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Tema 12.1 Componentes de un sistema de terapia gnica y vas de administracin.

El desarrollo de la gentica molecular durante los ltimos aos, y especialmente toda la informacin derivada del Proyecto Genoma Humano, han propiciado que podamos afrontar la modificacin directa de las alteraciones genticas o la utilizacin de cidos nucleicos como agentes teraputicos. La terapia gnica es una nueva modalidad teraputica surgida a finales de los aos 80, y que puede definirse como la transferencia de cidos nucleicos (ADN ARN) con fines teraputicos. Toda estrategia de terapia gnica se basa, por tanto, en la transferencia de cidos nucleicos (transferencia gnica) al interior de un grupo de clulas. Estas clulas pueden ser las clulas enfermas cuyo dao se pretende reparar, o bien un grupo de clulas normales que se modifican genticamente para que sean las efectoras de una accin teraputica, por ejemplo sintetizando una protena concreta. Por lo tanto, todo sistema de terapia gnica es anlogo a un sistema de transporte, en el que hay un agente que es transportado y un vehculo de transporte. En nuestro caso, el agente transportado es un cido nucleico y el vehculo encargado de llevarlo al interior de las clulas diana se denomina vector. Segn el modo de hacer llegar el vector (conteniendo el agente teraputico) a las clulas diana, es ya clsica la distincin entre terapia gnica ex vivo y terapia gnica in vivo. En el primer caso, la administracin del vector se realiza fuera del cuerpo: se obtiene una biopsia del rgano de inters, se expanden las clulas mediante cultivo celular y se ponen en contacto con el vector mientras estn siendo cultivadas. Esto hace posible seleccionar las clulas que hayan sido modificadas genticamente y re-introducirlas en el paciente. En la administracin in vivo, el vector teraputico se administra directamente al individuo enfermo por cualquiera de las vas habituales (intramuscular, oral, intravenosa, intraportal, subcutnea), escogiendo aquella que nos permita alcanzar la mxima eficacia teraputica.

La Figura 12.1 ilustra los componentes de un sistema de terapia gnica y las vas de administracin.

Tema 12.2 Naturaleza del cido nucleico teraputico

Segn el efecto biolgico que pretendemos obtener, el agente teraputico ser de distinta naturaleza. En general, podemos clasificar los cidos nucleicos teraputicos en tres grupos, dependiendo de si buscamos la correccin directa de una mutacin, la suplementacin gnica, o la inhibicin de la expresin. a) En los ltimos aos se ha conseguido corregir especficamente defectos a nivel del ADN de distintos modos. Uno de los primeros sistemas en ser desarrollados fue el de los quimeraplastos, molculas quimricas (hbridas) formadas por ADN y ARN que son capaces de reconocer

especficamente una mutacin y corregirla. Este tipo de tecnologa funciona con cierta eficacia cuando se aplica a clulas en cultivo (in vitro), y es de esperar que en el futuro se pueda utilizar tambin in vivo. Los quimeraplastos son oligonucletidos formados por una molcula lineal de ADN que contiene un tracto de 5 desoxi-ribonucletidos complementarios a la secuencia genmica que se quiere corregir. Es importante que esta regin correctora est flanqueada por fragmentos de 10 ribonucletidos (ARN). El oligonucletido se empareja especficamente con la regin mutada y los sistemas de reparacin celulares llevan a cabo la reparacin de la mutacin tomando como molde la base correspondiente del oligonucletido teraputico. Tericamente, es posible disear oligonucletidos ARN/ADN para corregir directamente las mutaciones puntuales que causan las enfermedades hereditarias ms frecuentes.

Figura 12.2 Estructura de un quimeraplasto. . En los ltimos aos se ha avanzado mucho en el desarrollo de nucleasas con dedos de zinc, conocidas como tijeras moleculares. Son unas protenas compuestas por un dominio de unin a ADN (formado por varios dedos de Zinc) fusionado con un dominio de rotura de ADN (habitualmente el enzima de restriccin FokI) Los dedos de zinc pueden disearse para la unin especfica a una regin del genoma, y esto crea una rotura de doble cadena del ADN que se repara mediante recombinacin homloga u otro sistema de reparacin del ADN.

La Figura 12.3 ilustra el funcionamiento de nucleasas de dedos de zinc.

b) En el caso de mutaciones que simplemente producen prdida de funcin, puede ser suficiente la suplementacin gnica, es decir, suplementar las clulas con copias normales del gen sin preocuparnos de corregir las mutaciones presentes en el ADN genmico. Lo ms habitual en estos casos es que el agente teraputico sea una unidad de expresin en la que la transcripcin del gen en cuestin viene regulada por promotores virales potentes, por promotores regulables o por promotores especficos de un tipo celular concreto.

La Figura 12.4 muestra un plsmido de expresin para suplementacin gnica.

c) Cuando el defecto gentico que tratamos de corregir origina una ganancia de funcin, como suele suceder en mutaciones con efectos oncognicos, lo lgico es intentar inhibir la expresin del gen que est causando el fenotipo aberrante. Los agentes teraputicos ms utilizados en estas circunstancias son las molculas antisentido o los ribozimas. Los oligonucletidos antisentido pueden inhibir directamente la expresin de un gen al unirse a la doble hlice de ADN mediante enlaces tipoHoogsteen, formado una triple hlice que impide la transcripcin mediada por la ARN polimerasa II. Estos oligonucletidos suelen estar modificados qumicamente para aumentar su estabilidad y eficacia, siendo las principales modificaciones los grupos fsforo-tioato en el esqueleto desoxi-ribosa-fosfato de los oligonucletidos, o bien los cidos nucleicos en los que el enlace fosfo-dister viene substituido por un enlace peptdico (denominados Acidos Nucleicos Peptdicos, PNA). Los ARNm antisentido son capaces de emparejarse con los ARN sentido y formar molculas bicatenarias de ARN que no pueden ser traducidas y son digeridas por la RNAsa H celular. Los ribozimas, pequeas molculas de ARN con actividad cataltica, pueden ser diseados para reconocer un ARNm especfico y degradarlo merced a su actividad endonucleoltica especfica. En general, la utilizacin de molculas antisentido y ribozimas est limitada por la baja eficacia que muestran todava en modelos in vivo.

La Figura 12.5 muestra los distintos tipos de molculas utilizadas para inhibir la expresin gnica. Hoy en da, las mejores perspectivas de inhibicin eficaz y especfica de la expresin gnica se basan en la interferencia de ARN, un mecanismo de silenciamiento gnico post-transcripcional descrito en plantas y C. elegans que consiste en la degradacin de ARN mensajeros endgenos por la presencia de molculas pequeas de ARN de doble cadena homlogas al mensajero que se destruye. Este proceso depende de una RNAasa tipo III llamada DICER, responsable de la formacin de los ARN pequeos, y de un complejo llamado RISC (RNA Induced Silencing Complex) que contiene unas protenas del complejo ARGONAUTA y los ARN pequeos que dirigen el complejo a la diana. Se ha visto que este mecanismo tambin juega un papel importante en la regulacin gnica en humanos, ya que el anlisis del genoma ha revelado la presencia de genes que codifican ARN pequeos (aproximadamente 75 nucletidos) que forman horquillas y que son procesados por DICER y protenas del complejo Argonauta para generar ARN intereferentes pequeos, de unos 21-22 nucletidos. Estos genes endgenos se denominan miRNA(microRNA), para diferenciarlos de los siRNA que provienen de molculas bicatenarias de ARN de procedencia externa. Actualmente se piensa que ambos tipos de molculas (miRNA y siRNA) tienen la misma va efectora, que acta impidiendo la traduccin (si la homologa de la molcula interferente con el ARN mensajero no es total), o bien eliminando los mensajeros si la homologa es total. Sorprendentemente, tambin se ha visto que las repeticiones centromricas y los transposones, cuando se transcriben, dan lugar a ARN interferentes pequeos que utilizan este mecanismo para modificar la cromatina, induciendo metilacin en las histonas en el ADN y provocando la formacin de heterocromatina o el silenciamiento transcripcional. En los ltimos aos se ha demostrado que se pueden utilizar siRNAs microRNAs para inhibir la expresin de genes endgenos, generando molculas interferentes especficas para un gen concreto. Por ejemplo, se ha conseguido silenciar genes endgenos en clulas humanas mediante siRNAs dirigidos especficamente frente a promotores concretos. Dicho silenciamiento se lleva a

cabo por metilacin de los dinucletidos CpG de esos promotores y por metilacin de la lisina 9 de la histona H3 de esa regin. El avance ms espectacular usando esta tecnologa tuvo lugar en 2004, cuando un grupo consigui reducir hasta un 40% los niveles de colesterol en ratn, usando unos siRNA sintticos conjugados con colesterol que fueron injectados directamente en la vena de la cola. Los siRNA fueron captados eficazmente por receptores del hgado, yeyuno y otros rganos y provocaron la degradacin de los ARNm endgenos de apolipoprotena B, con el consiguiente descenso en los niveles de LDL y colesterol total. Figura 12.6 El video ilustra el funcionamiento de los microARNs

Tema 12.3 Tipos de vectores y su utilizacin en distintas estrategias de transferencia gnica.


Los cidos nucleicos teraputicos han de ser vehiculizados al interior de las clulas diana por medio de vectores adecuados. Se distinguen dos tipos fundamentales de vectores: los basados en virus (vectores virales) y los vectores sintticos (vectores no virales) que intentan emular la capacidad natural que tienen los virus de introducir cidos nucleicos en las clulas. La siguiente Tabla resume las principales caractersticas de los vectores que se mencionarn a continuacin, y que es bueno repasar al final de este tema:

Como introduccin general, se puede decir que el vector ideal de terapia gnica debera ser fcil de preparar, tener gran capacidad para aceptar genes teraputicos de gran tamao, funcionar tanto en clulas en divisin como en clulas quiescentes, ser totalmente inocuo e invisible para el sistema inmune, fcilmente dirigible a distintos tipos de clulas diana, ser capaz de persistir en las clulas durante periodos prolongados y poseer elementos reguladores de la transcripcin del gen teraputico que sean fcilmente regulables para poder variar los niveles del producto teraputico segn sea necesario. A continuacin se vern algunos ejemplos de cmo

se han conseguido mejorar los distintos tipos de vectores para dotarlos con alguna de estas propiedades.

Tema 12.3.2 Vectores no-virales


Los Vectores no-virales representan un intento de imitar las funciones de los virus como vehculos de transferencia gnica mediante sistemas sintticos, de forma que en principio son vectores mucho ms seguros desde el punto de vista de su peligrosidad biolgica y su patogenicidad. En este sentido, los vectores no-virales no se diferencian conceptualmente de los frmacos a los que estamos habituados. La principal limitacin de este tipo de vectores es que, en la actualidad, su eficacia in vivo es mucho menor que la de los vectores virales. Esto se debe a la inestabilidad propia de sistemas sintticos complejos y a las diferentes barreras que han de superar: Los complejos entre el cido nucleico y los dems componentes de estos sistemas han de ser estables tras su administracin, y no desintegrarse antes de alcanzar las clulas. Por otra parte, la biodistribucin de estos preparados hace que la concentracin efectiva en las clulas diana sea baja, por lo que es importante que lleven en su superficie algn tipo de ligando para receptores especficos de las clulas a las que lo queremos enviar. Habitualmente, estos complejos entran en las clulas por endocitosis, de manera que quedan expuestos al ataque de las enzimas lisosomales. Para evitar esto, se intenta incluir en estos vectores algn tipo de molcula que altere el pH del endosoma y consiga romperlo antes de su fusin con los lisosomas y liberar as el complejo intacto al citoplasma. Estas molculas suelen ser pptidos o protenas virales que cumplen esta misma funcin en algunos tipos de virus. Una vez en el citoplasma, estos complejos han de ser lo suficientemente estables como para llegar hasta el ncleo, pues si el cido nucleico se libera muy pronto ser degradado por nucleasas citoplasmticas. Pero si son demasiado estables, el cido nucleico no conseguir liberarse y por tanto no podr entrar en el ncleo de la clula. Este compromiso entre proteccin y liberacin es quizs uno de los retos ms importantes que tienen que superar los vectores no virales para aumentar su eficacia actual. En cierta medida, la inclusin en estos complejos de alguna molcula capaz dedirigirlos al ncleo celular servira para acelerar su trnsito citoplasmtico. Por tanto, otro componente habitual en los vectores no virales son las molculas con seales de localizacin nuclear que adems permitan la entrada del cido nucleico a travs del complejo del poro nuclear, pues de lo contrario slo sern capaces de ser efectivos en clulas que estn en mitosis.

Como se ve, la tarea de construir un vector no-viral ideal equivale a intentar reconstruir en el laboratorio lo que los virus consiguen de manera natural, lo cual no es en absoluto sencillo. En cualquier caso, son uno de los campos de investigacin ms activa, sobre todo por parte de empresas farmacuticas y de biotecnologa, y es previsible que los prximos aos vean avances significativos en este terreno. Actualmente, los vectores no-virales ms utilizados son los siguientes: a) Inyeccin Directa: Lgicamente, lo ms sencillo es injectar directamente el cido nucleico (ADN desnudo) en el rgano de inters. Aunque poco eficaz, este procedimiento funciona razonablemente en ciertas aplicaciones y en algunos rganos. Por ejemplo, el msculo esqueltico es uno de los rganos que ms eficazmente incorporan un plsmido inyectado, alcanzando niveles de expresin suficientes para conseguir inmunizacin frente a protenas virales, tumorales, etc. En ocasiones se utiliza la inyeccin de ADN formulado con diversos polmeros (sobre todo poli-vinil-

pirrolidona) que lo protegen de la accin de las nucleasas y prolongan su vida media tras la administracin. Tambin se utiliza el ADN encapsulado en microesferas de polmeros biodegradables (por ejemplo, copolmeros de cido lctico y gliclico), que pueden inyectarse en un rgano y proporcionar liberacin sostenida del cido nucleico teraputico durante un periodo de tiempo ms o menos prolongado, dependiendo del tipo de polmero utilizado. Otra variedad es la transferencia gnica balstica (pistola gnica o gene gun), en la que el cido nucleico teraputico se adsorbe sobre la superficie de una bolas microscpicas de oro u otro metal inerte, que son disparadas a presin sobre el rgano diana. Es una va de administracin utilizada en la piel (para inmunizacin gnica) o a veces sobre otros rganos, pero las bolas no tienen un gran poder de penetracin (raramente superior a unos pocos milmetros).

Figura 12.15 Transferencia gnica por inyeccin intramuscular directa.

b) Complejos formados por el cido nucleico teraputico y otros componentes: son los sistemas ms complicados de elaborar y optimizar, pero los ms eficaces dentro de los vectores no-virales. El principio que subyace a todos los sistemas de este tipo es la complejacin del ADN (molcula grande con alto nmero de cargas negativas) con polmeros de naturaleza catinica (con cargas positivas), de manera que la neutralizacin de cargas da lugar a complejos ms o menos estables, de pequeo tamao, en los que el ADN est protegido de la accin de nucleasas. Suele distinguirse entre lipoplexos (cuando el ADN se compleja con lpidos catinicos) y poliplexos (ADN complejado por policationes, habitualmente poli-lisina o poli-etiln-imina). Sobre la estructura bsica de un lipoplexo o un poliplexo pueden aadirse otro tipo de molculas que acten como estabilizadores, ligandos para receptores especficos, molculas desestabilizadoras del endosoma, seales de localizacin nuclear. Por ejemplo, se ha utilizado poli-etiln-glicol para aumentar la estabilidad de lipoplexos en el torrente sanguneo y evitar la inactivacin por el suero. Asimismo, ha sido muy utilizada la unin de poli-lisina a transferrina o a orosomucoide, para conseguir unin especfica a receptores hepticos. Otra estrategia utilizada con bastante xito ha sido la formacin de lipoplexos que adems incluyen partculas del virus hemaglutinante del Japn (virus Sendai) inactivados, lo que proporciona una entrada en las clulas muy eficaz (por la fusogenicidad del virus Sendai) y buen escape endosomal.

Figura 12.16 Este video muestra la combinacin de vectores virales y no virales, con un ejemplo tomado del virus hemaglutinante del Japn (virus Sendai).

Tema 12.4 Aplicaciones clnicas de la terapia gnica.


Desde el caso de la nia Ashanti Da Silva, primer paciente de la historia tratado mediante terapia gnica en 1989 por sufrir Inmunodeficiencia Combinada Severa (dficit del enzima adenosndesaminasa), el nmero de ensayos clnicos llevados a cabo en todo el mundo ha aumentado rpidamente, de manera que en la actualidad hay varios miles de enfermos includos en protocolos clnicos de terapia gnica. Como las estrategias utilizadas son variadsimas, a continuacin se resumen las ms utilizadas hasta el momento: Terapia gnica del cncer: la estrategia ms utilizada es, sin duda, la utilizacin de los llamados genes suicidas. Se trata de transferir a las clulas tumorales un gen que codifique una protena capaz de activar un pro-frmaco inactivo a su forma activa. Es muy popular la utilizacin del gen de la timidn-kinasa del virus del Herpes Simplex (HSV-tk), que codifica una timidn-kinasa capaz de fosforilar el ganciclovir a ganciclovir-trifosfato. El ganciclovir tri-fosfato es la forma activa capaz de interferir con la replicacin del ADN y provocar la muerte de las clulas que estn dividindose activamente. Por tanto, si somos capaces de transferir el gen de la HSV-tk a las clulas de un tumor, que tienen una alta tasa replicativa, la administracin sistmica de ganciclovir conseguir matar selectivamente las clulas tumorales. Una ventaja aadida es el llamado efecto espectador (bystander), mediante el cual la timidn-kinasa producida en unas clulas puede pasar a las clulas vecinas, de forma que aunque no todas las clulas tumorales hayan incorporado el gen teraputico, el efecto citotxico es bastante homogneo en todo el tumor. Esta estrategia se ha empleado en tumores cerebrales, usando vectores retrovirales para transducir slo clulas tumorales (en divisin) pero no neuronas (que no se dividen). Tambin se ha empleado con xito en tumores hepticos, usando en este caso vectores adenovirales. Otra estrategia utilizada en terapia gnica del cncer se basa en la suplementacin de las clulas malignas con genes supresores tumorales (p53, por ejemplo). Se ha utilizado tambin la transferencia al tumor de genes que inhiben la angiognesis (endostatina, angiostatina, etc) para eliminar el tumor por falta de aporte vascular. Por ltimo, una de las estrategias que han tenido ms xito y que ofrecen mejores perspectivas de futuro es lainmunopotenciacin, es decir, favorecer la puesta en marcha de una respuesta inmune frente a las clulas tumorales. En este sentido, se han transferido los genes de gran variedad de citoquinas o molculas inmunopotenciadoras (IL-2, IL-12, GM-CSF, IFN-g, TNFa, etc.) tanto a clulas tumorales como a clulas presentadoras de antgeno (clulas dendrticas), o bien se han transferido a las clulas tumorales los genes de molculas co-estimuladoreas del complejo mayor de histocompatibildad (por ejemplo, B7.1) para favorecer la presentacin de los antgenos tumorales. El video de la Figura 12.17 muestra algunos ejemplos de utilizacin de terapia gnica frente al cncer. Terapia gnica de enfermedades hereditarias: la mayora de las enfermedades metablicas debidas a mutaciones inactivantes en genes que codifican protenas con actividad biolgica (un enzima, un factor de coagulacin, una hormona, etc) pueden abordarse mediante una estrategia de suplementacin gnica que restaure los niveles de la protena deficiente. Por ejemplo, se ha utilizado la transferencia gnica al msculo para conseguir la produccin local de distrofina en casos de distrofia muscular de Duchenne. De manera similar, se han transferido genes al msculo o al hgado para que estos rganos secreten al torrente circulatorio un factor que est ausente. En este sentido, ha tenido especial resonancia el xito alcanzado con la transferencia mediada por virus adenoasociados del gen del factor IX de la coagulacin al msculo esqueltico, para producir

niveles plasmticos de este factor que puedan corregir los defectos en la coagulacin que sufren animales hemoflicos. En los ltimos aos, hemos asistido a importantes avances en este campo, como la curacin de dos nios con adrenoleucodistrofia, la restauracin de la visin tricromtica en monos daltnicos, la curacin de un paciente adulto con talasemia, la reparacin de una mutacin causante de hemofilia mediante nucleasas de dedos de zinc, o la curacin de 13 nios burbuja. Inmunizacin frente a enfermedades infecciosas mediante transferencia gnica, con el fin de que las clulas sinteticen pptidos inmunognicos y estimulen al sistema inmune hasta eliminar el agente patgeno. Se estn ensayando inmunizaciones gnicas frente a virus (virus B y virus C de la hepatitis, virus de la gripe) u otros agentes, como el parsito de la malaria. Es bastante eficaz la inyeccin directa de un plsmido en msculo o la transferencia intradrmica mediante pistola gnica. En general, la eficacia de estos tratamientos reside en la capacidad de producir localmente una protena que sea liberada y capturada por macrfagos y otras clulas presentadoras de antgenos, que procesan esas protenas a pequeos pptidos y los presentan con molculas de clase II del sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) para estimular las clulas CD4+ (linfocitos T helper). Adems, si las clulas transfectadas expresan molculas de clase I del MHC tambin podrn presentar los pptidos recin sintetizados y estimular clulas CD8+ (linfocitos T citotxicos). Tras ms de 20 aos de trabajo, la terapia gnica est comenzando a demostrar su utilidad clnica en humanos, como se ha visto en los prrafos anteriores. De todas formas, an ser necesario esperar a los resultados de los ensayos clnicos que estn en marcha en todo el mundo. En 2011 haba 1714 ensayos clnicos activos, el 79% de ellos en fase I (estudio de toxicidad) fase I/II. El resto son ensayos en fase II (estudio de eficacia teraputica) o en fase III, y dos estn ya en fase IV. Las tablas siguientes, tomadas del sitio web del Journal of Gene Medicine, agrupan estos ensayos por tipos de enfermedad, vector o molcula teraputica: