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Mas Snchez, E; Ciriza Astrain, J; Lacasa Benito, I; MIana-Mena, J; Osta Pinzolas, R. Laboratorio de Gentica, Bioqumica y Grupos Sanguneos.

Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. * E-mail: osta@posta.unizar.es Palabras clave: terapia gnica, transgn, DNA, fase clnica. Resumen: Terapia gnica es el proceso por el cual un nuevo gen es introducido en clulas de un individuo para producir un efecto teraputico. Se realiza una breve descripcin de la metodologa utilizada y de algunas enfermedades en las que ya se est experimentando en fase clnica. Zaragoza, 10 de septiembre de 2001 1. Qu es la terapia gnica? 2. Introduccin al transgn 3. Enfermedades candidatas a la terapia gnica 1. Qu es la terapia gnica? Podemos definir la terapia gnica como el proceso por el cual un nuevo gen es introducido en clulas de un individuo para producir un efecto teraputico. Dicho efecto puede ser una activacin o una supresin de alguna funcin fisiolgica que se est produciendo incorrectamente en el individuo a tratar. Analicemos un poco ms los dos efectos teraputicos que este gen introducido puede realizar. En el caso de activar una funcin, podemos fijarnos en el caso de la inmunodeficiencia combinada severa donde la enzima ADA (adenosin desaminasa) est fallando. Lo que se ha intentado en esta enfermedad es introducir el gen que codifica para esta enzima de forma que realice la funcin que en el organismo no est realizando correctamente. Hoy en da sigue en experimentacin aunque ya en fase I y II en humanos. Respecto a suprimir una funcin que est siendo errnea o perjudicial para el organismo, podemos fijarnos en el caso del cncer. En esta enfermedad, hay una proliferacin incontrolada de clulas tumorales que causan un dao en el organismo. La terapia gnica en este caso intenta suprimir a esas clulas

tumorales introduciendo genes que denominaremos "asesinos" hacia estas clulas defectuosas para eliminarlas, evitando as la proliferacin de stas y por tanto el desarrollo incontrolado del tumor. El tratamiento del melanoma fue una de las primeras pruebas realizadas. Los tipos de terapia gnica existentes respecto al modo de introducir el gen en el organismo pueden ser clasificados en "in vivo" y "ex vivo". La terapia gnica "ex vivo" consiste en la realizacin de una primera fase en el laboratorio, de modo que obtenemos clulas modificadas genticamente (contiene el gen que queremos expresar en el organismo) y que posteriormente introduciremos en el individuo. La terapia gnica "in vivo" consiste en la introduccin del gen mediante un vehculo para que lo inserte en las clulas del paciente. Estos vehculos son los llamados vectores (tambin utilizados "in vitro"). Antes de explicar ms detalladamente el modo de introduccin del transgn y ver las enfermedades en las que se aplica la terapia gnica, es conveniente definir de forma clara qu es un transgn, tambin denominado construccin gentica. Podramos definirlo como un conjunto de uno o ms genes y secuencias reguladoras que controlan la expresin de ste. Este transgn es el que tiene la funcin teraputica, y es el que la terapia gnic Hasta el momento no se ha realizado ninguna experiencia, a pesar de ser lo ms idneo en un tratamiento, debido a su dificultad. Actualmente la mayora de las experiencias se estn realizando en modelos animales, pero tambin existen ya ensayos clnicos en humanos. Para conocer en qu situacin se encuentran dichos ensayos clnicos se puede visitar la pgina web http://www.wiley.co.uk/wilechi/genmed/clinical/relatedsites.htm actualizada de forma continua y donde podemos encontrar: las enfermedades que se estn tratando, los vectores que se estn utilizando, los pases que lo llevan a cabo y los resultados de las experiencias realizadas. Como datos ms interesantes podemos decir que el 50% de las pruebas se estn llevando a cabo con vectores retrovirales, siendo la enfermedad ms sometida a este tipo de pruebas el cncer. Estados Unidos es el pas donde se estn realizando mayor nmero de experiencias seguido por la Unin Europea. 2. Introduccin del transgn A pesar de que no es fcil la clasificacin, hemos credo conveniente dividir el modo de introduccin en dos tipos: los directos y los que utilizan determinados vehculos (sistemas indirectos).

2.1- Mtodos directos SISTEMAS QUMICOS Transferencia con fosfato de calcio Se empez a usar esta tcnica en los aos 60, pero fue en los 70 cuando se empez a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfeccin. Se basa en la precipitacin del DNA exgeno y los iones de calcio, provocando que la clula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfeccin puede llegar al 10% de las clulas, aunque suele ser transitoria. No es una tcnica que provoque toxicidad en las clulas pero la expresin del transgen es muy pequea. nicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicacin es "ex vivo".

SISTEMAS FSICOS Microinyeccin Consiste en colocar el DNA mediante una inyeccin en el ncleo de las clulas. Al introducirlo directamente all, evitamos la degradacin citoplasmtica y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualizacin. Las clulas que sobreviven y han insertado el material gentico presentan una alta eficacia de expresin del mismo. La tcnica es muy laboriosa y necesita clulas aisladas para su realizacin. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyeccin en embriones se denomina terapia gnica germinal siendo un mtodo "in vivo".

Electroporacin Se introduce la construccin gnica mediante un choque elctrico a las clulas que provoca la formacin de poros en sus membranas , por donde entra el transgn. Est especialmente indicado para clulas con una alta tasa de proliferacin. Sin embargo, muchas clulas mueren al no soportar el choque elctrico por lo que muchas veces no es la forma ms indicada en algunos tipos celulares.

DNA desnudo Consiste en la introduccin del DNA en una solucin salina o srica, normalmente mediante inyeccin intramuscular, para conseguir la expresin del transgn. Se ha observado actualmente expresin en timo, piel, msculo cardaco y msculo esqueltico. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la clula aunque se postula que es a travs del complejo del poro nuclear.

Tiene un bajo porcentaje de clulas transfectadas, no hay integracin en el genoma y una vez inyectado no hay replicacin en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realizacin de la terapia gnica "in vivo".

2.2- Mtodos directos (mediados por vectores) VECTORES NO VIRALES Liposomas En 1965 se descubri que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipdica a semejanza de una clula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la clula, pero hasta 1980 no se consigui una eficacia de transfeccin adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catinicos y liposomas aninicos.

Liposomas catinicos Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lpidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se estn probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro". Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradacin al transgn hasta su llegada al ncleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene lmite. Podemos hacerlos llegar a tejidos especficos incluyendo receptores en la capa lipdica. Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfecin, una expresin transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes sricos.

Biolstica o Gene-gun Consiste en el bombardeo de los tejidos con partculas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de all el nombre de la tcnica). La capacidad de penetracin es limitada usndose en lneas celulares, epidermis, msculo e hgado. Su expresin es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta tcnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de clulas animales) e "in vivo" (en el caso de clulas vegetales).

Vectores virales Esta metodologa comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar clulas de mamfero. El desarrollo en 1989 de las clulas empaquetadoras (aportan la composicin proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que sta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodologa al aumentar la titulacin en virus no patgenos. En todos los casos vamos a eliminar el mayor nmero de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exgeno. Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta el momento los virus ms utilizados en terapia gnica son los siguientes: - Retrovirus Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes teraputicos relativamente grandes (un mximo de 8 Kb). Necesitan de clulas empaquetadoras para su obtencin. Se transfiere el DNA del virus mediante la tcnica del fosfato de calcio a las clulas empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transduccin en la cual introducimos la construccin gnica de inters. Los virus inyectados en el husped integran su DNA en el genoma del husped expresando as el gen que le hemos aadido. Como las protenas del virus no son expresadas por el husped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una

alta eficacia de transduccin y tambin de expresin, siendo un sistema bien estudiado. Sin embargo, nicamente sirven para infectar clulas del husped que se encuentran en divisin. Adems los ttulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integracin en el genoma es al azar. Existen tambin vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es ms complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus.

- Adenovirus Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exgeno. Normalmente en terapia gnica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos. En este caso no se necesita la integracin del material hereditario del virus en el del husped para su replicacin, por lo tanto tampoco el transgn ser introducido en el genoma de la clula. Y por tanto tampoco necesitan que las clulas infectadas estn dividindose para su replicacin. La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transduccin, al igual que la expresin de la construccin gnica introducida, sin embargo sta es transitoria (pocas semanas). Esto ltimo obligara a tratamientos peridicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

- Virus adenoasociados (VAA)

Son parvovirus, contienen DNA como material gentico, y requieren la coinfeccin con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exgeno es pequea, slo de 5 Kb. Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la clula durante la replicacin, por lo que la transduccin (la cual es altamente eficaz) es estable en la clula diana. Adems pueden infectar tanto a clulas en divisin como a las que no lo estn (de gran importancia para la terapia gnica "in vivo"). Los vectores AAV no estn implicados en ningn tipo de enfermedad humana. Adems el riesgo de una respuesta inmune est minimizado ya que no produce protenas vricas. Sin embargo existen tambin una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todava no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus.

- Herpesvirus Son virus DNA cuyas clulas diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todava conocemos de esta familia de virus dificulta su utilizacin. La gran ventaja es el gran tamao de su DNA , que les permite aceptar varios genes teraputicos, incluso podran ir con sus propias regiones reguladoras. Uno de los inconvenientes es que habra que eliminar las secuencias que codifican para las protenas lticas del virus que causan la muerte de las clulas a las que infectan.

Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilacin de las caractersticas que deberan presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia gnica:

- permitir la incorporacin y expresin regulada durante el tiempo conveniente, de uno o ms genes necesarios para la aplicacin clnica requerida - ser especfico en su transferencia gnica - ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria - ser estable y fcil de obtener 3. Enfermedades candidatas a la terapia gnica Contrariamente a lo que en principio se pensaba, las enfermedades hacia las que se ha dirigido la terapia gnica no siempre corresponden a enfermedades genticas. Entre las pruebas realizadas se han propuesto distintos tipos de patologas a tratar con esta metodologa: * enfermedades monognicas * cncer * enfermedades infecciosas * otras enfermedades Trataremos sobre los tres primeros apartados, comentando algunos ejemplos de enfermedades que ya se encuentran en ensayos clnicos con humanos: 3.1- Enfermedades monognicas INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA El gen defectuoso codifica una parte de un receptor celular que enva las seales a los progenitores de las clulas T y NK, componentes cruciales del sistema inmunitario. Sin el mando de este gen, las clulas no se desarrollan, no crecen y tampoco proliferan. Los pacientes estn indefensos frente a la ms leve infeccin. Los afectados estn obligados a vivir en el interior de una burbuja estril, bajo un estricto control hasta que se sometan a un trasplante de mdula sea. En la actualidad existen 8 grupos de investigadores trabajando en esta enfermedad en fase I II. En todos los casos usan como gen terapetico la adenosin desaminasa, y como vector un retrovirus, variando las clulas diana a las que va dirigido el vector as como la va de administracin de ste.

FIBROSIS QUISTICA La fibrosis qustica es una enfermedad heriditaria, autosmica recesiva frecuente en la raza caucsica (el gen defectuoso codifica para el canal de cloro conocido como CFTR). Se trata de una enfermedad generalizada de las glndulas exocrinas, caracterizada por un transporte anormal de electrolitos, que conduce a una enfermedad crnica obstructiva de los pulmones, insuficiencia pancretica exocrina y aumento de la cantidad de electrolitos en el sudor. La enfermedad suele manifestarse por problemas respiratorios asociados con manifestaciones digestivas, diarrea crnica y retraso del crecimiento. Esta es la forma de presentacin ms frecuente. Sin embargo, a lo largo de la vida pueden aparecer signos y sntomas que configuran la historia natural de la enfermedad. Actualmente existen 27 lneas de investigacin en fase I II que en la mayora de los casos (25 de ellos) utilizan como transgn CFTR, como clulas diana, las clulas del epitelio del tracto respiratorio (nasal y bronquial), siendo la via de administracin en forma de aerosol. La nica diferencia entre unos casos y otros son los vectores utilizados: liposomas y adenovirus. HEMOFILIA

Existen dos tipos de hemofilia: la hemofilia "A" donde falla el factor VIII c: coagulante y la hemofilia "B", donde falla el factor IX c: coagulante. Un hemoflico que padezca hemofilia A o hemofilia B, no sangra con mayor rapidez que las dems personas, sino que sangra ms tiempo del habitual, y como su proceso de coagulacin no es el normal, precisa administrarse el factor carente o deficitario de la coagulacin con el fin de alcanzar unos niveles ptimos que le permitan una buena coagulacin y pare el sangrado. La hemofilia se manifiesta en forma de hemorragias, que pueden ser espontneas o producidas por algn golpe o trauma. Las hemorragias internas que pueden empezar de forma espontnea sin causa aparente, si tardan en controlarse pueden daar las articulaciones y los msculos. Este tipo de hemorragia puede ser incluso ms grave que las hemorragias que afloran al exterior, aunque stas sean ms llamativas. Hoy en da existen 6 lneas de investigacin en fase I II, de las cuales 3 estudian la hemofilia A, usando como transgn el factor VIII, y las otras 3 la hemofilia B, usando como transgen el factor IX. Las 6 lneas son muy diversas: - vectores utilizados: retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, DNA desnudo. - via de administracin usadas: subcutnea, intramuscular, intraheptica, intraperitoneal, intravenosa. Existen ms enfermedades que se estn tratando las cuales pueden ser consultadas en la pgina web:http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/. CNCER El cncer es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento excesivo y descontrolado de clulas que invaden y daan tejidos y rganos. Los distintos cnceres presentan caractersticas y comportamientos diferentes, lo cual dificulta mayormente cualquier tipo de terapia. Por todo ello las investigaciones preclnicas y clnicas en la terapia gnica del cncer estn orientadas hacia cuatro categoras distintas de estrategias: - La destruccin de las clulas tumorales mediante la expresin en ellas de productos txicos, o en su defecto, capaces de activar drogas que s lo son.

- La estimulacin de la respuesta inmune contra el tumor, potenciando los mecanismos del sistema inmune o modificando las clulas cancerosas para hacerlas ms susceptibles a su destruccin. ia (alta virulencia o alto nmero de afectados) se ha profundizado ms en ellos. - MELANOMA El melanoma es una enfermedad de la piel consistente en una transformacin cancerosa (maligna) de los melanocitos , que son las clulas que dan color a la piel. El melanoma generalmente ocurre en adultos, pero puede ocasionalmente encontrarse en nios y adolescentes. El melanoma es mucho ms grave que otros tipos de cnceres de piel, como por ejemplo los llamados epiteliomas , que se originan en las clulas basales o escamosas (otros tipos de clulas de la epidermis). Como la mayora de los cnceres, el melanoma se trata mejor cuando se detecta pronto. El melanoma puede diseminarse (por metstasis) rpidamente a otras partes del cuerpo a travs de la sangre o del llamado sistema linftico (Los ganglios linfticos son estructuras pequeas en forma de alubia, que se encuentran en todo el cuerpo y cuya funcin es producir y almacenar clulas que combaten las infecciones). Hasta momento existen 79 grupos investigadores trabajando en fases clnicas I II utilizndose genes que corresponden a molculas participativas en el sistema inmune (antgenos, complejo de histocompatibilidad, citoquinas,...). En la mayora de los casos las clulas diana son las clulas tumorales, siendo variada la va de administracin y los vectores usados. - GLIOBLASTOMA Los tumores primarios del Sistema Nervioso Central (SNC) constituyen alrededor del 2% del total de las neoplasias en el adulto y el 20% en nios. Los gliomas son el tipo ms frecuente, con una incidencia del 50% en la mayora de los casos. Actualmente existen 19 grupos investigando sobre terapia gnica en glioblastomas. Se ha alcanzado la fase III por parte de algn grupo, siendo generalmente usados los retrovirus introducida por via intratumoral, tratndose de una terapia "in vivo". El gen usado ms frecuentemente es la tirosina quinasa (TK). ENFERMEDADES INFECCIOSAS

- SIDA (Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirido) Las siglas SIDA significan sndrome de inmunodeficiencia adquirida. Es una enfermedad infecciosa producida por el virus de la inmunodeficiencia humana (conocido con las siglas VIH) que afecta al sistema inmunitario disminuyendo las defensas del organismo. De los 36 casos de estudios de terapia gnica para enfermedades infecciosas en fase clnica, 35 de ellos son sobre el SIDA, todos ellos se encuentran en fase I II. El vector ms usado es el retrovirus que se suele aplicar va intravenosa. Las clulas diana son clulas sanguneas siendo frecuente introducir genes de la cpside o la envoltura del virus HIV para que el organismo las reconozca y reaccione as el sistema inmunitario. Existen ms enfermedades que se estn tratando las cuales pueden ser consultadas en la pgina web:http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/ En el caso de Espaa los casos clnicos que existen en dicha base de datos son:

ID

Pas

Investigador Glioblastoma

Indicacin Carcinoma Hepatocelular y pancretico Carcinoma colorrectal, pancretico y hepatocelular

Gen (es) HSV-TK HSV-TK IL-142

139 Espaa J.M. Izquierdo 425 Espaa Jess Prieto 570 Espaa Bruno Sangro