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CROMATOGRAFÍA-2011

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido. b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas. El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

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La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido. b) Cromatografía líquido-líquido. a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.CROMATOGRAFÍA-2011 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas. c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas. d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido. Página 2 . Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar la concentración en su superficie de otras sustancias. La separación se debe a las diferencias de adsorción de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran superficie (adsorbente). El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Al Página 3 . c) Cromatografía de intercambio iónico. La superficie específica contiene centros polares aptos para la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS). La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil.CROMATOGRAFÍA-2011 b) Cromatografía de partición. Los enlaces entre moléculas adsorbidas y el adsorbente han de ser débiles para que su fijación sea reversible. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil. La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que esta finamente granulado. que son ambas líquidas. Como regla general. las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas. Cromatografía líquido-sólido (CLS). las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno).

3 4.879 g/ml 0.4 4.3 1.0 0.498 g/ml 0.713 g/ml 1.655 g/ml 0.0 2. En el caso del gel de sílice la interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si. El adsorbente más utilizado es gel de sílice aunque también se emplea alúmina activada. y los grupos funcionales polares de los compuestos orgánicos.033 g/ml 1. La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. el número de centros activos por unida es mayor.8 6. Propiedades de los disolventes más comunes.3 2. Disolvente Fórmula química Punto de ebullición Constante dieléctrica Densidad Disolventes no polares CH3-(CH2)4-CH3 C6H6 C6H5-CH3 CH3CH2-O-CH2-CH3 CHCl3 CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 69 °C 80 °C 111 °C 35 °C 61 °C 77 °C 2. La velocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporción del disolvente más polar.894 g/ml Hexano Benceno Tolueno Éter dietílico Cloroformo Acetato de etilo Disolventes polares apróticos CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 °C 2. y la capacidad de adsorción se incrementa.4-Dioxano Página 4 .CROMATOGRAFÍA-2011 disminuir el tamaño de las partículas.867 g/ml 0.

Página 5 .049 g/ml 0.810 g/ml 0.5 9.1 21 37 38 0.786 g/ml 0.CROMATOGRAFÍA-2011 Tetrahidrofurano (THF) Diclorometano (DCM) Acetona Acetonitrilo (MeCN) Dimetilformamida (DMF) Dimetil sulfóxido (DMSO) CH2-CH2-O-CH2-CH2 CH2Cl2 CH3-C(=O)-CH3 CH3-C≡N H-C(=O)N(CH3)2 66 °C 40 °C 56 °C 82 °C 153 °C 7.785 g/ml 0.791 g/ml 1.886 g/ml 1.803 g/ml 0.092 g/ml Disolventes polares próticos CH3-C(=O)OH CH3-CH2-CH2-CH2-OH CH3-CH(-OH)-CH3 CH3-CH2-CH2-OH CH3-CH2-OH CH3-OH H-C(=O)OH H-O-H 118 °C 118 °C 82 °C 97 °C 79 °C 65 °C 100 °C 100 °C 6.786 g/ml 0. Así las moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados por las moléculas polares presentes en la fase móvil.789 g/ml 0.21 g/ml 1.2 18 18 20 24 33 58 82 1.326 g/ml 0.944 g/ml CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1.000 g Ácido acético n-Butanol Isopropanol (IPA) n-Propanol Etanol Metanol Ácido fórmico Agua La retención se realiza en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria.

aluminio u otro soporte. La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa. desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades. lo que provoca su separación.CROMATOGRAFÍA-2011 Los tiempos de retención y la selectividad en la separación dependerán de la polaridad de los compuestos a separar (S). La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor). Cromatografía en capa fina. de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa. Cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. Rf= Distancia recorrida por el compuesto Distancia recorrida por el disolvente Página 6 . la cual puede ser de vidrio. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. la naturaleza del adsorbente (X) y la naturaleza de los disolventes que componen la fase móvil (M). que asciende a lo largo de la placa por capilaridad. La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria.

la visualización requiere utilizar un agente revelador. Para compuestos poco polares. La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta. se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media. que se desplazan con mucha facilidad. Se utiliza para la separación y aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas entre 100-200 mg. Página 7 . El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.CROMATOGRAFÍA-2011 La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. mezclas de hexano y acetato de etilo. La cromatografía preparativa se lleva a cabo en placas de gel de sílice de 1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Cromatografía preparativa en placa.

mediante una pipeta Pasteur. se marca con una cuchilla el contorno del compuesto a aislar y con ayuda de una espátula se desprende del soporte de vidrio el gel de sílice con el compuesto adsorbido. Página 8 . Durante la elución debe permanecer tapada para evitar la evaporación del disolvente. Una vez se han separado los productos que componen la muestra. se traza una línea continua con la muestra disuelta y se introduce la placa en posición vertical en una cubeta. se filtra el gel de sílice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro. Chromatotron. Una vez transferido a un erlenmeyer se añade un disolvente en el cual sea soluble el producto.CROMATOGRAFÍA-2011 En la superficie del adsorbente (gel de sílice).

El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel de sílice. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención. La elución de la Página 9 . La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones. aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico a escala preparativa.CROMATOGRAFÍA-2011 Cromatografía en columna.

0. Página 10 . la diferencia en ambos casos está en el tamaño de las partículas de gel de sílice (0. y consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro.063-0. pero sólo nos dará resultados cualitativos. Está casi en desuso. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a separar. la cromatografía a media presión (flash) proporciona mejores resultados.063 nm. utilizándose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en gradiente. Debido a que la disminución del tamaño de las partículas de adsorbente conduce a una separación más eficaz. a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. El método se basa en un mecanismo de reparto.CROMATOGRAFÍA-2011 cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión (Flash chromatography). Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el disolvente. sílice de columna.040-0. La altura del adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. b) Elección del disolvente.200 nm. Las variables que más influyen en la eficacia de la separación en cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son las siguientes. Es la más sencilla de las técnicas. sílice flash). El disolvente tienen que conducir a una buena separación de los componentes de la mezcla en capa fina. Cromatografía en papel. de manera que éste fluya por la tira por capilaridad. además de ser más rápida. que se deja evaporar.

lo que proporciona una fase líquida estacionaria térmicamente estable y difícil de hidrolizar en condiciones normales. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN.CROMATOGRAFÍA-2011 Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo. y una fase móvil también líquida. sobre cuya superficie se ha anclado una fase líquida con la incorporación de una cadena hidrocarbonada larga. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro. se retira el papel y seca. La cromatografía líquido-líquido. El soporte sólido por lo general es gel de sílice. anclada a un soporte sólido. Página 11 . mediante la transformación de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de sílice en grupos siloxano (Si-O-Si-R). Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. también llamada de partición se caracteriza por emplear una fase estacionaria líquida.

F. igual que en la cromatografía de adsorción. En este tipo de cromatografía el orden de elución está gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos más polares quedan más retenidos. con disolventes polares (cloroformo. Como fase móvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano. etanol. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de sílice en cromatografía líquido-líquido.. se distingue entre: a) Cromatografía en fase normal. pentano). lo que permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. En función de la polaridad de la fase líquida estacionaria. La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter polar. Página 12 . diclorometano. Funcionalidad Diamino Aminopropilo Nitrilo Nitro Diol Dimetilamino Propilo Fenilo Octilo Octadecilo Estructura -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 -(CH2)3-NH2 -(CH2)n-CN -(CH2)n-NO2 (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH -(CH2)3-N(CH3)2 -(CH2)2-CH3 -(CH2)n-Ph -(CH2)7-CH3 -(CH2)17-CH3 Polaridad Muy alta Alta Media Media Débil Débil Baja Baja Baja Muy baja Tipo Normal Normal Normal Normal Normal Normal Inversa Inversa Inversa Inversa La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en función de la naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de sílice.CROMATOGRAFÍA-2011 Tabla. metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la separación de compuestos muy polares que quedarían demasiado retenidos en una cromatografía sólido-líquido. La separación en la cromatografía líquido-líquido se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de la mezcla entre las dos fases líquida o en las diferentes interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales presentes en la cadena enlazada al gel de sílice.H. T.

La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter apolar. La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. cuando menos polar sea el disolvente empleado. Por tanto. los compuestos menos polares serán más solubles en la fase estacionaria que los más polares. los compuestos más polares estarán menos retenidos que los menos polares. de manera que se establece un mecanismo complejo que supone una combinación de equilibrios de solubilidad (partición) de la mezcla que se cromatografía entre la fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil. incluyendo grandes proteínas. Cromatografía de intercambio iónico. La separación ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie apolar de los componentes de la muestra. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada. La solución que se inyecta es usualmente llamada muestra y los Página 13 . Los tiempos de retención disminuyen cuando menor sea la proporción de agua. y para la separación de compuestos de una misma serie homóloga. como metanol o acetonitrilo siendo la fase móvil más polar que la fase estacionaria. Como fase móvil se emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles.CROMATOGRAFÍA-2011 b) Cromatografía en fase reversa. Se emplea para la separación de mezclas de compuestos de polaridad baja. pequeños nucleótidos y aminoácidos. que se retienen muy poco en una cromatografía sólido-líquido. La retención se explica en base a una adsorción preferencial del disolvente menos polar de la fase móvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria. al contrario que en la fase normal.

R-A-H+ + M+ + B.CROMATOGRAFÍA-2011 componentes separados individualmente son llamados analitos.<--> R-A-M+ + H+ + BLa cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente.+ L. Es usada a menudo en purificación de proteínas. Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico: La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente (SO3-. CO2-).<--> R4-N+B. análisis de agua o control de calidad. Las resinas cuyo grupo funcional activo es un sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras ácidas fuertes.+ M+ Página 14 . La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta.+ M+ + B. como un catión de amonio cuaternario (R4N+). R4-N+L. mientras que aquéllas cuyo grupo funcional activo es un ión carboxilato (CO2-) se consideran resinas ácidas débiles.

El desarrollo de esta técnica al estado de Página 15 . para la separación de cationes se puede utilizar una resina de ácido débil donde se producirá el siguiente equilibrio: R-CO2H + M+  R-CO2M + H+ En este caso. ternarios o secundarios (para la separación de aniones) y los iones presentes en la fase móvil. Por ejemplo. el catión M+ puede ser eluido de la columna por un ácido fuerte en una concentración capaz de desplazar el equilibrio representado en la ecuación anterior hacia la izquierda.CROMATOGRAFÍA-2011 R-H++ M+<--> R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R Este tipo de cromatografía se basa en el equilibrio de intercambio iónico entre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o carboxílicos (para la separación de cationes) o grupos amino cuaternarios.

PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA En todo procedimiento en química orgánica reconocemos las etapas que se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterización de los productos orgánicos. fue posible a partir de la década del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen los materiales típicos para el intercambio (grupos sulfónicos para cromatografía catiónica y grupos aminos cuaternario para cromatografía aniónica). llamada cromatografía iónica.CROMATOGRAFÍA-2011 cromatografía de alta resolución. vidrio o de algún polímero que son capaces de soportar las altas presiones comúnmente utilizadas en cromatografía líquida de alta resolución. Estos recubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice. Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificación de los productos preparados en un proceso sintético en química orgánica A + B C + D Otros Reactivos Mezcla de reacción Productos de reacción Purificación Caracterización Extracción Separación cromatográfica Cristalización Destilación Pf Peb RMN Página 16 .

En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prácticas no se lleva a cabo la separación cromatográfica. de esta manera damos una visión real del trabajo sintético en química orgánica. según el caso. se sugiere tener conocimiento de las características de los sustratos antes de comenzar. para caracterizarlos correctamente. requieren de una purificación adicional que se lleva a cabo mediante otra cromatografía más cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones.2 g de cada uno de los productos y antes de proceder a su separación habrá que decidir eluyente más adecuado para poder desarrollar una separación aceptable. aunque sea una operación necesaria en el trabajo de síntesis. Por ello. Finalmente los productos. Por esta razón hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un curso introductoria. la mezcla resultante se extrae para separar los sustratos que nos interesan. como hemos indicado en párrafos anteriores. Las mezclas estarán constituidas realmente por dos sustancias. que generalmente es el producto de reacción. En esta experiencia se propondrá la separación de los componentes de una mezcla hipotética de reacción por cromatografía de columna. se separa por cromatografía de columna. y por regla general. A continuación la mezcla obtenida. Procedimiento general Para el proceso de separación-purificación por cromatografía de columna se Página 17 . reactivos y/o algo del producto de partida. y como en casos anteriores. productos secundarios. Las mezclas estarán constituidas por 0.CROMATOGRAFÍA-2011 Una vez ha concluido la reacción.

procurando tener una franja horizontal. B) Opcionalmente se puede añadir arena hasta obtener una franja de unos 2-5 mm de espesor. C) Se deposita la muestra en disolución o adherida a una pequeña cantidad de adsorbente sobre la arena. Página 18 . E) Añadir la fase móvil con cuidado por la pared de la columna hasta llenarla.CROMATOGRAFÍA-2011 siguen los siguientes pasos: A) Se sujeta la columna a un soporte y se rellena con la fase estacionaria en forma de papilla o en seco según se nos indique. D) Opcionalmente se puede poner otra franja de arena como la primera o un poco de lana de vidrio. para proteger el frente de la fase estacionaria.

previamente pesado y el disolvente se elimina en el rotavapor.CROMATOGRAFÍA-2011 F) Los componentes de la mezcla deben eluirse manteniendo un flujo continuo de disolvente. G) Las fracciones recogidas deberán analizarse mediante una técnica cromatográfica analítica: cromatografía de capa fina para comprobar su contenido y pureza. Página 19 . Las fracciones que tengan semejante contenido se juntan en el mismo matraz.