Hastuti

,

Jurnal PROTEIN

Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein Yang Bertanggung Jawab Terhadap Sistem Kekebalan Lobster Air Tawar (Cherax quadricarinatrus Von Martens) The Effect of Poly I:C Injection On Protein Expression Wich Responsible to Immune System of Of Redclaw (Cherax quadricarinatrus Von Martens)
Sri Dwi Hastuti Fakultas Peternakan Perikanan Universitas Muhammadiyah Malang Jl. Raya Tlogomas No. 246 Malang. Telp. (0341) 464318. email: sridwihastuti@yahoo.com
Abstract

Background: Redclaw (Cherax quadricarinatrus Von Martens) is one of aquaculture organism
which widely cultured in many countries. The occurred of diseases often become a constrain in aquaculture industry and have not solved entirely. Therefore the understanding of redclaw immune sistem is important as an effort and strategic to combat disease problems in aquaculture. Methods: This research aims to investigate the effect of Poly I:C injection on the expression of protein which responsible on the immune sistem of redclaw for example is Mx proteins. Animal used in this study was redclaw with size of 13-20 g, injected with Poly I:C or Phosfat Buffer Saline (PBS) (as control). Animal injected with 2 mg/ml Poly I:C or PBS then sampled to get its haemocyte and hepatopancreas. Result: Gel electrophoresis of haemocyte showed that there is a protein with molecular weight of 3145 kDa which indicated as Lypopolisacharrides and β-1,3-glucan Binding Protein (LGBP). While, gel electrophoresis of hepatopancreas showed an expression of protein with the band of molecular weight below 66.2 kDa. This protein can be assumed as a member of Mx protein which has antiviral property. Keywords : poly i:c, haemocytes, lypopolisacharrides and β-1,3-glucan binding protein (lgbp), mx protein Abstraksi Latar Belakang: Lobster air tawar (Cherax quadricarinatrus Von Martens) merupakan hewan akuatik yang bayak dibudidayakan di beberapa negara. Dalam kegiatan budidaya hewan akuatik, resiko serangan penyakit seringkali muncul dan sampai saat ini belum bisa diatasi secara tuntas. Oleh karena itulah pemahaman yang mendalam terhadap sistem kekebalan redclaw sangat berguna dalam upaya dan strategi penanggulangan penyakit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penyuntikan Poly I:C terhadap ekspresi protein yang bertanggung jawab terhadap sistem kekebalan lobster air tawar misalnya Mx protein. Metode: Metode yang digunakan adalah eksperimen dengan materi uji berupa lobster air tawar berukuran 13-20 gram yang disuntik dengan Poly I:C atau Phosfat Buffer Saline (PBS) sebagai pembanding dengan dosis 2 mg/ml per ekor lobster air tawar dan diambil hemosit dan hepatopankreasnya. Hasil: Hasil elektroforesis hemosit mendeteksi bahwa ada protein dengan berat molekul 31-45 kDa yang kemungkinan adalah Lypopolisacharrides and β-1,3-glucan Binding Protein (LGBP). Sementara elektroforesis hepatopankreas menunjukkan ekspresi protein yang ditunjukkan oleh band yang berada pada berat molekul tepat dibawah 66.2 kDa. Protein yang dimaksud kemungkinan merupakan famili dari Mx protein yang mempunyai aktivitas antivirus. Kata kunci: poly i:c, hemosit, lypopolisacharrides and β-1,3-glucan binding protein (lgbp), mx protein

154

. Plant & Thune. termasuk protein kinase R (PKR). adenosine deaminase dan Mx proteins (Plant & Thune. 1997). glycolipids dari mycobacteria.3-glucan dari jamur dan rantai ganda dari RNA virus (Hoffman. 1995. Karena itulah penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekspresi protein pada redclaw yang diinjeksi dengan Poly I:C. Chen & Edgerton. IFN system merupakan sistem pertahanan tubuh yang pertama untuk melawan infeksi virus pada vertebrata. 1996.. dan dapat bertahan pada kondisi kualitas air yang buruk seperti kandungan oksigen terlarut yang rendah (Meade & Watts. Edgerton et al. Penyuntikan virus sintetis yang mirip rantai ganda RNA virus (Poly I:C) pada vertebrata telah terbukti mampu menginduksi respon antivirus dengan cara induksi sistem interferon (IFN system).. 2004). Israel.. 2004. 2000). 2001). 2002.. 2001. J. Jurnal PROTEIN PENDAHULUAN Lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) yang di daerah asalnya Australia dikenal dengan sebutan redclaw merupakan spesies yang potensial untuk dibudidayakan. Redclaw mempunyai satu set reseptor yang disebut dengan pattern recognition proteins / receptors (PRPs or PRRs). Saat ini belum ada penelitian tentang pengaruh Poly I:C terhadap sistem immunitas krustasea.Hastuti. mannans dari yeast. Jensen & Robertsen. 2002). 2001. 2000. Kafatos. Type I sistem interferon terdiri dari α dan β interferons. & Hew. Y. Huang... Sommer. Jensen. ß-1... Edgerton et al. Jacinto et al. asam lipoteichoic bakteri gram positif. 1999. 2004) serta Indonesia. 2004). & Karplus.. Muzinic et al. seperti misalnya lipopolysaccharida (LPS) dari bakteri gram negatif. 2003). Nygaard et al. redclaw tidak mempunyai sistem kekebalan adaptif dan tergantung pada sistem kekebalan alami (innate immunity) dalam mempertahankan diri terhadap serangan patogen. Hewan ini mempunyai beberapa keunggulan sebagai organisme budidaya. Studi yang telah dilakukan pada ikan yang diinjeksi dengan Poly I:C menunjukkan kemunculan Mx protein yang berperan sebagai agen antivirus (V. Albuqueque. 1999). Oleh karena itulah pemahaman yang mendalam terhadap sistem kekebalan redclaw sangat berguna dalam upaya dan strategi penanggulangan penyakit. Gel elektroforesis menunjukkan bahwa Mx protein mempunyai berat molekul antara 72. 2001). Dengan semakin berkembangnya budidaya kearah intensifikasi akan meningkatkan stress pada hewan yang selanjutnya akan menyebabkan munculnya masalah penyakit sebagaimana yang dialami oleh budidaya udang windu dalam sistem intensif (Lorenzon et al. MATERI DAN METODE 155 . China. Xu. Yap et al. Janeway. Edgerton & Owens. & Robertsen. yang menginduksi sintesis dari beberapa protein. Sebagai hewan yang masuk dalam kelas krustasea. 1994. dan telah dilaporkan bahwa virus WSSV yang merupakan virus dengan tingkat patogenitas yang sangat tinggi telah ditemukan dapat menginfeksi lobster air tawar dalam uji laboratorium (Edgerton et al. sehingga infeksi virus menjadi fokus utama yang harus diwaspadai dalam budidaya lobster air tawar khususnya jika budidaya telah berkembang kearah intensif. Beberapa virus lain juga telah ditemukan dapat menyerang redclaw (Edgerton. 2004). Pendeteksian substansi mikrobial dari patogen oleh PRPs akan mengaktifkan beberapa molekul biologis yang bertanggung jawab dalam sistem kekebalan tubuh termasuk protein antimikrobial (antimicrobial peptides) (Sritunyalucksana. Beberapa negara telah mengalami kerugian yang besar akibat penyakit white spot yang disebabkan infeksi virus WSSV pada budidaya udang (Zhang. reproduksinya yang mudah. Gur. 2000. Amerika Serikat (Barki. 2000. Hirono et al. 2002). Hewan ini sudah banyak dibudidayakan di beberapa negara seperti Ecuador. Plant & Thune.5 dan 76 kDa (I. yaitu dapat dipelihara dalam padat penebaran yang tinggi. pertumbuhan cepat dibanding dengan lobster air tawar jenis lain. Innate immunity yang dimiliki oleh krustasea mampu mendeteksi pola molekuler yang merupakan ciri spesifik suatu patogen (Sritunyalucksana. & Ekekowitz. Lee.

Berdasarkan hasil pengukuran protein. Dari hasil elektroforesis didapatkan bahwa tidak ada perbedaan dalam ekspresi protein antara perlakuan dengan Poly I:C dan PBS. CA).3) untuk menghindari penggumpalan haemolymph. memotong sebagian kecil hepatopankreas dan diletakan dalam 200 µl phosphate buffer konsentrasi 50 mM. Akuarium A berisi hewan uji yang diinjeksi dengan Poly I:C dengan dosis 2 mg/ml dan akuarium 2 berisi 4 ekor hewan uji yang diinjeksi dengan Phosfat Buffer Saline (PBS) (sebagai kontrol/pembanding). Sampel yang mengandung 10µg protein di running pada 10% SDS polyacrylamide gels (SDS-PAGE) selama 45 menit dengan tegangan 200V (Laemmli. CA).3 mM Sodium citrate . Hercules. yang sebelumnya telah diisi dengan 100 µl larutan Alsever’s yang terdiri atas 19.8 mM Sodium chloride.4. Sampel kemudian disimpan pada suhu beku (-80 º) sampai digunakan. HASIL DAN PEMBAHASAN Hemosit Semua hewan uji baik pada perlakuan Poly I:C dan PBS tetap hidup sampai saat sampling. Sel kemudian diekstraksi dalam SDS sample buffer. 239. Persiapan Gel Elektroforesis Haemolymph disentrifus pada 700 x g selama 15 menit pada suhu 4 ºC. suspensi sel kemudian diencerkan untuk mencapai konsentrasi protein 1 mg/ml. Protein dalam suspensi sel diukur dengan BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology. Namun demikian elektroforesis mendeteksi bahwa ada protein dengan berat molekul 31-45 kDa yang kemungkinan adalah Lypopolisacharrides and β-1. 182. Hepatopankreas dihomogenisasi menggunakan pestle kemudian disentrifus pada 10.5 M pH 7. pH 7.5 M pH 8. Konsentrasi protein kemudian diukur seperti cara untuk hemocytes diatas dan kemudian diencerkan sampai konsentrasi 1 mg/ml.5 mM Glucose dan 6. sesuai metode Laemmli. Gel kemudian diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad.000 x g selama 15 minutes pada 4 ºC. USA). Sampling Haemolymph dan Hepatopankreas Haemolymph diambil dari pangkal kaki jalan ke lima menggunakan syringe yang berukuran 1 ml. Supernatant (fase cair) diambil kemudian disentrifus sebanyak 2 kali untuk meghilangkan lemak yang berlebihan. 14 No. Resolving gel terdiri dari Tris–HCl buffers 1. Hercules. Injeksi dilakukan secara intramuscular pada bagian ventral (otot abdominal). 1970). SDS-PAGE yang digunakan adalah standards (Bio-Rad. 2 Tahun 2006 Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein Hewan Uji dan Penyuntikan Redclaw yang berukuran 13-20 gram dipelihara dalam akuarium dengan volume air 60 liter. tiap akuarium diisi dengan 4 ekor redclaw. supernatant dibuang dan pellet disuspensikan dalam 50 µl phosphate buffer konsentrasi 50mM. Setelah 4 hari.8.8 sementara Stacking gel terdiri atas 0. 1970. Hasil elektroforesis hemosits disajikan pada Gambar 1. 156 . Hepatopankreas diambil dengan membedah hewan uji pada bagian cephalothorax. dipanaskan selama 5 menit pada 95 ºC and dirunning pada SDS-PAGE 10% elektroforesis selama 45 minutes pada 200V.2 mM EDTA pH 7.Vol. Sampel ditambahkan dengan 2 volume SDS sample buffer. kemudian dipanaskan selama 5 minutes pada suhu 95 ºC.3-glucan Binding Protein (LGBP) (panah). haemolymph dan hepatopankreas dari hewan uji disampling dan dilakukan uji lanjutan. kemudian ditambahkan dengan 1 µl PMSF (10 mg/ml dalam isopropanol) untuk mencegah aktivitas proteolitik.

9 = sampel hewan dengan penyuntikan PBS (kontrol) berat molekul tepat dibawah 66. sementara kolom 2 dan 5 merupakan sampel protein dari perlakuan Poly I:C. kolom 2 dan 5). namun kemunculannya meningkat secara nyata pada sampel hepatopankreas dari perlakuan Poly I:C (Gambar 2.3.3 = treatment Poly I:C. 6 = treatment PBS 157 .2 kDa. kolom 3 dan 6 merupakan protein dari sample perlakuan PBS (kontrol). Kolom 1. kemungkinan merupakan famili dari Mx protein yang mempunyai aktivitas antivirus. Hepatopankreas Gel elektroforesis hepatopankreas ditunjukkan pada Gambar 2. kolom 3 dan 6). protein ini sebenarnya juga muncul pada sampel dari perlakuan dengan PBS (Gambar 2.Hastuti.8. Kolom 4. kolom 2.6.7 = marker. Kolom 1= protein marker. Kolom 1 dan 7 menunjukkan protein marker. Protein yang dimaksud diindikasikan dengan tanda panah pada gambar. Jurnal PROTEIN Gambar 1. Ekspresi protein yang menjadi perhatian adalah yang ditunjukkan oleh band yang berada pada Gambar 2.7 = sampel protein hemosit hewan uji dengan penyuntikan Poly I:C . Hasil Elektroforesis Protein Hemosit.. Gel elektroforesis Protein yang terekspresi dari hepatopankreas Redclaw. kolom 5. Kolom 2.5. kolom 4 = treatment LPS . Hasil elektroforesis menunjukkan adanya beberapa protein yang terrekspresi.

1992. Johnson. 1987. Johnson. dapat diasumsikan sebagai tempat utama produksi molekul yang berperan dalam system kekebalan (Gross. Zhang. S. 2004). Bartlett. Pengikatan lipopolisakarida bakteri terhadap LGBP akan mengaktifkan system proPO dan gen untuk antibakteri. & Warr. Selanjutnya dikatakan bahwa LGBP protein yang kemungkinan besar berperan penting dalam patogenitas virus sebagaimana bakteri dan jamur.. Dilaporkan dari beberapa studi bahwa hepatopankreas mempunyai aktivitas antimikroba melawan bakteri. Hemosits krustasea diketahui berperanan dalam innate immunity secara selular dan humoral (I. 1996. jamur. Luo et al.. 158 . Sequencing protein diperlukan untuk mengidentifikasi secara lebih detil protein yang terekspresi. Chisholm & Smith. dan yang lebih penting lagi mungkin mengindikasikan adanya aktivitas antivirus yang lebih luas pada invertebrata.Vol. dan virus. & Dhar. Sandsdalen. Kjuul. R. Pan et al. 1992. namun dipercaya bahwa krustasea memiliki protein antimikroba yang dapat merespon infeksi bakteri. jamur.. Gross dan rekannya menyatakan bahwa organ tempat filtrasi haemolymph pencernakan seperti hepatopankreas seharusnya berperan penting dalam sistem kekebalan tubuh (Gross et al. Protein antimikroba ini tidak hanya terletak pada haemolymph. 2003). Oleh karenanya. Gross et al. 2001. 2003. Poly I:C merupakan dsRNA sintetis yang telah diketahui mempunyai efek terhadap system kekebalan alami (innate) vertebrate dalam melawan infeksi virus melalui induksi interferons (IFN) yang selanjutnya akan memacu pengaturan transkripsi berbagai gen yang melindungi sel dari kerusakan dan kematian (Loker. Pain. Jika hasil sequencing membuktikan bahwa protein tersebut adalah anggota dari Mx protein. Roux dan kawan-kawan menemukan bahwa LGBP dapat terindetifikasi pada hemosit hewan yang sehat maupun yang terinfeksi oleh WSSV (Roux. Type I IFN merubah sel menjadi antivirus dengan induksi protein seperti 2’. Lee & Soderhall. 2002). Toll like receptor (TLR) yang berlokasi pada permukaan sel mampu untuk mengenali dan mengikat struktur virus yang kemudian menginduksi IFN melalui jalur NFκβ toll untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan terhadap materi asing yang masuk dalam tubuh dengan menginduksi Mx protein. & Styrvold. Wang et al. Dilaporkan bahwa LGBP mempunyai berat molekul antara 36 dan 40 kDa (J. 5’-oligoadenylate synthetase (OAS). Akan tetapi hanya sedikit informasi tentang sistem kekebalan pada organ lain. Salinas et al... Stensvag. Reichart. 2001). Walaupun Mx protein dan mekanisme induksinya pada krustasean masih belum jelas. & Hetru. 2000). yang merupakan anggota GTP-ases superfamily.. 2002). Karena itu masuk akal jika penyuntikan hewan uji dengan rantai ganda virus RNA sintetis dapat merangsang ekspresi LGBP. Browdy. Adema. 2004). yang mempunyai aktivitas antivirus (S. 14 No. Berat molekul dari protein yang terekspresi dengan perlakuan PolyI:C pada penelitian kali ini sama seperti Mx protein yang lain. Lee.. tidak ada data yang mengatakan bahwa invertebrata mempunyai reseptor yang mampu untuk mengenali virus dan homolog yang jelas dari interferon (Loker et al. (Hoffman. 2000). dan virus (J. dsRNA dependent protein kinase (PKR) dan Mx protein yang dapat menghambat replikasi virus (Salinas et al. 1987). Chisholm & Smith. Y.. Haug. Lee & Vidal.. 2002. Type I IFNs diproduksi oleh berbagai tipe (Robertsen et al. penelitian ini akan membuktikan adanya Mx protein pada krustasea. 2002). Klimpel. Y. Oleh karena itu penelitian ini juga mengamati ekspresi gen pada hepatopankreas yang berperan dalam sistem kekebalan. tapi juga dapat dideteksi pada organ atau jaringan yang lain seperti hepatopankreas (J. 2001. & Kepler. Lebih lanjut dikatakan upregulasi ekspresi pada elektroforesis sebagai respon terhadap penyuntikan PolyI:C juga mengindikasikan aktivitas seperti Mx protein. Hepatopankreas adalah organ kunci yang terlibat dalam respon kekebalan krustasea. 2 Tahun 2006 Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein Hasil elektroforesis hemosit menunjukkan kemuculan protein yang diasumsikan sebagai LGBP berdasarkan berat molekulnya. 2002). 2004). Sebagaimana diketahui ekspresi LGBP biasanya meningkat pada hewan yang terinfeksi bakteri atau jamur. 2004. Soderhall & Soderhall. Akan tetapi. Chapman. R. Ekspresi LGBP pada perlakuan dengan Poly I:C kemungkinan karena hewan uji telah terinfeksi oleh bakteri dari lokasi pemeliharaan.

Developmental and Comparative Immunology. C. & Karplus. Hoffman. K. Dengan demikian perlu penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan pemahaman yang lebih dalam tentang mekanisme antivirus pada krustasea dalam hubungannya dengan Mx protein. M. S. (2000). 12. J. M. 395405. (2002). & Ferrero. Aquaculture. 1313-1318. 2004). 172. Giulianini. K. Weight gain and survival of juvenile Australian crayfish Cherax quadricarinatus fed formulated feeds. A. 66826687. & Tabata. 27. 4144. Taniguchi. A. 343-354.. Current Opinion in Immunology. P.. Fish and Shellfish Immunology. (1997). Zhang et al.. S. Ogawa. C. Disarankan juga untuk meneliti ekspresi protein pada organ lain seperti lymphoid organ. 94. (1999). 7.. K. after injection of B-1. A. Haematological and phenoloxidase activity changes in the shrimp Penaeus stylirostris in relation with the moult cycle: protection against vibriosis. F. (2001). 284. Aquaculture magazine. A. Kafatos.. Fish and Shellfish Immunology. & Soderhall. J. & Soderhall. M. Mamoto. & Hetru. R. Innate immunity in higher insects. Phylogenetic perspectives in innate immunity. Management of interspecific food competition in fish-crayfish communal culture: the effects of the spatial and temporal separation of feed.. 26. Z.. Sakai. Janeway. 201. Lee. Approaching the asymptole? Evolution and revolution in immunology.. Aquaculture.. E. I. Immunostimulant effects of Hoffman. Le Groumellec. Chen. B. Aquaculture. 2003. A. 8.... (1997). (2001).. Lipopolysaccharide-induced hyperglycaemia is mediated by CHH release in krustaseans. 159 . Sottrup-Jensen. N. 150. Pacifastin.. The complement component C3 is produced by hepatocytes and behaves as an acute-phase protein in Atlantic salmon. Sakai. A.. A. Diperlukan sequencing terhadap protein yang telah ditemukan dalam penelitian ini untuk memastikan bahwa protein tersebut masuk dalam golongan Mx protein. 54. 1-13. Levy. J. M.. Reichart. (1996).. H. Salmo salar L.. 227-234. (1989). G. 121-131. P. (2001). 108. K. M. Lorenzon. Early events in krustasean innate immunity... 8-13. M. & Edgerton. Jurnal PROTEIN Haug et al. Gur. a novel 155-kDa heterodimeric proteinase inhibitor containing a unique transferrin chain. D. B. Janeway. Perlu juga dilakukan penelitian lanjutan dengan penyuntikan Poly I: C dengan berbagai dosis dan sampling yang dilakukan dalam waktu yang berbeda untuk mengetahui dosis letal injeksi Poly I:C dan memahami kinetika protein yang diharapkan. Environmental factors affecting immune responses in Krustasea. & Haffner... E.3-glucan.Hastuti. J.. Le Moullac. H. G... Froissard. P. 21. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA Barki. & Robertsen. C. Ansquer.. Luo et al. & Watts. 421-437. S. 2002. (1997). Meade. Freshwater crayfish culture in China. Journal of the World Aquaculture Society. B. & Aquacop. 469-474. Liang. Current research status of fish immunostimulants. Le Moullac. L. S.. (1995). F. 191(1-3). G. Proceding of the National Academy of Science USA. A. 63-92. X. Cold Spring Habour Symposium of Quantitation Biology. Y. & Ekekowitz... General and Comparative Endocrinology. Lunde. C. Science. (1997). (1999).

. Uppsala University. V. Selvin. (1996). Current Opinion in Immunology. 191(1-3). J. I. 2 Tahun 2006 Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein nucleotide isolated from yeast RNA on carp. 6. L. L. 41-72). 439-464). K. Huang.). K. & Ratcliffe. K. Sweden. L.. K. J. C. The proPO and clotting system in krustaseans. Soderhall. Immunomodulatory potential of marine secondary metabolites against bacterial diseases of shrimp.J. Immune reactions. Characterisation of some immune genes in the black tiger shrimp. K. Host defence reactions of the shore crab. Sritunyalucksana.Vol.. 10(1). M. Identification and localization of a prawn white spot syndrome virus gene that encodes an envelope protein. Aquaculture 230 : 241–248 Smith. Penaeus monodon. Cooper (Ed. M. 23. C. K..). 14 No. X. 10.. (1998b). 1069-1074. Soderhall. 83. Journal of Marine Biology Associated UK.P. L. 24. (1998a). Tuckova. (1982). Zhang. Journal of General Virology. 60. N. Advances in Comparative and Environmental Physiology (Invertebrate Immune Responses:Cells and Molecular Products) (Vol. In D. A.. & Soderhall. Soderhall... clearance and distribution of injected particles. Soderhall. 23-28. Mechanisms of antigen processing in invertebrates: are there receptors? In L. Holdich (Ed. 601-611. Aquaculture. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Unpublished Dissertation of Doctor of Philosophy. & Bilej. USA: Blackwell Science. & Cerenius. & Cerenius. 2004. A. 89-102. 23-28. 160 . (2002). (2001). Iowa.. Carcinus maenas (L. K. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology. Huxleya. Cyprinus carpio L. Xu. (1980). (2000). Lipton. Prophenoloxidase activating system and melanization-a recognition mechanism of arthropods Development and Comparative Immunology. A. & Hew. Sritunyalucksana. 53-69. Biology of Freshwater Crayfish (pp.).. X.. Journal of Fish Diseases. 433-438. Berlin: Springer. (2002). pp. & Soderhall.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful