You are on page 1of 8

Pla ant Wate er Relations Lab 

 

 

Water in the plant is in a d dynamic state e. It is continu ually moving  into the plant, within it an nd out of it. In n order to  understand a and to predict t the direction and rate of f such movem ments, the pot tential energy y of water (th he water  potential) mu ust be known n in the individ dual organs, t tissues and ce ells of the pla ant as well as in the enviro onment  (atmosphere e and soil). On nce the water r potential has been measu ured in differ ring regions o of the plant, it ts  direction of m movement is known by rem membering that water mo oves from reg gions of highe er to lower wa ater  potential. In this experime ent you will b become famili iar with the p pressure bom mb device whi ich allows one e to  measure xyle em pressure p potential (ass sumed to be in equilibrium m with the wa ater potential   of the leaf ce ells) and  the Chardako ov method of f measuring t the water pot tential of plan nt tissues. Wh hile the Chard dakov method d is still  used for mea asuring water r potential in root pieces, e embryos from m germinating g seeds, fruit pieces, and t tissue  culture expla ants, the pressure bomb an nd the thermocouple psyc chrometer have replaced its use for oth her plant  tissues. The p pressure bom mb is also used d to construct pressure‐vo olume curves for leaves, a powerful tec chnique  that gives a m measure of leaf cell osmot tic potential a and enables o one to calculate the turgor r of the plant. . Pressure‐ volume curve es can also pr rovide a meas sure of cell wall elastic pro operties.  
 

  Part 1:  P Pressure‐Vo olume Curve es (or Moistu ure‐ Release e Curves) 
 

One of the be est procedure es for determ mining components of cellu ular water po otential is thro ough the use of a  graphical technique called d the pressure e‐volume cur rve (moisture  release curve). A pressure e‐volume cur rve  describes the e relationship p between tiss sue water con ntent and the e components of tissue wa ater potential by  evaluating th he release of w water from tissues. 
 

The pressure e‐volume curv ve technique begins with a an excised sho oot or leaf an nd  uses an instrument known n as the Press sure Bomb or r Pressure Cha amber. 
 

Measuremen nt of Xylem Pr ressure Poten ntials using th he Pressure B Bomb 
 

In most rapid dly transpiring g, well‐watered plants, the e xylem wate r is under  tension or “n negative press sure.” If a cut t is made acro oss a stem, pe etiole or leaf  segment that t interrupts th he xylem elem ments, the wa ater within th hem will be  exposed to atmospheric p pressure. Sinc ce the water w within is unde er tension, th he  positive atmo ospheric pres ssure will forc ce  the water back into the xy ylem element ts,  away from th he cut surface es, or because e  the tension is s released during cutting  the xylem wa ater columns recede (snap p  back). The pr ressure bomb b forces the  water in the xylem elements back to th he  cut surface b by means of pressure arisin ng  in a pressuriz zed tank in which the  sample plant t (with its cut surface) has  been support ted. The pres ssure required d  is of the same magnitude as that of the e  original xylem m tension. We e can measur re  this pressure e by observing g a pressure  gauge attach hed to the pre essure tank,  and thereby obtain a pres ssure potentia al  value. 
From: Plant Physio ological Ecology (199 Lambers et al. 98)

tdl Spring 2013 

1

Biol 333 Plant Physiology 

 “bomb”)  Analytical scales  Air supply  Light source  Flood lamps  Magnifying glass  N2 gas  Eye protection  Plastic bags for early measurements  Coin envelopes for leaf mass        Pressure Bomb Procedure:    Your instructor will explain the operation of the pressure bomb and any special safety precautions that should  be adhered to during its operation. this will not affect  your measurement. which you will need to  calculate relative water content (RWC) for your actual pressure‐volume curve. Record the pressure reading  (convert bars to MPa) that is required just to bring the xylem sap back to the cut surface. Make sure that the lid is securely attached and that you have your safety glasses on.      Intercept is tissue saturated weight (g)              |Ψ| Fresh weight (g) tdl Spring 2013  2  Biol 333 Plant Physiology  . From these data you should be able to create a plot of the relationship between water potential (|Ψ|)  and fresh weight (g) and interpolate to x‐axis to estimate saturated weight (g). Immediately weigh sample and record (g).    2.  2. Determine water potential (Ψ) using the pressure bomb.  3.  5. The next step requires two people.) The other person will carefully observe the cut surface of the sample using the  magnifying glass provided. (You may have small leaks around the petiole or stem segment.    1. The cut  surface should protrude several millimeters above the stopper so that sap exudation from it can be readily  observed. Select a leaf or stem segment small enough to fit in the chamber and sever it with a clean cut using a razor  blade. Promptly place the petiole or stem in the rubber stopper insert and secure into the chamber. Repeat steps 2‐4 again. Let sample air dry for a period of time (shorter periods at the beginning and then aiding drying with  fans for later periods). Convert these numbers to the  more conventional MPa units when recording them. This is loss of water being held by turgor pressure. You should do this rapidly for the beginning several measurements because  initial water loss happens quickly. The original  xylem pressure potential is the same but opposite in sign to this pressure. the observer will call out NOW! The person in charge of pressurization will note the pressure  reading on the gauge and stop admitting pressurized gas to the chamber.  6. One person will very slowly pressurize the gas chamber in which your  sample has been placed. Excise a leaf or stem section from your plant with a sharp razor blade or scalpel.Materials:  Plant pressure chamber (aka.  4.    Constructing a pressure‐volume curve for your sample:  1. When the xylem sap reaches the cut surface due to pressure from inside the  chamber.

  8. Now you have the data necessary to construct your pressure‐volume curve which should look  something like the following example:        1/Ψ = 1/”balancing” pressure RWC = (fresh weight – dry weight)/(saturated weight – dry weight) A = 1/solute potential at full turgor (1/Ψs100) B = 1/solute potential at turgor loss point (1/Ψs0) C = relative water content at turgor loss point D represents turgor pressure component E represents osmotically held water     D 1/Ψ A B E C     RWC   Higher ------------------------------ lower Figure adapted from: The Physiology of Plants Under Stress (1996) Nilsen & Orcutt                         tdl Spring 2013  3  Biol 333 Plant Physiology  . even following ample  drying time.7. you should place the leaf sample in an envelope for oven drying (to determine dry  biomass). Calculate relative water content (RWC) as follows:         RWC  =      fresh weight (g) – dry weight (g)      saturated weight (g) – dry weight (g)   9. When you no longer get noticeable changes in the water potential of your leaf.

PRESSURE‐VOLUME CURVE RAW DATA:    species                                                       species                                                     time                                                       time                                                     mass                                                       mass                                                     pressure  (Mpa)                                                       pressure  (Mpa)                                                       species                                                       species                                                     time                                                       time                                                                                                  mass                                                       mass                                                     pressure  (Mpa)                                                       pressure  (Mpa)        tdl Spring 2013  4  Biol 333 Plant Physiology  .

First.    Materials  A. cork borer rs (#1 or #2). razor r blades. In a f flask. Because in the test t solution that t has no  concentration change. paraf film.0 M sucro ose solutions    Methods    1. In this s solution the ere was no net  movement of water into o or out of the s solution  that could ch hange its conc centration. the e osmotic pot tential is  identical to the water potential of the plant  tissue.73 to –0. kim mwipes.  tdl Spring 2013  5 Biol 333 Plant Physiology  . th he known osm motic  potential of t this solution is equal to the e water  potential of t the plant tissu ue. thereby caus sing a concen ntration  change in the e solution and d a change in tissue  weight that c can be measu ured.  B. assorted pipettes an nd  glassware for mixing s solutions.  Pasteur p pipettes (som me bent for de elivering test solution into  control solut tion). Considering for a  moment how w water move es (from regio ons of  higher water r potential to regions of low wer water  potential).Part 2:  The Chardakov Method for r Estimation of Water Po otential    The Chardako ov method is a simple met thod for  determining the water po otential of plant tissues  t solutions wi ith known  involving a number of test osmotic pote entials.  C. After r reaching equ uilibrium.2% w/v v in water)  0. get approximately 10 00 ml of 1. make u up five solutio ons that span n the range fr rom –2.5 M and 1.12 MPa). Y You will add t this to  your test tubes in step b. In solu utions that ha ave water pot tentials  either lower or higher tha an that of the plant  tissue.0M M and 0.    Plant ma aterials. set up a “wide‐range” contro ol and test ser ries of differe ent sucrose co oncentrations s as follows:   a. we can see how w these situations would  occur.  the test solut tion that has not changed its  concentration and whose tissue pieces s have not  weight is ident tified (steps 2 2d and 2e in  changed in w the procedur res below). Plant t tissues are ad dded to  these test solutions. water r will flow into o or out of the solution  respectively. Th herefore.  Methylen ne blue soluti ion (0..e. long g forceps. Chemical ls and Solutio ons. scalpels with blades.  this is the situation that w would also res sult in no  net gain or lo oss of weight of the subme erged  tissue.  (or ot ther section  of pla ant tissue)  From: The Physiolo ogy of Plants Under S Stress (1996) Nilsen & & Orcutt  Test tube es.  make e up five sucr rose solutions s in small beakers such tha at your solutio ons span the osmotic pote ential  range e (i. pet tri dish. Equipment.5 M s sucrose soluti ions. Using Ta able 1 as a gu uide.

Working quickly.6 20:10. Repeat the procedure  for the remaining four tubes of the test series.    c.05  0.30  0.55  0.4 Dilution (mL 0.16  0. Place each series of tubes in order of increasing  concentrations.1 20:2.60  0.    Table 1.00  0.    2.70  0.31 ‐2.884.40  0. MPa**)  ‐2.     b. **osmotic potential = s = ‐RTCs.48 ‐1.78  0.33  0.    a. T = absolute temperature = 273 + °C.2 20:3.34 ‐1.90  0.80  0. Cs = molal concentration of solute.05  0.63 ‐1. molality.3 5:20 3:27 0:25 *experimentally determined relationship:  m = (M‐0.22  0. Once you have  narrowed the range.27  0.0M  sucrose: mL water)  20:0 20:1.72  0.  b.6 20:5.07 ‐0.25  0.75  0.17 ‐2.85  0.6 10:13.66 ‐0.84  0.80 ‐0.01  0.89  0.0 20:6.You will use this wide range to run an initial test on the tissue you have chosen.06  1.20  0.g.0099)/0.8 20:13.73 ‐2.95  0.46 ‐2.12 0. and dilutions for sucrose solutions of varying osmotic potentials.00  Dilution (mL 1.00    Sucrose solution  (molality.35  0. Take your plant representing one of the treatments involved in our experiment. trim it into 2 cm length cylinders (uniformity of size is important) and immediately cover  dish to minimize drying.2% w/v in water) to each test solution and thoroughly mix the tubes by inversion with a piece of  tdl Spring 2013  6  Biol 333 Plant Physiology  .10  0.24 ‐0.0 20:8.39 ‐0. Label one series of tubes  the control series and the other series the test series. Use a cork borer  (internal diameter of 4 mm) to cut a cylinder from the appropriate plant material.15  0.55  0.00 20:0 20:2.4 20:16. add a drop of methylene blue solution  (0.38  0.61  0. Now determine the general range of water potential of your plant tissue. Molarity.12  1.5M  sucrose:mL water)  Osmotic Potential  (megaPascals. The test solutions should cover the tissue.65  0. place 2 cylinder pieces at a time on a paper towel and gently blot dry. When each tube of the test series contains two pieces of tissue. Add 5 ml of each sucrose solution to the two  correspondingly labeled test tubes (this 5 ml can be a rough measurement… e.44  0.22 ‐1.90 ‐1. support 10 test tubes in two rows of 5 in a test tube rack.6 20:8. Place this core in a  Petri dish.92 ‐0.04 ‐1.50  0.  Sucrose solution  (Molarity.45  0.10  0.4 15:15 10:15 10:23.00831. Then weigh the  2 cylinders together to the nearest 0.01 g (record this value in Table 1 of the data sheet) and transfer  them immediately to the first sucrose solution of the test series in the rear row.95  0. where R = gas constant =  0.2 20:5. Collect at least at least 10 tissue pieces (each will be 4 mm x 2 cm).58 ‐2. you will make up more solutions within that narrower range to determine a more  precise osmotic potential of the tissue. label one tube in  each row to correspond to the above sucrose solutions.75 ‐1.67  0.50  0. m*)  1. M)  1. measure 5 ml into  one of the tubes and simply pour to match the liquid level for all the others).54 ‐0. For each treatment test.

 while holding test tube against a white background. Perform these steps on  all test solutions.       3. Slowly  release a drop of the blue test solution. Repeat the testing as indicated in  above. or simply diffuses out. If the drop rises.Parafilm covering the top of the tube. to  determine whether the drop rises. Since a  closely graded concentration series was not used. After 30 minutes. Record your results in Table 2 on your data sheet. If needed. If the density of the test solution is the same as or close to that of the control  solution. the test solution has  decreased in density over its initial value. mix up solutions in a narrow range (as needed based on  your wide‐range results) and set up tubes to test your plant tissue.     e. Also cover the 5 tubes containing the same solutions without  tissue (the control series). the drop will not move up or down appreciably but will diffuse out. withdraw a small  amount of the test solution from the first tube of the test series with a Pasteur pipette. Once all tubes have been tested. the actual “null‐point” will have to be interpolated. holding the pipette about an inch under the surface of the control solution. determine more closely the water potential of your chosen plant tissue with additional tests.    a.      Water potential of sample tissue = ________________________________        tdl Spring 2013  7  Biol 333 Plant Physiology  . Conversely. the drop of the  test solution will fall. Perform  these steps on all the test solutions. falls. Record the results in Table 1 of the data sheet. if the density has increased.    d. using a bent Pasteur pipette. Weigh the 2 pieces on the analytical balance and record the weight (g). Remember that the water potential of the tissue is equal to the osmotic potential of that sugar solution  in which there is no net movement of water into or out of the tissue OR no net change in tissue weight. Transfer this  pipette to the corresponding tube in the control series (solution of identical starting sucrose  concentration).      Results and Conclusions: Interpret your results and determine an approximate water potential value for tissue  tested. remove the tissue pieces from one test tube at a time and once again  blot the surfaces dry. Record your results in in Table 1 of the data sheet. mix the test series again and then. Using your “wide‐range” results as a guide.

  Results of water potential determinations of plant tissue using solution from a narrower range of osmotic  potentials.    Tube  number                      Species  Watering  Molarity of  treatment  sucrose  Osmotic  potential (MPa)  Initial weight of  tissue pieces (g)  Direction of Drop  Movement*  Final weight of  tissue pieces (g)                                                                                                                                              *Indicate the relative movement of the test drops in the controls by using an ↑ for up. and ↔ for no movement      tdl Spring 2013  8  Biol 333 Plant Physiology  .  Results of water potential determinations of plant tissue using the Chardakov method.CHARDAKOV METHOD DATA:      Table 1.    Test  series  Tube  number  1  2  3  4  5  1  2  3  4  5  Species  Watering  Molarity of  treatment  sucrose  Osmotic  potential (MPa)  Initial weight of  tissue pieces (g)  Direction of Drop  Movement*  Final weight of  tissue pieces (g)                                                                                                                                              *Indicate the relative movement of the test drops in the controls by using an ↑ for up. ↓ for down. ↓ for down. and ↔ for no movement        Table 2.