Ciencia, n 251, Agosto de 1997, pp. 44-50. [18]. Ibid., p. 49. [19]. Bertrand JORDAN, Los impostores de la gentica, Ediciones Pennsula, S. A., Barcelona, 2001, p. 94. [20]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 1. [21]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 617. [22]. Ibid., p. 619. [23]. Carlos Alonso BEDATE, Terapia gentica, op. cit., p. 260. [24]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, op. cit., pp. 266-267. [25]. Ibid., p. 269. [26]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 621; Robert MANARANCHE, Terapia gnica, en Jean-Franois MATTEI (Coord.), El Genoma Humano, Editorial Complutense, S. A., Madrid, p. 96. [27]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, op. cit., p. 270. [28]. M. CAVAZZANA-CALVO et al., Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)X1 disease, Science, 2000, 288: 669-672. [29]. Robert MANARANCHE, Terapia gnica, op. cit., pp. 105-108. [30]. El Pas, 9 de Diciembre de 1999. [31]. Ibid. [32]. El Pas, 19 de Febrero de 2000. [33]. El Pas, 4 de Marzo de 2000. [34]. El Pas, 12 de febrero de 2000. [35]. Alain FISCHER, Lmites y esperanzas de la terapia gnica, Eidon, Febrero / Mayo 2001, n 6, p. 19. [36]. Lydia FEITO GRANDE, El sueo de lo posible. Biotica y terapia gnica, op. cit., p. 344; Edward M. BERGER y Bernard GERT, tica de la terapia gnica, Perspectivas bioticas 1999, vol. 4 (7-8), pp. 30. [37]. Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas y clonacin, op. cit., p. 11. [38]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 1. [39]. Vase la cita 35 del captulo anterior. [40]. La fenilalanina es uno de los aminocidos esenciales y, por lo tanto, debe estar presente en la dieta, incluida la de las personas fenilcetonricas. La dieta adecuada para ellas no carece por completo de este aminocido sino que debe encontrarse en las cantidades mnimas, imprescindibles para la formacin de las protenas, pero suficientemente bajas para evitar su acumulacin perjudicial. [41]. Citado por Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas y clonacin, op. cit., p. 15.

[42]. Jacques TESTART, Homens provveis. Da procriaao aleatria reproduao normativa, Instituto Piaget, Lisboa, 2000, p. 41. [43]. Daniel SOUTULLO, Sobre clons e xenes. Ensaios sobre as implicacins sociais da Bioloxa, Edicins Laiovento, Santiago de Compostela, 2001, pp. 179202. [44]. Ibid., pp. 196-202. Juan Jos Oliva Se acaba de graduar como licenciado en Biologa por la Universidad de Granada NDICE 1. Introduccin 1.1 Concepto de terapia gnica 1.2 Objetivos globales de la terapia gnica 2. Desarrollo de la terapia gnica 2.1 Genes ajenos integrados en el cromosoma del animal receptor 2.2 Los transgenes pueden ser regulados por los pratones de tejido especfico 2.3 La expresin transgnica puede ser dirigida a tejidos especficos 2.4 Transgenes utilizados para matar tipos celulares especficos 2.5 Los retrovirus pueden ser utilizados para esbozar linajes celulares 3. Definicin de vector 4. Vectores virales 4.1 Retrovirus 4.2 Adenovirus 4.3 Virus adenoasociados 4.4 Herpesvirus 5. Vectores no virales 5.1 Bombardeo de partculas 5.2 Inyeccin directa de ADN 5.3 Liposomas catinicos 5.4 Transferencia de genes mediante receptores 6. Diseo de vectores 6.1 Retrovirus 6.2 Adenovirus 6.3 Virus adenoasociados 6.4 Herpesvirus 7. Produccin de vectores 7.1 Retrovirus 7.2 Adenovirus 7.3 Virus adenoasociados 8. Eficacia del vector 8.1 Estudios in vitro 8.2 Estudios en animales

1. INTRODUCCION 1.1 CONCEPTO DE TERAPIA GENICA.

El concepto de terapia gnica podemos abordarlo desde diferentes deficiones como son: " Es la introduccin de material exgeno (natural o recombinante) en sujetos humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotpico." Es una estrategia terapetica basada en la modificacin del repertorio gentico de clulas somticas mediante la administracin de cidos nucleicos y destinada a curar tanto enfermedades de origen hereditario como adquirido. " " Es la transferencia de material gentico nuevo a clulas de un individuo dando lugar a un beneficio terapetico para el mismo. " Aunque estas deficiones rozan lo meramente descriptivo, la terapia gnica engloba un amplio rango de posibilidades que no pueden ser incluidas en una descripcin tan general. Actualmente el trmino terapia gnica se ha visto "aumentado" con el tiempo hasta incluir transferencias gnicas de naturaleza preventiva y aquellas que contribuyen al avance de la investigacin mdica. Lo cual roza mucho con confusiones al respecto del trmino que inicialmente se le dio . Cabra preguntarnos si la terapia gnica dista mucho ms de la expresin de " intervenciones estrictamente terapeticas en el ser humano ", ya que la controversia del trmino nos lleva a pensar cosas totalmente distintas. En el transcurso de este trabajo iremos perfilando ideas sobre la problemtica que rodea a dicho concepto. As se lleva a pensar desde diversos colectivos de expertos en biotica, medicos , etc , que el trmino de terapia gnica debera sufrir nuevas modificaciones: Desde un punto de vista biolgico, deberiamos hablar de transferencia gnica ,puede ser tanto en lnea germinal como en lnea somtica. Atendiendo a sus objetivos, tendriamos que hablar de transferencia gnica: Con finalidad mdica tanto en prevencin, investigacin , diagnstico clnico y terapia. Con finalidad no mdica para su uso en ingeniera gentica orientada a la mejora de caractersticas o a la eugenesia. En cuanto a todas las ideas y puntos de vista que rpidamente surgen al conocer estas nuevas definiciones, las trataremos ms profundamente en diversos apartados. 1.2 OBJETIVOS GLOBALES DE LA TERAPIA GENICA. La terapia gnica se presenta como una promesa terapetica de utilidad en todo tipo de patologas, la cual probablemente revolucionar nuestra concepcin de la medicina. El surgimiento de la terapia gnica ha sido posible gracias a la confluencia de los avances del conocimiento en campos tales como: Biologa Molecular, Gentica , Virologa, Bioqumica, y Biofsica entre otras. El estudio conjunto de todas estas ciencias pretende dar respuesta a las siguientes preguntas: Cul es la naturaleza del producto gnico? Es un cido nucleico? Es una protena? Si es as, Es secretada , donde se localiza, cunta cantidad se requiere, y durante cunto tiempo? Cul es el tejido diana? Es un tipo particular de clula? Es una clula fcilmente accesible? El estado de la enfermedad la deja ms o menos accesible? Est la clula en divisin o no ?

Es posible el tratamiento in vivo o ex vivo? Esto es, Pueden las clulas ser separadas y tratadas ex vivo, como en todos los primeros protocolos o pueden , o deben, ser tratadas in situ? Si las clulas son tratadas ex vivo, Sern readministradas como un neorgano separado o sern colocadas en su localizacin normal? Si es un neorgano, Comprender clulas de la misma o de distinta especie? Es requerida la expresin del gen de forma temporal o permanente? Ser la clula devuelta tratada? Eliminar la clula tratada una aplicacin acertada? Es necesario el tratamiento de todas las clulas en un rgano o tejido? Habr un efecto permanente? Tendrn las clulas tratadas una ventaja selectiva ? Desde estas simples consideraciones, se sigue que los requerimientos para cualquier aplicacin varian en gran manera e influirn profundamente en la eleccin de un vector para ser desarrollado y testado. Los factores que requerirn ser testados incluyen la eficacia de la transferencia del gen , la duracin de la expresin del gen, la capacidad para repartir la dosificacin, y la capacidad para dirigirse a las clulas apropiadas y evitar las inapropiadas. Los factores desconcertantes que puedan aparecer, incluyen la incapacidad del vector para entrar o integrarse en los cromosomas celulares, el cierre de los promotores transcripcionales, la prdida del ADN introducido, la destruccin de las clulas tratadas y la neutralizacin del vector insertado o del producto gnico. Todos estos factores dependern fuertemente de la eleccin del vector y de la capacidad del hospedador para responder a dicho vector. 2. DESARROLLO DE LA TERAPIA GENICA. Determinados descubrimientos en el campo de la Biologa Molecular han hecho posible el desarrollo de la terapia gnica. Los primeros experimentos surgieron en la introduccin de genes en levadura y clulas de mamfero en cultivo tisular. El reto estaba en qu habra que hacer si quisieramos estudiar el control gentico del desarrollo de un organismo superior, donde las interacciones celulares juegan un papel crucial. 2.1 GENES AJENOS INTEGRADOS EN EL CROMOSOMA DEL ANIMAL RECEPTOR. Los primeros animales superiores en que se utilizaron estas tcnicas fueron ratones. Estos experimentos se basaban en las tcnicas del ADN recombinante. El ADN ajeno o extrao era inyectado en embriones tempranos y era incorporado a los cromosomas de algunas clulas embrionarias y mantenidos en ellos , con su consiguiente proliferacin y diferenciacin en clulas tisulares adultas . Tambin se hicieron experimentos en los que el ADN ajeno poda integrarse en la lnea germinal. Una vez que la clonacin de genes fue posible se poda microinyectar en embriones tempranos de ratn el ADN deseado. La mejor tcnica era aquella en la que se microinyectaban genes clonados en un vulo fertilizado con dos proncleos, uno masculino y otro femenino que sern los que darn lugar al ncleo del embrin unicelular. Cientos de copias del ADN extrao disueltos eran inyectados directamente en uno de los dos proncleos y despus el embrin inyectado sera transferido al tero de la madre adoptiva, y se espera que finalice el desarrollo embrionario. El porcentaje de zigotos que sobrevivieron a la manipulacin y el desarrollo variaban entre el 10-30% . De los supervivientes el nmero de individuos que

presentaban ADN extrao en sus cromosomas era del 2-40% . El ADN extrao apareca integrado al azar sin preferencia por un lugar concreto en los cromosomas . A estos ratones se les llam ratones transgnicos, y al ADN inoculado se le llam transgn . Se supo que el ADN inyectado poda ser estable tanto en clulas somticas como germinales. En ratones derivados de embriones inyectados con ADN de interfern humano clonado o con ADN de la beta-globina del conejo, se vio que transmitan estos transgenes a su descendencia como un rasgo mendeliano, junto a sus dems genes. Todos los ratones derivados de un nico progenitor forma una lnea de ratones en la que cada miembro posea los mismos transgenes y en la misma posicin del genoma. Lo que posteriormente se intent conocer o determinar es que si esos transgenes adquiridos se expresaban, y en ese caso, si su expresin est apropiadamente regulada . Estos experimentos se llevaron a cabo ms adelante con clulas totipotenciales ( en clulas embrionarias del blastocito del ratn ), las cuales se podan cultivar en un cultivo tisular pero manteniendo intacta su capacidad de diferenciacin. A estas clulas se les introduca el ADN deseado por transfeccin plasmdica o por infeccin retroviral. Estas clulas transgnicas se inoculaban en el tejido diana, en el cual por sus condiciones caractersticas podan diferenciarse a clulas del tipo de tejido en el que se encontraba pero transportando en su interior los neogenes. Como las clulas totipotenciales pueden ser manipuladas in vitro antes de inyectarlas en el embrin, los genetistas de ratones podan utilizar la recombinacin homloga para producir ratones transgnicos con mutaciones en genes especficos o reemplazar genes mutados por su equivalente normal. 2.2 LOS TRANSGENES PUEDEN SER REGULADOS POR PATRONES DE TEJIDO ESPECFICO Aunque un transgn integrado en una localizacin cromosmica distinta a la de su duplicado endgeno, normalmente se expresa,de manera que mimetiza la expresin del gen endgeno. 2.3 LA EXPRESION TRANSGENICA PUEDE SER DIRIGIDA A TEJIDOS ESPECIFICOS El ARN codificado para la insulina humana puede ser diferenciado fcilmente del ARN trranscrito por los genes de la insulina del ratn. Cuando ratones transgnicos del gen de la insulina humana eran analizados, el ARN de la insulina humana slo se encontraba en el pncreas y no en otros tejidos. Esto significa que la transcripcin de los transgenes de la insulina humana era inducida por las mismas seales que inducan a los genes endgenos de la insulina del ratn, es decir, que responde a lasmismas seales reguladoras que los genes endgenos. Los transgenes pueden interrumpir la funcin de los genes endgenos, pero en muy raras ocasiones. Los transgenes interrumpen esas funciones de genes endgenos cuyo producto es requerido para una embriognesis normal. Las anormalidades resultantes nos pueden dar pistas sobre el proceso del desarrollo a partir de los genes cuya funcin se ha interrumpido. Una lneas de ratones transgnicos (S) fue creada usando una molcula de ARN recombinante

comprimida de un virus del tumor de mamas del ratn (MMTV) , LTR y con el gen c-myc de ratn. Cuando el ratn heterozigtico se reproduca algunos de sus descendientes tenan anormalidades en los miembros anteriores y posteriores. Esto demostr que hubo cosegregacin de la zona MMTV-myc y confirm que la integracin del transgn da al gen endgeno. El fenotipo de los ratones homozigticos se asemejaba a una conocida mutacin de un locus llamado ld para la deformacin de los miembros, luego encontraron alelos para el locus ld a los que se les llam ld"Hd" (Harvard). La localizacin cromosmica de la insercin de ld"Hd" fue determinada y comparada con la ld. El ADN integrado con MMTV-myc era usado como etiqueta para clonar ADN de la regin de insercin de la regin ld"Hd". Luego, se vio que descendientes ld/ld"Hd" tenan deformidades idnticas a los de ld"Hd"/ld"Hd", lo que demostraba que los dos loci eran allicos. De este modo, la insercin transgnica puede ser utilizada no solo para la identificacin sino para clonar genes importantes para el desarrollo. 2.4 TRANSGENES UTILIZADOS PARA MATAR TIPOS CELULARES ESPECIFICOS La introduccin de genes en tipos celulares especficos es una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo del ratn. En otro tipo de experimentos, el opern para un gen expresado en una clula diferenciada especfica es usado para restringir la expresin de un gen de una toxina exclusiva a esa clula. Solo el tipo celular especfico es matado, y los efectos de la ausencia de estas clulas en el desarrollo del ratn pueden ser analizados. Por ejemplo, el gen para la elastasa 1 se expresa slo en el pncreas exocrino, y sus secuencias reguladoras son usadas directamente en la expresin de la cadena de la toxina diftrica A, en esas clulas. Veinticinco ratones transgnicos eran obtenidos, y siete de ellos carecan de un pncreas normal. Por microscpio se descubri que algunos ratones posean un pncreas rudimentario en el que la parte exocrina era altamente anormal. Experimentos similares de ablacin celular se han hecho usando otras secuencias promotoras. Las del gen del cristalino ( lente proteca ) han sido utilizadas en la expresin directa de la cadena de la toxina diftrica en clulas de la lente del ojo en desarrollo. Una dificultad en esta aproximacin, es que el gen de la toxina es activado tan pronto como la clula activa al gen endgeno. Si esto ocurre tempranamente en el desarrollo, la ablacin de algunas lneas celulares poda ser letal para el desarrollo. En cambio, un sistema inducible para una muerte selecitva de clulas se ha descubierto al unir el gen de la timidina quinasa del herpesvirus1 (tk), a secuencias promotoras de iniciacin de clulas especficas. Las clulas que contengan ese transgn no se mueren hasta que se les aaden los nuclesidos sintticos. Los nuclesidos no son txicos, pero la tk del herpesvirus metaboliza esos nuclesidos en productos que matan a clulas en divisin. La siguiente tcnica ha sido utilizada para determinar la relacin de linaje en la pituitaria anterior. Se cree que las clulas que sintetizan prolactina derivan de una clula precursora que sintetiza hormona del crecimiento (HC). Las clulas

productoras de HC y las de prolactina de la pituitaria anterior eran utilizadas como clulas diana en ratones transgnicos usando tk con ambas sustancias. Seguido a la inyeccin de los nuclesidos sintticos, animales con promotores HC unidos a transgenes tk, crecan formas enanas y carecan de clulas sintetizadoras de HC y de las que sintetizan prolactina, pero a los que tenan transgenes prolactina-tk eran normales. La primera conclusin de este estudio es que las clulas formadoras de prolactina no se dividan, ya que si lo hiciesen moriran por los nuclesidos metabolizados. La segunda es que las clulas formadoras de HC deban ser las precursoras de ambos tipos de clulas, ya que el ratn donde se mataron las clulas formadoras de HC, perdi sus clulas formadoras de prolactina. 2.5 LOS RETROVIRUS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA ESBOZAR LINAJES CELULARES Los estudios de linajes celulares han sido realizados por introduccin de marcadores gnicos en ratones recin nacidos. Los retrovirus son vectores eficientes en transportar genes a las clulas. Los virus Moloney Murine-Leukemia recombinantes han sido fabricados sustituyendo sus genes gag, pol y env por el gen lacZ de E. coli. Clulas que contengan este virus recombinante integrado en su ADN pueden ser identificadas por microscopio por tincin. El objetivo de estos experimentos es liberar al marcador vrico a una zona particular en un embrin o animal joven, infectando as un nmero limitado de clulas. De cada clula infectada se obtiene un clon de clulas que contenga el marcador vrico integrado. Las distribuciones y tipos de clulas teidas del clonado proporciona informacin del linaje celular que tienen con las clulas de las cual se ha obtenido. Esto se ha hecho particularmente en estudios del desarrollo de la retina. El marcador vrico se inyecta entre la retina y el epitelio pigmentado en el da del nacimiento o en los siete das desps del nacimiento. Seis semanas despus se hacan secciones tisulares que se tean con X-gal (azul) , y se vio que una pequea cantidad de virus formaba agrupaciones de clulas teidas de azul, y que eran las que procedan de una sola clula infectada. Podemos sealar que algunos clones tenan ms de un tipo celular, demostrando as que un nico precursor puede dar distintos tipos celulares. Hay algunos problemas con esta tcnica. Por ejemplo, algunas clulas que llevan marcadores vricos puede que no expresen la beta-galactosidasa y el virus no puede ser encauzado a una clula en particular. Hay mtodos alternativos, que incluyen inyeccin directa de marcadores con dextranos fluorescentes, lo que se ha hecho con Xenopus, y que es difcil hacerlo en embriones de mamferos. Todos estos experimentos en ratones estn encauzados para la futura aplicacin de la terapia gnica en humanos. Por todo ello son una base indispensable para el desarrollo de futuras iniciativas en terapia gnica y para contraste de resultados y pruebas de inminentes proyectos. 3. DEFINICION DE VECTOR Los vectores son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exgeno a la clula, facilitando la entrada y biodisponibilidad intracelular del mismo, de tal modo que este pueda funcionar correctamente. Se han utilizado una

gran variedad de vectores con fines experimentales, pero todos ellos pueden ser clasificados en: vectores virales y vectores no virales. 4. VECTORES VIRALES En este anlisis, consideramos los sistemas de vectores basados en cuatro grupos de virus diferentes: retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus. De manera clara, los virus pueden ser utilizados como vectores en la terapia gnica, al menos bajo circunstancias ideales. La pregunta que debe ser contestada es, qu barreras hacen posibles en el presente que limiten la asplicacin de estos vectores vricos? 4.1 RETROVIRUS Los retrovirus comprenden una gran clase de virus desarrollados que contienen ARN de cadena sencilla como genoma viral. Durante el ciclo de vida vrico normal, el ARN vrico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena doble (gracias a la accin del enzima reversotranscriptasa) que se integra en el genoma de la clula hospedadora y se expresa en perodos prolongados. Como resultado, las clulas infectadas vierten virus de forma constante sin dao aparente en la clula hospedadora. El genoma viral es pequeo (aproximadamente 10 kilobases) , y su organizacin prototpica es muy sencilla, comprendiendo tres genes que codifican: gag, el grupo especfico de antgenos, protena de la cpsida y de la matriz sin actividad enzimtica. pol , la transcriptasa inversa, proteasa e integrasa. env , protenas de la envuelta del virus (transmenbrana y superficial). Los extremos del genoma cuando ya es ADN son llamados LTRs, ( long terminal repeats) e incluye actividades promotoras incrementadoras y secuencias involucradas en la integracin. El genoma tambin incluye una secuencia necesaria para el empaquetamiento del ARN vrico, otras secuencias para el corte y empalme entre donador y aceptor y para la generacin de ARNs mensajeros envueltos de forma separada. De forma importante, la mayora de los retrovirus se pueden integrar slo en clulas que se replican, aunque el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) parece ser una excepcin. Esta propiedad, poseida por la mayora de los retrovirus, restringe claramente su uso como vector para la terapia gnica. Los retrovirus han sido estudiados de forma intensa en los ltimos veinte aos, en parte porque una categora de retrovirus causa tumores en animales. Esta capacidad de causar tumores y trasnsformar las propiedades de desarrollo de las clulas en un cultivo, se entiende bien ahora, y est basada al menos en dos mecanismos bsicos: El primero es que ciertos virus han incorporado protooncogenes activados que por una mutacin han adquirido la capacidad de transformar el desarrollo celular. La habilidad del retrovirus para transformar clulas por este mecanismo no es asunto de importancia en la terapia gnica, porque los oncogenes son siempre suprimidos de los vector. El segundo mecanismo de transformacin por retrovirus, resulta de una mutagnesis insercional sobre la integracin de un genoma vrico. Debido a que el LTR vrico tiene actividad promotora e incrementadora y est presente en ambos finales del genoma, la insercin de una secuencia de LTR adyacente a

un protooncogn celular puede llevar a una expresin inapropiada de una protena involucrada en la regulacin celular. Este mecanismo fue estudiado extensamente en la activacin del gen c-my por el virus de la leucosis aviar (ALV). Si los vectores retrovricos para la terapia gnica se integran en el genoma humano de forma aleatoria , la mutagnesis insercional ocurrir con cierta frecuencia. Esto podra llevar a la activacin del protooncogn o a la ruptura de un gen supresor de tumores. En la prctica, de cualquier forma, los hechos adversos atribuidos a la mutagnesis insercional son extremadamente bajos, quizs reflejando la observacin de que la mayora del genoma humano no est codificado y esa transformacin oncognica lleva consigo normalmente muchos hechos mutagnicos. Esencialmente. los vectores de retrovirus son relativamente simples, conteniendo en los extremos 5' y 3' secuencias LTR, una secuencia de empaquetamiento y una unidad de transcripcin compuesta por el gen o genes de inters. Para desarrollar este vector, se deben suministrar las funciones perdidas del virus en "trans" usando la as llamada lnea de clulas envase. Esta clula est creada para contener copias integradas de los genes gag-pol-env, pero no la seal de empaquetamiento, as las secuencias del virus ayudante no llegan a ser empaquetadas. Rasgos adicionales aadidos o quitados del vector o la lnea de clula envase reflejan intentos de hacer los vectores ms eficaces o reducir la posibilidad de contaminacin del virus ayudante. La principal ventaja de los vectores de retrovirus es que se integran y son capaces, potencialmente, de una expresin a largo plazo. Pueden ser desarrollados en cantidades relativamente grandes, pero hay que tener precaucin para asegurar la ausencia del virus ayudante. El rango de hospedadores del vector puede ser manipulado, pero su aplicacin a clulas que se replican es limitada. Todava quedan dudas acerca de la posibilidad de la mutagnesis insercional. 4.2 ADENOVIRUS Los adenovirus comprenden una gran clase de virus no desarrollados que contienen ADN lineal de cadena doble. El ciclo de vida normal del virus requiere la divisin de clulas y lleva consigo una infeccin productiva en clulas tolerantes durante la cual grandes cantidades de virus se acumulan en el ncleo. El ciclo de infeccin productiva lleva cerca de 32 a 36 horas en el cultivo celular y comprende dos fases, la primera, la ms importante para la sntesis del ADN, la segunda, durante la cual las protenas estructurales y el ADN vrico son sintetizados y ensamblados en viriones. En general, las infecciones de adenovirus estn asociadas con enfermedades benignas en humanos. El genoma del adenovirus es ms grande ( sobre 35 kilobases ), y su organizacin es ms compleja que la de retrovirus. De las cuatro primeras unidades transcripcionales, cada una tiene un promotor separado , y codifica ARN mensajero empalmados de varias formas. La ltima unidad transcrita codifica protenas requeridas para la formacin del virus. La transcripcin es secuencial en la que los genes E1 se expresan pronto, y en parte activan la transcripcin de otros genes tempranos . La funcin de las protenas tempranas tiene varias categoras: por ejemplo, la protena E1 rescata clulas de la quiescencia,

dejndolas capaces de sintetizar ADN vrico rpido y protenas, usando predominantemente las funciones del cdigo del hospedador. Los genes E3 codifican funciones para detener los mecanismos de defensa de la clula hospedadora, por ejemplo, para anular los efectos del factor del tumor necrtico (TNF) en clulas infectadas y bloquear el transporte de protenas nacientes de clase I del MHC, as reducir la presentacin de nuevos pptidos vricos sintetizados por el sistema inmune del hospedador. Los genes E2 codifican protenas involucradas en gran manera en la replicacin del ADN.La regin E4 es compleja en su transcripcin y codifica funciones que regulan la transcripcin entre las fases primaria y secundaria del ciclo de vida vrico. Los adenovirus han sido estudiados tambin de forma intensa en un pasado reciente. Las razones son dobles: la primera es que el genoma vrico comprende varias unidades de transcripcin que interactan, y son los suficientemente complejos para ser interesantes, tambin lo suficientemente simples para permitir un anlisis molecular detallado. Como resultado, muchos conceptos importantes en la Biologa Molecular eucaritica se establecieron primero en los estudios de adenovirus, como el corte y empalme de ARNs mensajeros. la segunda razn es que los adenovirus tambin pueden transformar las propiedades de desarrollo de clulas cultivadas y formar tumores cuando son inyectados en roedores recin nacidos. Este proceso resulta de la infeccin de adenovirus en clulas no permisivas. Bajo estas circunstancias, algunas expresiones tempranas de un gen y la sntesis de ADN ocurren, pero muy poco, despus resulta la expresin de la protena y la no produccin de virus. En cambio en una pequea proporcin de las clulas infectadas de forma frustrada, el ADN vrico se integra y resulta la expresin de los genes tempranos. La expresin constitutiva de las protenas E1a y E1b, como en una infeccin productiva, anula la actividad supresora del tumor de las protenas Rb y p53, en este caso de forma fortuita lleva una transformacin del crecimiento celular. Tambin estn involucrados factores adicionales. Por ejemplo, algunos serotipos de adenovirus, como el Ad12, son ms oncognicos que otros, como el Ad2 y el Ad5. Esta capacidad del adenovirus de transformar clulas en cultivo no se contempla como un gran problema en las aplicaciones de la terapia gnica, porque a pesar de investigaciones extensas los adenovirus no han estado nunca asociados la aparicin de tumores de forma natural, ya sea en humanos o en animales y porque los genes que transforman el E1 estn exentos de la mayora de los vectores defectuosos de adenovirus. Los vectores de adenovirus son algo ms grandes y complejos que los retrovirus o vectores de virus adenoasociados (AAV), en parte porque solamente una pequea fraccin del genoma vrico es eliminado de los vectores ms corrientes. Si otros genes fueran eliminados, necesitaran ser provistos en "trans" para producir el vector, lo cual se ha comprobado que es difcil. En vez de eso, dos tipos generales de vectores basados en adenovirus han sido estudiados, la supresin en los vectores de E3 y E1. Algunos virus de tipo salvaje que estn en los almacenes de los laboratorios carecen de la regin E3 y pueden creceran ausencia de un virus ayudante. Esta capacidad no significa que la produccin del gen E3 no sea necesario en el salvaje solo que la copia en clulas cultivadas no la requieren. La

supresin de la regin E3 permite la insercin de secuencias de ADN exgeno para producir vectores capaces de una infeccin productiva y la sntesis transitoria de cantidades relativamente grandes de protenas. La supresin de la regin E1 discapacita al adenovirus, pero estos vectores pueden ser todava desarrollados porque all existe una lnea celular humana establecida ( llamada 293 ) que contiene la regin E1 de Ad5 y que expresa de forma consecutiva las protenas de E1. Aplicaciones ms recientes de la terapia gnica que involucran a adenovirus han utilizado la reposicin de vectores E1 desarrollados en clulas 293. Las principales ventajas de los vectores de adenovirus se resumen en que son capaces de transferir el gen episomal de forma eficiente en una amplia cantidad de clulas y tejidos y que son fciles de producir en grandes cantidades. La principal desventaja es que la respuesta del hospedador al virus parece limitar la duracin de la expresin y la capacidad de repetir la dosis, al menos con altas dosis de vectores de primera generacin. 4.3 VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV) El AAV es un virus muy pequeo, muy simple, no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfeccin con adenovirus u otros para replicarse. El AAV est extendido en la poblacin humana, como evidencian los anticuerpos al virus, pero no est asociado con ninguna enfermedad conocida. La organizacin del genoma es extremadamente simple, comprendiendo slo dos genes: rep, que codifica una familia de protenas superpuestas involucradas en la replicacin e integracin. cap, que codifica una familia de tres protenas estructurales vricas. Los extremos del genoma comprenden repeticiones terminales (TR) de cerca de 145 nucletidos. Los AAV de tipo salvaje pueden integrar su ADN en el cromosoma del hospedador en ausencia del virus ayudante. Esta integracin puede ocurrir con ms frecuencia en regiones del cromosoma 19 y est involucrada la protena rep. Los vectores de base AAV son extremadamente simples. Contienen slo las secuencias vricas TR que bordean la unidad de transcripcin de inters. El nico problema parece ser que la longitud del vector ADN no puede exceder mucho de la longitud del genoma viral con 4680 nucletidos. Generalmente, el desarrollo de vectores AAV es voluminoso y lleva consigo la introduccin en la clula hospedadora, no solo del propio vector, sino tambin de un plsmido que codifica rep y cap para proveer de las funciones de virus ayudante. La ventaja potencial del vector AAV es que parece capaz de una expresin a largo plazo en clulas que no se dividen, posiblemente aunque no necesariamente porque el ADN vrico lo integra. Los vectores son estructuralmente simples, y pueden de todas formas provocar menos respuesta de la clula hospedadora que del adenovirus. Su principal limitacin en el presente es que los vectores son difciles de desarrollar en grandes cantidades. 4.4 HERPESVIRUS El virus presenta un material gentico compuesto por ADN bicatenario lineal de 100 a 250 Kb. En el virus del herpes simplex ronda las 50 Kb. mientras que en citomegalovirus las 220 Kb.

En la mayora de los casos el virus presenta dos trozos de ADN bicatenario lineal unidos dando una estructura nica llamadas molcula L y molcula S. Poseen en sus extremos secuencias repetidas terminales ( TRL y TRS ) que son los sitios mediante los cuales permite unirse a las dos molculas. As, al unirse pueden hacerlo en diferentes orientaciones segn la combinacin de las diferentes secuencias creando as cuatro posibilidades o tambin llamados ismeros. El potencial de estos virus como vectores gnicos recae en la habilidad de llevar grandes secuencias de ADN extrao insertadas y su habilidad para establecer infecciones latentes de larga duracin en las cuales el genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en la clula hospedadora . Los herpesvirus son , de cualquier manera, enormemente diversos, variando en su tamao de genoma, en la organizacin del genoma, en el contenido gentico, en las clulas sobre las que acta y la patognesis, y en consecuencia diferentes herpesvirus tienen muy diferentes usos potenciales en reparto de genes. La naturaleza de la latencia viral es de particular relevancia. El virus de Epstein-Barr y otros miembros del gamma-herpesvirus pueden establecer infecciones latentes en clulas en divisin; el episoma viral se replica coordinadamente con la divisin celular y est heredado por toda la progenie de clulas. Como retrovirus, este grupo de herpesvirus tiene el potencial para repartir genes a clulas pluripotentes y su progenie diferenciada. Un inconveniente mayor al uso de estos virus en terapia gnica, de cualquier manera, es el hecho de que gamma-herpesvirus estn asociados con daos linfoproliferativos y en algunos momentos con malignidad .El uso de gamma-herpesvirus requerir la identificacin y eliminacin de estos genes involucrados en la transformacin celular y el mantenimiento de aquellas funciones necesarias para la replicacin del virus y el mantenimiento del plsmido viral. En contraste a los gamma-herpesvirus, el virus del herpes simplex (HSV), y otros miembros de alfa-herpesvirus, no pueden mantener una infeccin latente en clulas en divisin. El genomas del virus no contiene un origen de latencia de la replicacin del ADN y el virus persiste en el hospedador por el establecimiento de infeccin latente en clulas de larga duracin neuronas sensoriales en el caso del HSV. Los genes repartidos usando un vector del virus del herpes simplex pueden por lo tanto mantenerse indefinidamente como un componente del episoma latente viral en clulas de larga duracin , pero la herencia de los genes reaprtidos a las clulas hijas de la siguiente generacin podra ocurrir slo como resultado de una fortuita integracin no especfica. Un tercer grupo de herpesvirus, los betaherpesvirus o citomegalovirus, pueden tener potencial como vectores gnicos para la terapia gnica, pero nuestro desconocimiento de la biologa de estos virus, y en particular la naturaleza de la infeccin latente, es escasa y no hay proyectos inmediatos de explorar este potencial. An as algunos herpesvirus estn siendo probados en el reparto de genes extraos y terapia gnica, aunque hasta ahora slo se han utilizado los virus del herpes simplex (HSV) in vivo. 4.4.1 INFECCIN PRODUCTIVA Y ESTADO LATENTE La secuencia nucleotdica del virus del herpes simplex ha sido determinada,tambin todos los productos gnicos han sido identificados, y la mayora de las funciones de los productos gnicos se conocen por lo menos hasta el nivel superficial. La infeccin productiva comprende la expresin de todos los

genes conocidos en una cascada temporal de tres fases. Los genes tempranos codifican protenas reguladoras de las cuales algunas son esenciales para la infeccin del ciclo; los genes tempranos codifican enzimas necesarios para la sntesis del ADN viral y para modificar protenas de la clula hospedadora ; los genes tardos codifican las protenas del virin. El ciclo productivo termina con la muerte celular siguiendo despus de una infeccin in vivo. Los eventos que llevan a una infeccin latente se conocen muy poco, pero virus mutantes para el ciclo de infeccin productiva pueden iniciar y establecer una latencia neuronal aunque la infeccin tambin es posible en otras clulas. La infeccin latente en neuronas expresa una familia de transcritos desde el promotor LAT pero las funciones de estos transcritos se desconoce, y la interrupcin o deleccin del promotor LAT no previene la infeccin latente. Las conclusiones pertinentes para la construccin del vector es que las funciones de los genes no virales parecen neceasarios para el establecimiento o mantenimiento del estado latente. 4.4.2 REPLICACIN DE VECTORES COMPETENTES. De los aproximadamente setenta genes de HSV ms de la mitad son dispensables para el crecimiento en el cultivo celular. Los productos gnicos dispensables incluyen activadores transcripcionales, enzimas modificadoras de nuclesidos y nucletidos, una protena quinasa y algunas protenas de membrana de funcin desconocida. Estos genes representan mltiples convenientes para la insercin de secuencias ajenas y su deleccin resulta muy variable dependiendo de los niveles de atenuacin. Muchos otros genes que se han identificado cuya deleccin resulta en una atenuacin dramtica , y es posible formar vectores competentes y que son completamente apatognicos. Mientras estos vectores son necesarios en la investigacin sobre los problemas del reparto de genes y de la expresin gentica a largo plazo, es improbable que los vectores competentes replicativos sean aceptados para uso clnico. En concreto, la atenuacin a travs de la deleccin de mltiples genes se encauzar para fabricar generaciones de virus que slo estn parcialmente atenuados si la recombinacin debiera ocurrir con el HSV residente en el hospedador. 4.4.3 REPLICACIN DE VECTORES DEFECTIVOS La funcin de algunos genes de HSV son absolutamente necesarios para la repliacin del virus y la deleccin de estos genes necesita de la correspondiente funcin " in trans" de la clula ayudante. Mutantes de HSV combinados con clulas ayudantes se basan en un nmero de funciones gnicas que carecen del regulador transcripcional para genes inmediatamente tempranos (IE3), del transactivador vrico Vmw65 (VP16) y de un nmero de glicoprotenas de superficie esenciales. La atenuacin se ha enfocado hacia vectores carentes del gen IE3 porque la funcin es requerida durante el ciclo productivo, pero otros genes IE son expresados, de hecho hiperexpresados, ante la carencia de IE3 y se ha visto que los productos gnicos de IE son citotxicos. Los vectores que carecen del transactivador vrico (VP16) ofrece la ventaja de que esa protena acta activando la transcripcin de todos los genes inmediatamente tempranos y que adems es una esencial componente de la estructura del virin. 4.4.4 VECTORES AMPLICN El ADN del HSV se replica por el mecanismo del crculo rodante y los plsmidos que contengan un origen de replicacin de HSV actuarn como un modulador para

la sntesis de ADN en clulas coinfectadas con HSV . Si el plsmido tambin contiene una seal de empaquetamiento de HSV, entoncs el concatmero lineal ser empaquetado en partculas virsicas. Los plsmidos de este tipo se les llam amplicn. La replicacin del amplicn y empaquetamiento es dependiente de un virus auxiliar y la progenie infectiva es una mezcla del amplicn empaquetado y del virus auxiliar , que no pueden ser fsicamente distinguidos ni separados. Siempre que el virus auxiliar sea defectivo para la replicacin, la propagacin de la mezcla amplicn-virus auxiliar requiere una lnea celular completamentaria, entonces el virus auxiliar componente de la mezcla no representa riesgo y puede ser ignorado para el propsito de la transferencia de genes. La ventaja de este sistema, es que el amplicn pueda acomodar una secuencia extraa que se aproxima al lmite de empaquetamiento del HSV ( aproximadamente 150 Kb ). Estos amplicones empaquetados pueden repartir gran cantidad de genes o algunas copias de pequeos genes por partculas. La desventaja comn de todos los sistemas auxiliares dependientes, es que el radio del auxiliar-amplicn vara considerablemente en su trnsito y por eso es difcil preparar colonias de vectores reproducibles. 5. VECTORES NO VIRALES 5.1 BOMBARDEO DE PARTCULAS Este se ha mostrado como un mtodo efectivo de transferir genes tanto in vitro como in vivo . En este mtodo fsico el plsmido de ADN es primero revestido sobre su superficie de gotas de 1 a 3 micras de dimetro de oro o tungsteno. Estas partculas son aceleradas por una descarga elctrica de un aparato o por un pulso de gas y son " disparadas" hacia el tejido. Un acercamiento menos invasivo es por el bombardeo directo de partculas en la piel. La fuerza fsica del impacto supera la barrera de la membrana celular. Sin embargo, caractersticas de rigidez de los diferentes tejidos, la procedencia del ADN extrao, y la capacidad de transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia de la expresin de los genes en conjunto. En experimentos sobre epidermis de rata, tejidos musculares, hgado y pncreas se ha observado que el ADN extrao de la clula no llega a integrarse en el genoma de las clula hospedadora, y existe como un episoma relativamente inestable. Esto podra sugerir aplicaciones limitadas de esta tecnologa en la terapia gnica, pero sera til para investigaciones en la expresin de construcciones de ADN en tejidos especficos. El requisito para un procedimiento quirrgico en sujetos humanos de igual modo est muy limitado a la hora de usar esta tecnologa. De cualquier manera, las tcnicas quirrgicas de endoscopa podran hacer menos incoveniente estas limitaciones descritas. Finalmente un desarrollo factible de este mtodo puede ser aplicado en su uso directo como parte de un protocolo de vacunacin. Como demuestran las investigaciones de Ulmer y colaboradores en la inyeccin directa en el msculo, del gen que codifica la protena de matriz del virus influenza A. El individuo (en este caso ratn ) manifest una respuesta de proteccin inmunitaria frente al virus en posteriores infecciones. 5.2 INYECCIN DIRECTA DE ADN

Por este mtodo el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado. En experimentos llevados a cabo por Wolff y colaboradores mostraron niveles significativos de expresin en el uso sobre clulas del msculo esqueltico para construcciones de genes chivato o genes trazadores. La longevidad de la expresin se mostr persistente durante al menos 60 das en las inyeccin con ADN, aunque con ARN y protenas tuvo una vida media menor que 24 horas. Mediante anlisis con Southern blot se sugiri que el ADN se encontraba como un episoma circular cerrado no replicativo. El mecanismo preciso de captura del cido nucleico a travs de la membrana celular muscular fue postulado como resultado de una serie de caractersticas estructurales favorables de clulas multinucleadas, retculo sarcoplasmtico y un extenso sistema tubular transverso. Gracias a ste el contenido extracelular es penetrado profundamente en la clula facilitando la transferencia del ADN. As el mtodo de inyeccin de ADN directamente es simple, econmico, y un procedimiento que no es txico comparado con la entrega mediante virus. El potencial para llevar largas construcciones de ADN es tambin ventajoso. De cualquier manera, los niveles y persistencia de la expresin de genes es probablemente demasiado corta (das) . Esta tecnologa puede tener potencial como un procedimiento de vacunacin, y como expresin de genes a un nivel bajo. Si es suficiente para alcanzar una respuesta inmunolgica. Por otro lado, sera inaceptable considerar una correccin extendida de daos miopticos tales como la Distrofia Muscular de Duchenne por mltiples inyecciones en muchos grupos de msculos en repetidas ocasiones. 5.3 LIPOSOMAS CATINICOS La tcnica recae en las propiedades de carga elctrica del ADN (negativo debido a la cadena de fostatos en la doble hlice), lpidos catinicos (carga positiva) y la superficie celular (una red de cargas negativas debido a los residuos del cido silico). As, lo mismo que hacen las histonas (protenas ricas en aminocidos cargados positivamente que compactan el ADN), los lpidos catinicos interaccionan con las cargas negativas del ADN condensndolo. El exceso de cargas positivas permiten a los transportadores catinicos interaccionar, mediante enlaces electrostticos con las cargas negativas que presenta la membrana celular. Cualquiera que sea la naturaleza del vector, sus interacciones con el ADN son imprescindibles. La mayor parte de los equipos mezclan de manera emprica vector y cido nucleico, formando un complejo que contiene , en general, varias molculas de ADN. Estos complejos vector catinico/ ADN tienden a agregarse y observados al microscopio electrnico tienen un dimetro de 50 a 150 nanmetros. nicamente una condensacin controlada del ADN permitira la formacin de partculas que encerrarn una sola molcula de ADN. Esto reducira su dimetro a una veintena de nanmetros, lo que facilitara considerablemente su paso a los compartimentos vasculares, as como la penetracin en las clulas y su ncleo. Decir tambin que el hecho de que el ADN est compactado lo protege de las enzimas ( nucleasas ) capaces de degradarlo. As lpidos monocatinicos tales como DOTMA (N(1-(2,3-dioleyloxy)-propyl)-NNNtrimethylammonium chloride) y los pptidos policatinicos de segunda generacin

como DOPSA (2,3-dioleyloxy-N-(2(sperminecarboxamido) ethyl)-NN-dymethyl-1propanaminium trifluoroacetate) forman liposomas que se unen espontneamente a polianiones de ADN o ARN. El resultado es la captura del 100% de los complejos estables de ploinucletidos, y por atraccin de cargas y por propiedades de fusin, los lpidos pueden absorberse a la membrana celular y entregar el cido nucleico directamente dentro del citoplasma, evitando la ruta de degradacin lisosomal. Pero, cmo logran que los complejos transfectantes entren en las clulas? Al igual que muchos virus en sus ciclos infectivos interaccionan con protenas azucaradas de la membrana plasmtica, los complejos transfectantes con carga neta positiva, parece que utilizan estas molculas de superficie para fijarse en la clula. Luego, las interacciones electrostticas les permiten la penetracin. In vitro, la etapa de penetracin en la clula no plantea problemas. Las molculas comerciales son extremadamente eficaces sobre cultivos celulares se acercan muchas veces al 100%. In vivo, sin embargo, su eficacia cae considerablemente para, a veces, llegar casi a cero. As, despus de la inyeccin por va intravenosa de complejos cargados positivamente, se constata que la transferencia de genes tiene lugar principalmente hacia las clulas del pulmn y del hgado. Esta biodistribucin sugiere que los complejos transfectantes se agregan en partculas de gran tamao, ya que , sin duda, interaccionan con protenas de la sangre. Por tanto,no pueden abandonar eficazmente el sistema vascular: las partculas son retenidas mecnicamente por unos filtros naturales, los pulmones yel hgado, y penetran en las primeras clulas que encuentran. En el tratamiento de la fibrosis cstica, Alton y colaboradores desarrollaron una preparacin con un ADNc para el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cstica (CFTR) y un liposoma catinico DC-chol/DOPE (3beta-N-N' , N'dimethylamino ethanecarbamoyl) cholesterol/dioleoyl phosphatidylethanolamine). Esta combinacin lipdica ha sido aprobada en pruebas en humanos e in vitro ha mostrado al menos tanta eficacia como DOTAP ( N-(1-( 2,3 -dioleoyloxy) propyl)N,N,N,-trimethylammonium methyl-sulphate) o DOTAP/DOPE. Se comprob que su aplicacin no provocaba signos de inflamacin o necrosis en el tejido. Adems el ADNc era expresado en ARNm por RTPCR y aunque algunos ratones tratados corregan completamente la deficiencia, otros slo tenan una correccin parcial, as que se obtienen limitadas conclusiones a la hora de su alicacin en humanos. Tal vez, los tejidos ms intensamente estudiados para el desarrollo de liposomas catinicos sean las paredes de los vasos arteriales. Las enfermedades cardiovasculares son las causas ms comunes de morbilidad y mortalidad en las sociedades industrializadas . Sistemas en la entrega de ADNliposomas mediante catteres son factibles, pero son limitados por una baja eficiencia de transfeccin y por la toxicidad, pero a pesar de todo los sistemas de ADN-liposomas son usados. Segn Nabel y colaboradores una posibilidad para aumentar la dosis de liposomas catinicos sera pronosticar un aumento en la eficiencia de transfeccin, aunque se ha demostrado que puede ser limitado por la toxicidad celular a concentraciones crecientes. Para dirigir este problema se ha informado recientemente de la creacin de un nuevo liposoma catinico, el DMRIE (dimyristyloxy-propyl-3- dimethyl-hidroxyetilammonium/ DOPE).

Aunque el aumento de la eficiencia de transfeccin de DMRIE/DOPE con respecto a DC-chol/DOPE fue ms tarde de lo esperado. El mecanismo de cmo la proliferacin de clulas aumenta con la transferencia y expresin de liposomas mediados con ADN es simple especulacin. Una propuesta para esta hiptesis es que la rotura de la membrana nuclear de la clula diana que ocurre durante la mitosis puede liberar en el citoplasma factores nucleares que estabilizan el ADN. El ADN transfectado puede entonces ser protegido por estos factores de la digestin por nucleasa de la clula hospedadora por una combinacin de particin estructural y/o intracelular. El futuro de la entrega de genes mediante liposomas catinicos en sistemas cardiovasculares parece prometedor en la luz de estos recientes desarrollos. La proporcin de lpidos con respecto al ADN/ARN, tambin como la concentracin total tiene que ser cuidadosamente optimizada para evitar toxicidad observada con elevadas dosis. Este mtodo es usado en general como un eficiente propsito para transfectar ADN dentro de una amplia variedad de lneas celulares de crecimiento en cultivos de tejidos. Varios estudios han demostrado la eficiencia de liposomas policatinicos en el reparto de ADN in vivo. Este mtodo es una alternativa atractiva a los mtodos de transferencia viral debido a que no hay obligaciones en el tamao del ADN, baja inmunogenicidad y fcil volumen de preparacin. 5.4 TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES En los mtodos anteriormente descritos el problema es que el ADN termina por el conjunto del organismo y no a sus objetivos especficos debido a que no posee la capacidad de introducirse en su tejido diana. Para ello - lo mismo que en vectores vricos - se pueden transplantar al transportador de los ligantes, unas molculas que sern reconocidas por los receptores presentes en el tipo celular elegido. La naturaleza de los ligantes es muy variada , desde azcares, pptidos, hormonas, etc. Su inters es que son capaces de sustituir por una interaccin transportador/clula muy especfica, la no especfica debida a las cargas inicas. Las clulas absorben los elementos del medio exterior por endocitosis: su membrana se repliega hasta formar una vescula, el endosoma. Los complejos de transfeccin aprovechan este mecanismo para penetrar en sus objetivos celulares. El interior del endosoma se acidifica progresivamente y luego se fusiona con otra clase de vescula llamada lisosoma . ste contiene enzimas que degradan su contenido. Por tanto, una vez en el endosoma, los complejos deben necesariamente escapar de l antes de ser vertidos en los lisosomas y sufrir su ataque enzimtico. Por esto, a los vectores sintticos se les asocia unas molculas, llamadas fusigenas, que desestabilizan las membranas del endosoma y les permite evadirse. A fin de que la actividad fusigena se manifieste nicamente despus de la entrada en el endosoma, se eligen unas molculas cuya actividad slo tiene lugar cuando el medio se acidifica. Una vez en el citoplasma, todava es necesario que el ADN llegue al ncleo de la clula. Introducido en clulas en crecimiento (especialmente clulas en cultivo), el ADN penetra en el ncleo durante la divisin celular, cuando se rompe la envoltura nuclear. Pero en las clulas en reposos- estado en el cual se encuentran la mayor parte de las clulas del organismo- la envoltura nuclear constituye una barrera que nicamente deja pasar, por difusin , las molculas cuyo tamao sea inferior a 9

nm. Las molculas cuyo tamao est comprendido entre 9 y 25 nm. pueden penetrar en el ncleo valindosed de los poros de la membrana nuclear. En tal caso, se trata de un transporte activo que necesita el reconocimiento de unas seales especiales llamadas seales de localizacin nuclear (NLS). Pero la implantacin de este tipo de seal en un vector sinttico no ha mejorado la eficacia de la transfeccin. Adems, recordemos que la mayora de los complejos de transferencia miden ms de 25 nm. Actualmente, esta etapa del transporte nuclear es la ms difcil de resolver, a pesar de que es objeto de muchsimos estudios. Otro problema: si el vector ha de permanecer asociado al ADN hasta el interior del ncleo, hay que asegurarse de que su presencia no interfiera con la transcripcin del gen introducido. As, por ejemplo, complejos a base de polmeros (polietilniminas) inhiben poco o nada la transcripcin del transgn. En cambio, los transportadores catinicos a base de lpidos inhiben esta transcripcin cuando presentan un exceso de cargas positivas. Adems de los problemas de vectorizacin del ADN a las clulas-objetivo, hay otros elementos cruciales, como el mantenimiento duradero del gen terapetico en las clulas -necesario si se desea tratar una enfermedad gentica- y la regulacin de su expresin segn las necesidades del organismo. Para asegurarse el mantenimiento del gen, una primera solucin eficaz es la integracin del transgn en el genoma del husped. Idealmente, esta integracin debera tener su objetivo muy bien fijado, pero esto todava no se consigue. En efecto, una integracin al azar en el cromosoma puede hacerse mediante otro gen e inactivarlo. Otra va de integracin es el mantenimiento de las construccin gentica, el plsmido, en la forma llamada episomal, llegada al ncleo, pero no integrada en el genoma del husped, se replicarn con las divisiones celulares. Para conseguirlo, se emplean sistemas desarrollados por virus tales como el de Epstein-Barr. Y una tercera posibilidad : introducir en la clulaobjetivo minicromosomas artificiales (MAC) estables y que se replican de modo autnomo. 5.4.1 RECEPTOR DE ASIALOGLICOPROTENAS (ASGPr) Este tipo de receptor es especfico para hepatocitos. El hgado es de gran importancia en el metabolismo del cuerpo, por tanto es obvio que sea diana para las terapia gnica, tambin muchas enfermedades son debidas a deficiencias en enzimas hepticas. Como describamos para los liposomas catinicos, el ADN es empaquetado en un complejo electrosttico, se usa " asialoorosmucoid-polylysine" (ASOR-PL) en lugar de lpidos. As el receptor es cruzado y unido con el conjugado de policatin y ligando e interacta con el policatin de ADN, y son eficientemente unidos a los ASGPrs en la superficie del hepatocito. La purificacin cuidadosa de los conjugados de ASOR-PL es esencial, y a su vez hay que optimizar la proporcin del conjugado y el ADN. Una vez que se ha alcanzado esto, es relativamente econmico y simple el procedimiento para llevar a cabo una inyeccin perifrica intravenosa, evitando as la necesidad de cateterizar un vaso de forma selectiva. Dos ventajas significativas son la baja inmunogenicidad del complejo y la habilidad para transferir fragmentos grandes de ADN (ms de 48 kb) . La baja inmunogenicidad permitira mltiples inyecciones, que debera ser casi seguro

para las construcciones de ADN actuales, ya que la eficiencia de la expresin del gen in vivo es relativamente baja, y cae rpidamente con el tiempo. Un ejemplo de la aplicacin de este sistema ha sido la bajada del colesterol en suero seguido al reparto de los genes que codifican los receptores de las lipoprotenas de baja densidad (LDLr). Anteriormente comentabamos el mtodo de entrada, mediante endocitosis mediada por receptor, y escape del endosoma antes de la fusin con el lisosoma. En este caso las sustancias empleadas en esa inhibicin de la unin con el lisosoma son una droga antimalaria (cloroquinina) que aumentan la supervivencia del ADN por inhibicin de la acidificacin del endosoma. Tambin se han usado protenas de la cpsida de adenovirus que facilitan la entrada por endocitosis, y ya en el interior se dan vesculas recubiertas de clatrina. El mecanismo de cmo la cubierta de la vescula compuesta por estas partculas adenovricas inhiben la acidificacin es todava incierto. Lo nico que se conoce es la capacidad de rotura del endosoma . Actualmente la va de investigacin intenta descubrir protenas vricas y pptidos sintticos que tengan propiedades de rotura del endosoma. Tambin se estn llevando a cabo un sistema que combina las ventajas de los liposomas de llevar ADN de gran tamao con las propiedades de fusin del virus HVJ o tambin llamado virus Sendai que no es patgeno en humanos. El ADN es condensado por mezcla con protenas no histnicas de cromosomas de alta movilidad del grupo-1 (HMG-1). Estas protenas parecen aumentar la eficiencia de la translocacin nuclear y la expresin seguida a la fusin de la superficie celular. A este complejo ADN-HMG-1 se le aaden lpidos neutros (colesterol, fosfatidil colina, fosfatidil serina). La proporcin de lpidos usados es crtica para la formacin de buenos liposomas. El virus Sendai se inactiva por una breve exposicin a irradiacin ultravioleta, y se mezcla con el complejo ADN-HMG-1 cubierto por liposomas. Este mtodo ha sido desarrollado para el reparto en paredes vasculares, hgado, rin. El mtodo es eficiente, fcil de llevar a cabo, requiere un tiempo corto de incubacin y tiene un tamao del ADN ilimitado. Aunque la transfeccin es eficiente en estos tejidos se necesita una cateterizacin en vasos como pueden ser la vena porta del hgado, arteria renal, coronarias, etc. La principal desventaja tiene que ver con el uso de virus Sendai intactos, a pesar de que tenemos como garanta que no es patgeno en humanos, y da una duracin corta en la expresin y en el reparto de los transgenes. Se debe a que el ADN como ya dijimos permanece como un episoma inestable en la clula hospedadora. Las investigaciones se centran as en el aumento de la estabilidad del ADN y/o la integracin para mejora los proyectos de expresin a largo plazo. As una posibilidad se centra en la ventaja del reparto conjunto del ADN con protenas. As, la estabilidad del ADN procedera de un recubrimiento con protenas de cromosomas y/o otras protenas nucleares. Se hicieron intentos con la protena recA , una recombinasa de bacterias para intentar una integracin en el genoma de la clula hospedadora. Pero los resultados resultaron ser un fracaso. Aunque recientemente se ha visto que diferencias en la parte amino-terminal pueden ser la causa de este fallo.

As en conjunto este tipo de vectores para la transferencia de genes in vivo estn en una fase rpida de desarrollo. Su produccin es sencilla y segura, son estables y pueden contener construcciones genticas de gran tamao. Son eficientes en el reparto de los genes. Por lo que podran ser incorporados a prcticas clnicas. Pero sin embargo, su eficacia in vivo es actualmente decepcionante, seguramente porque el conocimiento de los mecanismos que intervienen es todava insuficiente. Pero sin duda el da en que podamos superar las limitaciones de estos sistemas sern el campo dentro de la terapia gnica con ms aplicaciones, beneficios terapeticos y costes de manipulacin y construccin. 6. DISEO DE VECTORES Los vectores vricos estn hechos al menos de dos componentes, el genoma vrico modificado y la estructura del virin que lo rodea. La mayora de los vectores de la generacin presente comprenden partculas vricas basadas en gran manera en el tipo de estructura del virus sin cultivar. Esta estructura envuelve y protege al cido nucleico viral y provee los medios para unirse y entrar en las clulas dianas. De todas formas, el cido nucleico del virus en un vector diseado para la terapia gnica es cambiado de muchas formas. Los objetivos de estos cambios son discapacitar el crecimiento del virus en las clulas diana mientras se mantiene su capacidad para desarrollarse en forma de vector en el envoltorio asequible o clulas auxiliares, dar espacio en el genoma vrico para la insercin de secuencias de ADN exgeno e incorporar nuevas secuencias que codifiquen y capaciten la expresin apropiada del gen de inters. De esta forma, podemos considerar que los cidos nucleicos del vector comprenden dos elementos: esas secuencias vricas esenciales que permanecen y la unidad de transcripcin para el gen exgeno. Ya que cualquier secuencia que permanezca del virus que codifica, podra ser expresada , incluso por un vector viral discapacitado, todas las secuencias vricas no esenciales deberan ser eliminadas. As, idealmente, un vector contendr slo aquellas secuencias de cido nucleico de virus necesariamente requeridas en cis. De todas formas, todas las dems funciones viralesson necesarias para permitir la replica del genoma del vector para los propsitos de produccin y provisionamiento de las protenas necesarias para ensamblar el virin. Idealmente un envase especfico o clula auxiliar deberia ser construido para que exprese aquellas funciones vricas capaces de funcionar en trans. En la prctica, la expresin de las protenas estructurales del virus y de las protenas implicadas en la replicacin a menudo resultan txicas para una lnea celular, particularmente si el ciclo de vida del virus incluye una ayuda, entonces la infeccin productiva producir la muerte celular ms que una infeccin crnica. As, la lnea celular de envoltura apropiada requiere desarrollar muchos vectores idealizados que no existen. Los rasgos mnimos esenciales presentes en generaciones de vectores vricos se discuten a continuacin. 6.1 RETROVIRUS 6.1.1 SECUENCIAS VRICAS ESENCIALES Ya que las clulas toleran la presencia de protenas constitutivas de retrovirus, la generacin de lneas celulares envolventes o clulas de ensamblaje que expresen todas las protenas vricas es relativamente clara. En consecuencia, los vectores

de retrovirus slo necesitan contener los elementos nucleicos en cis. Estos incluyen las secuencias LTR 5' y 3' y la secuencia de ensamblaje (algunas veces referida como ) que se establece aguas abajo de LTR 5'. La regin esencial de 5' contiene numerosas funciones vricas, incluyendo muchas envueltas en la replicacin e integracin del cido nucleico, secuencias promotoras e incrementadoras, un sitio de unin del ARN de transferencia cebador (PBS) y un sitio donador de empalme. Esta regin tambin abarca los codones de iniciacin para la protena gag, el cual en el caso del virus MoMLV incluye una corriente ascendente, que encuadra CUG que codifica una variante de la protena gag glicolisada con una extensin N-terminal, as como la ms usual AUG. LTRs de varios retrovirus, que incluye aquellos con especificidad para especies diferentes, han sido usados con xito para generar vectores de retrovirus. Incluso los vectores basados en HIV se han producido. Ya que los retrovirus de murine estn bien caracterizados y los experimentos llevan consigo habitualmente modelos de ratn, los vectores utilizan el LTR de MoMLV, y la secuencia de ensamblaje (por ejemplo el N2. LNL6, y los vectores MFG). Aparte de las emisiones seguras que envuelven la generacin de virus recombinates de tipo sin cultivar en la lnea celular de ensamblaje analizada antes, para cualquier aplicacin dada, muchos rasgos influencian la eficacia de un LTR. Algunos variantes de LTR han sido designadas especialmente para la expresin de ciertos tipos de clulas; por ejemplo, el vector basado en el virus de la clula de raz embrinica de murine se expresa en clulas embrinicas. Los cambios en la LTR influencian la expresin, incluyen eliminaciones en la regin U3 y sealan mutaciones que cambian la unin del factor de transcripcin o unin de otras protenas especficamente de la clula. El PBS inmediatamente adyacente al 5' tambin influye en la expresin; por ejemplo, un elemento silenciador de algunas clulas se une al emplazamiento de ARN de transferencia para la prolina pero no al ARN de transferencia para la glutamina. La seal de ensamblaje generalmente usada es ms extensa que la utilizada en los vectores de primera generacin e incluye ahora N-terminal de gag que codifica secuencias. La expresin inicial del codn de iniciacin para la sntesis de gag ms el gen de inters puede ser prevenida por la mutacin de la secuencia AUG o la insercin aguas abajo de un codn de terminacin. Adems , el codn de iniciacin CUG de aguas arriba en MoMLV no est presente en MoMSV. Como consecuencia para las aplicaciones tales como el vector LNL6, se construye una secuencia de empaquetamiento hbrida que consiste en secuencias de MoMSV sin las secuencias CUG y MoMLV aguas arriba que contienen un AUG mutado. Esta regin tambin contiene el donador del empalme producido de forma natural aguas arriba del AUG del gag, el cual interactuaria con el aceptor del empalme aguas abajo de las secuencias que codifican el env. De todas formas, en ausencia del sitio aceptor de env, un sitio aceptor de un empalme crptico 3' en las secuencias que codifican el gag de la seal de empaquetamiento extendida es activada . El uso de la combinacin del sitio aceptor-donador parece ser importante en algunos vectores (como el N2) pero no en otros (LNL6). Las secuencias vricas esenciales al final de 3' del vector viral incluyen las LTRs pero poco ms .

6.1.2 UNIDAD DE TRANSCRIPCIN PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO En el proceso de designacin de la unidad de transcripcin de un vector de retrovirus, aparecen diversas preguntas. Primero, es una protena requerida o codificar el vector el gen de inters ms un marcador seleccionable? Si se necesitan dos protenas, se usarn dos promotores o un ARN mensajero dicistrnico? Otra consideracin importante es la cantidad de producto del gen requerida y la duracin deseada de la expresin. 6.1.3 EL PROMOTOR Y EL INTENSIFICADOR El LTR vrico se usa comnmente como promotor e intesificador del gen de inters. Estos promotores son considerados como relativamente fuertes, y pueden dar grandes cantidades del producto gnico . Si una lnea celular especfica es el objetivo, un promotor especialmente adaptado a esa lnea celular ser necesario, como se argument antes. Cuando dos genes son insertados, un segundo promotor es a menudo incluido aguas arriba de la segunda unidad de transcripcin. Un estudio reciente sistemtico compar combinaciones y orientaciones distintas de los promotores de SV40 y CMV con betagalactosidasa y neomicina como los genes testados y se encontraron efectos marcados, lo cual variaba con la construccin precisa, en ambos, la expresin del gen y la estabilidad del vector. Un acercamiento alternativo es incorporar unos sitios internos de entrada para el ribosoma aguas arriba de la segunda regin que codifica y contar con una transcripcin sencilla para generar ambos productos gnicos. Una importante consideracin para las aplicaciones que requieren una expresin a largo plazo es un promotor cerrado. Los experimentos indican que en algunos casos, el ADN vrico integrado persiste pero la transcripcin se ve reducida a niveles indetectables. Este descubrimiento ha llevado a la bsqueda de promotores de mantenimiento de larga duracin o promotores con gran especificidad tisular. Tambin, cuando el producto es una protena segregada, la investigacin se ha dirigido a encontrar un tejido alternativo en el cual el gen pueda ser expresado pero el cierre pueda ser menos problemtico. 6.1.4 EMPALME Ya que muchos vectores estn construidos por insercin de un ADN circular apropiado en un vector "cassette" preformado, la mayora dependen de las seales de unin situadas en el extremodel vector. En el vector N2, por ejemplo, un donador de empalme y un aceptor estn presentes en la secuencia extendiad de empaquetamiento. En el vector MFG, el aceptor de empalme es la secuencia que normalmente se utiliza en la produccin de ARN mensajero de env. Localizando el AUG de la secuencia introducida que codifica precisamente en el lugar del AUG de env ha resultado una expresin altamente eficiente. 6.1.5 CONCLUSIONES DEL DISEO DE VECTORES DE RETROVIRUS Aunque el diseo de vectores de retorvirus ha alcanzado un estado avanzado,es algo an emprico. Este problema resulta en parte de la naturaleza de los retrovirus. Como el cido nucleico del virus es ARN, los sitios de empalme crpticos presentes en cualquier genoma recombinado puede ser funcional y, en consecuencia, preludio del empaquetamiento de transcritos de largo metraje. El xito slo se puede asegurar testando el vector en clulas de embalaje apropiadas

para determinar si se obtiene un alto ttulo de virus, y si el vector es estable. Adems, su capacidad para transducir clulas objetivo con alta eficiencia necesita ser ensayada. Considerando sto, de manera sorprendente pocos estudios sistemticos se han hecho para comparar las propiedades de estos vectores . A menudo, lo que se construye, usado en estudios comparativos, difiere en ms de un rasgo, haciendo difcil una interpretacin. Una excepcin, que puede ser interpretada , es el estudio sistemtico de la expresin de beta-galactosidasa y de neomicn-resistencia en los vectores estrechamente relacionados mencionados antes. Un estudio ms reciente examin la expresin estable del ADA humano en clulas hematopoyticas de ratn reconstituidas usando vectores MFG que contienen rasgos que influenciaban la expresin en otros contextos. Los resultados indican que los parmetros testados, el uso de una mutacin PBS solamente o una LTR del virus del sarcoma mioproliferativo (MPSV), ms que una LTR del MoML, produca expresin del gen significativamente mejorada. 6.2 ADENOVIRUS Vectores Ad4 basados en la eliminacin de E3 han sido diseados par el uso como vacunas. En estos vectores, la unidad de transcripcin que codificael inmunogn (por ejemplo el antgeno de superficie de la hepatitis B o el pg160 del HIV) se inserta en la regin E3 del genoma de una cepa salvaje. Las pruebas en animales han sido satisfactorias, pero los resultados en test humanos han sido decepcionantes. Esto refleja probablemente la importancia de la regin E3 en cuanto a que reduce la respuesta de inmunidad de la clula hospedadora al adenovirus. En su ausencia, la sntesis de antgenos dirigida al vector es de corta vida e incapaz de producir inmunidad. 6.2.1 GENES VRICOS ESENCIALES Virtualmente todos los vectores adenovricos para la terapia gnica son vectores a los qwue se les ha sustituido E1, a los que les falta la mayora de la regin que codifica el E1 y crecen en clulas 293. Los vectores retienen inmediatamente es extremo terminal 5' inmediato del genoma viral, incluyendo las repeticiones terminales, secuencias requeridas para el empaquetamiento, y la superposicin de la regin incrementadora de E1. Todas las secuencias que codifican para E1a son borradas, pero a menudo permanecen algunos de los extremos 3' del gen E1b y todas las protenas de las secuencias que codifican las secuencias IX. Todos los restos del genoma vrico pueden ser dejados intactos, pero normalmente algunos o todas las secuencias que codifican la regin E3 son tambin eliminados. Un informe describe un vector en el que E3 es retenido pero todas las secuencias en E4 eran eliminadas con la excepcin de ORF-6, que era retenido porque pareca ser la nica secuencia de la regin E4 que es esencial para el crecimiento en el cultivo de tejido. El vector Ad2/ORF-6 se desarrolla bien, y es estable en clulas 293. Los intentos para crear vectores basados en adenovirus con eliminaciones ms extensas son limitadas por la capacidad de producir clulas de empaquetamiento apropiadas. En el presente, la eliminacin de genes no esenciales,mutacin condicional de otros genes, o la provisin de funciones del ayudante mediante la coinfeccin ms que la expresin constitutiva son las opciones ms simples. Un informe del as llamado vector pseudo-adenovirus (PDV) describa el desarrollo de

un vector de base Ad2 que contena solamente secuencias terminales repetidas virales 5' y 3' bordeando el ADN exgeno que codifica beta-galactosidasa. El desarrollo y empaquetamiento del vector en clulas 293 coinfectadas con un auxiliar de tipo salvaje es posible, pero la dificultad de quitar todo el virus auxiliar de tipo salvaje presentes, limita la aplicacin prctica de tal vector. Otros informes recientes describen un vector E1- y E3- deleccionados en el cual el producto del gen E2a incluye una mutacin sensible a la temperatura. Esta construccin fue producida con la esperanza de que al decrecer la actividad de la protena de unin al ADN producida a 37C dejara el resto de genoma vrico ms quiescente. 6.2.2 UNIDAD TRANSCRIPCIONAL PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO. PROMOTOR E INCREMENTADOR Varios promotores se han usado par expresar genes exgenos en los vectores de adenovirus, incluyendo adenovirus MLP, PGK e hbridos CMV/beta-actina, as como el promotor endgeno E1a. La eleccin de un promotor adecuado depende de la aplicacin y del tejido. El promotor cerrado como resultado de los vectores de adenovirus an no han sido descritos. 6.2.3 POLIADENILACIN Se han usado una variedad de seales para la poliadenilacin, incluyendo la secuencia endgena E1b/protena IX. Un problema que parece causar la baja produccin de virus en algunos casos es la oclusin po cierre del promotor en la unidad de transcripcin de la protena IX, que es causada por la lectura a travs de un fuerte promotor aguas arriba del gen introducido. La expresin de la protena IX deja el empaquetamiento menos eficiente. Se puede resolver el problema aparentemente utilizando una fuerte seal de poliadenilacin, tal como en SV40, aguas abajo del ADNc exgeno o invirtiendo la unidad de transcripcin. 6.3 VIRUS ADENOASOCIADOS 6.3.1 ELEMENTOS VRICOS ESENCIALES Las nicas secuencias esenciales para un vector AAV son los 145 nucletidos TRs en el 5' y 3' al final del vector. Estos dan las secuencias necesarias para la replicacin y el empaquetamiento del vector de ADN. 6.3.2 UNIDAD DE TRANSCRIPCIN PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO Para algunas aplicaciones, el tamao del vector de ADN es problemtico.El ADN es mayor de 4800 nucletidos es difcil de replicar y empaquetar. Como consecuencia, la regin promotor-incrementador y la seal de poliadenilacin utilizada son seleccionadas algunas veces desde la base del tamao mnimo requerido. Sin duda, un vector que codifica el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) utiliza un promotor sin el TR que no ha sido hasta ahora descrito. Cuando el tamao del ADN introducido no es problemtico, se pueden utilizar unidades de transcripcin ms convencionales. Estas unidades pueden incluir varios promotores exgenos y, en algunos casos, marcadores seleccionables. Para introducir la especificidad de expresin en tejidos, tambin han sido introducidos segmentos de regiones de control del locus, pero con un xito limitado. 6.4 HERPESVIRUS

Adems del diseo y construccin de vectores HSV disminuidos la seleccin de promotores que resultarn en una expresin a largo plazo estable de un gen transducido en un tipo celular deseado es un rea de investigacin activa. Hasta hoy los estudios se han centrado profundamente en la expresin del gen lac Z que ha sido situado bajo control de varios promotores celulares o virales con el propsito de definir aquellos elementos activos en cis suficientes para conferir una expresin gentica neuronal duradera. Nuestro poco conocimiento de estos factores actuantes en cis y trans en el control de las expresin gentica neuronal in vivo, junto con la posible inactivacin de promotores heterlogos en el contexto del genoma vrico latente asociado a histonas nos ha llevado a las pruebas empricas en un nmero elevado de elementos reguladores celulares y virales. El sitio de insercin de promotores heterlogos del genoma de HSV y /o la proximidad de secuencias reguladoras del promotor lac pueden influenciar significativamente su actividad durante la latencia. Desde que el virus codifica los LATs son transcritos indefinidamente durante la latencia neuronal, se han hecho considerables esfuerzos para definir aquellos elementos del promotor lac importantes en una expresin gentica neuronal duradera, y para determinar si este promotor tambin puede ser usado para dirigir una expresin gentica ajena. Se ha demostrado que la replicacin competente de los vectores HSV es capaz de la expresin estable de la beta-globina y de la betagalactosidasa en una proporcin de neuronas sensoriales de murine cuando dichos genes son situados en diferentes localizaciones aguas abajo de la caja TATAque contiene el promotor LAT al que se le llama LAT1. Datos recientes han dilucidado la complejidad de la regin reguladora del promotor LAT y han indicado que la expresin duradera sea facilitada por elementos contenidos en una segunda regin promotora, llamada LAP2 , que se encuentra aguas abajo de LAP1 y tiene caractersticas comunes a los promotores de genes "housekeeper" eucariotas. Se ha vistoque el promotor LAP2 dirigen la expresin del gen lac Z en neuronas trigeminales durante 300 das despus de la infeccin, independientemente de LAP1 cuando es insertado en una localizacin genmica ectpica. De este modo el aumento de la complejidad de la regin promotora LAT de HSV ofrece considerables promesas como elemento suficiente para conferir una duradera expresin gentica en neuronas in vivo y es importante determinar el nivel de expresin que puede alcanzar esta regin promotora en diferentes tipos de neuronas desde que los primeros estudios se sugiri que la actividad de estos promotores en neuronas del sistema nervioso central es considerablemente menor que el observado en el sistema nervioso perifrico. Est claro que aunque vectores repartidores de genes HSV en etapas tempranas de su desarrollo, se han hecho progresos significantes respecto al desarrollo de replicaciones apatognicas como en sistemas basados en amplicones. El mayor obstculo que se ha de superar ahora y que, deja problemas con todo lo relacionado con el sistema de vectores es la expresin duradera. As, aunque la expresin transitoria pueda ser alcanzada fcilmente por promotores bien caracterizados nuestro conocimiento de los requerimientos precisos que facilitan la expresin gnicas estable es pobre y la influencia de factores como la organizacin de la cromatina, metilacin y la estabilidad del ARN han de ser profundamente estudiados.

7. PRODUCCIN DE VECTORES 7.1 RETROVIRUS La produccin de vectores basados en retrovirus en clulas empaquetadoras tiene tres objetivos, la produccin de cido nucleico del vector encapsidado en una partcula vrica con especificidad de infeccin, la produccin eficiente de grandes cantidades de vectores, y evitar la salida de retrovirus replicativamente competentes (RCR). 7.1.1 CLULAS EMPAQUETADORAS Una lnea de clulas empaquetadoras, se produce por medio de una transfeccin en el plsmido del virus auxiliar que codifique gag, pol, env y por la seleccin de clulas que expresen las protenas y que soporte la produccin de vector. Se puede evitar la replicacin de las secuencias auxiliares haciendo al menos delecciones en las secuencias empaquetadoras. De forma similar, para evitar la recombinacin con el vector en replicacin se han de quitar secuencias adicionales. Por ejemplo, otras secuencias adems de la secuencia que codifique la envoltura, incluyendo la LTR 3' , son comnmente deleccionadas y sustituidas por una secuencia poliadenlica, como la del SV40. Las delecciones se pueden incorporar al LTR 5' para reducir su habilidad para replicarse y en su lugar se puede utilizar un promotor exgeno. Otras adaptaciones diseadas para asegurar que la lnea de clulas empaquetadoras no pueda producir RCR incluye la insercin de mutaciones puntuales o delecciones en posiciones claves del genoma del auxiliar y romper el genoma viral en dos unidades transcripcionales, uno que codifique gag y pol, y el otro que codifique env. La combinacin de estos acercamientos y la transfeccin de clulas en diferentes tiempos para incitar a la integracin del genoma dividido en diferentes sitios en el cromosoma de la clula hospedadora reduce la posibilidad de recombinacin. A pesar de esto, la mltiple recombinacin cruzada genera un estallido del vector de replicacin-competente y queda la posibilidad de que deba ser constantemente testado para la produccin en masa. Para asegurar la especificidad apropiada del objetivo, el gen env del virus auxiliar/lnea de clula empaquetadora puede ser variado. Por ejemplo,para generar un vector capaz de infectar clulas murina (tambin llamado vector ecotrpico), se puede usar en una lnea de clulas de empaquetamiento que expresa una secuencia env desde un retrovirus murine como el MoMLV, pero para la produccin de un virus capaz de infectar clulas humanas, en vez de este, se puede usar la secuencia env de un virus anfotrfico como el 4070A. Recientemente, se ha llevado a cabo acercamientos ms sofisticados del objetivo. Inicialmente, estas llevaban consigo la modificacin covalente de viriones. Una aproximacin ms precisa consiste en quitar secuencias del gen env y reemplazarlas con secuencias que codifican protenas con diferente especificidad. Por ejemplo, las secuencias erotropoyticas se han utilizado para apuntar al receptor Epo. Otro acercamiento en incorporar un anticuerpo de cadena simple dentro de la secuencia env. Un acercamiento diferente utiliza la capacidad del retrovirus para incorporar glicoprotenas de otros virus en su desarrollo para producir as los llamados pseudotipos. Mtodos desarrollados de forma reciente incorporan la protena HA del virus influenza y la protena G del virus de la estomatitis vesicular

(VSV) como la glicoprotena de superficie de vectores retrovirus. La incorporacin del VSV tiene dos consecuencias: primero, el vector tiene as un amplio campo de objetivo de la glicoprotena VSV; segundo, las partculas del virin parecen ms estables y pueden ser concentradas por centrifugacin sin prdida de dosificacin (ttulo de una solucin). Para producir vectores de retrovirus, un vector dado en forma de plsmido es transferido en una lnea de clulas de empaquetamiento seleccionada. Las secuencias del nuevo vector se integran y se replican bajo la influencia de las funciones del vector auxiliar endgeno, por eso generando viriones descendientes con la protena de envoltura relevante provistas por la lnea de clas de empaquetamiento. Tpicamente, la produccin de vectores en diversas lneas de clulas de productoras es examinada para encontrar un productor de alta estabilidad. 7.1.2 RETROVIRUS DE REPLICACIN COMPETENTE Mucho esfuerzo ha ido en desarrollo de lneas celulares de empaquetamiento debido a que la produccin de virus debe ser reducida al mximo posible. Desde que este virus puede replicarse, su presencia en una poblacin diferente incompleta o defectiva de retrovirus presentara serios problemas de seguridad. Considerando las consecuencias de inyeccin de un vector auxiliador libre y un vector que contiene RCR en primates: los monos tratados con virus auxiliares libres permanecan con la enfermedad libres durante los perodos de observacin, mientras que aquellos tratados con un vector que contiene RCR desarrolla linfomas despus de pocos meses. Presumiblemente, el virus que replica es vertido o liberado constantemente e infecta clulas adicionales. La viremia resultante lleva a mltiples rondas de integracin, eventualmente resultan en una acumulacin de sucesos mutagnicos. El FDA requiere ser testado de forma rigurosa en lotes clnicos del vector si son de uso en humanos, y aunque raramente, estas salidas de RCR en lotes clnicos han ocurrido. La caracterizacin molecular del RCR muestra que regiones mnimas de secuencias de homologa pueden dar lugar a recombinantes. 7.1.3 PURIFICACIN La capacidad para transducir objetivos celulares con retrovirus depende en parte de la multiplicidad de la infeccin, la cual depende del volumen y la concentracin del virus aadido a las clulas. Idealmente, los vectores para uso clnico podran ser purificados y concentrados, pero esto es dficil en la prctica porque las partculas de retrovirus son relativamente frgiles. Nuevos virus pseudotipo pueden ser una excepcin, pero en el presente, lo mejor que pueden ser hecho es proteger la produccin de clulas productoras de alta dosificacin de virus. Adems, para el uso humano, la lnea de clulas para empaquetamiento debe ser testada rigurosamente para excluir la presencia de virus humanos y otros componentes. 7.2 ADENOVIRUS 7.2.1 CLULAS DE EMPAQUETAMIENTO Una lnea celular (clulas 293), se usa generalmente casi de forma exclusiva para adenovirus. Estas clulas se producen por la transfeccin de ADN del Ad5 cortado en clulas del rin del feto humano. Despus de la seleccin y aprobacin, la lnea celular que resulta contiene cerca del 11% del genoma Ad5 desde el 5' y

est inmortalizada, presumiblemente bajo la influencia de las funciones E1a y E1b. La duracin exacta de la insercin de Ad5 y el nmero exacto de secuencias E1 de Ad5 es desconocido. Debido a que las clulas 293 contienen poco genoma de adenovirus (codifican, como mucho, una protena estructural), su descripcin como una lnea de clulas de empaquetamiento es debatible. Quizs la lnea de clulas auxiliares es ms apropiada en este caso. 7.2.2 ADENOVIRUS DE REPLICACIN COMPETENTE (RCA) Justo como los retrovirus, la recombinacin entre secuencias de E1 de Ad5 presentes en clulas 293 y las secuencias superpuestas en los vectores eliminados E1 en parte defectuosos, pueden generar adenovirus de replicacin competente (RCA). Este problema se ha detectado en vectores basados en Ad2 de ms longitud que el tipo sin cultivar, porque una vez presente, la progenie de replicacin competente cubre rpidamente el vector introducido y porque el recombinante es un hbrido Ad5/Ad2 que puede ser distinguido de los tipos sin cultivar. Aunque menos fcil de detectar y caracterizar, la generacin de RCA con vectores basados en Ad5 y en Ad2 ms pequeos tambin ocurre. La frecuencia de esta recombinacin es difcil de medir de forma segura. En el futuro, los investigadores intentarn minimizar secuencias que se superpongan con las secuencias de clulas 293. De forma similar, un desarrollo valioso sera una clula 293 de segunda generacin con una regin codificante E1 mejor definida, la cual podra ser dividida entre E1a y E1b (como con las clulas de empaquetamiento del retrovirus) para no fomentar la recombinacin. Aunque el RCA puede ser generado en la produccin de vectores de adenovirus si son potencialmente peligrosos. Adenovirus de tipo sin cultivar pueden ser no fiables y la movilizacin y diseminacin del vector por s mismo no parece posible. Sin embargo, el requerimiento corriente de FDA para lotes clnicos de adenovirus es un RCA o menos por dosis. 7.2.3 PURIFICACIN Al contrario que retrovirus, los adenovirus permanecen estables cuando son sujetos a una purificacin extensiva. Los procedimientos implican mltiples ciclos de congelacin y descongelacin para romper las clulas infectadas, y uno o ms pasos de centrifugacin seguido de dilisis o cromatografa. Las preparaciones purificadas del vector que contiene 10e12 partculas/ml, puede ser obtenido con facilidad. As la magnitud del rango es mayor de lo que es posible en retrovirus y AAV . Las preparaciones son testadas extensivamente para RCA y otros virus contaminantes. Adems, las preparaciones deben encontrar un requerimiento de FDA de una partcula infectiva de unidad de radio menor que 100. 7.3 ADENOASOCIADOS 7.3.1 CLULAS DE EMPAQUETAMIENTO Los vectores AAV no tienen todas las secuencias que codifican virus, pero la lnea de clulas de empaquetamiento no estable ya ha sido analizada. En consecuencia, los genes cap y rep deben ser introducidos en clulas como plsmidos al mismo tiempo que el plsmido del vector que contiene el ADN circular flanqueado por TR. Los mtodos de transfeccin usados para este propsito son ineficientes y difciles de cubrir. Adems, las clulas transfectadas requieren una superinfeccin con adenovirus para dar funciones auxiliares

adicionales. Los esfuerzos para mejorar la eficiencia de los mtodos de produccin son obstaculizados porque la protena rep es txica para las clulas. Aunque se han considerado muchos mtodos ingeniosos para solventar este problema, como fabricar un adenovirus auxiliar para expresar rep y cap, esto queda como un hecho significativo; ahora, los esfuerzos a gran escala para producir material para experimentos de animales y las pruebas clnicas implican la aplicacin de la fuerza bruta de los mtodos de transfeccin tradicional. 7.3.2 PURIFICACIN El auxiliar de adenovirus puede ser separado de los preparados de AAV por tratamiento de calor y/o por la centrifugacin de CsCl para producir viriones purificados. 8. EFICACIA DEL VECTOR 8.1 ESTUDIOS IN VITRO Una vez que se ha diseado y producido un vector particular para una aplicacin dada y se muestra que se puede producir en cantidades apropiadas, la prxima pregunta que aparece es, funciona? cunto producto gnico se sintetiza? cul es la duracin de la expresin? Se pueden dirigir estas cuestiones usando clulas cultivadas. El primer problema que necesita ser clasificado es si el virus transferir el gen a las clulas deseadas. Para los vectores de retrovirus, este problema ser determinado por una protena que lo envuelve. Para los vectores basados en adenovirus, el conocimiento de la biologa del virus no permite predecir si el vector entrer en una clula particular o tejido, porque el tropismo conocido est definido en trminos de capacidad del virus para replicarse en una clula. Un vector con xito requiere slo que el virus entre en una clula y exprese un gen exgeno. Adems, el receptor de adenovirus no est bien caracterizado, de nuevo hacer una prediccin es difcil. En la prctica los vectores de adenovirus pueden entrar en la clula de una amplia variedad de tejidos y especies. El rango del hospedador de AAV es difcil de predecir a partir de datos de infecciones vricas, porque el virus es defectuoso en cada caso. En la prctica, como con los adenovirus, los experimentos de transferencia de genes han demostrado que los vecotres son capaces de entrar en gran variedad de clulas. Los marcadores seleccionables son comnmente usados para ayudar en la identificacin y enriquecimiento de clulas en las que un vector ha transferido el gen , especialmente con vectores basados en retrovirus y AAV. La seleccin para la resistencia a G418 en clulas tratadas con un vector que contiene un gen de resistencia a la neomicina es un modo poderoso de seleccionar clulas que posiblemente contengan el gen de inters adyacente.Aunque es de ayuda para estudios iniciales in vitro, este informacin no es necesaria para indicar el grado de transferencia del gen que esposible de alcanzar en ausencia de seleccin, excepto quizs en aquellas raras instancias donde la transferencia del gen teraputico confiere por s mismo una ventaja selectiva. La transferencia del ADNc de ADA a clulas T con pacientes deficientes en ADA es un ejemplo. Algunas generaciones posteriores de vectores retrovirus no tienen marcadores seleccionables aunque son muy eficientes, por ejemplo, los vectores basados en MFG en algunso vectores AAV, el gen teraputico es tan grande como para impedir la inclusin de secuencias seleccionables.

Los mtodos usados para detectar la transferencia y expresin del gen no deberan ser slo cuantitativos , sino tambin indicar el porcentaje de clulas en las que el gen es transferido y expresado. Para detectar la transferencia del gen, el cido nucleico puede ser examinado por mtodos basados en Southern, Northern y PCR. El mtodo de la PCR puedeser extremadamente sensible, pero la mayora de las configuraciones no son cuantitativas. Ninguno de estos mtodos mide el porcentaje de clulas para las cuales la transferencia ha ocurrido, pero se puede calibrar este valor usando los mtodos in situ para detectar el cido nucleico en la clula diana. El estado de integracin del cido nucleico del vector transferido es examinado a menudo. Se debe recordar que, ya que el comportamiento del virus tipo salvaje est bien caracterizado, un vector relacionado no se comportar necesariamente del mismo modo. Por ejemplo, en ausencia de rep los vectores AAV no siempre se integran, y si lo hacen, la integracin puede no retener siempre la especificidad del tipo salvaje. La deteccin del producto de la accin proteca codificada por el vector se puede hacer por muchos mtodos. La inmunocitoqumica es til para las protenas estructurales y no segregadas, aunque tengan una limitada sensibilidad para protenas expresadas en pequeas cantidades. Los mtodos de inmunoprecipitacin se usan algunas veces, pero dan pequeas indicaciones de la distribucin de la protena. Las protenas segregadas se detectan a menudo mediante test de ELISA y otros mtodos basados en anticuerpos con gran sensibilidad. Algunos productos de la accin proteca son detectados mediante ensayo de funcin, especialmente varios genes usados comnmente para propsitos anlticos, por ejemplo, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa (CAT) y luciferasa. El colorante de la beta-galactosidasa es relativamente insensible y subgetiva a ser coloreada artifialmente en algunas clulas y tejidos, aunque la seal de localizacin nuclear para distinguir la actividad enzimtica exgena evita este problema. Los ensayos con luciferasa y CAT son muy sensibles, pero no dan indicacin de la distribucin de la expresin gnica. Los ensayos para determinar la funcin de un gen teraputico expresado es muy til porque permite testar, por ejemplo, la complementacin del efecto de un gen, o la inhibicin del desarrollo vrico. La deteccin de la actividad de los canales para cloro del producto del gen CFTR , deriva de pacientes con fibrosis qustica, es un buen ejemplo de este tipo de ensayo. La interpretacin de los datos obtenidos usando clulas en cultivo requiere precaucin. Estas clulas se inmortalizan o se transforman o son de tejidos o especies inapropiadas. Ms an, sus propiedades de desarrollo, marcadores de superficie y receptores, el espectro de protooncogenes celulares expresados y supresores de tumor, e incluso su contenido de virus endgeno puede diferir de lo normal. Cada uno de estos factores podra influir en la unin, comprensin y expresin del vector. Adems, los datos obtenidos en clulas cultivadas ignoran necesariamente la influencia potencial de las respuestas fisiolgicas in vivo as como la respuesta inmune. Para mejorar algunos de estos problemas, se necesita tejido humano primario, pero estos cultivos son difciles de obtener y desarrollar y tiene una duracin de vida limitada.

El uso de clulas humanas ha sido particularmente til en el estudio de la transferencia de genes por fibrosis qustica. Por ejemplo, clulas epiteliales respiratorias primarias pueden ser desarrolladas en monocapa formando uniones estrechas, permitiendo as el ensayo de propiedades electrofisiolgicas en cmaras Ussing. Un paso inmediato entre el cultivo de clulas y animales es el uso de xenoinjertos. Por ejemplo, la trquea descarnada de rata puede ser poblada con clulas de los conductos areos humanos e reinjertada en ratones desnudos, permitiendo el estudio de la clula en monocapa durante algunas semanas. 8.2 ESTUDIOS EN ANIMALES Sin duda, los experimentos animales forman parte esencial del estudio de cualquier aplicaciones de terapia gnica y se deberan iniciar lo antes posible. Estos experimentos tienen dos objetivos, el estudio de la seguridad del sistema de vectores y el estudio de la eficacia de la transferencia de genes. Los estudios de seguridad se requieren por el FDA antes de que cualquier protocolo humano se permita. El efecto de la dosis y su duracin es estudiado en varios animales, incluyendo primates y otros animales que sean hospedadores para el virus salvaje (por ejemplo, las ratas del algodn se usan para el estudio de adenovirus). La difusin de secuencias vitales, especialmente a las gnadas, es examinado y la replicacin o expresin parcial de los supuestamente virus defectuosos tambin es testada. Cualquier defecto adverso como la inflamacin tras la administracin del vector es estudiada. El propsito de estos experimentos no es mostrar que el vector no tiene efectos adversos, ya que cualquier clase de droga tiene estas propiedades en algunas dosis. El objetivo es determinar el tipo de suceso adverso que podra esperarse si los humanos estuvieran expuestos al vector, y establecer las posibles dosis con la posible que estos efectos podran ser predichos. Estos datos permiten la valoracin de la posible proporcin riesgobeneficio de cualquier prueba potencial. Los tests de eficacia requieren el desarrollo de modelos relevantes de estudio. Por ejemplo, para una enfermedad gentica, un ratn con un gen eliminado o un animal con el fenotipo apropiado sera vlido. Para aplicaciones en clulas hematopoyticas se puede utilizar la repoblacin de la mdula en animales irradiados letalmente o tratados con drogas. El ratn eliminado no tiene algunas veces el fenotipo predicho; las clulas hematopoyticas del ratn son ms fcilmente manipuladas, seleccionadas, desarrolladas y transducidas con el vector que las clulas de primates y especialmente humanos y los modelos de cncer en la vida real son impredecibles, a causa de la metstasis de los tumores humanos. Las respuestas inmune e inflamatoria al vector viral o a la protena exgena son importantes parmetros a estudiar. El uso de animales recin nacidos o ratones desnudos es valioso en los efectos que evaluan la administracin de vector en ausencia de un sistema inmune completo funcionamiento. Adems, la tendencia de los ratones que soportan mutaciones de eliminacin de genes importantes en el sistema de inmunidad estn disponibles as para que cualquier efecto pueda ser estudiado en detalle para probar el papel relativo de las diferentes armas del sistema inmune. Los ensayos sensibles estn disponibles para detectar un gran espectro de citoquinas de ratn, agentes inflamatorios y marcadores celulares. 8.2.1 RETROVIRUS

En la mayora de los casos, los vectores retrovirus son aplicados ex vivo. Las clulas hematopoyticas, epitiales o musculares son objetivos comunes. La transduccin ha sido demostrada mediante el uso de clulas de mridos en cultivo, y la repoblacin de animales se ha alcanzado usando varias molculas de ADN circular. Por ejemplo, los investigadores han informado de la transduccin de clulas hematopoyticas con ADNc que codifica globina, glucocerebrsidasas y ADA; de fibroblastos con el factor IX; y de clulas musculares con el factor IX, hormona del desarrollo y ADA. Aunque inicialmente se detectan altos niveles de expresin, en algunos casos las expresiones disminuyen en un perodo de das a semanas. El anlisis de clulas transferidas es entonces necesario. Demostrando la persistencia del ADN integrado en algunos casos, se ha establecido que la expresin que conduce el promotor del gen exgeno est cerrada . Estos resultados han llevado a la investigacin de promotores ms apropiados. Aparte de algunos xitos, la expresin de larga duracin , especialmente de grandes niveles de protenas, como abundantes factores de coagulacin de sangre, permanecen problemticos. Adems, las observaciones hechas u otras especies, especialmente primates (incluyendo humanos), pueden ser problemticos. Los sujetos humanos han sido tratados con clulas T autlogas que codifican ADA y con clulas de hgado transducidas ex vivo con el receptor de baja densidad de lipoprotenas . 8.2.2 ADENOVIRUS En los dos ltimos aos, vectores de adenovirus que codifican marcadores betagalactosidasa u otras protenas han sido administrados a un nmero importante de tejidos en animales. De forma sorprendente, la expresin ha sido detectada en numerosos tejidos, incluidos pulmn, corazn, hgado, msculo, mdula, cerebro, sistema nervioso central, clulas endoteliales, riones, clulas de la retina y tumores slidos. Los individuos con fibrosis qustica han sido tratados con vectores adenovirus en la nariz y pulmn. Los niveles de expresin en animales dependen de la cantidad de virus aadida y del vector usado, pero en general la expresin inicial es intensa , la duracin de la expresin vara en gran manera. En ratones desnudos recin nacidos. la expresin es de larga duracin, mientras que en ratones adultos la expresin decrece mucho en dos o tres semanas. La prdida de expresin se asocia, particularmente en el hgado, con las infiltracin de clulas inmunes e inflamatorias. Estudios anteriores con virus de tipo salvaje en ratones que no eran permisivos a la replicacin vrica, mostraban dos fases de respuesta caracterizada por una infiltracin inicial mediada por citoquinas de neutrfilos y monocitos, seguidos por una respuesta mediada por clulas T . El esfuerzo ms corriente es focalizar en el intento de comprender los papeles relativos de los diferentes tipos de clulas en los procesos inflamatorios, resultantes de la administracin de vectores adenovirus y la destruccin aparente de clulas tratadas con el vector. Una proposicin es que los vectores defectuosos expresan an cantidades significativas de protenas vricas, las cuales son el objetivo de los linfocitos T citotxicos (CTLs), que en consecuencia eliminan las clulas que expresan el vector . La sntesis de protenas de vectores defectuosos podra resultar de la expresin del gen que falla o de la complementacin del desarrollo del vector en clulas diana por secuencias E1 integradas por funciones codificadas de la clula

hospedadora con actividad parecida a E1, o por protenass similares codificadas por otros virus. La hiptesis de destruccin de CPL, ocurre en contra de anteriores informes en que los adenovirus CTLs estaban restringidos, al menos en algunos haplotipos para las protenas E1. Cualquiera que sea el mecanismo en los ratones, las cuestiones reales son , ocurren estos mecanismos en primates, especialemente humanos, y si es as, es posible erradicar los efectos? Por ejemplo, la expresin de la protena del adenovirus E3 gp19 podran reducir la respuesta de inmunidad del hospedador al vector debido a que esta reduccin es una funcin normal en el ciclo de vida del virus de tipo salvaje. Otros acercamientos experimentales incluyen la incorporacin de una mutacin sensible a la temperatura en el gen E2 para que la protena de unin al ADN desfavorezca la expresin del gen vrico. Otro acercamiento es la eliminacin de parte de la regin E4 para el mismo propsito. Ya que el ADN del adenovirus raramente se integra, muchas aplicaciones de la terapia gnica usando vectores de adenovirus requerir una administracin repetida. Los estudios de dosis repetidas revelan que los animales pueden volverse resistentes a mltiples administraciones y ala expresin del gen posterior. Este fenmeno vara con la dosis y el tipo de administracin y es el sujeto de un intenso estudio. Para los procedimientos que conlleva la administracin por va de la corriente sangunea, por ejemplo, al hgado, una explicacin posible es el desarrollo de anticuerpos neutralizantes humorales. El objetivo de nuevo es comprender los mecanismos involucrados, as disear vectores mejorados capaces de evadir los mecanismos de vigilancia. Un estudio cuidadoso de las respuestas inflamatorias e inmunes definir para cada aplicacin si existe una ventana teraputica para el uso de los vectores de adenovirus en la cual la eficacia es evidente y sin toxicidad asociada. Esta definicin esdifcil porque los resultados obtenidos en animales raramente predicen lo que ocurrir en humanos. Sin duda, esta consideracin ha impulsado el argumento para administrar vectores de terapia gnica a humanos en lo que sera un estado muy temprano del desarrollo de la droga. La propensin de algunos vectores de adenovirus a marcar clulas tratadas para la destruccin se puede usar para aventajar la destruccin de clulas cancergenas. El uso de vectores suicidas que codifican agentes citotxicos que a menudo producen efectos presentes junto con la respuesta inmune provocada en parte por el propio vector podra probar una aplicacin efectiva de antitumores para los adenovirus. 8.2.3 ADENOASOCIADOS Las dificultades en generar el vector AAV suficiente han impedido la disponibilidad de muchos datos animales. Los tratamientos ex vivo de fibroblastos y clulas hematopoyticas resultaron en la expresin de genes de globina y el producto gnico de la anemia de Fanconi. La aplicacin in vivo da vectores para la tirosn hidroxilasa en el cerebro y vectores que codifican CFTR en conejos y monos que tambin han sido analizados. Hasta la fecha la expresin ha sido de larga duracin, y los efectos contrarios de la administracin del vector no han sido notificados. Mientras se llevan a cabo experimentos con dosis ms altas necesitaremos establecer si los vectores AAV evitan alguno de los problemas

inflamatorios y de inmunidad vistos con los vectores de adenovirus y si es as, por qu? NDICE DE LA SEGUNDA PARTE: 9. Estrategias teraputicas 9.1 Estrategias ex vivo 9.2 Estrategias in vivo 9.3 Terapia gnica in vivo o in vitro? 9.4 Otras estrategias utilizando cidos nucleicos 10. Aplicaciones de la terapia gnica en humanos 10.1 Fibrosis qustica 10.2 Fibroblastos de la piel usados en terapia gnica 10.3 Terapia gnica aplicada a hepatocitos 10.4 Linfocitos modificados genticamente 10.5 Utilizacin de clulas hematopoyticas en la expresin de clulas en animales 10.6 Deficiencia de adenosn desaminasa en humanos 10.7 Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia muscular de Duchenne 10.8 Terapia gnica en la cura del cncer 10.9 Terapia gnica en infeccin por HIV 11. La terapia gnica en el plano jurdico 12. Terapia gnica: perspectivas futuras y consecuencias 12.1 Cuestiones econmicas 12.2 Perspectivas futuras 12.3 Consecuencias de la terpia gnica 13. El negocio de la salud 14. La tica en la terapia gnica 9. ESTRATEGIAS TERAPUTICAS 9.1 ESTRATEGIAS EX VIVO El tratamiento est basado en la obtencin previa de clulas del paciente procedentes de un tejido u rgano de inters. A continuacin se procede a la disgregacin de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro, en donde las clulas son posteriormente transfectadas por el " gen teraputico" utilizando para ello un vector adecuado. Las clulas transfectadas son seleccionadas en funcin de su capacidad para expresar el gen exgeno de forma estable y persistente. Las clulas as seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente. Tambin se puede utilizar lneas celulares alognicas en aquellos casos en los que el rgano o tejido de inters no puede ser extrado con facilidad o que ofrece dificultada in vitro. MTODOS DE TRANSFERENCIA GNICA IN VITRO Mtodos no virales Qumicos: Fosfato clcico. Fsicos: Electroporacin, Microinyeccin, Bombardeo de partculas Fusin: Complejos ADN-liposomas Endocitosis mediada por receptor: Complejos ADN-protena, Complejos ADN-

cpsida/ envoltura viral , Inmunoliposomas/liposomas destinados. Mtodos virales Adenovirus Retrovirus Virus Adeno-asociados Herpesvirus. 9.2 ESTRATEGIAS IN VIVO El tratamiento est basado en la administracin sistemtica de la construccin gnica de inters. Aunque el ADN puede ser administrado de forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algn vector que facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y localizacin intracelular del mismo, de tal forma que ste resulte en un gen funcionante. As mismo, es importante recurrir a vectores con destinos especficos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado rgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumticos o quirrgicos. MTODOS DE TRANSFERENCIA GNICA IN VIVO Mtodos no virales Inespecficos ADN desnudo Complejos ADN-liposomas Especficos Mediados por receptor Complejos ADN-protena Inmunoliposomas/liposomas destinados Mtodos virales Adenovirus Retrovirus Virus Adeno-asociados Herpesvirus 9.3 TERAPIA GNICA IN VIVO O IN VITRO ? La decisin sobre si se debe llevar a cabo in vitro o in vivo la transferencia de genes depende de un gran nmero de factores, incluyendo los rasgos fisiolgicos del tejido diana daado, la naturaleza del tejido con respecto a los genes que deben ser transferidos, la facilidad para transferir los genes dentro de las clulas, la habilidad para llegar hasta ese tejido diana, su respuesta frente al mtodo de transfeccin, etc. As, el hecho de elegir un tipo de estrategia u otra es resultado de extensos y laboriosos estudios para cada tipo de trastorno. De modo que no hay un patrn generalizado para cada enfermedad , y por tanto los investigadores se encuentran cada vez, con ms obstculos que resolver a la hora de llevar a cabo el ensayo. Por otra parte, algunos resultados, in vitro dan esperanzas sobre su aplicacin in vivo, pero sin embargo los datos obtenidos de experiencias in vivo rozan en la mayora de los casos el duro y desolador fracaso. Lo cual dificulta an ms si cabe las aplicaciones y desarrollo de tcnicas en la terapia gnica. 9.4 OTRAS ESTRATEGIAS UTILIZANDO CIDOS NUCLEICOS Como ya hemos visto la terapia gnica supone la manipulacin de las clulas utilizando procedimientos destinados tanto a reparar e incorporar nuevos genes en

la clula como tambin a bloquear e inhibir la sobreexpresin de los mismos con fines teraputicos. OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO Los oligonucletidos son secuencias cortas de cidos nucleicos diseados para unirse a secuencias especficas de ADN (formacin de ADN triplex) o ARN (formacin de heteroduplex ARN-ADN). Los oligonucletidos antisentido son complementarios de secuencias especficas de un determinado ARN mensajero (secuencia sentido) . La formacin de un heteroduplex bicatenario sentidoantisentido bloquea la traduccin del mensaje gentico a protena. Las estrategias antisentido tienen un gran potencial teraputico para inhibir la expresin de genes en patologas tales como el cncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas como el SIDA. Sin embargo, su utilizacin en clnica se ha visto limitada por su corta vida media en la circulacin sistemtica y su dificultad para acceder con actividad funcional al citoplasma y/o ncleo celular. Ms adelante en el apartado sobre aplicaciones sobre el cncer se explicar este tipo de estrategia con mayor profundidad. REPARACIN GNICA MEDIANTE OLIGONUCLETIDOS Es una estrategia destinada a reparar genes cuya alteracin es originada por una mutacin puntual conocida y el objetivo es activar selectivamente los mecanismos celulares de reparacin del ADN, el el lugar de la mutacin. Para ello se disean oligonucletidos especficos para secuencias genmicas adyacentes al lugar de la mutacin, en cuyo extremo el oligonucletido lleva un agente capaz de lesionar el ADN , mediante la formacin de un enlace covalente con el nucletido responsable de la mutacin . La lesin selectiva del nucletido mutado, desencadena el proceso celular de reparacin del ADN que conduce a una normalizacin estructural y funcional del gen. RIBOZIMAS El trmino ribozima ha sido introducido para describir molculas de ARN con actividad enzimtica. Se ha identificado una enorme variedad de motivos catalticos de ribozimas, todos los cuales catalizan reacciones en sustratos de ARN.Estas reacciones llevan a cabo la rotura y ligacin de las cadenas en sitiosespecficos. Una caracterstica comn para todos los ribozimas es el requerimiento del in de un metal con carga divalente, como el magnesio Mg+2 , que participa en la reaccin qumica. Diferentes centros catalticos de ribozima han sido incorporados en ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad de aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos centros cortndolos en sitios especficos. La actividad del centro cataltico de ribozima da el corte y destruccin del ARN diana. Aparejando el ribozima con el sustrato necesitara poco tiempo para cortar el ADN diana, inactivndolo funcionalmente. Una vez que la diana ha sido cortada, el ribozima puede disociarse de los productos cortados y repetir el ciclo de unin , rotura y disociacin. La habilidad de los ribozimas para cortar dianas y despus reciclarlas proporciona una ventaja sobre los ARN antisentido estandar; as acta estequiomtricamente, y no destruye la funcin del ARN diana. Los ribozimas pueden ser producidos qumica, bioqumicao biolgicamente, y algunas caractersticas de los oligodesoxinucletidos antisentido tales como modificaciones qumicas en la cadena o en las uniones entre nucletidos, pueden

ser incorporadas dentro de la molcula del ribozima sinttico, as aade estabilidada la molcula. La especificidad de apareamiento de bases, puede ser usada para dirigir los ribozimas a sus dianas, de ese modo se sugiri desde etapas muy tempranas en el conocimiento de los ribozimas que estas molculas nicas podran ser creadas por ingeniera para reconocero aparearse con bases del ARN diana de cualquier clula o virus. Aunque se han hecho significativos progresos en la ingenieria de ribozimas, todava hay un montn de cosas que deben ser aprendidas en orden para optimizar la funcin del complejo de los ribozimas en el comportamiento intracelular. Hasta estos das, la mayora de experimentos intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con los ribozimas denominados "cabezamartillo" (hammerhead). De cualquier manera, otros motivos de ribozimas, tales como los llamados "horquilla" (hairpin), comparte mucho de los mismos requerimientos bsicos para maximizar la eficacia intracelular. As, la aplicacin con xito del ribozima "cabeza-martillo" debera proporcionar valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de ribozimas. La simplicidad del dominio cataltico de "cabeza-martillo" lo ha hecho popular en el diseo de ribozimas que actan en trans. Los requerimientos en el sitio de corte son relativamente simples, y virtualmente cualquier UX (donde X es U, C o A) pueden ser dianas, aunque la eficiencia de la reaccin de rotura vara entre diferentes combinaciones. Por otro lado una versin de ingeniera del ribozima "horquilla", tambin llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar mltiple variedad de dianas en trans. Aunque hay una serie de cambios en el sustrato para este tipo de ribozima. Entre stos, incluye una G obligatoria junto al sitio de rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en las combinacionesde secuencia gua-sustrato, lo que hace que tenga un potencial xito contra una amplia variedad de ARN diana. Estos ARNs catalticos son relativamente simples y pueden ser construidos para esconder secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un ARN deseado. Hay cinco reas de investigacin que podran llevar a un aumento en la eficacia intracelular de los ribozimas. Estos son: El reparto de ribozimas a clulas apropiadas. La eficiente expresin de los ribozimas en estas clulas. La co-localizacin de los ribozimas y el sustrato de ARN diana en el mismo compartimento. La especificidad de los ribozimas para reconocer y cortar slo la diana del sustrato de ARN. El aumento del reciclaje del sustrato mediado por los ribozimas. 1) Reparto de ribozimas El efectivo uso de ribozimas como agentes teraputicos depende de los mtodos ideados en el reparto de construcciones de genes de ribozimas para que de la expresin de los ribozimas en las clulas dianas apropiadas. El reparto se puede llevar a cabo por los diferentes mtodos que hemos visto. Hasta el da de hoy, el sistema ms explotado se hace usando vectores de retrovirus. Estos vectores pueden ser construidos para esconder entre la ARN

polimerasa II y III unidades de transcripcin para la expresin de ribozimas . De cualquier manera, la utilidad general de los vectores retrovricos en la terapia gnica basada en los ribozimas puede ser limitada por la baja eficiencia de transduccin en clulas primarias, debido a la integracin al azar del ADN viral y la frecuente silenciacin transcripcional de los genes codificados. Otro vector desarrollado para este reparto son los virus adenoasociados (AAV) los cuales tienen una elevada eficiencia de transduccin y la potencial integracin en una localizacin nica en un cromosoma. Los adenovirus por su parte no garantizan la integracin del vector viral. En mtodos virales sin embargo no dan el reparto de los genes de ribozimas ex vivo, lo cual dificulta un poco la manipulacin y el xito del sistema. 2) Estrategias de expresin de ribozimas La eleccin del contexto de la secuencia del promotor para la expresin intracelular de los transcritos de ribozimas, es uno de las decisiones ms importantes que necesitan ser hechas para una aplicacin intracelular con xito de ribozimas. Las mayores consideraciones son la eleccin de un sistema de expresin ( ejemplo, inducible, especfico del tejido o promotores constitutivos) , y los posibles efectos adversos o tiles de secuencias en cis- que se requieren para dar el "cap" en el ARN, la terminacin del transcrito y la exportacin desde el ncleo al citoplasma. De modo esquemtico presentaremos algunas de las ltimas innovaciones en este campo. a) Representa fusiones del represor (R) de la tetraciclina (TET) con el virus del herpes simple (HSV) y su transactivador VP16; las fusiones estn unidas a el operador de TET que est posicionado aguas arriba de un promotor basal. En ausencia de tetraciclina, el complejo se une a la regin operadora, activando la transcripcin. En presencia de tetraciclina, la transcripcin es "apagada" porque el represor interacta con el antibitico y no puede alargarse la unin a los operadores. UTR son regiones no trasladables. b) y c) representan promotores en cassette de la polimerasa III derivados de un ARNt. La ribozima reemplaza o parte del lazo del pseudouracilo por un aceptoraminoaclico (en b), est insertado dentro del anticodn del lazo (en c). En ambos casos, las cajas A yB estn insertadas intactas y son requeridas para la expresin; una hilera de 5 timinas (uracilos en ARN) terminan la transcripcin. d) muestra una representacin de un promotor para un ARN nuclear pequeo (ARNns) U6. Este es un promotor de polimerasa III similar a el del ARNt; de cualquier manera, los elementos de regulacin del promotor estn aguas arriba de la regin que codifica el "maduro" . La construccin de ribozima est posicionada inmediatamente despus de la seal para dar el "cap" (una pequea estructura en lazoy un corto tramo de nucletidos unidos o adyacentes) as una apropiada unin del cap al transcrito puede tener lugar. La terminacin de la transcripcin est sealizada por una regin de 5 timinas (uracilos en ARN). DSE representa potenciadores a larga distancia, y PSE es un elemento de secuencia prxima. El transcrito de la polimerasa II y del promotor U6 se les unen la caperuza, mientras que los ARNt transcrito no tienen. 3) Co-localizacin de ribozimas y ARNs diana

Las estrategias para potenciar la accesibilidad del ARN diana juntamente con la ribozima en un complejo compartimento intracelular es un aspecto intensamente estudiado por ser de inters en la optimizacin de la funcin intracelular de la ribozima. Las primeras investigaciones fueron llevadas a cabo por Sullenger y Cech , que demostraron que la co-localizacin de un ribozima con el ARN diana daba una mejora importante en la eficiencia de un ribozima "cabeza-martillo". En este experimento el ribozima y la diana estn co-localizados va vector retroviral. As el ribozima era slo efectivo cuando los ARNs eran co-empaquetados. Todava se conoce poco sobre los mecanismos que regulan las vas de movimiento de transcripcin a translacin para la mayora de los ARNs. Los transcritos nucleares estn procesados y migran a travs de vas especficas. No se puede pronosticar por tanto la ruta y la distribucin de los transcritos nucleares. As, hay numerosos ejemplos de ARNs que se localizan en regiones especficas del citoplasma. La estrategia de co-localizacin puede cojer la ventaja de varios eventos de procesamiento post-transcripcional que tienen lugar en el ncleo de la clula. La insercin de ribozimas que actan en trans- en ARNs que son dirigidos dentro del ncleo, pueden ser usados para concentrar ribozimas dentro del ncleo. La co-localizacin de ribozimas con ARNm en el ncleo puede ayudar a aumentar la posibilidad de la interaccin ribozima-diana antes de que la translacin ocurra en el citoplasma. Para muchas dianas, el mejor compartimento para la interaccin con un ribozima puede determinarse slo empricamente. Por lo tanto, es importante que diferentes estrategias se intenten en orden para determinar cual es la ms eficaz para un ribozima dado y combinacin de diana. 4) Reciclaje del sustrato por los ribozimas El apareamiento especfico de bases determina la sellecin de un ribozima para una diana. Como todas las secuencias de ribozimas tienen diferente potencial en las interacciones de apareamiento de bases, una acumulacin de datos de diferentes experimentos de ribozimas requeridos para una rigurosa valoracin de combinaciones ptimas en la composicin y longitud de las secuencias que aparean. A su vez, mutaciones en el sitio de rotura pueden afectar a la eficiencia del ribozima. Como conclusin, podemos decir que los ribozimas son ARNs catalticos que pueden actuar como una endoribonuclesa de secuencia especfica, para lo cual utilizan unas Secuencias Gua Internas (IGS) que le permiten unirse a secuencias complementarias (antisentido) de un determinado ARN. Mediante mutaciones del elemento IGS es posible cambiar la especificidad del ribozima hacia un ARN especfico conteniendo las secuencias complementarias a la nueva secuencia de la regin IGS. Se han aprobado ensayos clnicos utilizando ribozimas en pacientes con SIDA, con el fin de intentar degradar molculas especficas de ARN en las clulas infectadas con el VIH. 10. APLICACIONES DE LA TERAPIA GNICA EN HUMANOS Existe una gran esperanza para pacientes afectados que puedan ser tratados por terapia gnica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo por un gen normal. An as, los obstculos que supone la terapia gnica son muy importantes. Se necesita

mucha informacin sobre la patologa molecular de un desorden gentico, antes de que los investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la terapia gnica, y si es as, tambin habra que tener en cuenta diferentes asusntos sociales y icos. El gen en cuestin debe ser clonado y adems debe existir una manera segura de introducir el gen en las clulas. Los primeros experimentos en los que clulas tratadas genticamente o manipuladas, y fueron introducidas en pacientes humanos comenzaron en 1.989, y las primeras pruebas clnicas sobre terapia gnica, para las eficiencia de adenosin desaminasa, comenzaron el Septiembre de 1.990. A continuacin discuteremos las tcnicas de terapia gnica empleadas en las diferentes enfermedades humanas as como sus problemas y resultados. 10.1 FIBROSIS QUSTICA Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes humanos en clulas sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la expresin gnica, es decir, que el gen introducido sea estable. El gen para la fibrosis qustica (CF) era un objetivo importante para la terapia gnica. In vivo se haban descrito anormalidades en la conductancia en los canales de cloro, y una lnea celular CF- expresaba el mismo defecto. Esta lnea celular se utiliz en ensayos que intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la clula. Uno de los vectores que ms se han utilizado en la lucha contra la fibrosis qustica ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado en un vector retroviral. Las clulas CF- eran infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la clula con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418. Las clulas expresaban el gen CFTR. Los datos ms interesantes procedan de las medidas del grado de funcionamiento de los canales para el cloro. El flujo aninico de las clulas en respuesta a una estimulacin por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo aninico de las clulas CF- y de las clulas CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta rpidamente en clulas CF- con CFTR , pero en las clulas CF- el flujo permaneca bajo. Se utilizaron tcnicas electrofisiolgicas para determinar si la conductancia para el cloro influa en ese flujo aninico. Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban nicamente en las clulas CF- con CFTR. Significativamente, la respuesta de las clulas CF- con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia gnica para la fibrosis qustica , usando vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea posible. 10.2 FIBROBLASTOS DE LA PIEL USADOS EN TERAPIA GNICA Un tipo de clulas que sirve como vehculo para transferir genes son los fibroblastos de la piel. Estas clulas han sido usadas en pacientes afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales. Los fibroblastos se obtienen fcilmente

crecen bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las clulas de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que contena un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de enzima en las clulas infectadas alcanz el nivel de las clulas normales. En el caso de la deficiencia de adenosn desaminasa, los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA produca ms ADA que las clulas normales. Los investigadores calculan que se necesitan ms de 4x10e8 fibroblastos tratados genticamente para producir efecto teraputico en pacientes. Una cuestin importante sera conocer si los fibroblastos de la piel podran sintetizar y secretar gran cantidad de una protena que no es un producto normal de esa clula. Por ejemplo, podra un fibroblasto de la piel tratado genticamente ser usado para producir el factor IX en pacientes con hemofilia B? Los fibroblastos humanos son infectados in vitro por un vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un ADNc del factor IX dirigida por un promotor intensificador de un citomegalovirus. Por radioinmunoensayo sedetermin que estas clulas infectadas producan gran cantidad de factor IX. Este factor IX es completamente funcional e indistinguible del factor IX original del plasma. Como conclusin, los ltimos avances a la hora de perfeccionar las tcnicas tanto en el cultivo de clulas de la piel como de producir vectores estables y fiables para expresar e introducir informacin gentica en estas clulas, unidos a la relativa facilidad con que estos cultivos son transplantados , hacen suponer que,en aos venideros, la piel ser uno de los primeros y ms atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia gnica, contribuyendo as a la revolucin de los mtodos teraputicos que esta nueva disciplina, sin duda, introducir en la Medicina. 10.3 TERAPIA GNICA APLICADA A HEPATOCITOS Otro tejido diana para la terapia gnica es el hgado . Un gran nmero de enfermedades metablicas hereditarias afectan al hgado, y el transplante de hgado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas tcnicas se han desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos. Ejemplos de la utilizacin de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por terapia gnica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la lipoprotena de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son homozigticos para la mutacin del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque al corazn antes de los 20 aos. En este experimento los vectores retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan para infectar cultivos de hepatocitos. Se obtenan lneas celulares que eran capaces de degradar las lipoprotenas de baja densidad a un nivel ms o menos normal. Hasta ahora este experimento slo se ha utilizado en cultivos celulares , aunque es uno de los ms seguros a probar en individuos. Un experimento que se quiere hacer en humanos y que ahora slo se hace en ratones es transferir los genes alfa-1 antitripsina humanos (hAAT) y el gen betagalactosidasa de E. coli a hepatocitos. 10.4 LINFOCITOS MODIFICADOS GENTICAMENTE

Un sistema de entrega a clulas de melanomas malignos est siendo utilizada en experimentos clnicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores slidos y que pueden matar clulas tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-2),que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producan la regresin del melanoma. Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento en clulas humanas genticamente modificadas se utiliz un vector retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina. Antes de que los experimentos clnicos comenzaran, se ha visto que los TILs eran eficientes y establemente infectadas con un vector, que eran muy resistentes al G418 y de que la integracin retroviral no alteraba la caracterstica de crecimiento de las clulas. Cinco pacientes fueron tratados con estos TILs. Se le retir al tumor a cada paciente y los TILs se hicieron crecer en un cultivo con interleuquina-2 . Las clulas infectadas con un vector retroviral en los que los genes gag, pol y env fueron sustituidos por el gen para la resistencia a la neomicina. El porcentaje de las clulas en las que el neogn se haba integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes recibieron al menos 10e11 TILs que procedan de sus propios tumores. Muestras de sangre tomadas en das siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio que los TILs modificados genticamente que contenan el neogn estaban presentes en tres pacientes. Sesenta das despus slo se detectaba en dos pacientes. An as, se encontraron clulas que contenan el neogn en muestras de tejido tumoral, pero no est claro si estas clulas tomaron este neogn por suerte o por transferencia de un vector. La conclusin que se sac, es que los TILs son tiles para tratar clulas tumorales, pero todava no se ha comprobado el rendimiento que puede sacarse de esta facultad ya que los resusltados son contradictorios segn diferentes pruebas. 10.5 UTILIZACIN DE CLULAS HEMATOPOYTICAS EN LA EXPRESIN DE CLULAS EN ANIMALES De la misma manera que el retrovirus acta como un vector para transportar un gen a una clula, la clula puede ser considerada como un vector en el siguiente paso del proceso, que es transportar el gen al cuerpo del paciente. Qu requisitos deben cumplir estas clulas? Deben ser fciles de obtener, crecer bien en cultivo y de soportar la infeccin retroviral. Despus de la infeccin, la clula vector debera ser fcil de devolver al paciente y debera continuar viva por varios meses, preferentemente por el bien del paciente.Las clulas de la mdula poseen algunas de estas caractersticas. La mdula contiene clulas stem que pueden dar lugar a todas las clulas de la serie hematopoytica. La infeccin de estas clulas stem hace que aparezcan diversas que contengan el gen teraputico. Tambin se han utilizado las clulas de la mdula para tratar enfermedades hematopoyticas, en otras palabras, las tcnicas para reconstruir la mdula de los pacientes se est trabajando intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de usar clulas de la mdula como vectores celulares, es que tienen dificultad de producir altos niveles de expresin del gen introducido. En uno de los experimentos, el gen

intacto de la beta-globina humana con secuencias adyacentes en 3' y 5' son usadas en la cosntruccin de retrovirus. El retrovirus que lleva el gen de la betaglobina se inyectaba en las clulas de la mdula y posteriormente se vio que eritrocitos que procedan de estas clulas medulares llevaban beta-globina funcional. 10.6 DEFICIENCIA DE ADENOSIN DESAMINASA EN HUMANOS Se debe a un trastorno autosmico recesivo. Su deficiencia origina una disfuncin intensa en las clulas T y B , que provoca la muerte de los pacientes antes de los dos aos de edad por infeccin masiva. Se comenz a estudiar su tratamiento por terapia gnica en 1.990 para una mutacin en el gen adenosn desaminasa. Los nios aquejados de este mal eran incapaces de iniciar una respuesta inmunitaria ante las infecciones y estaban abocados a una vida muy limitada, ( "nios burbuja"). Sin una especial atencin moran irremediablemente. Dos nios de cuatro y nueve aos con deficiencia de ADA estn recibiendo terapia gnica. De los nios se aislan linfocitos T, a los que se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son devueltos a los pacientes. Los nios han estado recibiendo clulas con genes corregidos cada uno o dos meses durante un ao y estos nios mostraron mejoras clnicas significativas. Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decrecin del nmero de infecciones. El nio de menor edad, que ha sido tratado por ms tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy esperanzadores, y si la terapia gnica en clulas stem de la mdula avanza, no ser necesario un injerto continuo de clulas modificadas. Actualmente, el tratamiento preferido esel transplante de mdula sea de un donante HLA idntico, que puede producir una curacin completa aunque conlleva una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA idntico. La sustitucin enzimtica no consigue una restitucin completa y produce otros efectos txicos. Un tratamiento sustitutorio consiste en inyectar el enzima ADA combinada con polietilenglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad.Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante. Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya ms de cuatro aos ensayos clnicos de transferencia gnica de ADA hacia los linfocitos T perifricos, previamente tratados in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejora clnica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los ndices de la funcin inmunitaria. En opinin de algunos, ni en este pionero ensayo ni en otros existen evidencias inequvocas de que el tratamiento gentico ha producido beneficios teraputicos . Los riesgos de posible mutagnesis insertiva de genes relacionados con el cncer, despus de repetidas transferencias retorvirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clnicos en Italia y Pases Bajos. Segn sus autores, en uno de estos ltimos ensayos la transferencia gentica haba funcionado y se haba conseguido la reconstitucin inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo tambin inyecciones rutinarias de ADA sinttica, y estos tratamientos convencionales podran ser responsables en buena parte de su buena salud.

10.7 TRANSFERENCIA DE MIOBLASTOS USADA PARA TRATAR LA DISTROFIA MUSCULAR DUCHENE Los mioblastos son las clulas stem del msculo esqueltico. Durante el desarrollo, los mioblastos se fusionan para formar fibras musculares multinucleadas. Un pequeo nmero de mioblastos no se fusionan y forman clulas individuales, llamadas clulas satlite, que se situan entre las membranas de las fibras musculares y de la matriz extracelular que cubre las fibras musculares. Las clulas satlite poseen la habilidad de fusionarse con otras clulas satlite y fibras musculares para tomar parte en la regeneracin muscular. Los mioblastos se convierten as en las clulas vector ideal para transportar genes a las fibras musculares. Un obstculo en la terapia gnica de la DMD es que el gen y su ADNc son muy grandes. Esto se ha conseguido superar por la construccin con un ADNc completo para la distrofina, que se puede expresar en clulas. Dos ADNc bibliteca ( A y B ) fueron construidos en los cuales la reversotranscriptasa fue directamente a comenzar la sntesis de las primeras cadenas de ADN en dos puntos del ARN mensajero de la distrofina. Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers que hibridaban por la mitad (biblioteca A) o con el extremo 3' (biblioteca B) del ARN mensajero. Estos clones contenan 78Kb. del extremo 5' del gen y 8 Kb. fueron aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B respectivamente. Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a una porcin de un sitio de restriccin para dar un ADNc completo. Esto se clon en un vector SV40 y se transfect por electroporacin en clulas COS. Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se produca una molcula correcta de distrofina en las clulas COS, y estudios inmunofluorescentes demostraron que se localizaba en la membrana celular. Aunque estos experimentos demuestran que genes grandes como el de la distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero puede pasar mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener aplicaciones clnicas. 10.8 TERAPIA GNICA EN LA CURA DEL CNCER El diagnstico del cncer a nivel molecular permitir un pronstico ms preciso; pero an podemos llegar ms lejos utilizando una terapia gnica que tiene como finalidad la destruccin selectiva de la clula tumoral. La prdida del oncosupresor p53 puede ser corregida introduciendo una copia sana en la clula neoplsica; la sobreexpresin del oncogen k-ras tambin puede suprimirse introduciendo el gen k-ras antisentido que inactive su expresin o bloquee sus ARNs. Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un tumor ya que infectarn e insertarn su ADNc en clulas en divisin; los adenovirus, aunque no integren en el huesped pueden permanecer activos el tiempo suficiente para destruir el tumor. Tambin es posible introducir en el tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2) , que potencialmente protege de distintos tipos de cncer y de sus recidivas. Las inmunotoxinas son el resultado de acoplamiento de toxinas muy letales (como la diftrica o la ricina) a anticuerpos monoclonales especficos de carcinomas, constituyendo las denominadas bombas biolgicas, puesto que son como proyectiles letales dirigidos contra clulas tumorales. Por ltimo , la terapia gnica permite elaborar vacunas a partir de las propias clulas tumorales de un paciente por manipulacin ex vivo y reinsercin en el organismo de partida.

Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia gnica en el hombre, se puede considerar el cncer como el rea ms importante y de ms rpida expansin. SUSTITUCIN DE ONCOSUPRESORES DEFECTUOSOS POR INGENIERIA GENETICA Las propiedades neoplsicas de numerosos cultivos celulares pueden revertirse con frecuencia, al insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden ser rb, dcc o p53. Es muy posible que la introduccin de p53 en un tumor que carezca de la funcin de este gen, pueda restaurar la normalidad tisular. Se estn realizando ensayos clnicos en los que se depositan broncoscpicamente en las inmediaciones de un tumor de pulmn , retrovirus que llevan una copia intacta de p53. La eficacia de esta terapia se ver incrementada si en vez de hacer llegar al tumor un nico oncosupresor, se elaboraran "lotes gnicos" de varios oncogenes y oncosupresoresque simultneamente corrijan las alteraciones acumuladas en las clulas del tumor. Un nico vector que porte varios oncogenes/oncosupresores o una mezcla de vectores que contenga cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores son las dos modalidades con las que se especula en la actualidad. INHIBICIN MOLECULAR DE LA EXPRESIN DE ONCOGENES Tanto los tumores slidos como las leucemias y linfomas exhiben activacin mutacional o sobreexpresin de oncogenes u oncosupresores mutados ; la malignidad de las clulas podra desaparecer impidiendo la expresin de los oncogenes y oncosupresores por administracin de pequeos oligodesoxinucletidos complementarios a los ARNs mensajeros y ADNs correspondientes. Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de tratamiento difiere sustancialmente de las terapias genticas tradicionales. En la mayora de los tratamientos genticos, se suministran genes enteros y sanso para sustituir las verisones que faltan o que son defectuosas e incapaces de dirigir la sntesis de una protena necesaria. Los oligonucletidos no pueden producir protenas. Su virtud radica en la capacidad para bloquear la expresin de genes existentes. Los oligonucletidos antisentido son la primera de las nuevas medicinas genticas que han llegado a la etapa de ensayo clnico. De su potencialidad teraputica se sospech ya a principios de los 80, cuando se descubri que ciertos microbios, adems de fabricar ARNs mensajeros, tambin producan de forma natural ARN antisentido. La explicacin ms lgica para este comportamiento pareca ser que el organismo utilizaba las molculas antisentido como forma de regular la expresin gnica. Si el ARN antisentido se empareja con su molcula complementaria de ARN mensajero, cabe pensar que bloquear la maquinaria celular encargada de traducir en protenas la cadena con sentido. Las clulas vegetales y animales emplean a veces la estrategia antisentido para controlar la expresin gnica. Con la ayuda de las tcnicas del ADN recombinante crearon genes que producan versiones antisentido de ciertos ARN mensajeros seleccionados. Cuando se introducan esos genes en la clulas se comprobaba que, en efecto, ocasionalmente se consegua disminuir la produccin de la protena cifrada por la cadena de ARN que era blanco del antisentido. Los resultados sugeran la posibilidad de disear molculas antisentido que funcionasen a la manera de drogas e impidiesen selectivamente la traduccin. Sin

embargo, para utilizarlas como tales drogas, haba que enviarlas al interior de las clulas del cuerpo, y hacerlo de una forma fcil y eficaz. En la mayora de los casos, lo mejor sera administrar pequeos fragmentos de antisentido sintticos, en vez de genes enteros. La construccin del primer oligmero surgi en 1.978, reconoca el ARN mensajero del virus del sarcoma de Rous y disminua su replicacin en la clula lo que indicaba que haba bloqueado la produccin de protenas vricas. Dos consideraciones a la hora de fabricar un oligonucletido son: primero, los oligonucletidos sin modificar portan una carga negativa en la cadena del grupo fostato. Las molculas dotadas de carga suelen tener dificultades para atravesar las membranas celulares, que no estn cargadas. La mayora de los investigadores daban por supuesto que los oligmeros con muchas cargas seran incapaces de entrar eficazmente en las clulas. En segundo lugar, las clulas poseen numerosas enzimas que degradan el ADN forneo. Caba pensar entonces en una pronta degradacin de los oligmeros que consiguiesen entrar en las clulas. Para ello reemplazaron un tomo de oxgeno de cada grupo fosfato por un grupo metilo (-CH3 ). Convertan as los fosfatos cargados negativamente en unidades sin carga: los metilfosfonatos. De esa menera los oligonucletidos entraban mejor en las clulas y resistan el ataque enzimtico. Pero al eliminar las cargas, los oligmeros se volvan hidrofbicos y se hacan insolubles en soluciones acuosas, esta falta de solubilidad puede dificultar la produccin en masa. Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar un tomo de oxgeno de los grupos fosfato por un tomo de azufre cargado negativamente. Estos oligmeros fosfotiolados son conocidos como oligos S, que son solubles en agua, fciles de producir y reistentes a la degradacin enzimtica. Los oligonucletidos antisentido pueden bloquear la traduccin al menos de dos maneras. Obstaculizan la "lectura" normal del ARN con sentido. y, adems, al unirse al ARN mensajero estimulan a una enzima (ribonucleasa H) que corta, y por tanto destruye, al ARN mensajero que participa en la unin. Los oligonucletidos son muy caros y la estabilidad de los compuestos debe mejorarse. Habr que elaborar mtodos ms idneos para introducirlos en las clulas en las cantidades adecuadas. Una nueva estrategia gentica est basada en los llamados trplices, que son oligonucletidos sintticos que actan igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda se acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la forma B del ADN. Hoy sabemos que los oligonucletidos suelen unirse a una de las cadenas de la doble hlice, y slo a las bases pricas de esa cadena mediante uniones de tipo Hoogsteen. As, los oligonucletidos son capaces de unirse a la regin de control del gen diana, para impedir que los factores de transcripcin iniciasen dicho proceso. Hasta el momento in vitro, han tenido xito oligonucletidos contra ras, p53, myc, myb, bcr-abl, bcl-2 y contra el factor de crecimiento semejante a la insulina. Se encuentran el fase clnica la utilizacin de oligonucletidos contra el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En la fase preclnica, se introdujeron in vitro molculas de ARN antisentido en clulas tumorales procedentes de un

glioblastoma de rata, estas clulas se inyectaron en ratas genticamente idnticas con tumores cerebrales. Los tumores desaparecieron incluso en ratas con tumores extendidos a otras partesdel cuerpo. Las clulas introducidas desencadenaron una respuesta inmunolgica estimulando clulas T citotxicas que erradicaron el tumor o los tumores a la vez que protegieron al organismo de la aparicin de nuevos microtumortes. En las pruebas clnicas, son clulas del propio paciente las que se modifican ex vivo con la introduccin del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en vez de ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque los hbridos ARN-ARN son ms estables que los ADN-ARN. La inhibicin de la expresin del oncogen ras se puede conseguir in vitro con la insercin en la clulas tumorales de genes que transcriban un ARN mensajero antisentido, complementario al ARN mensajero normal del oncogen ras. Estos antigenes eliminan especficamente la produccin del producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por hibridar con l , impidiendo as que sean sustrato de traduccin por los ribosomas celulares. El mayor problema de esta terapia gnica es asegurarse de que todas las clulas tumorales reciben el oligonucletido antisentido, ya que cualquiera que escape tendr una ventaja proliferativa sobre las otras y prevalecer induciendo de nuevo el tumor. El segundo mtodo de bloqueo del oncogn ras acta a nivel de protena. La protena Ras ocupa una posicin importantsima en la transmisin deseales para que la clula responda a los factores de crecimiento. Las mutaciones Ras producen una transmisin continua de seales de proliferacin independientemente de la presencia de los factores estimulantes. Tanto la protena Ras normal como la mutada precisan de una transformacin o maduracin que las convierta en protenas biolgicamente activas y esta modificacin consiste en una farnesilacin, es decir, la adquisicin de un grupo farnesil que permitir a la protena anclarse en su lugar habitual de la membrana celular, desde donde transmite la seal de proliferacin. La farnesil transferasa es la enzima que normalmente facilita el grupo farnesil; as, inhibidores de la enzima impedirn que Ras adquiera su forma biolgicamente activa. El compuesto CBBX ( cistena, 2 Benzodiacepinas y un aminocido variable) es muy buen inhibidor de la farnesil transferasa y parece incuo para las clulas. Clulas transformadas en cancerosas por haberles introducido un gen ras mutado, se incuvaron en presencia del compuesto CBBX, impidindose de modo muy eficiente la farnesilacin y observndose un crecimiento tpico de clulas normales no cancerosas. La inhibicin no ha de ser total puesto que las clulas necesitan una cierta cantidad de Ras para funcionar correctamente; adems hay otras protenass que han de farnesilarse para adquirir su capacidad funcional. Es necesario controlar muy bien las dosis para que se inhiba la enzima lo suficiente para impedir un crecimiento incontrolado, pero permitiendo el resto de las funciones de la clula. La inhibicin de oncogenes en clulas tumorales in vitro es un requisito imprescindible para su utilizacin in vivo. En animales de experimentacin (ratas) estas tcnicas han logrado la desaparicin de tumores experimentales sin aparicin de recidivas o secuelas de otro tipo. INSERCIN TUMORAL DE VECTORES SUICIDAS: EXPRESIN CONSTITUTIVA O SELECTIVA

Los vectores suicidas que se emplean para erradicar tumores son preferentemente retrovirus defectivos en los que los genes propios del virus ( gag, pol y env) han sido sustituidos por un gen de seleccin (neo) y por otro gen capaz de inducir su propia muerte. Un ejemplo de gen suicida es el gen de la timidina quinasa (tk) del Herpes simplex (HS), que al expresarse en la clula tumoral confiere sensibilidad al antibitico antiherptico ganciclovir. La quinasa del Herpes no es tan estricta como su homloga celular y fosforila anlogos de la guanina (ganciclovir o aciclovir), que pueden as ser insertados e incorporados en la molcula del ADN paralizando la replicacin y provocando la muerte celular. Solamente aquellas clulas que hayan adquirido la quinasa del Herpes incorporarn clulas en divisin, caracterstica diferencial de las cluas tumorales que se desarrollan en tejidos especializados, las cuales normalmente ya no se dividen. El cerebro adulto es uno de los rganos en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. El sistema se ha puesto a punto en la rata, donde pueden ser inducidos tumores cerebrales malignos por inyeccin directa de clulas neoplsicas. Los retrovirus portadores del gen tk del HS se introdujeron en las clulas murinas empaquetadoras que poseen en su genoma un retrovirus defectivo. Este retrovirus defectivo es poseedor de los genes que se eliminaron del retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ), pero carece de una regin imprescindible para el empaquetamiento de la partcula; estas clula murinas se convierten entonces en fbricas de retrovirus teraputicos y se denominan clulas productoras. La introduccin en el seno de un tumor cerebral de clulas productoras origina un gran nmero de retrovirus que infectarn lgicamente las clulas prximas del tumor. Al cabo de unos das, en los que cada vez ms clulas tumorales adquieren el retrovirus teraputico, se inicia el tratamiento de la rata con el ganciclovir, que , efectivamente es capaz de provocar el suicidio de todas las clulas tumorales . En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales malignos por terapia gnica con retrovirus portadores del gen tk del Herpes, se encuentra en la actualidad en fase de ensayos clnicos; el tratamiento del enfermo con ganciclovir produce en algunos casos la disminucin del tumor tratado. Tratamientos similares se estn aplicando tambin a otros tipos de tumores, como melanomas cutneos o cnceres de ovario. Una variante ms versatil y selectiva se podra conseguir aadiendo al gen suicida un promotor de clulas tumorales. Se conocen algunos genes que se expresan preferentemente en determinados tumores, en muchos de estos casos se han aislados los promotores y se han acoplado enzimas que confieren un efecto suicida. Un promotor especfico de un tipo de tumores impedira que la enzima suicida se expresara en cualquier otra clula distinta a la neoplsica, aunque pudiera ser infectada por el retrovirus teraputico por encontrarse en fase proliferativa. Se prevee su suso clnico en un futuro prximo para hepatomas, melanomas, cnceres de mama y cnceres de pncreas. INMUNOTOXINAS PARA COMBATIR EL CNCER Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales surgi la idea de elaborar inmunotoxinas para el tratamiento del cncer acoplando anticuerpos tumorales

especficos a toxinas mortales. Estas inmunotoxinas se uniran y mataran clulas neoplsicas. Se les denomin bombas biolgicas o balas mgicas, ya que funcionan como proyectiles dirigidos para hacer blanco en clulas cancerosas. Problemas de toxicidad en las aplicaciones teraputicas pusieron de relieve que simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se curara el cncer. Aunque no se han resuelto todos los problemas originales,se puede decir que las inmunotoxinas actuales estn muy mejoradas y ya se estn realizando ensayos clnicos que permitiran muy pronto evaluar el alcance de esta tecnologa en la cura del cncer. Para eliminar un cncer humano todas las clulas neoplsicas deben quedar expuestas a suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su destruccin sin causar daos adicionalesen las clulas normales. Esto requiere una alta especificidad, estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la clula diana y efecto celular letal. La estructura de la inmunotoxina empez siendo la inmunoglobulina G (Ig G) completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en el interior de la clula el puente disulfuro se reduce liberando la toxina. Un paso adelante lo constituy la sustitucin de toda la molcula de Ig G por una parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas, como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos heterodmeros (Fab')2 y Fab' unidos entre s por puentes disulfuro. Cada dmero est formado por una cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente disulfuro por la parte constante. Los frgamentos Fab' se pueden unir directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados como consecuencia de la reduccin de (Fab')2. La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera es su menor tamao, lo cual facilita notablemente la penetracin en la clula. Los conjugados toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniera gentica fusionando a nivel de ADN las regiones que codifican por cada parte, o bien por medio de un enlace qumico que una las dos partes in vitro. Las partes variables de Fab', unidas por un puente disulfuro y que constituyen las Fv-Tx. Slo se pueden obtener por ingeniera gentica fusionando a nivel de ADN las regiones codificantes correspondientes, pero son algo inestables. La inclusin de un pptido de conexin estabilizador en las molculas recombinantes (Fv csTx) ha solucionado este problema. La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son ms especficos que los polivalentes, por estar dirigidos contra una pequea parte especfica de la protena (epitopo) y no contra su totalidad. Los anticuerpos deberan estar dirigidos contra las partes especficas de las protenas que estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los anticuerpos autnticamente especficos de carcinomas deberan reconocer las formas mutadas de las molculas que controlan el crecimiento celular pero en sus versiones normales. En la mayora de los casos no se consigue una especificidad tan precisa y la mejor aproximacin son los anticuerpos cuasi-especficos que reaccionan con antgenos que se expresan predominantemente en determinados carcinomas y muy poco en las clulas normales. Otros requisitos para que la inmunotoxina sea eficiente son : que el antgeno est en la superficie de la clula , de ah que se utilicen receptores o carbohidratos de membrana;

que el complejo antgeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma celular por endocitosis, y que se libere la toxina mortal por reduccin de los puentes disulfuro que la unen con la mitad inmunolgica. Las toxinas que ms se utilizan son la ricina, la toxina diftrica y la exotoxina de Pseudomonas. Las tres matan la clula inhibiendo la snteis de protenas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes, necesitndose muy pocas molculas para inactivar todos los ribosomas celulares. Sus genes han sido clonados, caracterizados y parcialmente alterados para mejorar sus propiedades txicas. El mayor inconveniente de las toxinas es que pueden reaccionar indiscriminadamente con cualquier clula causando toxicidad inespecfica. Se han conseguido delecciones gnicas que eliminan una pequea regin de ADN responsable de la interaccin toxina-clula; ello disminuye notablemente la toxicidad inespecfica evitando que toxinas conjugadas o aisladas, puedan causar la muerte de otros tipos celulares. El efecto antitumoral de la toxina es mucho ms rpido ( unos siete das ) que el desarrollo de una respuesta inmunolgica seria. An no disponemos de la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las clulas tumorales sin producir efectos ms o menos deletreos en el resto del organismo. La causa principal de estos decepcionantes resultados es que las inmunotoxinas no llegan realmente a todas las clulas tumorales, particularmente en los tumores slidos. Los motivos de esta inaccesibilidad son varios: poca vascularizacin del tumor, una gran presin del fluido intersticial en los ndulos tumorales, presencia de membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y ocultamiento de los posibles antgenos antitumorales que deberan exhibirse en las membranas de las clulas neoplsicas. Todo esto contribuye a que la efectividad de las inmunotoxinas no haya alcanzado an las espectativas esperadas. INCREMENTO DE LA INMUNOGENICIDAD TUMORAL Y VACUNAS CONTRA EL CNCER Ciertas molculas producidas en la clula tumoral pueden convertirse en antgenos de rechazo. Las clulas tumorales producen al menos dos tipos de antgenos que pueden ser reconocidos por las clulas T citotxicas: Los productos de los oncogenes, es decir, protenas aberrantes distintas a las originadas por los protooncogenes y exclusivas de clulas tumorales. Antgenos tumorales formados por los productos de genes embrionarios que no se expresan en las clulas normales de adultos. Claramente la habilidad para crear respuestas contra antgenos propios especficos de tejido puede ser de gran utilidad para el tratamiento de cnceres derivados de rganos no esenciales como la prstata, pero por otra parte los antgenos especficos de tejido pueden crear problemas de autoinmunidad, que deben ser superados. Recientemente se han utilizado vacunas trumorales para el tratamiento de pacientes con tumores slidos. Las estrategias empleadas han sido variadas y los resultados inconsistentes. Sistemticamente clulas tumorales irradiadas se mezclaban con diversos coadyuvantes, como el bacilo de Calmette-Guern, para estimular la respuesta inmunolgica. La inclusin de coadyuvantes no pareci incrementar la accin mediada por las clulas T, pero en algunos casos las clulas

tumorales irradiadas mostraron un rechazo inmunolgico. Desgraciadamente, en la mayora de los casos la magnitud de la respuesta fue pequea, y no se consigui erradicar tumores ya establecidos. PERSPECTIVAS DE LA TERAPIA GNICA Y MOLECULAR Todos los tratamientos de terapia gnica que se han descrito estn ms indicados para cnceres de tipo metasttico que primario; dado que an hoy no se conoce el alcance de la curacin, es preferible que los pacientes hayan agotado otros mtodos de curacin y que los riesgos de la terapia gnica sean menores de los derivados de la evolucin de la propia enfermedad. Hay muchos problemas pendientes : cmo transferir de manera estable y eficiente a tumores in vivo; cmo evitar los riesgos de infeccin vrica en pacientes y operadores; cmo generalizar los tratamientos de terapia gnica,... La eficiencia de toda esta tecnologa en la cura de una de las mayores "plagas" de nuestra sociedad es an nfima para el numero de trastornos que se ocasionan y a su especial rpidez y avance de la enfermedad. La solucin por tanto no es enfocar la respuesta a un nico tratamiento teraputico, sino combinar con diferentes tcnicas (quimioterapia, radioterapia, tratamientos farmacolgicos de ltima generacin, terapia gnica,....) las habilidades de stos, y preparar mediante estudios detallados y especficos la mejor respuesta al caso. As, que an hoy tras decadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y aunque estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe preguntarnos si ser la respuesta definitiva a tanto tiempo de espera y en muchos casos de impotencia y resignacin. 10.9 TERAPIA GNICA EN INFECCIN POR HIV. La terapia gnica para el HIV est destinada a realizar muchos propsitos. Los propsitos son proteger clulas no infectadas residuales y eliminar clulas infectadas. Pero lo que ms se intenta es reducir la infeccin en personas infectadas y evitar la expansin del virus a travs de la poblacin. Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a travs de estos esquemas: OBJETIVOS POTENCIALES DE LA TERAPIA GNICA PARA INFECCIN POR EL HIV La mayora de los procesos del ciclo viral tiene puntos vulnerables que pueden ser desvaratados con mtodos genticos. Algunos aspectos como son la transcripcin y translacin son llevadas a cabo por la maquinaria de la clula hospedadora es probable que la inhibicin siginificativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos especficos del virus son utilizados como puntos de arranque: la entrada en la clula, la transcripcin inversa, o la integrcin. La interaccin entre los ARN tat y rev con protenas es un punto claramente vulnerable al igual que el empaquetamiento del ARN genmico. INMUNIZACIN POR PROTENAS DEL HIV La expesin in vivo de una protena viral puede ser utilizada como una vacuna gentica para atacar al virus. Usando sistemas con virus influenza en modelos animales han demostrado la eficacia de esta vacuna gentica, en la cual una inyeccin directa de ADN plasmdico puro que codifica protenas virales lleva a una expresin persistente de los genes virales. En infeccin por HIV es importante conservar regiones del virus genmico como inmunognico porque el virus posee gran habilidad de mutacin y de evitar

respuestas neutralizantes. se ha visto que en pacientes con SIDA que la evasin de la respuesta inmune contra epitopos especficos de las clulas T citotxicas pueden ocurrir incluso en porciones relativamente conservadas del HIV, como es el gag. La entrega de genes virales junto a genes que codifcan molculas inmunoestimulatorias, como la molcula B7/BB1, es otro desarrollo potencial. El pg160, protena precursora de la envuelta expresada en clulas singnicas, est siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias humoralesy celulares en ratones. Una vez que clulas que desarrollan la inmunidad expresan la protena inmunognica probablemente sern destruidas por contener un virus transcipcionalmente activo. La gran proporcin de clulas infectadas albergando un virus latente persistir y proveer un pozo del que emergern mutantes capaces de evitar la respuesta inmunitaria. Es por esto por lo que la inmunizacin con protenas del HIV sigue siendo muy difcil por no decir casi imposible, al menos con la tecnologa actual. Adems hay que sumar el hecho de que es un virus con una elevada tasa de mutacin, con lo cual la creacin de inmunidad para un tipo de producto gnico puede verse intil si el virus cambia por mutacin. INHIBICIN MEDIADA POR INTERFERN ADNs copia de interferones han sido clonados e insertados en vectores para su expresin constitutiva o inducible en clulas diana. El tratamiento con interfern induce algunas protenas celulares una de las cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interacta con la estructura en bucle del ARN que codifica rev y puede inhibir la expresin de protenas gag-rev dependientes. DESTRUCCIN AUTOLTICA DE CLULAS INFECTADAS Se han desarrollado varias estrategias para que clulas infectadas por HIV se autodestruyan. La subunidad A de la toxina diftrica (DT-A) est codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen suicida inducible. Slo una pequea molcula de DT-A puede ser suficiente para matar a una clula. Otros genes letales que se usan incluyen a la timidina quinasa de HSV (tk) , que es incua al menos que en el medio haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de estos compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como ya dijimos en su aplicacin en el cncer ), la clula muere. Otros resultados prometedores se han obtenido usando in vitro la toxina quimrica CD4 de Pseudomonas que mata clulas que producen el pg120 del virus. Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside en la interaccin tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor muy promscuo , que es activado por un gran nmero de protenas adems de tat, incluyendo factores transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un control limitado de la expresin del gen suicida inducible por tat, y la destruccin de la clula puede ocurrir bajo otras circunstancias que no sean la infeccin por HIV. INTERFERENCIA DIRECTA CON PROCESOS VIRALES La interferencia en la replicacin viral se puede hacer por interrupcin de procesos virales como son la entrada en la clula, o ms fcilmente, en la salida, aqu el ADN del provirus no es un objetivo prctico. Para aumentar la posibilidad de inhibicin antes de la integracin del HIV probablemente se necesite la produccin constitutiva de genes antivirales.

- La interferencia se puede realizar por varios mtodos . Uno de ellos es la modificacin de la molcula CD4. Bloqueando la molcula CD4 para que el pg120 viral no pueda adsorberse sobre l es una proposicin esperanzadora. In vitro se ha visto tambin que clulas mutantes para el CD4 no reconocen la glicoprotena de la envoltura del HIV por lo que son resistentes ante la infeccin del virus. Otra manera sera inyectar grandes cantidades de CD4 en la sangre, pero se ha visto que la dosis requeridapara que sea detectable en el plasma, es ms alta de lo esperada. Otros se realizan utilizando terapia basada en nucletidos, de los que hay tres clases de ARN antivirales y que son: el ARN antisentido, los ribozimas y el ARN decodificante. - El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado por un vector AAV, y produce una reduccin superior al 90% de las replicacin del HIV. Estas molculas antisentido necesitan estar presentes en ms nmero que su secuencia diana, lo que dificulta su produccin y eficacia. - Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran despus de cada interaccin cataltica no se requieren en gran cantida. Los ribozimas anti-HIV expresados establemente en clulas HeLa-CD4+ pueden inhibir la replicacin del HIV. Este mismo efecto se produce en blancos que posean la integrasa RT y las regiones tat y env. ESTRATEGIAS CENTRADAS EN PROTENAS Protenas mutantes pueden a veces interferir en la funciones normales. Esto se conoce como fenmeno transdominante negativo , en el que un pequeo nmero de protenas mutantes pueden interferir en los efectos de una gran cantidad de protenas normales. Las protenas ms utilizadas para este experimento son las protenas tat y rev. Tambin se ha visto que en mutantes dominantemente negativos de la protena de la envoltura puede inhibir la produccin de HIV, y mutantes dominantemente negativos en el dominio de unin a CD4 pueden reducir la cantidad de CD4 y disminuir la produccin del virin. SECUESTRO EN TRANS DE PROTENAS En teora se pueden secuestrar algunas protenas estructurales del virus. El secuestro de una envoltura viral por un CD4 que contiene una seal de retencin del retculo endoplasmtico, se ha podido ver en varios experimentos . Cadenas sencillas de anticuerpos se han desarrollado para secuestrar la protena de envoltura en el retculo endoplasmtico. La co-transfeccin de cadenas sencillas de anticuerpos especficos para pg120, tambin reduce los niveles de partculas HIV infecciosas, sin afectar al nivel de produccin de la protena gag. Estas metodologas son particularmente sensibles al acercamiento de la terapia gnica y parece probable que dentro de los prximos 5-10 aos una combinacin de terapias, incluyendo agentes farmacolgicos y agentes de terapia gnica, puedan ser usados en concierto para minimizar la propagacin del HIV dentro de un individuo afectado y de este modo prolongar su vida libre de enfermedad. Una vacuna basada en la terapia gnica es tambin una seria posibilidad. El HIV por si mismo puede paradjicamente llegar a ser una valiosa arma teraputica y la terapia gnica del SIDA puede llegar a ser el campo pionero para el desarrollo de acercamientos similares a otros agentes infeccionsos.

11. LA TERAPIA GNICA EN EL PLANO JURDICO El Derecho es un instrumento para configurar la actuacin social, y en particular el Derecho Penal debe estar atento a los avances sociales de cualquier tipo y mucho ms a los progresos tcnicos que sirven para mejorar el sistema de vida de los ciudadanos. Sin embargo, El Derecho reacciona de una forma ms lenta a las expectativas que se producen en la sociedad (avances tecnolgicos), esta falta de sincrona motiva que a veces existan vacios jurdicos que producen en la cuidadana una cierta sensacin de indefensin. Algunos avances tecnolgicos con fines meramente teraputicos esconden intereses menos loables como pueden ser el mejoramiento de la especie. Es aqu cuando el ordenamiento jurdico ha de intervenir regulando y protegiendo estos avances. A la hora de legislar hay que tener en cuenta: Las posibilidades actuales, futuras y futuribles de la ingeniera gentica. Los riesgos presentes, futuros y futuribles existentes en la manipulacin gentica. Los principios jurdicos que determinan los lmites de licitud de las intervenciones manipuladoras. Los sistemas de control y las tcnicas de reglamentacin de stos. El esfuerzo del legislador espaol en dar respuesta a estos interrogantes encuentra su plasmacin en la Ley del 28 de Diciembre de 1.988, la cual contiene las autorizaciones, prohibiciones y sanciones sobre la donacin y utilizacin de embriones y fetos humanos, o de sus clulas, tejidos u rganos con fines diagnsticos, teraputicos, de investigacin o experimentacin. En este punto encontramos a la doctrina dividida, pues distinguimos a un sector minoritario que afirma la suficiencia jurdica de esta Ley, y un sector mayoritario que considera la ya mencionada Ley como insuficiente, reclamando una tutela eficaz de estos bienes a nivel penal. Basndonos ya en el Cdigo Penal de 1.995, donde se recoge bajo la denominacin de "Delitos relativos a la Manipulacin Gentica" ( Ttulo V del Libro 2 ) desarrollado en los artculos 159 al 162 inclusive, podemos diferenciar dos bloques. Uno el ms directamente relacionado con la manipulacin gentica propia, y un segundo bloque ms distante del concepto de manipulacin al que afecta, de manera impropia o de ninguna manera. Por tanto nos centraremos en el primer bloque compuesto por el artculo 159, que protege la integridad de la especie y su normal desarrollo , y el artculo 161 que defiende la intangibilidad del patrimonio gentico humano en su apartado primero, y la identidad gentica de cada uno de los ciudadanos que integran la especie humana en su apartado nmero dos. En atencin a este bloque y por contraposicin es lgico afirmar que slo supone una limitacin a la manipulacin gentica, ya que acepta el inters teraputico de esta aplicacin. Artculo 159. Contempla dos hiptesis diferenciadas por la comisin subjetiva de la conducta: a) Tipo doloso. Referido al 159.1 del CP. Castiga la manipulacin gentica realizada de forma voluntaria conociendo de su ilicitud.

b) Tipo imprudente. Referido al 159.2 del CP. La diferencia con el 159.1 est en que la manipulacin es lcita (teraputica), sin embargo, va a ser castigada porque el manipulador infringe los ms elementales cuidados profesionales (actuando de manera temeraria). Artculo 161. Tenemos ahora dos partes diferenciadas: 161.1. Va a castigar la fecundacin del vulo que persigueun fin que no sea la procreacin humana. 161.2. Va a castigar la creacin de seres humanos idnticos por clonacin u otros procedimientos dirigidos a la seleccinde la raza. Referente a todo esto, el Parlamento Europeo aprob , el 16 de Marzo de 1.989, la Resolucin sobre los Problemas ticos y Jurdicos de la Manipulacin Gentica, que recomienda la prohibicin de los experimentos destinados a la investigacin de laclonacin en humanos, De igual forma se pronunci el Consejo de Europa. Adems del delito que supone la manipulacin gentica, el Cdigo Penal de 1.995 castiga, persigue y sanciona a los resultados originados por la manipulacin. Es el caso de los delitos de lesiones recogidos en el Libro 2, Ttulo III y IV centrado en : las lesionesstricto sensu , en persona , y lesiones producidas a nivel fetal (conocido jurdicamente como nasciturus = el que va a nacer ). De forma ms concreta y especfica mencionamos el articulado que recoge ambas ideas. Lesiones stricto sensu: Art. 147, art.148, art.149, art. 150, art.152. Lesiones al nasciturus: Art. 157, art.158. Como antecedentes al Cdigo Penal de 1.995 es importante destacar los artculos 420, 421 del Cdigo Penal de 1.973. En cuanto a la terapia gnica en la lnea germinal, nos remite a la Ley sobre Tcnicas de Reproduccin Asistida, que admite la terapia gnica (art. 1.3) en embriones y fetos en el tero nicamente si se cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de disponer de una lista de enfermedades en las que la teraputica sea posible desde criterios estrictamente cientficos. Dicha lista debe aprobarla el Gobierno de la nacin por Real Decreto (disposicin final 10,d) siempre que no se influya en los caracteres hereditarios no patolgicos ni se busque la selleccin de los individuos o la raza 8, art. 13.3c y d, resp.). 12. TERAPIA GNICA: PERSPECTIVAS FUTURAS Y CONSECUENCIAS 12.1 CUESTIONES ECONMICAS Datos econmicos indican que los costes de los primeros aos de transplantes cardiacos son unos 90.000$ por paciente (dolares de 1.983) en los EEUU, sera razonable preguntarse si la terapia gnica ser otra tecnologa cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de mdula sea, en la terapia gnica humana ser trabajada intensamente y supondra unos considerables costes iniciales. Pero an cuando nadie asigna un valor econ,mico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo ms seguro es que algn da la terapia gnica costar considerablemente menos que la hospitalizacin repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis qustica. En breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad gentica causado por el defecto en un gen, la terapia gnica se puede convertir en un mtodo de cura bastante costoso. En un futuro ms lejano, las perspectivas para la terapia gnica en humanos todava no estn claras . Pero si se rompiese el eslabn entre el transplante de mdula sea y la terapia gnica, sta se podra aplicar a un crculo de pacientes

ms extensos. Por ejemplo, si vectores especficos para un particular tipo de clula diana se pudiera desarrollar, la combinacin vectro/gen, quiz pueda ser administrada de forma intravenosa. Aeste nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina setars en el umbral de una nueva era para el tratamiento de ms de 3.000 desrdenes genticos que afecten a nuestra especie. 12.2 PERSPECTIVAS FUTURAS El rango potencial y la versatilidad de la terapia gnica han sido perfilados en puntos anteriores de este trabajo. esta es una nueva forma de intervencin teraputica a un nivel molecular, con aplicaciones en muchas reas del tratamiento mdico que engloba desde la correccin de un locus individual de un defecto gnico heredado por inmunizacin, tratamiento de enfermedades infecciosas hasta el cncer. Esta es tambin una nueva farmacologa. Mientras muchos frmacos corrientes persiguen modificar procesos endgenos por la aplicacin de novedosos, compuestos artificiales, la terapia gnica reparte un agente biolgicamente activo muy especfico a un sitio determinado y a la vez con la posibilidad de permanentes, transitorios o inducibles estadosde la expresin. Como un nuevo frmaco debe ser testado en el contexto de la herencia. La heredabilidad requiere dos funciones: primero, la transmisin de la informacin de generacin eln generacin, y segunda, la expresin de la herencia. Transmisin y expresin estn separadas a nivel molecular, y , en organismos multicelulares, a nivel celular. La determinacin celular va seguida por la diferenciacin en un estado temprano que separa irreversiblemente el linaje somtico de los portadores potenciales de informacin a la siguiente generacin: las clulas de la lnea germinal. La exprewsin del gen teraputico puede ser afectada transitoriamente por el uso de vectores que no se integran o por clulas diana con una vida biolgica limitada. Si, como es normal, la expresin es requerida a largo plazo, deberemos usar vectores que se integren o autoreplicativos. Estos son ms difciles de distribuir y controlar.El material gentico en un cromosoma est influido directamente por partes del genoma cercanas y distantes que actan en cis y trans. Esto no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con la transferencia gnica como prctica corriente es la expresin a largo plazo del gen transducido cuando la transferencia se produce en secuencias mnimamente contextuales. La familia del gen de la globina lo ilustra bastante bien. El control de la expresin depende de cuatro regiones distantes aguas arriba reconocidas por su hipersensibilidad ADNasa I y se les llam regiones para el control del locus (LCRs). An con estas regiones incluidas la transferencia del gen de la globina era imprescindible ya que se poda reorganizar de diferentes maneras. Cmo podemos solventar este problema? En principio se comenz a "limpiar" la construccin de motivos de interferencia extraos por esacaneo de las secuencias del vector que actuaban como seales cis, las cuales podran ser las responsables de las distintas formas de reorganizar, y se intent posteriormente eliminarlos sistemticamente por deleccin o por mutacin puntual dirigida. La sustitucin por un gen anormal o no funcional por recombinacin homloga es una segunda posibilidad, y tericamente, la forma ideal de terapia gnica. Hasta ahora esto se ha ido practicando sucesivamente en lneas celulares o en clulas stem embrionarias de animales. La confianza que nos proporciona los procesos

celulares endgenos para la recombinacin son insatisfactoriamente bajos. Sin embargo, desde hace aos se conocen enzimas que catalizan la escisin e insercin de material gentico por reconocimiento de una secuencia nucleotdica particular, esto es lo que se est usando en la transferencia de genes eucariticos. El sistema mejor conocido es el sistema cre/loxP de los bacterifagos. La enzima cre reconoce una secuencia oligonucleotdica particular y corta una pieza de material gentico existente entre dos deesas secuencias, y despus ligar los extremos del material gentico cortado. Las secuencias que cortan las enzimas se llaman loxP. Introduciendo sitios loxP se crean sitios de insercin y delecciones especficas en clulas stem embrionarias. Una tercera posibilidad es intentar transferir una unidad gentica grande que contenga el gen y todo la unidad llevar asociada regiones de control junto a genes accesorios en un formato autorreplicativo. A esto se le llama cromosoma artificial , y que nos supera las limitaciones en el tamao del ADN que puede ser transportado a base de vector. Esto se ha demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de levadura) para crear ratones transgnicos. Los cromosomas artificiales tambin evitan los problemas en el control del sitio de integracin del ADN exgeno. Los centrmeros y telmeros de levadura parece que no son funcionales en clulas de mamferos por lo que el objetivo ms corriente sera la produccin de vectores de cromosomas artificiales que lleven los centrmeros y telmeros que combinen la habilidad de transportar grandes piezas de ADN (varios cientos de kilobases), con la capacidad de segregacin com un cromosoma independiente en sincrona con el genoma del hospedador en la clula en divisin. Por ltimo,varios sistemas estn siendo explorados para el reparto de hormonas, factores de coagulacin, anticoagulantes, y otros agentes teraputicos. Cuando sus genes estn introducidos dentro de fibroblastos o clulas del endotelio vascular, sus productos pueden ser detectados en sangre durante diversos perodos de tiempo. Estudios recientes en ratones sugieren que mioblastos pueden ser particularmente ventajosos como clulas diana para el reparto de protenas recombinantes. Transferencia gnica in vitro seguida por el reinjerto de las clulas est siendo explorado para restaurar funciones de enfermedades crnicas del sistema nervioso. Si se consigue probar como efectivo tales tcnicas de implantacin combinadas con los genes transfectados podran ofrecer un nuevo camino de tratamiento para desrdenes crnicos tales como el Parkinson o la enfermedadad de Alzheimer. En otoo de 1.998, French Anderson uno de los pioneros de la terapia gnica propuso una solicitud de aprobacin de un protocolo para el estudio de la terapia gnica in utero. Anderson se propone tratar dos enfermedades genticas muy graves; la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un defecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial, el del enzima adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar el mtido en fetos portadores de estas anomalas genticas, cuyas madres hayan decidido abortar. Slo despus de la interrupcin del embarazo podrn los investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todava se necesitarn de dos a tres aos de trabajo

en vectores y de ensayos en el animal para que estos proyectos sean tcnicamente aceptables. Si la terapia gnica in utero se revela eficaz, el principal problema tico que, con el tiempo,suscitar este tipo de intervencin en el feto ser el riesgo de modificacin de las clulas del grupo germinal, precursoras de las clulas sexuales y, por tanto, del patrimonio gentico que se transmite a la descendencia. Ahora bien, la prohibicin de la terapia goza de consenso. El proyecto de convencin de biotica del Consejo de Europa, por ejemplo,excluye tal posibilidad. Incluso del RAC (Recombinant Advisory Committee), rgano del National Institutes of Health (NIH). 12.3 CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GNICA La modificacin del material gentico de una clula afecta tanto a la clula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que disea deliberadamente cambios genticos que son potencialmente propagables. Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genticas de la lnea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero, cules son estos riesgos? MUTAGNESIS Todas las integraciones cromosmicas, aparte de los cambios homlogos, poseen el potencial de alteracin de locis endgenos fortuitos y por lo tanto producir mutagnesis, que puede derivar en oncognesis. Si realizamos la terapia gnica en clulas somticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas clulas somticas a las futuras generaciones pero alteramos la lnea gentica del individuo. La intervencin directa en las clulas somticas difiere del tratamiento mdico convencional slo en que aqu hay una clara y directa conexin entre la terapia y la seleccin gentica. En el caso de sndromes causados por locis dominates el conjunto completo de genes est representado por los individuos afectados. Su xito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamao de este conjunto en la siguiente generacin. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la fecuencia del gen en la poblacin est mantenida por que ocurran nuevas mutaciones. En las enfermedades genticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el nmero de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se vern afectados) la influencia del xito de la terapia en la frecuencia gnica ser tambin mayor. La modificacin deliberada de la lnea germinal tendria efecto sobre la estructura de la poblacin slo por una transformacin gentica a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sera la introduccin de resistencia a una enfermedad patgena. Si slo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podri existir la posibilidad de un gran cambio gentico en la poblacin Sera la terapa gnica en la lnea germinal realmente necesaria? La terapia gnica somtica, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformacin gncia de la lnea germinal puede slo tener efectos sobre la descendencia an no nacida. Esto por lo tanto no afectar al paciente que eat siendo tratado. Con las posibilidades de investigacin de prenatales de la preimplantacin tanto como de la donacin de esperma y vulos y adopcin es muydifcil ver como la intervencin deliberada en

la lnea germinal puede ser ticamente justificable. No obstante esta idea ser ms profundizada en el siguiente apartado, sobre la tica en la terapia gnica. 13. EL NEGOCIO DE LA SALUD El hecho de que la terapia gnica sea una tecnologa minuciosa, con dificultades tcnicas, muy lenta y no menos potencial como arma teraputica en la cura de muchas enfermedades, hizo apostar desde el principio en este campo a la mayora de las empresas de biotecnologa y grandes grupos farmaceticos. Actualmente estas empresas invierten millones y millones de dolares en este mercado. En Marzo de 1.998, Transgne empez a cotizar en la bolsa de Estrasburgo. Su cotizacin simultnea en el Nasdaq y el Nouveau March (mercados burstiles norteamericano y francs, especializados en valores de alta tecnologa y de crecimiento), le permiti ganar 613 millones de francos (unos 15.000 millones de pesetas ). Fue a partir de los 90 cuando se produjo el alza en estas empresas cuando entraron bolsa llegando a ganar no menos de 174 millones de dlares ( unos 24.000 millones de pesetas ) entre 1.993 y 1.995. As , los grandes grupos farmaceticos empezaron su inversin en estas nuevas empresas llegando incluso a comprar compaias enteras o a fusionarlas. Por ejemplo, en 1.995 se compraron por 729 millones de dlares ( ms de 100.000 millones de pesetas ) cuatro sociedades de terapia gnica: Rhone-Poulenc adquiri Applied Inmune Sciences, Sandoz (que se fusionara ms adelante con Ciba para dar Novartis ) compr Genetic Therapy Inc. (GTI), Chiron (que posteriormente sera adquirida por Ciba y se integrara por lo tanto en Novartis) se hizo con Viagene y Schering Plough compr Canji. Pero tras el informe publicado por los Intitutos Nacionales de Salud (NIH) sobre los resultados sobrevalorados y la eficacia clnica de los protocolos se produjo una gran caida en bolsa de estos grupos. Salvo los grandes grupos farmaceticos que por su potencia financiera aguantaron el generalizado descalabro. La mayora de las empresas "pequeas" de terapia gnica no lograron ganar ms de 69 millones de dlares ( unos 10.000 millones de pesetas ) desde el final de 1.995 hasta la primavera de 1.998. Mientras empresas farmaceticas aprovechaban el bache de otros para invertir en 10 aos unos 800 millones de dlares (ms de 110.000 millones de pesetas ). Debido a que los productos de terapia gnica son el resultado de la unin del gen y un vector encargado de transportarlo (en la mayora de los casos), el objetivo de todas estas empresas era adquirir el dominio en estos dos componentes bajo objetivos de rentabilidad como factor comn. Aunque actualmente la terapia gnica no tiene una consistencia suficiente para determinar cul ser la tecnologa de transferencia que se impondr a las otras. Se supone que en el futuro no habr una tecnologadominate sino diferentes mtodos segn el tipo de patologas tratadas, el rgano implicado, y eventualmente las caractersticas del gen. Esto implica que las empresas no pueden invertir todos sus esfuerzos en una sola aplicacin, sino tomar o disponer de una base tecnolgica lo ms amplia posible. As por ejemplo, empresas como Transgne tienenacceso tanto a vectores virales y no virales. Haciendo ms incapi sobre estos ltimos, pues en palabras de Bernad Gilly, director de Transgne, " a largo plazo el futuro pertenece sin duda a

los vectores no virales, pero todava queda mucho trabajo por hacer antes de que sus rendimientos les permitan competir con las cualidades de los vectores virales". Adems, las empresas de terapia gnica tienen que acceder a los genes. Esto plantea un nuevo problema en este duro mercado, pues la mayora de los genes importantes estn patentados y su acceso o su licencia es sumamente costosa econmicamente. As las diferentes empresas han ido abrindose camino en el mundo de los acuerdos y licencias. Por ejemplo, Transgne tiene un acuerdo con Human Genome Sciences (HGS) una de las empresas con los mayores bancos de genmica funcional (estudio sistemtico de la funcin de genes descubiertos, adems de su estructura) . Este acuerdo le da a Transgne una licencia exclusiva para un nmero mximo de 10 genes seleccionados del banco de datos de la empresa norteamericana. As Transgne tiene acceso durante 10 aos por unos 4000 millones de pesetas, invertidos en forma de una participacin del 10% de su capital. Por otro lado Cell Genesys espera basar su poltica en la patente de los genes descubiertos por sus equipos y en adquirir licencias de los que han sido descubiertos en los laboratorios pblicos. Novartis por su parte accede a los bancos de Incyte, adems est invirtiendo 250 millones de dlares durante 10 aos en su propio centro de genmica funcional en La Jolla (California). En cuanto a la reglamentacin de los protocolos son diferentes segn sea en EEUU o en Europa, debido a que en Europa hay ms limitaciones y mayor grado de exigencia.Aqu la terapia gnica est encuadrada en dos directrices, una sobre el confinamiento y la otra sobre la diseminacin de Organismos Genticamente Manipulados (OGM). Actualmente en revisin por el Parlamento Europeo. En cuanto al confinamiento, la nueva versin parece que se orienta hacia una cierta simplificacin. Aunque esto depende mucho de los pases. Ms rigurosos en Blgica y Francia, por ejemplo, que en Gran Bretaa. Por lo que respecta a la diseminacin de OGM, su revisin europea parece preveer un reforzamiento de las restricciones a la utilizacin de productos de terapia gncia. No es por tanto casualidad que una aplastante mayora de pruebas clnicas se realicen en EEUU. Tanto ms cuando que en Europa, aunque el registro de los productos surgidos de las biotecnologas corresponde exclusivamente a la Agencia Europea del Medicamento, la reglamenteacin de pruebas clnicas se deja a cada estado, lo que no simplifica el proceso. Desde la ultima primavera se viene preparando en Europa una directiva con una reflexin especfica sobre la terapia gnica, que tendra que permitir una armonizacin. En un futuro las empresas de terapia gnica que logren un da comercializar sus productos no sern slo las que habrn sabido poner a punto los productos ms seguros, ofreciendo la mejor relacin calidad-precio, sino tambin las que habrn establecido la mejor estrategia de propiedad y patente. As, este derecho a patentes y a diversos trabajos e investigaciones garantizan tanto una batalla legal como una batalla contra el tiempo, por encontrar los mejores genes, vectores y tcnicas de transferencia. Lo que a menudo en vez de ser un incentibo a la hora de acortar la espera a nuevos descubrimientos, roza tintes mercantilistas y rastreros. Ya que si una empresa posee cierta informacin,

no es que sea reticente a compartirla, sino que en la mayora de los casos se niega a ninguna publicacin de su trabajo para por un lado, evitar plagios, y por otro sacar jugo econmicamente a su descubrimiento. No podemos entender como algo tan universal como es la salud personal, puede ser motivo para crear increbles fortunas y enrriquecimiento a unos pocos. De ah el ttulo del apartado, "el negocio de la salud", pues debajo de todo este montaje, de buscar soluciones a tantas enfermedades, se esconde el instinto egosta, materialista y podrido de ciertos grupos que se denominan "farmaceticos", que en vez de aportar ayuda lo que hacen es limitarla, entienden la salud como un privilegio ms que como un derecho. Cmo se puede jugar con la salud de la gente tan vilmente. No rechazamos que este tecnologa es cara y necesita de un personal y unas infraestructuras al alcance de muy pocas empresas, y que sus productos en la mayora de los casos, y tecnolgicamente hablando, son grandes obras de ingeniera gentica. Pero la razn para que estos productos que son la salvacin para tanta gente se vean retenidos y filtrados, dirigidos, y en la mayora de las veces concebidos, para gentes de clase alta capaces de costearlos, o en pases capaces de poder distribuirlos, roza los ms internos sentimientos de crueldad. Recordemos que para mucha gente es el vil metal lo que mueve el mundo, para ellos no hay gloria sin dinero. Sin irnos ms lejos, merece mencin el caso del Dr. Manuel Elkin Patarroyo que ha donado su vacuna sinttica contra la malaria a la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Sin beneficios, ni lucro, cuando podra haberla vendido por una gran cantidad a tantas empresas farmaceticas que le presionaban por la patente. Hechos como ste son los que refuerzan la idea de que el hombre tiene, a veces, en sus manos el poder para salvar vidas, y debemos aprender a repartirlo equitativa y solidariamente en beneficio de todos. 14. LA TICA EN LA TERAPIA GNICA Si analizamos el concepto de tica, nos encontramos con que es "la parte de la Filosofa que trata la moral y las obligaciones del hombre". Cabe preguntarnos qu cuestiones morales y obligaciones hacia el hombre surgen como resultado de la terapia gnica. Durante todo este trabajo hemos mantenido un tono meramente descriptivo de la tecnologa de la terapia , sin asomarnos a estas obligaciones y moral de la que hablbamos antes. La terapia sea gnica o no, surge para "readaptar", volver al individuo a un estado "normal", un estado saludable. As, lo primero que nos debe sugerir este comentario es que, el fin ltimo de la terapia gnica debe ser ayudar, reanudar en el individuo una vida normal en la que pueda seguir con un ritmo cotidiano al igual que lo llevaba antes de sufrir la enfermedad. Sigue as un principio Aristotlico sobre la bsqueda de la Felicidad.En este caso la Felicidad encarnada en el trmino de salud. Es la antigua lucha del hombre sobre las dificultades hacia su nivel de Felicidad, el interminable camino hacia un destino prspero. Pero no nos deviemos del enfoque inicial, por qu una tica? Cules son las obligaciones del hombre? Recordemos que en ese viaje, en ese caminar a "lomos" de la terapia gnica viajan valores menos puros, ms , si cabe decirlo, mundanos y oscuros. Es el riesgo de que no consigamos llegar a ayudar, sino esconder tras esta ayuda motivos crueles y perversos sobre acciones que moralmente son

despreciables. Lgicamente son estas ideas las que nos desvan de nuestro camino solidario. Son estos instintos internos, nuestra otra cara, la que lucha por vencer nuestra conciencia y tica y aduearse de nuestra voluntad. Pero quines o qu son esas voces profundas que tantas veces nos tientan? La terapia gnica es un instrumento muy poderoso para que sea utilizado con ideas distintas a las de su concepcin. Quin nos dice que al aplicar esta tecnologa no se "despertaran" alelos defectivos o deletreos? En un individuo hay multitud de genes reprimidos, algunos de ellos letales, encerrados como en una "caja de Pandora" esperando una oportunidad para librarse de su prisin. El riesgo de estos tratamientos est en su aplicacin a nivel gentico, con lo cual sin un control y especificidad adecuada podran despertar esos genes dormidos o librarles de su represin. Actuaran "devastando" reas de nuestro organismo, aduendose del control celular y finalmente acabando con la vida del individuo. As, quin nos dice que esto no ocurrir? Sabemos realmente si esto es slo una utopa? Del mismo modo, cabra preguntarnos, los nuevos productos de la terapia gnica tendran caractersticas antignicas? Esto quiere decir, que si una vez formada la nueva protena resultante del tratamiento, dara una reaccin inmunolgica en el individuo por autoinmunidad pudiendo llegar incluso a la muerte. Son suficientes los estudios previos para llegar a conclusiones que permitan determinar estos efectos o nos estamos precipitando? En el caso de vectores virales, ya sabemos que hemos eliminado su potencial infectivo y destinado a su servicio teraputico. Pero, estamos completamente seguros que no pueden reaparecer estas caractersticas? Estamos seguros que los tenemos perfectamente controlados? Si lo pensamos framente llegamos a ideas muy poco esperanzadoras. Creemos que el hombre con su tecnologa puede "domesticar" a organismos que tras varios millones de aos de evolucin han creado mecanismos de escape tan maravillosos y efectivos que cabe pensar en una suprema "inteligencia molecular" ? Un virus capaz de sobrepasar barreras, de luchar eficientemente en "guerra armamentstica" con su hospedador, en que la evolucin le ha dotado de mltiples mecanismos para superarse a s mismo, cmo la arrogancia del hombre llega hasta afirmar un control absoluto en una casi perfecta mquina de la naturaleza? En la famosa novela "Parque Jursico" hay una frase que desarrolla esta idea, " la vida siempre encuentra un camino". Estos virus forman parte de una unidad podramos llamarla, multifuncional, no importa que unos caigan, los que queden pueden mutar, recombinarse genticamente, ser seleccionados creando una nueva estirpe ms fuerte, ms efectiva, ms resistente. Podemos ganar una batalla, pero la guerra sigue, y sin embargo alardeamos de un control, de unas cadenas que en cualquier momento pueden ser rotas. Es el tan repetido hecho de dominacin por el hombre, pero ahora a nivel microscpico. An creemos que somos los reyes de la Creacin, que somos el ltimo peldao en la escalera de la Evolucin. Nuestra visin antropocntrica nos ciega en hechos que no tienen validez absoluta. Quizs los tengamos retenidos ahora, pero seguro que no por mucho tiempo. Pronto se librarn de sus "grilletes" y seguirn sus ciclos infectivos ,ahora alterados, pero con el mismo fin de siempre desde hace millones de aos, perpetuarse.

De otro lado, hemos dotado a la produccin de los tratamientos de un control, de una regulacin. Pero, son seales propias las que inducen su elaboracin? Su eficacia es constante? Son fiables? De nuevo nos topamos con una extensa rea sin descubrir, no conocemos mucho de la regulacin en eucariotas y sin embargo, podemos "jugar al mecano" dando construcciones que luego probamos para ver si da resultado. Y an as, quin nos dice que un resultado favorable no se deba a otro tipo de interacciones celulares? Qu resultado celular tendra esto? Basamos la eficacia en nuestra construccin, y sin embargo es completamente falso. Creemos que es una imprudencia el aplicar tratamientos que cabra denominarlos de "hipotticos", pues realmente desconocemos todas sus implicaciones. Y lo ms grave, quin nos dice que a largo plazo esto no pueda ocasionar mutagnesis o alterar otras funciones celulares o alteraciones en el ADN a gran escala? Seramos emisarios de la fatalidad al calificar como teraputico algo que ms tarde alterara la salud o incluso destinara irremediablemente a modificaciones, cncer o muerte a muchos pacientes, por el mero hecho de que no conocamos todas las respuestas a tantas preguntas. Esperemos que esto no pese en nuestras conciencias por ser cmplices sumisos y callados de un descalabro evolucional. Destacar tambin el riesgo en la terapia gnica en la lnea germinal. El hecho de que se produzca mutagnesis, recombinaciones u otros procesos en terapia gnica somtica no deja de ser, an despus del dao al paciente, un duro revs. Pero an as el dao est retenido en el individuo, no se expande. Caso contrario es la terapia en lnea germinal. Aqu cualquier modificacin del repertorio gentico se transmitir a las sucesivas generaciones. Estaremos modificando as la especie? Bajo nuestro punto de vista y an despus de los beneficios teraputicos no nos cabe otra respuesta y es que s. Los nuevos descendientes seran genticamente distintos a nosotros, y es aqu donde surgen multitud de preguntas, seran considerados individuos de una nueva especie? Tendran los mismos derechos y obligaciones? Tendran la misma dignidad que los dems humanos?... Es en nuestra opinin algo muy grave. El hombre en su evolucin ha ido cambiando su patrimonio gentico por medio de mutacin, seleccin, migraciones,... y todo bajo la direccin de una Seleccin Natural que filtraba, cribaba a los "mejores", los ms adaptados. As, el patrimonio gentico ha ido alcanzando rangos ms complejos y predestinados por la Evolucin. Sin embargo,ahora el hombre pretende manipular genes en los nuevos descendientes, adquiriendo un papel supremo, obteniendo una categora en la cual su aplicacin perdurar en el tiempo. Cabe preguntarnos, es necesario una terapia gnica en la lnea germinal? Estamos engaando cuando queremos decir terapia gnica? La respuesta a la primera pregunta es de difcil solucin. El saber que un nuevo hijo nacer enfermo si no se le aplica la terapia o incluso nacer muerto, no cabe ms respuesta que la de aprobacin al mtodo teraputico. El amor a un hijo prevalece frente a los riesgos a correr.Pero apartando este hecho , quines somos nosotros para tomar el mando? Quines somos nosotros para obrar y "jugar a ser Dios", para crear nuevas especies? Y es aqu donde recordamos una frase ya expuesta sobre la peligrosidad del maluso de la terapia gnica. Bajo la clasificacin de terapia se incluiran protocolos para

"crear" nios con ventajas adaptativas, sera entonces un mejoramiento de la especie. Una nueva raza de "superhombres" creados con fines oscuros, dara lugar a una nueva forma de marginacin social, "la marginacin gentica" de los menos adaptados.Desarrollaramos hombres a nuestro antojo, adaptados a diversas condiciones, con oculto destino. Esto sera una de las mejores armas creadas por el hombre. Cul sera el lmite? Hasta donde deberamos manipular? Estamos llegando al borde del precipicio y no deseamos parar. Hemos matado a la Seleccin? Nos hemos colocado su corona y la hemos desterrado? Quizs no, quizs sea de nuevo la arrogancia, el poder que creemos tener, algn da todo se volvera contra nosotros, pero hasta entonces quizs ya hubieramos acabado con nuestra especie. En palabras de Hobbes, " el hombre es un lobo para el hombre". Nuestra necesidad de conocer todo, nuestra curiosidad nos lleva a veces a indagar en terrenos en los que nunca deberamos haber entrado, lemos el aviso pero lo ignoramos, y justificamos conductas perversas con la careta de que su fin ser solidario. En verdad, que nuestro ansia de conocer, controlar y dominar no tiene lmites y eso ser nuestra perdicin. Como dice French Anderson, " el concepto de mejoramiento de la especie es un ejemplo de una pendiente resbaladiza, una vez que te embarcas es muy duro parar". Ya dijimos en el anterior apartado que la salud es un derecho universal. El hombre es el nico animal que adems de su propio "armamento", su inmunidad creada por la Naturaleza, ha conseguido mediante la medicina atacar, perseguir y eliminar las enfermedades que nos han ostigado. Pero, si recordamos uno de los principios bsicos de la teora de la Seleccin Natural, " los ms adaptados son los que sobreviven". Esto provocaba que el resto mora o no se reproduca, con lo cual la especie era "purificada" genticamente. Ya que slo participaban para la nueva generacin los genotipos ms adaptados.El hecho es que el hombre al aplicar tratamientos sobre individuos enfermos ha "rescatado" personas no adaptadas, y as se ha acumulado un lastre que arrastra la especie humana. Los realmente elegidos se han visto diluidos en el conjunto de la poblacin. La especie se ha vuelto heterognea, mixta, donde conviven individuos "rescatados" e individuos "adaptados". Lgicamente el hombre no puede permitir seguir las leyes de la seleccin al dejar morir a los menos adaptados, pero esto plantea un problema, llegarn a perderse una gran cantidad de individuos "rescatados" en el futuro? El que la especie no sea uniformemente adaptada traer consecuencias evolutivas? An no podemos responder a estas cuestiones, pero si en nuestras manos est el ayudar a una persona, sin duda correremos el riesgo. Como conclusin y dejando un poco la tica, pensamos que aunque al valorar los beneficios y los riesgos de los tratamientos los datos no nos hagan estar de acuerdo con su aplicacin, la impotencia, la angustia y el dolor por ver como seres queridos se mueren sin poder auxiliarles nos obliga a saltar barreras en nuestra concepcin de lo ticamente justo para soar, con que si al menos pudimos ayudarles en llegar a esa Felicidad utpica de la hablabamos al principio, nuestra Felicidad la abremos alcanzado. BIBLIOGRAFA Pgina Web de la universidad de Valencia sobre terapia gnica

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Introduccinmodestos resultados en la transferencia de genes a humanos con finalidad teraputica son presentados a menudo en la prensa y en la literatura divulgativa como logros espectaculares y verdaderas revoluciones en el tratamiento de enfermedades como el cncer, el SIDA o la diabetes. Algunos presupuestos bsicos en esta literatura son los siguientes: Las principales enfermedades pueden ser descritas a nivel molecular, que sera el nivel adecuado para explicar su gnesis. Esto nos obliga a distinguir entre "genes defectuosos" y "genes sanos", entre "instrucciones genticas defectuosas" y "programa gentico adecuado". El tratamiento adecuado consiste en "reprogramar" las instrucciones errneas, en sustituirlas por otras correctas o en compensar las errneas aadiendo otras adecuadas. La realidad es mucho ms compleja y requiere indagar qu se entiende por terapia gnica (TG) en sus diferentes aplicaciones. Adems, nos exige clarificar la terminologa utilizada. En los ltimos aos han proliferado las propuestas de ensayos clnicos que difcilmente podramos considerar "teraputicos" en sentido estricto, es decir, destinados a curar o aliviar el sufrimiento producido por enfermedades graves asociadas a alteraciones genticas, hereditarias o no. No deberamos considerar "terapias gnicas" las destinadas a prevenir el desarrollo de enfermedades hereditarias, conforme a los datos derivados de un anlisis gentico "revelador de propensiones" a las mismas; ni las de carcter preventivo,

contra infecciones generalizadas de origen viral; o las transferencias gnicas destinadas a identificar los fenmenos (genticos, fisiolgicos, cromosmicos, etc.) implicados en la etiologa de una enfermedad especfica (su fin primario es el diagnstico, que en muchas ocasiones de poco sirve para la terapia). Aunque la expresin "terapia gnica" significa, en su origen, Introduccin de material gentico exgeno (natural o recombinante) en sujetos humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotpico, con el tiempo se ha ido "ensanchando" hasta incluir transferencias gnicas de naturaleza preventiva y aquellas que contribuyen al avance de la investigacin mdica. Probablemente no existan confusiones al respecto entre los especialistas, y todos sepan reconocer cundo se usa en sentido estricto y cundo en sentido amplio. Pero frecuentemente no tienen en cuenta el hecho de que, adems de ellos, tambin hablan de "terapia gnica" expertos en biotica, abogados, filsofos, polticos, representantes de organizaciones sociales y religiosas, etc., muchos de los cuales desconocen su significado preciso en gentica clnica y recurren al significado ms comn. No debera extraar, pues, que muchos asocien a dicha expresin algo ms que "intervenciones estrictamente teraputicas en el ser humano"; ni que en las sociedades contemporneas, las intervenciones etiquetadas como "terapia gnica" susciten temores, recelos y animadversin. Este solapamiento de significados (estricto/amplio) es visto por algunos como una va para colar subrepticiamente, bajo la etiqueta saludable de "terapia", lo que no pasan de ser intervenciones genticas difcilmente justificables desde el punto de vista cientfico y (por lo mismo) tico, como transferencias de carcter preventivo u orientadas al diagnstico clnico. Una reflexin similar parece dar la razn a quienes se oponen a este tipo de tcnicas basadas en el argumento de la "pendiente resbaladiza" [slippery slope]: Si se acepta cualquier tipo de TG, ser muy fcil dar el salto de intervenciones "razonables" a otras mucho ms controvertidas, simplemente ampliando el rango de connotaciones de la expresin "terapia gnica". Las situaciones confusas inciden particularmente en las legislaciones que comienzan "desde cero", y en relacin con la TG muchos pases estn obligados a legislar ex nihilo. Esto significa que pueden imponerse restricciones excesivas a la investigacin basadas en malentendidos muy difundidos y, entre otras cosas, cerrar la puerta a cualquier tipo de medicina predictiva o crear serios problemas de interpretacin legal para el futuro. Torres y otros han propuesto incluso eliminar una expresin tan ambigua como "terapia gnica", y buscar expresiones alternativas para cada tipo de intervencin. Pero nadie sabe a priori el tipo de intervenciones que sern posibles en el futuro. Por eso propone Torres esta clasificacin elemental: Desde el punto de vista biolgico, deberamos hablar de transferencia gnica, que puede ser en lnea germinal o en lnea somtica. Atendiendo a sus objetivos, tendramos que hablar de transferencia gnica: Con finalidad mdica (prevencin, investigacin -diagnstico clnico- y terapia); Con finalidad no mdica (ingeniera gentica humana orientada a la mejora [enhancement] de caractersticas o a la eugenesia).

I. Las terapias gnicas (TG) como aproximacin novedosa a las enfermedades hereditarias 1. Limitaciones de la terapia gnica en humanos El primer objetivo de la identificacin y clonacin de genes responsables de enfermedades de origen gentico es el diagnstico precoz, prenatal o postnatal. Pero diagnsticos eficaces sin terapia posible satisfacen poco a los afectados. La identificacin de genes humanos mediante tcnicas de ingeniera gentica constituye, no obstante, el primer paso para desentraar las bases moleculares y fisiopatolgicas de una enfermedad. Conocidas stas, las estrategias de investigacin pueden ir en dos direcciones: Va farmacolgica, para intentar compensar las consecuencias fisiolgicas del disfuncionamiento celular; va gentica, buscando la introduccin de un gen forneo -el transgn- en las clulas afectadas, para que sustituya al gen anmalo. Este enfoque es el que corresponde a la terapia gnica. Desde los primeros intentos (no autorizados) de terapia gnica por Martin Cline en 1979-1980 hasta hoy. Lo ideal sera colocarlo dentro de uno de los cromosomas de la clula diana, en sustitucin del gen anmalo. Pero, de momento, el recurso a la tcnica ms eficaz est vedada en humanos. La recombinacin homloga se ha mostrado operativa en ratn, permitiendo una modificacin estable y definitiva de las clulas embrionarias germinales, transmisible a la descendencia. Pero esta posibilidad en el hombre es rechazada unnimemente por todos los comits internacionales de biotica. Slo queda el recurso a la adicin gnica: el gen defectuoso sigue presente en el cromosoma, y el transgn introducido puede permanecer fuera del ncleo o de los cromosomas en forma de ADN no cromosmico (episoma). Otra alternativa sera la introduccin al azar del transgn en el genoma, con el riesgo de alterar la funcin de algn gen esencial. Las precauciones frente a estas estrategias tan imprecisas consisten en impedir la propagacin y transmisin del sistema de transferencia del gen (el vector) y comprobar si la insercin del gen forneo no conlleva la inactivacin de algn gen del hospedador o la activacin de algn proto-oncogn. 2. Mtodos de transferencia gnica Dependiendo de las caractersticas de la clula, del tejido o del rgano a modificar se opta por una manipulacin in vitro u otra in vivo, con o sin reimplantacin de las clulas modificadas. En los ensayos de transferencia gentica, el gen normal (ADNc) es clonado en un vector de expresin -un agente que transporta el ADNc al tejido diana donde, bajo la regulacin de un promotor (parte de la secuencia de ADN que activa al gen) se hace activo. Estos elementos de expresin son construidos normalmente en virus defectuosos capaces de reproducirse con ayuda de una lnea celular. El empleo de virus modificados parece altamente efectivo en la distribucin del gen hasta el lugar elegido, pero no puede replicarse. Por eso los retrovirus son el vector preferido, aunque ltimamente se han comenzado a utilizar adenovirus y virus herpes como agentes diseminadores eficaces. La eleccin de una manipulacin in vivo o in vitro condiciona la del sistema de transferencia del gen:

Un tipo de terapia gnica se basa en modificar genticamente in vitro un conjunto de clulas que forman un "organoide", especie de microfbrica que, una vez implantado en el organismo, produce la protena necesaria, la cual llega hasta el organismo donde se necesita por el torrente sanguneo. Cuando el objetivo son clulas o tejidos que pueden renovarse a partir de clulas precursoras como las del tejido hematopoytico (la mdula sea), la piel (queratinocitos y fibroblastos), los endotelios (recubren la cara interna de los vasos sanguneos y linfticos), el hgado y los msculos (mioblastos), se extraen y cultivan las clulas y son expuestas a la accin de un retrovirus que les transfiere el gen. Al dividirse, transmiten el transgn a las clulas hijas. Slo se reinyectan al paciente aquellas clulas en las que el transgn se ha integrado y funciona correctamente. Esta estrategia ex vivo empleando vectores construidos a partir de retrovirus es la ms utilizada recientemente contra ciertos tipos de cncer. Para clulas quiescentes (completamente diferenciadas y que se dividen poco o nada) y las asociadas a funciones mecnicas o estructurales (msculo estriado, msculo cardaco o pulmones) se sigue la estrategia in vivo, aplicada con cierto xito a una enfermedad pulmonar -la mucoviscidosis- y en principio adecuada para enfermedades neuromusculares o neurodegenerativas. Los vectores adenovricos y otros sintticos como los liposomas son los ms adecuados en estos casos. Muchos atribuyen las limitaciones de las tcnicas de transferencia gnica disponibles al desconocimiento de las caractersticas que debe reunir el vector adecuado. Por esta razn buena parte de la investigacin reciente se est centrando en la eleccin y diseo de nuevos vectores ms eficaces, creando incluso centros especializados para desarrollar este tipo de investigacin. 3. Enfermedades genticas humanas candidatas a la TGH Las enfermedades hereditarias provocadas por la carencia de una enzima o protena son las ms idneas para estos tratamientos. Pero tambin aquellas en las que no importa demasiado el control preciso y riguroso de los niveles de la protena cuya produccin se pretende inducir mediante manipulacin gentica (como el factor VIII de la sangre, por ejemplo). Se trata, normalmente, de enfermedades monognicas, originadas por la alteracin de un nico gen recesivo anmalo y en las que basta la mera presencia del producto gnico para corregir el defecto. A finales de los 80 se consideraban alteraciones idneas para ser objeto de tratamiento gnico la enfermedad de Lesch-Nyhan (provocada por la ausencia de la enzima HPRT -hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa-, que provoca grave deficiencia mental y tendencia compulsiva al automutilamiento) e inmunodeficiencias como PNP (muy grave, provocada por la carencia de una purina nuclesido fosforilasa) y ADA (la que padecen los "nios burbuja", en los que la falta del enzima adenosin desaminasa les deja absolutamente indefensos contra cualquier agente patgeno, obligndoles a vivir en un ambiente absolutamente estril). En estos casos se conocan y haban sido clonados los genes implicados. Bastara una pequea presencia de los productos gnicos necesarios para corregir la alteracin, y unos niveles ligeramente superiores de los mismos no parece tener consecuencias negativas. Las clulas implicadas en la produccin de estos enzimas se hallan en la mdula sea, lo cual plantea el problema adicional de hallar donantes compatibles para iniciar el tratamiento. Los

experimentos indican que el tratamiento gnico de algunas clulas extradas a los enfermos y su posterior reinsercin est siendo eficaz -al menos en ADA-, y que, tras dos o ms aos de tratamiento se ha conseguido la relativa normalizacin del sitema inmune y la restauracin de la inmunidad celular y humoral, gracias en parte a ventajas de crecimiento que las clulas tratadas genticamente parecen tener sobre las anmalas Aparte de la mdula sea, los tejidos humanos mejor conocidos eran hasta hace muy poco la piel y la sangre. En otras clulas se plantean mltiples problemas para extraer las clulas necesarias, cultivarlas durante el tiempo requerido para manipularlas genticamente y ser reimplantadas al paciente. El bajo nmero de clulas madre en la mdula sea, no diferenciadas todava -antes de constituir las clulas especficas de la sangre- y problemas en su reconocimiento han constituido un importante obstculo para la TG. Adems, ninguna de las tcnicas disponibles a comienzos de los 90 permita insertar un gen en su locus o lugar cromosmico especfico dentro de la clula diana. A finales de 1994, las posibilidades y aplicaciones de los tratamientos gnicos se ampliaron notablemente, con diferentes resultados segn las lneas celulares manipuladas: 3.1. Tratamiento gnico de enfermedades hepticas: Los experimentos con ratones transgnicos, bioqumica y fenotpicamente modificados, han permitido evaluar la eficacia teraputica de la transferencia gnica somtica de vectores adenovirales con replicacin alterada que codificaban el ADNc de la ornitina transcarbamilasa (OTC). La duracin de su expresin est por determinar todava, creo, pero los primeros resultados parecen esperanzadores. Algo parecido puede decirse sobre la expresin de betagalactosidasa y a 1-antitripsina humana en hepatocitos aislados en modelos transgnicos. A pesar de los problemas tcnicos que persisten en relacin con la transferencia ex vivo de clulas y de la duracin limitada de la expresin teraputica, hay al menos dos protocolos clnicos aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hgado. Los tratamientos van destinados a pacientes con insuficiencia heptica aguda y al tratamiento de la hipercolesterolemia familiar. De manera global, la precaucin y el estudio detenido de los protocolos clnicos presentados seguirn siendo la norma, mientras persistan los problemas de expresin transitoria y grado de eficacia insuficiente en el tratamiento gentico heptico tanto in vivo como ex vivo. 3.2. Hemoglobinopatas y tratamiento gnico de clulas hematopoyticas: El dominio adquirido en los trasplantes de mdula sea y la capacidad que tienen las clulas primordiales hematopoyticas (CPH) para reconstituir totalmente la mdula sea, hacen del sistema hematopoytico un candidato idneo para el tratamiento gnico. Las inmunodeficiencias combinadas severas (ADA), las hemoglobinopatas (talasemias), las deficiencias de adhesin leucocitaria y las enfermedades de depsito lisosomal (enfermedad de Gaucher) han acaparado la mayor parte de las investigaciones en tratamiento gnico. Recientemente se han identificado los genes responsables de tres enfermedades inmunitarias ligadas al cromosoma X, y diversos tipos de leucemia, el cncer y el SIDA estn siendo objeto de intensos estudios que incluyen aproximaciones teraputicas de tipo

gentico. En las CPH los vectores retrovirales parecen ser, de momento, los ms eficaces para la transferencia. ADA (trastorno autosmico recesivo; frecuencia: 25% de las ICS): Su deficiencia origina una disfuncin intensa en las clulas T y B, que provoca la muerte de los pacientes antes de los 2 aos de edad por infeccin masiva. Actualmente, el tratamiento preferido es el trasplante de mdula sea procedente de un donante HLA idntico, que puede producir una curacin completa aunque conlleva una alta morbilidad. Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA idntico. La sustitucin enzimtica no consigue una restitucin inmunitaria completa y produce otros efectos txicos. Un tratamiento sustitutorio, consistente en inyectar el enzima ADA combinada con polietilenoglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante. Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya ms de cuatro aos ensayos clnicos de transferencia gnica de ADA hacia las clulas T perifricas, previamente tratadas in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejora clnica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los ndices de la funcin inmunitaria. En opinin de algunos, ni en este ensayo pionero ni en otros existen evidencias inequvocas de que el tratamiento gentico ha producido beneficios teraputicos. Los riesgos de posible mutagnesis insertiva de genes relacionados con el cncer, despus de repetidas transferencias retrovirales, no se han visto confirmados hasta el momento. Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clnicos en Italia y Pases Bajos. Segn sus autores, en uno de estos ltimos ensayos la transferencia gentica haba funcionado y se haba conseguido la reconstitucin inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo tambin inyecciones rutinarias de ADA sinttica, y estos tratamientos convencionales podran ser responsables en buena parte de su buena salud. Enfermedad de Gaucher: Autosmica recesiva, es producida por el derivado proteico de un gen que codifica la enzima glucocerebrosidasa. El trasplante alognico de mdula sea ha corregido la enfermedad en algunos pacientes, pero ya se ha conseguido la trasferencia gnica retroviral de un gen recombinante normal de la glucocerebrosidasa en clulas madre de ratn, seguida de la expresin proteica en macrfagos diferenciados a partir de clulas madre transducidas. Las hemoglobinopatas representan el trastorno gentico ms frecuente en humanos, y la mayor parte de los experimentos con tratamiento gnico persiguen la expresin regulada de altos valores del gen de la globina utilizando vectores retrovirales. Pero a mediados de 1994 no se haba conseguido la expresin regulada de los genes de la globina utilizando vectores retrovirales. 3.3. Tratamiento gentico del cncer: Parece que procesos cancergenos hereditarios como el retinoblastoma, poliposis adenomatosa familiar, cncer de mama y melanoma estn relacionados con un gen nico que predispone al paciente a presentar neoplasia. Leucemia y linfomas no hereditarios parecen provocados por nuevas mutaciones (translocaciones, a menudo) que confieren un nuevo rasgo gentico a la clula maligna. La correccin

gnica de todas las clulas malignas implicadas en procesos cancergenos constituye un desafo sorprendente. Inmunoterapia contra el cncer. Muchos estudios han intentado incrementar la cantidad y citotoxicidad especifica de los linfocitos que reaccionan con las clulas tumorales. Los primeros intentos incluan el marcaje de unas clulas inmunes llamadas linfocitos de infiltracin tumoral (TILs, tumor-infiltrating lymphocytes) para seguir el progreso del tratamiento contra el melanoma maligno. Steven Rosenberg, uno de los ms conocidos investigadores sobre el cncer de los NIH, consigui en 1990 la aprobacin definitiva para una segunda aplicacin de la terapia gnica a pacientes con casos avanzados de melanoma, cncer de piel que anualmente mata a unos 28.000 ciudadanos en EE.UU. El enfoque adoptado por Rosenberg reconoce las limitaciones del recurso a fuerzas externas (radiacin, quimioterapia y ciruga) con los pacientes cancerosos y propone una estrategia basada en los propios mecanismos internos del cuerpo, como la terapia gnica, para conseguir que el propio cuerpo rechace la enfermedad. Rosenberg y su equipo extrajeron linfocitos de infiltracin tumoral procedentes de los tumores de pacientes con melanoma. Los TILs fueron introducidos en una solucin de interleuquina-2, una sustancia natural que potencia su efecto destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus de leucemia de ratn manipulados. El sistema de transporte y distribucin de Rosenberg haba sido neutralizado y dotado mediante tcnicas de ADN recombinante con un gen humano. Este gen codifica un factor de necrosis tumoral (TNF), una protena que interfiere con el suministro de sangre al tumor y debilita las clulas tumorales. Los virus alterados se insertan ellos mismos junto con su gen polizn dentro del material gentico de los TILs, y estos son inyectados en la sangre de los pacientes con melanoma. Conforme a las previsiones, los TILs activados se hospedaran en los tumores como si fuesen misiles teledirigidos, atacando las clulas cancerosas y a la vez liberando el factor antitumoral (txico) para ayudar a exterminarlos. Un ao despus, sin embargo, el comit de asesores cientficos del National Cancer Institute's Division of Cancer Treatment cuestion la fiabilidad y algunos elementos cruciales de los experimentos de Rosenberg, negndole un contrato de 3,9 millones de dlares por 3 aos para desarrollar clulas TIL en un laboratorio independiente. Han fallado varios aspectos importantes en los dos aos de experimentacin. Aunque los TILs s se dirigan al tumor, no lo hacen los modificados con el TNF. Parece que algo relacionado con la insercin del TNF interfiere con su capacidad para hospedarse en el tumor. El resultado es que la mayor parte de los linfocitos modificados quedan atrapados en el hgado, bazo y pulmones, donde probablemente son destruidos. Y la expresin no regulada en estos rganos del TNF puede originar procesos txicos secundarios. Otro mtodo basado en la inmunoterapia ("vacunacin gentica" o inmunoterapia activa) trata de aumentar el carcter "extrao" de las clulas tumorales para estimular la accin antitumoral de las clulas asesinas (linfocitos T y macrfagos) del sistema inmunitario. Las clulas tumorales producen en su superficie unas protenas anmalas capaces de activar las clulas asesinas. Algunos tumores incluso son portadores de antgenos propios ("antgenos asociados a los tumores") que permanecen "silenciosos" en las clulas normales. Esto ocurre con productos gnicos descubiertos en algunos melanomas humanos, las protenas MAGE

(melanoma antigen) y MART (melanoma antigen recognized by T-cells) descubiertas recientemente por los equipos de T. Boon y Rosenberg, respectivamente. Normalmente, los antgenos son presentados a las clulas inmunitarias en forma de fragmentos por las protenas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) presentes en las superficies de las clulas. Pero una de las diferencias fundamentales entre las clulas normales y las tumorales est en que estas ltimas no presentan correctamente los antgenos tumorales. Esta es una de las caractersticas que se pretenden modificar. Incremento de la inmunogenicidad de las clulas tumorales: Mediante modificacin gentica se intenta potenciar la respuesta inmunitaria dirigida contra el tumor. Se utilizan diversas protenas especficas, especialmente citoquinas y molculas de adhesin celular (interleuquina-2, interleuquina-4, el TNF, etc.) que no producen ningn efecto sobre el crecimiento de las clulas tumorales in vitro pero inhiben el crecimiento del tumor in vivo. En ratn, las clulas tumorales son eficazmente rechazadas cuando han sido manipuladas mediante tcnicas de ingeniera gentica para expresar diversas citoquinas o bien el complejo principal de histocompatibilidad. Esto hace pensar que en humanos, el protocolo debera incluir la eliminacin de una parte del tumor, la transduccin de las clulas in vitro con las formas de expresin adecuadas y el reimplante de estas clulas tumorales al paciente. Se han aprobado diversos protocolos clnicos en todo el mundo para la transferencia in vitro a clulas tumorales de genes de citoquinas (IL-2, IL-4, el interfern g , el GM-CSF o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrfagos, etc.) para diferentes tipos de cncer: colorrectal, de mama, melanoma maligno, neuroblastoma, carcinoma de pulmn, de rin, etc. Otros ensayos persiguen la utilizacin de genes protectores, mediante la transferencia de genes que incrementen la resistencia a varios frmacos en clulas madre de pacientes con tumores slidos o leucemia y permitan niveles superiores de quimioterapia para erradicar la enfermedad residual. Otros estudios proponen utilizar genes destructores como los de la toxina diftrica y los que codifican el TNF para eliminar las clulas cancerosas; o el empleo de "genes suicidas", que transforman un producto no txico (por ejemplo, un antivrico como el aciclovir) en un veneno que provoca la muerte de las clulas. Otros enfoques del tratamiento gnico contra el cncer pretenden el marcaje de las clulas malignas con protenas codificadas por genes de supresin tumoral como elp53 (alterado en el 50% de los casos) o ras (alterado slo en el 30%). In vitro, las clulas malignas a las que se ha transferido la forma natural del p53 ya no tienen capacidad tumorignica o la tienen ms dbil que las clulas originales. Muy recientemente, se ha desvelado el funcionamiento de otro gen muy directamente implicado en la supresin de tumores, el p16. De momento, se estn diseando los vectores para introducirlo adecuadamente en las clulas tumorales y conseguir su expresin con arreglo a las previsiones. Pero el propio director de equipo, el espaol Manuel Serrano, reconoce las dificultades inherentes todava a las terapias gnicas y deposita ms esperanzas en el diseo de alguna molcula por sntesis qumica capaz de imitar la accin del gen p16. Todas estas alternativas presentan numerosos inconvenientes todava. Sigue siendo difcil extraer y modificar clulas tumorales. Slo una fraccin de ellas poco controlable- resulta manipulable para una posible fabricacin de vacunas

parciales. No todos los tumores son fsicamente accesibles. El problema ms importante lo constituye la elevada eficacia necesaria en la transferencia de las clulas modificadas a las clulas neoplsicas, de modo que no perjudiquen a las normales. Por ltimo, la manipulacin de clulas tumorales con genes inhibidores de la proliferacin celular como el p53 requiere la modificacin de todas las clulas tumorales, y como la mayora de cnceres proceden de una cascada de anomalas genticas, la reversin de una sola de ellas no bastara seguramente para detener la enfermedad. 3.4. Tratamiento gentico de las clulas respiratorias: Para la fibrosis qustica (enfermedad autosmica recesiva, que afecta a 1/2.500 recin nacidos blancos) existe un tratamiento convencional (fluidificacin de las secreciones del sistema respiratorio, tratamiento de las infecciones y sustitucin de las enzimas pancreticas). Se ha descubierto recientemente el gen implicado en la enfermedad, el regulador de la conductancia transmembrana (CFTR), lo que ha supuesto un importante avance hacia su tratamiento gnico. Se estn siguiendo estrategias in vivo para el tratamiento de la FQ, ms adecuadas y viables que las ex vivo. Despus de algunos intentos con ratones (instilacin traqueal de un adenovirus recombinante con replicacin defectuosa que codifica el CFTR) con buenos resultados -aunque la expresin del gen no ha durado ms de 42 das- se aprobaron varios ensayos clnicos en humanos utilizando un vector adenoviral con CFTR y transferencia gentica de un complejo ADN-liposoma. Los riesgos de toxicidad parecen descartados en los primeros intentos y basta algo tan sencillo como un inhalador para conseguir la expresin del gen y aliviar en un 30% los sntomas de la enfermedad. 3.5. Tratamiento gentico muscular En ratones se ha conseguido la sustitucin de las secuencias anmalas del gen mutante por secuencias normales, corrigiendo as el defecto gentico. 4. Uso teraputico de cidos nucleicos anti-sentido Una aproximacin sorprendentemente novedosa al control de la expresin gentica consiste en la inyeccin de secuencias cortas de nucletidos o sondas de cidos nucleicos anti-sentido, obtenidas por sntesis qumica, que se unen al ARN nuclear y bloquean su procesamiento o salida desde el ncleo; otras veces se unen directamente al gen para impedir su transcripcin en ARN. Como es obvio, este tratamiento es el adecuado para situaciones en las que se trata de bloquear el funcionamiento de un gen cuyo producto resulta nefasto para el organismo. Segn las previsiones iniciales, estamos ante una tcnica enormemente especfica, probablemente decisiva para la regulacin controlada de genes especficos, cuyo dominio podra acelerarse gracias al conocimiento detallado de la secuencia de todos los genes humanos que el PGH terminar proporcionando. En octubre de 1993, la Agencia Nacional Francesa de Investigacin sobre el Sida aprob un ensayo que propona el empleo de una secuencia antisentido, producida por la empresa norteamericana Hybridon, para inhibir la replicacin del VIH. De la estrategia antisentido se esperaban adems importantes aplicaciones en todas aquellas enfermedades humanas de claro componente gentico, incluyendo el cncer, las enfermedades cardiovasculares, las inmunes -alergias-, las autoinmunes y las infecciones virales.

Sin embargo, los resultados conseguidos hasta hoy (octubre de 1995) indican que la tcnica debe afrontar todava numerosos imprevistos y lo mejor que se puede decir es que los compuestos antisentido no funcionan tal y como los investigadores esperaban. Las impresiones de uno de los investigadores directamente implicados en el diseo de este tipo de oligonucletidos son ilustrativas: "The assumption is that we are designing oligonucleotides that dont interact with anything besides [their targets]"; "Many people are worried that a lot of the positive effects reported are not just antisense but other nonantisense mechanisms as well" (Cy Stein, Columbia Univ.). Estas limitaciones de la tcnica [y del "enfoque"?], tras numerosos ensayos clnicos, han provocado que varios expertos critiquen la excesiva rapidez con que se ha dado el salto, en este caso como en otros, del laboratorio a la clnica. Por consiguiente, habr que seguir perfeccionando la tcnica hasta que funcione con arreglo a las perspectivas. Se ha sugerido que no basta dirigir los oligonucletidos al gen diana, sino que ser preciso disear molculas antisentido capaces de interactuar con las protenas asociadas al gen, implicando ms mecanismos y niveles que el gentico. El fracaso inicial en las primeras aplicaciones de esta tcnica apunta a la tesis que con mayor detalle expongo en el captulo seis: la mayor parte de la investigacin biomdica se desarrolla dentro de un paradigma de investigacin centrado casi exclusivamente en un nivel, el gentico, que es necesario pero que, a la luz de otros muchos estudios ofrecidos por la literatura experimental, se est revelando claramente insuficiente para la comprensin de las enfermedades que consideramos "genticas". 5. Ventajas de las TG y perspectivas a corto plazo Como hemos visto, en los dos ltimos aos se han producido progresos sustanciales dirigidos a la correcin gentica de enfermedades hereditarias. La aproximacin gentica se ir imponiendo progresivamente por varias razones: Evita las complicaciones potenciales del trasplante, puesto que se introduce el gen normal en el propio tejido somtico del paciente. En un tratamiento ideal, el gen corrector sera diseminado en una lnea celular auto-regeneradora, que replicara el gen transferido y se replicara a s misma, eliminando la necesidad de una terapia repetitiva. Ya hemos comentado los logros parciales en la expresin prolongada de los genes transferidos (tratamiento de la deficiencia de ADA y de la FQ, por ejemplo). Recientemente, James Wilson y su equipo en la universidad de Michigan consiguieron resultados positivos en el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar. Procedimientos tcnicos como la recombinacin homloga evitan el azar biolgico de los vectores virales y permite realizar la sustitucin del gen defectuoso por un gen normal. Se ha conseguido una recombinacin autntica en cultivos de clulas humanas y de ratn usando grandes segmentos de ADN introducidos mediante microinyeccin o por electroporacin (mediante la cual se induce a las clulas diana a absorber el ADN extrao). Este mtodo, una vez perfeccionado lo suficiente, tiene la ventaja de que permite reemplazar genes defectuosos por genes normales, en lugar de integrar los genes correctos (va vector retroviral) entre las clulas portadoras del gen defectuoso. El mismo procedimiento est siendo ampliamente utilizado como un medio para obtener ratones transgnicos, de gran inters mdico porque permiten construir

modelos animales de enfermedades humanas con los que experimentar y desarrollar posibles terapias. En relacin con la corea de Huntington, por ejemplo, puesto que conocemos la mutacin gentica que la provoca, podramos reproducirla mediante ingeniera gentica en los genes homlogos del ratn. El ratn se convertira as en un modelo para estudiar las maneras de evitar la enfermedad, al menos hasta que aparezca una terapia capaz de corregir las consecuencias de esta trgica alteracin. Toda una variedad de enfermedades humanas estn siendo reproducidas en ratn para determinar las estrategias teraputicas adecuadas. En concreto, para el estudio de enfermedades del sistema inmune se dispone ya un amplio muestrario de modelos murinos. Aparte de sistemas modelo para es estudio de enfermedades, los ratones transgnicos estn siendo utilizados tambin como biorreactores. La TG est dando sus primeros pasos, pero los resultados publicados en los ltimos diez o doce meses justifican que las perspectivas a medio plazo sean alentadoras. Las cuestiones ticas suscitadas por las posibles aplicaciones de estas tcnicas se tratarn en el captulo 5. II. Interrogantes tico-jurdicos planteados por la terapia gnica Los progresos de la ingeniera gentica han llevado a desarrollar poderosos mtodos de diagnstico. Pero hacen posible, adems, diversas intervenciones en el material gentico humano. Entre todas, destaca por sus potencialidades la terapia gnica, entendida como "la curacin de enfermedades o defectos graves debidos a causas genticas, actuando directamente en los genes, mediante la adicin, modificacin, sustitucin o supresin de genes". Es aplicable a defectos genticos de diversa ndole: i) hereditarios, cuando son transmitidos por Alos genes de los padres; ii) No hereditarios, cuando las anomalas se producen por errores imprevistos en la formacin de las clulas sexuales; y iii) congnitos, cuando ocurren durante el desarrollo embrionario. Por el momento, se trata en su mayora de intervenciones para corregir defectos de origen monognico. Como especificamos en el captulo anterior, cabe distinguir intervenciones en clulas somticas y en clulas de la lnea germinal. 1. TG somtica La terapia por transferencia gnica en tejidos somticos plantea cuestiones ticas muy limitadas, puesto que el xito o el fracaso en el intento afectar slo al paciente enfermo. El asunto entra dentro de las preocupaciones tpicas en torno a cualquier tipo de experimentacin con humanos, exactamente dentro del clculo de beneficios y riesgos para el individuo. Existe unanimidad en exigir una evaluacin cuidadosa del riesgo que implica el uso de vectores virales, incluyendo su capacidad para infectar las lneas celulares del progenitor y el potencial dao colateral de la insercin. Las intervenciones sobre clulas somticas (en el pncreas, por ejemplo, para combatir la diabetes) no afectan, en principio, a la dotacin gentica de la persona sometida a ellas, pues no intervienen en los procesos reproductores del ser humano. Pero, desde el punto de vista jurdico, las clulas somticas y sus componentes (incluidos los genticos) forman parte de la integridad personal (fsica o psquica del individuo), dentro de lo que podramos considerar como subcategora de "integridad gentica" y, por consiguiente, se benefician de la

proteccin jurdico-penal otorgada a ese bien jurdico. De lo dicho podemos derivar algunas conclusiones de carcter tico-jurdico: La TG en la lnea somtica se circunscribe, en su calificacin jurdico-penal, a la valoracin jurdica de cualquier tratamiento, sin perjuicio de las matizaciones que corresponde tener en cuenta cuando se trata de un tratamiento nuevo o en fase de experimentacin, esto es, de que constituya lo que se viene conociendo como "experimentacin teraputica", que implica el sometimiento a las directrices y limitaciones generales comnmente aceptadas sobre esta modalidad teraputica (principalmente la ponderacin de riesgos y beneficios y el consentimiento informado del interesado). La TG somtica conforme a la lex artis no slo es en principio lcita, sino que ni siquiera realiza el tipo de los delitos de lesiones corporales. Cualquier otra accin no teraputica, que comporte la alteracin o modificacin de los componentes genticos de las clulas de una persona, realiza el tipo de lesiones corporales, en la medida en que suponga un menoscabo en su integridad corporal, o en su salud fsica o mental (art. 420 del CP espaol), dependiendo el tipo aplicable de las medidas asistenciales que sean necesarias para su sanidad, de ser sta posible (arts. 420, 421 582 del CP espaol), o de cul sea la configuracin de estos delitos en el CP que resulte aplicable. Romeo Casabona considera estas acciones lcitas, no obstante, si estn amparadas por una causa de justificacin, donde juega una funcin primordial el consentimiento del interesado (portador del bien jurdico protegido) y la eficacia que en relacin con la integridad corporal o la salud le reconozca a dicho consentimiento el ordenamiento jurdico correspondiente (frecuentemente a travs del n1 11 del art. 8 del CP: ejercicio legtimo de un derecho o profesin, siempre que se encuentre apoyo en algn sector del ordenamiento jurdico). 2. Transferencia gnica en lnea germinal. Objeciones La transferencia de genes a clulas germinales (gametos, cigoto) o a embriones humanos tiene poca demanda prctica, de momento, y suscita importantes reservas, sobre todo cientficas, pero tambin ticas. Es probable que el diagnstico de embriones llegue a ser pronto una realidad en la atencin mdica, como ha sucedido en los estudios con ratn. Si esta opcin est disponible para una pareja que desea evitar la transmisin a su descendencia de una enfermedad heredada de modo recesivo, parecera ms lgico permitir la implantacin de un embrin normal (tres de cada cuatro) en lugar de intentar la correccin de un embrin afectado (uno entre cuatro). Las tecnologas actuales de transferencia y sustitucin tienen tasas de xitos notablemente bajas (1/1.000-1/100.000) o dan lugar a recombinaciones ilegtimas en las que el gen se inserta en lugares indebidos, a veces en medio de otro gen. Tales inserciones al azar han provocado enfermedades en embriones de ratn. Por tanto, la correccin de alteraciones mediante transferencia gnica en la lnea germinal no slo plantea controversias sino que ofrece, adems, poco valor prctico para el ser humano. Con esta clase de tcnicas pueden barajarse, en principio, los mismos criterios que para las intervenciones en la lnea somtica. No se plantea la cuestin de la proteccin de los gametos y del cigoto totipotente como tales, sino la capacidad reproductora de individuos que presentan anomalas en sus clulas reproductoras o que se manifiestan inmediatamente despus de su unin.

No obstante, la TG en lnea germinal plantea otros problemas ticos y jurdicos de ndole mayor. Aunque en el futuro pueda contribuir a erradicar defectos genticos en las estirpes intervenidas, tambin tendr efectos de modificacin definitiva del componente gentico intervenido y de transmisin a las generaciones sucesivas, cuya trascendencia para la especie humana no se conoce todava con precisin ni es posible, por lo mismo, controlar sus potenciales efectos negativos, en su mayora todava desconocidos. Los recelos ante efectos imprevisibles llevaron a algunos especialistas a proponer una prohibicin absoluta de esta modalidad teraputica y a solicitar otros un aplazamiento o moratoria hasta que se tenga ms informacin al respecto. Unos pocos, en fin, entienden que no deben cerrarse totalmente las puertas a esta terapia en la medida en que no se pueden apreciar por el momento riesgos reales para el ser humano como especie, siempre y cuando se garantice su no transmisin, va reproductiva, a otros seres humanos, y pueda establecerse, en caso contrario, un seguimiento y control de sus consecuencias en varias generaciones posteriores [?]. Las puntualizaciones habituales sobre el asunto destacan tres aspectos: Determinar qu debe entenderse en estos casos por terapia en sentido estricto y su posible diferenciacin de las manipulaciones con fines de transferencia gnica experimental o encaminada a una mejora genotpica o fenotpica. Puesto que otras intervenciones no teraputicas en la lnea germinal sern transmitidas genticamente a la descendencia, procede determinar si est presente algn otro bien jurdico que trasciende a la colectividad, digno de proteccin y sobre el cual sea necesaria su identificacin. Esta segunda consideracin orientara respecto a si debe ser lcita y permitida cualquier manipulacin en la lnea germinal; o, de no serlo, sobre si la prohibicin debe trasladarse al mbito penal y constituir delito. A la vista de la situacin actual, parece ms prudente tica y jurdicamente apoyar la tesis de la moratoria en lo que se refiere exclusivamente a la terapia en la lnea germinal. Romeo Casabona no considera oportuno, por el momento, la incriminacin de estas prcticas experimentales en la investigacin. Es partidario de que permanezcan "en el mbito de lo ilcito administrativo y en el de la toma de decisiones sobre restricciones en la concesin de fondos pblicos de apoyo a esas actividades y a la investigacin de las que sean tributarias, sin perjuicio de admitir como alternativa que puedan realizarse, previa aprobacin de comits de expertos, con fines teraputicos en cada caso concreto y previa ponderacin de las garantas que se ofrezcan de evitacin de mutaciones o aberraciones no deseables". 3. El Derecho espaol no excluye la TG en lnea germinal: Nos remite a la Ley sobre Tcnicas de Reproduccin Asistida, que admite la terapia gnica (art. 1.3) en embriones y fetos en el tero nicamente si se cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de disponer de una lista de enfermedades en las que la teraputica sea posible desde criterios estrictamente cientficos. Dicha lista debe aprobarla el Gobierno de la nacin por Real Decreto (disposicin final 10, d), siempre que no se influya en los caracteres hereditarios no patolgicos ni se busque la seleccin de los individuos o la raza (art. 13.3.c y d, resp.). "La amplitud de los trminos de este ltimo requisito permite pensar que la Ley espaola no excluye, en principio, la TG en la lnea germinal, sin perjuicio de las

restricciones que pueda introducir a este respecto la lista de enfermedades mencionada cuando se publique." 4. La seleccin de sexo con fines teraputicos Relacionada con la TG est la seleccin de sexo con fines teraputicos, como medio de impedir la transmisin de enfermedades hereditarias ligadas a los cromosomas sexuales, as como la creacin de mosaicos genticos beneficiosos por medio de la ciruga, al transplantar clulas, tejidos y rganos de los embriones o fetos a enfermos en los que estn biolgica y genticamente alterados o falten, tambin permitidos por la Ley (art. 8.2.c de la Ley 42/1988). No se contempla la seleccin de sexo con fines distintos. 5. Otro argumento en favor de posibles transferencias gnicas en lnea germinal a humanos Algunos autores delimitan un campo especial de reflexiones sobre la manipulacin en lnea germinal, relacionado con la "ventaja gentica". En veterinaria, se est desarrollando una intensa investigacin sobre la resistencia a enfermedades. Debera ser tenida en cuenta tambin la resistencia humana a la enfermedad? Caskey habla, por ejemplo, de la prdida generalizada en la especie humana de uricasa (sus consecuencias son la enfermedad de la gota), de sntesis de vitamina C (su carencia provoca escorbuto) y el gen de resistencia a la gripe (incrementa la sensibilidad a la gripe). Es perfectamente imaginable que en el futuro, de alguna manera, la manipulacin gentica de un individuo en la lnea germinal pueda ser emprendida para introducirle o reintroducirle el gen de resistencia a la enfermedad. De ser as, las consideraciones sobre el riesgo-beneficio tendrn que cambiar significativamente respecto a las que figuran en las orientaciones institucionales vigentes (las del Institutional Review Board, por ejemplo): el principal problema tico ser el riesgo de daos actuales en comparacin con el beneficio para la salud de las futuras generaciones. El papel de las mutaciones somticas en las enfermedades adquiridas ya es evidente en las neoplasias celulares T y B. Puesto que los mtodos basados en el ADN son (eventualmente) precisos y de alta sensibilidad, muchos confan en que esta tecnologa experimentar una notable expansin en el diagnstico precoz de la malignidad. Lo que no est tan claro es si un nmero sustancial de desrdenes tienen un gen para susceptibilidad que pueda ser detectado. Alteraciones como el xeroderma pigmentoso, el sndrome de Bloom y la anemia de Fanconi, en las que la reparacin de los defectos en el ADN termina en un incremento de la susceptibilidad a mutaciones en muchos loci, entraran en una categora aparte. Los modelos del retinoblastoma, neurofibromatosis, enfermedad de von Hippel-Lindau, enfermedad de Gardner y otras proporcionan una primera aproximacin a la susceptibilidad para la malignidad. En estos casos, un alelo heterocigoto hace a un individuo susceptible de desarrollar un tumor maligno. Los entusiastas del PGH confan en una rpida mejora de la capacidad para identificar genticamente susceptibilidades en los individuos, incluyendo la incorporacin de estas tcnicas al repertorio de procedimientos comunes para vigilancia y prevencin de enfermedades genticas. Presumiblemente, la "vigilancia gentica" basada en el anlisis del ADN aadir precisin y exactitud predictiva al diagnstico prenatal; con el tiempo, puede que tambin eficacia teraputica,

aunque para desarrollar este segundo aspecto se necesiten nuevos enfoques en la investigacin. 6. Consideraciones a la luz de los ltimos avances Los ltimos informes sobre resultados de diferentes ensayos de TG y el uso de cidos nucleicos antisentido ilustran a la perfeccin las implicaciones ticas de una investigacin biomdica enfocada desde un enfoque metodolgico reduccionista que, unida a una falta [deliberada?] de rigor semntico entre los especialistas, ha llevado a ensayar en humanos tcnicas de TG de escaso fundamento cientfico, muy necesitadas de estudio bsico preliminar. Quizs la inclusin de la expresin "terapia gnica" en el ttulo sea la nica manera de colar ciertos protocolos clnicos a los comits encargados de su revisin o de presentarlos como Apolticamente rentables; y es probable que los ensayos se hayan realizado con pacientes terminales. Pero desde un punto de vista tico considero inadmisible que sea a posteriori cuando el equipo de expertos revele su total desconocimiento de los procesos in vitro relacionados con la tcnica. El hecho de que las primeras lecciones para continuar la investigacin en animales se hayan aprendido con humanos y animales se comenta por s solo. Uno se pregunta qu resultados "prometedores" se ofrecieron al comit encargado de aprobar los protocolos clnicos para decantarlo por su aceptacin, cuando los propios expertos reconocen, una vez terminados los primeros ensayos en humanos, que "nunca supieron cmo funcionaba in vitro". Sin embargo, esto no debera restar valor a una investigacin que ha proporcionado conocimientos de gran valor sobre la biologa humana y el tipo de material gentico a transferir, aunque por ahora fallen las estrategias para introducirlo de manera eficaz. 6.1 Sobre la eficacia de las TG realizadas hasta ahora: Los artculos ms recientes que evalan la eficacia de las primeras TG y sus efectos a largo plazo inducen a pensar que, hasta ahora, ms que "terapia gnica" se ha estado practicando "ingeniera gentica humana" con intencin supuestamente teraputica, escasamente avalada por los resultados. En este sentido, el riguroso informe sobre terapias gnicas encargado por Harold Varmus, director de los NIH (EE.UU.) a un comit ad hoc de 14 expertos, daba un diagnstico acertado de la situacin: "los investigadores saltan inmediatamente, en algunos casos, del descubrimiento del "gen de una enfermedad a intentar una terapia gnica, sin utilizar previamente el hallazgo como base de trabajo para tratamientos ms convencionales". No se duda que esta investigacin ser de enorme utilidad algn da. Pero "debe dedicarse ms esfuerzo a intentar contestar preguntas bsicas en el laboratorio y menos a probar terapias en pacientes". El informe reconoce que "a rush of prematurely optimistic publicity risks eroding public confidence and damaging the field" y aconseja a los investigadores mostrarse "more restrained" en la comunicacin de sus hallazgos y a la hora de suscitar expectativas relacionadas con la TG. Segn Stuart Orkin (Harvard Medical School), "there was a uniform feeling that there has been an overselling of current research in the field, wich has led to an inaccurate perception of success. Despite anecdotal claims to the contrary, clinical efficacy has not been definitively demonstrated in any gene therapy protoco"l. Por eso no entiendo cmo personas supuestamente conocedoras de la cuestin juegan a despertar expectativas injustificadas que pueden contribuir a motivar decisiones reproductivas

irresponsables en posibles destinatarios: "De una forma un poco arbitraria podemos dividir las aplicaciones mdicas ms inmediatas del conocimiento del genoma en diagnsticos y teraputicas. Estas ltimas se pueden subdividir en directas (terapia gnica propiamente dicha) y en indirectas (farmacologa)". 6.2 En relacin con el empleo de sondas de cidos nucleicos antisentido: Esta tcnica fue presentada en sus comienzos como "terapia antisentido", por ms que se hallaba en fase de estricta experimentacin inicial. Conforme a las previsiones, tendra un gran impacto en el tratamiento de las principales enfermedades humanas (cncer, enfermedades cardiovasculares, inmunes alergias- y autoinmunes, etc.), reforzado por el conocimiento detallado de la secuencia de todos los genes humanos que aportara el PGH. Despus de haberse aplicado a humanos en varios protocolos recientes, las ltimas conclusiones sugieren, una vez ms, que donde se dijo "terapia" slo hubo "ingeniera", con un desconocimiento alarmante de aspectos bsicos del ensayo que debieran haberse estudiado in vitro ms exhaustivamente. Me remito, de nuevo, a las ltimas impresiones de varios expertos directamente implicados en la investigacin: "lo mejor que se puede decir es que "los compuestos antisentido no funcionan tal y como los investigadores esperaban"; (...)"estamos diseando oligonucletidos que no interactan con nada ms all de su objetivo"; (...) "muchos temen que buena parte de los efectos positivos dados a conocer se deban no precisamente a mecanismos antisentido sino a otros mecanismos adicionales implicados". Y, otra vez a posteriori, los lamentos: "Es demasiado pronto para aplicar estas tcnicas a humanos, cuando ni siquiera sabemos cmo funcionan en el tubo de ensayo. De cara al futuro inmediato no se proyectan "terapias", sino "ensayos de ingeniera gentica" destinados a aplicar las lecciones aprendidas con humanos y animales". Y la correcin del enfoque inicial apunta hacia una aproximacin no exclusivamente genmica: no basta dirigir los oligonucletidos al gen diana, sino que ser preciso disear molculas antisentido capaces de interactuar con las protenas asociadas al gen, implicando ms mecanismos y niveles que el gentico. 7. Dos ltimos ejemplos ilustrativos El primer ensayo de transferencia gnica a humanos de Anderson, Blaese y Rosenberg en 1990, usando clulas de retrovirus transformadas para potenciar la respuesta inmunitaria contra melanomas malignos pretenda verificar que la infeccin retroviral no afectaba las propiedades funcionales de las clulas en las cuales el gen transferido se usaba como marcador. A pesar de ser considerado por todos el primer ensayo de terapia gnica, no fue un caso de tratamiento teraputico, sino simplemente un experimento de cara a la investigacin bsica. La expresin "TG" habra que reservarla para tratamientos dirigidos a corregir alteraciones fenotpicas. Dos ejemplos de TG gnica de sustitucin fueron los ensayos para la ADA y la fibrosis qustica. Un aspecto importante de la discusin en el futuro ser determinar qu es una enfermedad y un riesgo en el contexto de una medicina genmica preventiva. Hay un cierto consenso entre los expertos en no considerar aconsejable ni admisible la TG en lnea germinal ni la TG perfectiva, orientada a mejorar ciertas caractersticas o rasgos de un individuo. Pero algunos casos se prestan a debate.

Se ha aprobado un protocolo de ensayo de multirresistencia a frmacos importante para pacientes con un cncer avanzado. Mediante tcnicas de transferencia gnica se capacita a las clulas de la mdula de un paciente para que resistan los devastadores efectos secundarios de la quimioterapia. Este incremento de la resistencia natural de las clulas hematopoyticas podra convertirse en una terapia fundamental contra el cncer. En este caso, no se trata de eliminar o sustituir un gen por otro que sintetice correctamente un producto necesario, puesto que los niveles de expresin MDR en las clulas de tejido hematopoitico de los pacientes bajo tratamiento es normal. Lo que hacemos es introducir molculas informacionales que codifican la produccin de sustancias supuestamente tiles para destruir las causas de las clulas cancergenes, las condiciones bajo las que se desarrollan y, finalmente, los efectos de la enfermedad. De hecho, la insercin del gen MDR supone incrementar un rasgo natural de nuestras clulas, y esto es lo que significaenhancement en el contexto de la transferencia gnica humana. Un gen MDR adicional mejora la resistencia de nuestras clulas contra los frmacos anti-cncer, p.ej., y le proporciona al individuo una propiedad que puede durar bastante ms de lo que requiere el propio tratamiento, puesto que ADN exgeno introducido por un retrovirus en el genoma de la clula puede persistir en las clulas infectadas. Estamos, pues, ms bien ante un caso de ingeniera gentica humana perfectiva que ante un ensayo de TG. Aunque la mejora no constituye en s misma el propsito de la transferencia, esto no significa sino que la mejora mediante transferencia gnica se convierte en mero medio en el contexto de una patologa. De ah a que la TG se aplique para la mejora perfectiva como un fin, sin ms referencia a patologas concretas, no hay ms que un paso. III El caso de la clonacin NOTA: esta seccin est escrita en forma de notas de orador. En breve aparecer un artculo elaborado. La Tcnica (clulas mamarias totalmente diferenciadas (reprogramacin) No deberamos hablar de "fotocopias genticas": El vulo contiene ADN mitocondrial propio Difcilmente las instrucciones genticas de Dolly se vern sometidas a la misma presin de idnticos estmulos en el medio intrauterino. Interacciones complejas entre genes y entorno Peculiar insercin en el medio externo (ambiente, interacciones sociales...) El ADN es un programa de instrucciones abiertas y muy flexibles. La utilidad de Dolly como animal no es aplicable, normalmente, al ser humano: Sera grande en combinacin con tcnicas de IG y transferencia de genes tiles para producir medicamentos u otras sustancias. Se obtiene un individuo molde / rentable y se copia cuanto se quiera. Mantener intactos genotipos de valor probado. Recuperar especies en vas de extincin Riesgos: Prdida de diversidad gentica Tendencia a la uniformidad en ganado Aplicable a humanos? Muy probablemente, antes o despus. Cundo?

En combinacin con un eventual TG imaginable En hipotticas circunstancias personales / prdida de seres queridos Observaciones: Un individuo clnico tendra la misma dignidad que los dems humanos Ni su individualidad ni sus derechos como persona ser varan reducidos Nunca sera una "copia comportamental" de nadie (ni Hitler ni Einstein) Nuestra identidad depende mucho ms del nivel neuronal que del gentico. Identidad gentica no es sinnimo de identidad biolgica ni identidad personal Reflexin crtica: Quin decide qu es "genotipo probado" para sugerir que merece ser copiado? Quin es nadie para condicionar caracterstas biolgicas de terceros? Quin prefiere saberse fruto de un diseo humano y no del azar evolutivo? Podran condicionar estas reflexiones la personalidad de un individuo? Hay ms informacin y comentarios sobre la clonacin en este sitio web (artculos de Enrique Iez): Tras las huellas de Dolly Clonacin: aspectos tcnicos Clonacin: aspectos ticos Para informacin cientfica sobre la terapia gnica, vase el artculo de Juan Jos Oliva 1997 Miguel Moreno Muoz