Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Ps-Graduao Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental

Fernanda Barbosa de Queiroz

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAO DE FRMACOS E PERTURBADORES ENDCRINOS EM AMOSTRAS DE ESGOTO UTILIZANDO EXTRAO EM FASE SLIDA E CROMATOGRAFIA LQUIDA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessrios para a obteno do ttulo: Mestre em Engenharia Ambiental. rea de Concentrao: Tecnologias Ambientais

Orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso Co-orientador: Prof. Dr. Srgio Francisco Aquino

Ouro Preto, MG 2011

Q384d

Queiroz, Fernanda Barbosa de. Desenvolvimento e validao de metodologia para determinao de frmacos e perturbadores endcrinos em amostras de esgoto utilizando extrao em fase slida e cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas [manuscrito] / Fernanda Barbosa de Queiroz - 2011. 114f. : il., color; graf.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso. Co-orientador: Prof. Dr. Srgio Francisco de Aquino. Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Cincias Exatas e Biolgicas. Mestrado em Engenharia Ambiental. rea de concentrao: Tecnologias ambientais. 1. Frmacos - Teses. 2. Cromatografia lquida de alta eficincia Teses. 3. Espectrometria de massa - Teses. 4. Esgotos - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Ttulo. CDU: 615:628.3 Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br

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 melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar. melhor tentar, ainda que em vo que sentar-se, fazendo nada at o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias frios em casa me esconder. Prefiro ser feliz embora louco, que em conformidade viver

Martin Luther King iv

 minha me, Lita, pelo amor, apoio e por sempre acreditar em mim. v

AGRADECIMENTOS
Agradeo a Deus por sempre me guiar nos momentos de deciso e pela fora concedida nos momentos difceis. Aos meus orientadores, Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso e Prof Dr. Srgio Francisco de Aquino, pela oportunidade de realizar esse mestrado, confiana, pacincia e grandes ensinamentos. Vocs so grandes orientadores! Ao professor Dr. Maurcio Coutrim pela colaborao e por estar sempre disposto a contribuir com sua experincia. Aos meus irmos Renata, Erika e Rodrigo e cunhados Jnior e Daniel pelo interesse e incentivo. Vocs me fizeram acreditar que todo o esforo valeria a pena. Ao Bruno pelo amor, compreenso, pacincia e grande incentivo para realizao desse mestrado. Voc foi fundamental para que eu seguisse em frente diante das dificuldades. Prof. Dr. Cludia Carneiro por me dar a primeira oportunidade de trabalhar com pesquisa cientfica e pelos ensinamentos. Aos professores do curso de graduao e ps-graduao por todo o conhecimento compartilhado e aos colegas do mestrado pela amizade e companheirismo. Aos amigos de Ouro Preto, em especial a Carol e Lliam, pela convivncia e amizade. Ao Diva por me incentivar a fazer o mestrado e me indicar as pessoas certas. Repblica Tanto Faz pela acolhida em todos os momentos que precisei, amizade, carinho e momentos felizes. Vocs so muito especiais! Aos parceiros de iniciao cientfica, Mark, Rafaela e Luana pela boa vontade, dedicao e amizade. Vocs foram muito importantes para a realizao desse trabalho. Ao professor Carlos Chemicharo e toda a equipe do DESA, pela oportunidade de trabalho. Em especial a Bruna e Emanuel pelo apoio. Aos amigos do laboratrio Miriany, Keila, Ananda, Bruno, Carlcio, Taciana, Gustavo, Regiane, Dbora, Luciana, Natlias e Lucas pelo companherismo, ajuda e amizade. Em especial ao Jlio por estar sempre disposto a ajudar, pelos conselhos e conhecimentos intercambiados. Muito obrigada mesmo! CAPES pela concesso da bolsa de estudo. A todos que contriburam de alguma maneira para a realizao desse trabalho. Muito obrigada!!!

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SUMRIO
1 - INTRODUO .......................................................................................................... 1 2- OBJETIVOS ................................................................................................................ 4 2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................ 4 2.1.1 Objetivos Especficos ...................................................................................... 4 3 - REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................................... 5 3.1 - Introduo............................................................................................................ 5 3.2 - Perturbadores Endcrinos .................................................................................... 6 3.3- Frmacos................................................................................................................9 3.4-Caractersticas e Toxicidade................................................................................ 11 3.4.1 Estrognio....................................................................................................15 3.4.2 Alquilfenis.................................................................................................16 3.4.3 - Aditivos industriais..................................................................................... 17 3.4.4 Frmacos......................................................................................................18 Antiiflamatrios.......................................................................................................18 Reguladores Lipdicos.............................................................................................19 Antibiticos e Antifngicos.....................................................................................19 3.5 - Ocorrncia no meio-ambiente.............................................................................21 3.6 - Mtodos de anlise de Microcontaminantes orgnicos.......................................28 3.6.1 - Tcnicas de Preparo de Amostras................................................................28 Extrao em Fase Slida (SPE)...............................................................................29 Microextrao em Fase Slida (SPME)................................................................. 30 Polmeros com Impresso Molecular (MIPs)..........................................................31 3.6.2 - Tcnicas de Anlises....................................................................................31 Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas................................................. 32 Cromatografia Lquida- Espectrometria de Massas............................................... 32 Espectometria de Massas....................................................................................... 32 3.7 - Efeito matriz...................................................................................................... 34 4- MATERIAIS E MTODOS..................................................................................... 34 4.1- Primeira etapa: desenvolvimento do mtodo analtico ....................................... 39 4.1.1 - Limpeza da vidraria..................................................................................... 39 4.1.2 - Reagentes e Consumveis............................................................................ 39 4.1.3 - Desenvolvimento da extrao, concentrao e clean-up de extratos...........41 Primeiro teste..........................................................................................................42 Segundo teste..........................................................................................................42 Terceiro teste..........................................................................................................43 4.1.4 - Anlise Cromatogrfica .............................................................................. 45 4.1.5 - Avaliao do efeito da matriz.......................................................................50 4. 2 - Segunda etapa: Validao do mtodo ...............................................................50 4.2.1 Seletividade................................................................................................... 51 4.2.2 Ajuste de curva analtica/Linearidade e faixa de trabalho..........................52 4.2.3 - Limite de Deteco/Limite de quantificao.............................................. 52 4.2.4 Preciso....................................................................................................... 53 4.2.5 Exatido...................................................................................................... 53 4.3 - Terceira etapa: Monitoramento em amostras reais e avaliao da remoo dos micropoluentes em sistemas simplificados de tratamento de esgoto ......................... 54 4.3.1 rea de estudo e Amostragem ..................................................................... 54 4.3.2 Caractersticas dos Sistemas de tratamento simplificados avaliados ............ 55 Sistema UASB-wetland .......................................................................................... 55 vii

Sistema UASB-lagoas de polimento ...................................................................... 56 5 RESULTADOS E DISCUSSES............................................................................ 57 5.1- Desenvolvimento da etapa de extrao, concentrao e clean-up de extratos .... 57 5.1.1 - Primeiro teste.............................................................................................. 57 5.1.2 - Segundo teste............................................................................................. 58 5.1.3 - Terceiro teste.............................................................................................. 60 5.2 - Desenvolvimento do mtodo analtico: HPLC/MS........................................... 68 5.2.1 - Fases mveis ............................................................................................... 68 5.2.2 - Colunas utilizadas ...................................................................................... 69 5.2.3 - Anlise de nonilfenol .................................................................................. 70 5.3 - Validao do Mtodo ......................................................................................... 70 5.3.1 - Seletividade ................................................................................................. 70 5.3.2 - Ajuste de curva analtica /Linearidade e faixa de trabalho ......................... 75 5.3.3 - Limite de Deteco/Limite de quantificao...............................................83 5.3.4 - Preciso...................................................................................................... 84 5.3.5 - Exatido...................................................................................................... 85 5.3.6 Avaliao do efeito da matriz nas respostas ............................................... 87 5.4 - Aplicao da metodologia no monitoramento de amostras de esgoto ............... 88 5.4.1 - Ocorrncia de frmacos e perturbadores endcrinos no esgoto bruto ........ 88 5.4.2 - Aplicao na avaliao da eficincia de remoo dos microcontaminantes pelos sistemas de tratamento de esgotos................................................................. 94 6 - CONCLUSES ......................................................................................................... 97 7 - PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS.................................................... 99 8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................... 100

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LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1: Principais rotas de frmacos no meio-ambiente (Tambosi, 2008)............... 10 Figura 3.2: Classes teraputicas detectadas no meio-ambiente, expresso em % relativa. Dados coletados de 134 artigos publicados entre 1997 e 2009. Adaptado de Santos et al, 2009.................................................................................................................................11 Figura 3.3: Estrutura qumica dos alquilfenis............................................................... 16 Figura 4.1: a) Aparato de extrao. Manifold com os cartuchos de SPE b) Cartuchos Strata X e Strata SAX (Phenomenex)............................................................................ 40 Figura 4.2: Grupo ligante do cartucho Strata X.......................................................... 40 Figura 4.3: Grupo ligante do cartucho Strata SAX .................................................. 40 Figura 4.4 : Procedimento de extrao......................................................................... 45 Figura 4.5: Colunas C18 (Shimadzu) acopladas............................................................ 46 Figura 4.6: Esquema do LCMS-IT-TOF........................................................................ 46 Figura 4.7: Cromatgrafo lquido acoplado ao espectrmetro de massas - HPLC-MS ITTOF (Shimadzu)........................................................................................................... 47 Figura 4.8: Esquema dos pontos de coleta.................................................................... 55 Figura 5.1 : a Cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- de amostra extrada apenas pelo cartucho Strata X; b cromatograma dos ons dos LAS [M-H]- de amostra extrada pelos cartuchos Strata SAX e Strata X. Compostos apresentados: C10-LAS (m/z
297,1530), C11-LAS ( m/z 311,1686), C12-LAS (m/z 325,1843), C13-LAS ( m/z 339,1999). 61

Figura 5.2 a: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada apenas pelo cartucho Strata X. b: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada pelo cartucho Strata SAX c: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada pelo cartucho Strata X (forma seqencial). Compostos apresentados: C10-LAS (m/z 297,1530), C11-LAS (m/z 311,1686), C12-LAS (m/z 325,1843), C13-LAS (m/z 339,1999), Bisfenol A (m/z 227,1070), Estradiol (m/z 271,1704), Etinilestradiol (m/z 295,1704).........................................................................................................................64 Figura 5.3: Resultados por rea. Fase 1: gua com 5mM cido oxlico; metanol /acetonitrila (1:1) com 5mM cido oxlico ; Fase 2: Acetato de amnio e cido actico ix

0,1% v/v em gua ; metanol/acetonitrila (1:1); Fase 3: gua; metanol/acetonitrila (1:1); Fase 4: gua; metanol; Fase 5: gua com 3 mM NH4OH; metanol com 3mM

NH4OH......................................................................................................................... 69 Figura 5.4: (a) Cromatograma de ons [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Sulfametoxazole , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o

Sulfametoxazole............................................................................................................ 71 Figura 5.5: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Bezafibrato , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Bezafibrato.................................. 71 Figura 5.6: (a) Cromatograma de ons [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Trimetoprima , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o Trimetoprima.......................... 72 Figura 5.7: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Diclofenaco , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Diclofenaco.............................. 72 Figura 5.8: (a) Cromatograma de ions [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Trimetoprima (m/z 291,1459), e de de ions [M-H]- de uma pdro de 50 ng/mL para o Diclofenaco (m/z 294,0096) e Bezafibrato (m/z 360,1009).......................................... 72 Figura 5.9: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Bisfenol A , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Bisfenol A................................... 73 Figura 5.10: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Estradiol , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Estradiol............................................73 Figura 5.11: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Etinilestradiol , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Etinilestradiol......................... 74 Figura 5.12: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Bisfenol A (m/z 227,1072), Estradiol (m/z 271,1707) e Etinilestradiol (m/z 295,1707)74 Figura 5.13: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Nonilfenol mistura , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Nonilfenol mistura........... 74 Figura 5.14: (a) Cromatograma de ions [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Miconazol , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o Miconazol.................................... 74 Figura 5.15: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Nonilfenol mistura (m/z 219,1759) e de de ions [M+H]+ de uma padro de 50 ng/mL para o Miconazol (m/z 416,9914)................................................................................. 75 Figura 5.16: Curvas analticas dos compostos estudados............................................... 80 Figura 5.17: Grfico sumrio da estatstica bsica dos resduos com teste de normalidade de Anderson-Darling do composto diclofenaco....................................... 81 x

Figura 5.18: Grfico de resduos do composto diclofenaco........................................... 82 Figura 5.19: Grfico sumrio da estatstica bsica dos resduos com teste de normalidade de Anderson-Darling do composto bisfenol A......................................... 82 Figura 5.20: Grfico de resduos do composto Bisfenol A.......................................... 83 Figura 5.21 - Concentrao dos frmacos e perturbadores endcrinos encontrados nas amostras de esgoto......................................................................................................... 89 Figura 5.22 : Cromatograma de ions [M+H]+ do composto trimetoprima (m/z 291,144) e de ons [M-H]- do composto bezafibrato (m/z 360,0998) encontrados em amostra de esgoto bruto................................................................................................................... 93 Figura 5.23 : Cromatograma de ons [M-H]- do composto bisfenol A encontrado na amostra de esgoto.......................................................................................................... 93 Figura 5.24 : Cromatograma de ons [M-H]- do composto Nonilfenol mistura encontrado em amostra de esgoto bruto........................................................................................... 93 Figura 5.25: Variao da rea cromatogrfica do composto nonilfenol mistura em cada sistema de tratamento investigado.................................................................................. 96

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LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Substncias qumicas classificadas como EDCs....................................... 8 Tabela 3.2: Estrutura e propriedades fsico-qumicas dos compostos estudados......... 12 Tabela 3.3: Excreo diria (g) per capta de estrognios por humanos...................... 16 Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BZF (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E2 (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais................................................................................... 23 Tabela 4.1: Caractersticas dos padres utilizados........................................................ 41 Tabela 4.2: Segmentos e ons monitorados................................................................... 48 Tabela 4.3 Condies de anlise de microcontaminantes por cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas.............................................................................. 49 Tabela 4.4: Caractersticas e condies operacionais do sistema UASB-Wetland no plantada........................................................................................................................... 56 Tabela 4.5: Caractersticas e condies operacionais do sistema UASB-Lagoas de polimento........................................................................................................................ 56 Tabela 5.1: Resultado por rea do teste de lavagens (clean-up) do cartucho com solues metanlicas em diferentes concentraes....................................................... 58 Tabela 5.2: Resultados do teste utilizando cartucho Strata SAX e C18(valores em reas dospicoscromatogrficos............................................................................................... 59 Tabela 5.3: ndice de Recuperao dos analitos em diferentes cartuchos e procedimentos de extrao.................................................................................................................... 62 Tabela 5.4: Resposta em rea cromatogrfica dos compostos LAS e dos compostos estradiol, etinilestradiol e bisfenol eludos dos cartuchos Strata SAX e Strata X.. 66 Tabela 5.5: ndice de Recuperao dos compostos estudados (concentrao de 100 ng/L)............................................................................................................................... 67 Tabela 5.6: rea Mdia e o desvio padro relativo (DPR) das sete repeties de cada concentrao dos padres da curva de calibrao......................................................... 77
Tabela 5.7: Parmetros das equaes das curvas analticas dos compostos estudados e seus respectivos coeficientes de correlao (Sulfametoxazole (SMZ), Trimetoprima (TMP), Miconazol (MCZ), Diclofenaco (DCF), Bezafibrato (BZF), Estradiol (E2), Etinilestradiol (EE) e Bisfenol A (BPA)......................................................................................................... 79

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Tabela 5.8: Limites de Deteco e Limites de Quantificao do Mtodo considerando limites do equipamento, correes de diluio, rendimento de extrao e efeitos da matriz............................................................................................................................. 83
Tabela 5.9: Resultados teste de Preciso............................................................................... 85

Tabela 5.10: ndice de Recuperao dos compostos estudados (concentrao de 100 ng/L)............................................................................................................................... 86 Tabela 5.11: Variao percentual nos sinais de cada composto nas amostras analisadas........................................................................................................................ 87 Tabela 5.12: Concentrao dos microcontaminantes em vrias etapas de tratamento de esgoto (n=12).................................................................................................................. 94

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LISTA DE NOTAES
ANVISA APCI APPI BPA BZF CDL CI DCF DPR E1 E2 E3 EE EI ELISA ELL EFS ESI ECD EDCs ETE FID GC-MS HPLC INMETRO Industrial IT Koc Kow LAS LD on trap Coeficiente de Soro Coeficiente de Partio Octanol-gua Linear alkylbenzene sulphonate Limite de Deteco xiv Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Atmospheric pressure chemical ionization Atmospheric pressure Photoionization Bisfenol A Bezafibrato Curved Dessolvation Line Chemical Ionization Diclofenaco Desvio padro relativo Estrona Estradiol Estriol Etinilestradiol Electron Ionization Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Extrao Lquido-Lqudo Extrao em Fase Slida Electrospray Electron Capture Detector Endocrine Disruptors Compounds Estao de Tratamento de Efluente Flame Ionization Detector Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas High Performance Liquid Chromatography Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade

LQ MCZ MIPs MS NP PPCPs RIE SIM SMZ SPE SPME TMP TOF USEPA VTG

Limite de Quantificao Miconazol Molecularly Imprinted Polymers Mass Spectrometer Nonilfenol Pharmaceuticals and Personal Care Products Radioimunoensaio Selected Ion Monitoring Sulfametoxazol Solid Phase Extraction Solid Phase Micro-Extration Trimetoprima time of flight United States Environmental Protection Agency Vitelogenina

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RESUMO

A ocorrncia e os efeitos de frmacos e perturbadores endcrinos no ambiente tm sido discutidos na literatura nos ltimos anos. Esses compostos so capazes de afetar a sade humana e os organismos aquticos. Nesse estudo foi desenvolvida e validada uma metodologia analtica, utilizando extrao em fase slida e cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas e ionizao por eletrospray, para determinao dos frmacos sulfametoxazol, trimetoprima, diclofenaco, bezafibrato e miconazol e dos perturbadores endcrinos estradiol, etinilestradiol, bisfenol A e nonilfenol em amostras de esgoto. A matriz esgoto possui muitas substncias que so capazes de interferir no mecanismo de ionizao dos analitos de interesse, podendo assim, afetar o desempenho do mtodo em termos de deteco, seletividade, repetibilidade e limite de quantificao. Para contornar e minimizar esse problema, foram adotadas nesse trabalho melhorias nas etapas de concentrao e clean-up dos extratos atravs do uso de um cartucho de troca inica forte, amina quaternria (Strata SAX), seguido de extrao em cartucho (Strata X), contendo um grupamento hidroflico (pirrolidona) e outro lipoflico (benzila). Foram otimizadas as condies de cromatografia e realizadas correes dos resultados pelas respostas de quantidades adicionadas dos analitos aos extratos. O mtodo desenvolvido se mostrou eficiente na determinao dos compostos de interesse tendo em vista os parmetros de validao: preciso, especificidade, exatido (recuperao), limite de deteco e quantificao, linearidade e avaliao do efeito matriz. Os coeficientes de correlao (R) das curvas de calibrao foram maiores que 0,99 (exceto para o miconazol que foi maior que 0,97) apresentando boa linearidade do mtodo na faixa de trabalho que variou de 5 a 250 ng/mL. Foram obtidos baixos limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) que variaram de 1 a 12,4 ng/L e 3,3 a 41,3 ng/L respectivamente. O composto trimetoprima apresentou o menor LD e LQ e o composto etinilestradiol apresentou o maior LD e LQ entre todos os compostos avaliados. O DPR da preciso intra-dia foi menor que 14% para todos os compostos. Apesar das baixas recuperaes para alguns compostos, o mtodo apresentou boa preciso dos resultados. O mtodo foi aplicado para determinao dos compostos em amostras de esgoto e para avaliao da eficincia de remoo em sistemas simplificados de tratamento de esgoto da Estao Experimental de Tratamento de Esgotos da UFMG-COPASA, localizada junto ETE Arrudas, em Belo Horizonte, MG. Bisfenol A e o antibitico trimetoprima xvi

(mediana de 165 ng/L e 61 ng/L respectivamente) foram encontrados em todas as amostras. Etinilestradiol (EE2) e estradiol (E2) forma raramente detectados. Os frmacos sulfametoxazol (mediana 13 ng/L), diclofenaco (mediana 100 ng/L) e bezafibrato (mediana 95 ng/L) foram encontrados em 92% das amostras. Miconazol foi raramente detectado, somente em 16,7% das amostras e a concentrao mais alta encontrada foi de 13,9 ng/L. O mtodo analtico desenvolvido e sua aplicao uma importante contribuio para a avaliao da remoo desses compostos pelos sistemas de tratamento de esgotos brasileiros, para se conhecer sua eficincia em termos de remoo desses microcontaminantes.

Palavras-chave: Frmacos, perturbadores endcrinos, cromatografia lquida de alta performance acoplada espectrometria de massas, extrao em fase slida, esgoto, efeito matriz

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ABSTRACT
The occurrence and effects of pharmaceuticals and endocrine disruptors in the environment have been discussed in the literature in recent years. These compounds are capable of affecting human health and aquatic organisms. In this study, it was developed and validated an analytical method, using solid phase extractions and liquid chromatography coupled to mass spectrometry using electrospray ionization for the determination of the pharmaceuticals: sulfamethoxazole, trimethoprim, diclofenac, bezafibrate and miconazole and endocrine disruptors: estradiol, ethinylestradiol, Bisphenol A and nonylphenol in sewage samples. The sewage matrix has many substances that are capable of interfering with the ionization mechanism of the analytes, and may thus affect the performance of the method in terms of detection, selectivity, repeatability and limit of quantification. To work around and minimize this issue, was adopted in this work improvements in the concentration and clean-up steps of extraction by using a quaternary amines strong exchange cartridge (Strata SAX), followed by the extraction in a Strata X cartridge which has a lipophilic (benzil) group and a hydrophilic (pyrrolidone) side group. It was also improved the chromatography conditions and made corrections of the results by the responses of added quantities of analytes to the final extracts. The method developed proved efficient in determination of compounds of interest by the validation parameters: precision, specificity, accuracy (recovery), limit of detection and quantification, linearity and evaluation of the matrix effects. The correlation coefficients (R) of the analytical curves were greater than 0.99 (except for the miconazole that was greater than 0.97) showing good linearity of the method in the range of work that varied from 5 to 250 ng/mL. Were obtained low limits of detection and quantification that ranged from 1 to 12.4 ng/L and 3.3 to 41.3 ng/L respectively. The compound trimethoprim presented the lowest LD and LQ and compost ethinyl estradiol presented the largest LD and LQ between all compounds evaluated. The precision intra-day was less than 14% (RDS) for all compounds. Despite low recoveries for some compounds, the method presented good accuracy of the results. The method was applied for the determination of compounds in sewage samples and for assessment of removal efficiency in simplified systems of sewage treatment station's Experimental sewage treatment plant of UFMG-COPASA, located next to the ETE Arrudas, in Belo Horizonte, MG. Bisphenol A and the antibiotic trimethoprim (median

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of 165 ng L-1 and 61 ng L-1 respectively) were found in all samples. Ethinyl estradiol (EE2) and estradiol (E2) were rarely detected. The pharmaceuticals sulfamethoxazole (median13 ng L-1), diclofenac ( median 100 ng L-1) and bezafibrate (median 95 ng L-1) were found in 92% of the samples. Miconazole was rarely detected, only 16.7%, with the highest concentration found of 13, 9 ng L-1. The method developed is a important contribution for the evaluation of sewage treatment plants in Brasil in the removal of emerging microcontaminants.

Keywords:

Pharmaceuticals;

endocrine

disrupters;

high

performance

liquid

chromatography tandem mass spectrometry; solid phase extraction; sewage; matrix effect

xix

1 - INTRODUO
Nas ltimas dcadas, tm se observado a ocorrncia e a frequente deteco de uma variedade de microcontaminantes orgnicos em amostras de gua superficial, esgoto, gua subterrnea, e at mesmo gua potvel em diversas partes do mundo (Zuccato, et al., 2010; Kasprzyk-Hordern et al, 2008d; Kim, et al., 2007; Roberts, et al., 2006; Brown et al., 2006 ; Castiglioni, et al 2005; Komori, et al., 2004). Dentre esses compostos tambm chamados de contaminantes emergentes, que so amplamente utilizadas pelo homem, esto includos frmacos de diferentes classes tais como analgsicos, antibiticos, reguladores lipdicos, anti-inflamatrios, hormnios sintticos, alm de substncias utilizadas em protetores solares, em produtos de higiene pessoal, em plastificantes e detergentes. Esses compostos surgem como uma nova classe de poluentes orgnicos de preocupao ambiental devido ao seu elevado potencial para afetar o meio ambiente e at mesmo a sade humana (Fent, Weston et al., 2006). So geralmente muito polares e, portanto, de grande mobilidade no ambiente aqutico (Gebhardt e Schroder, 2007). Em sua maioria, so compostos recalcitrantes. Alguns podem causar disfuno do sistema endcrino de homens e animais, sendo classificados como perturbadores endcrinos (Segner, Caroll et al., 2003). Os chamados perturbadores endcrinos tm atrado a ateno do pblico e da comunidade cientfica em virtude de suas propriedades carcinognicas e estrognicas. Os seus efeitos so cumulativos e pode ser que eles somente apaream em geraes posteriores (ZafraGmez, Ballesteros et al., 2008). Um grande nmero de compostos farmacuticos de diferentes classes consumido anualmente em todo o mundo. Aps a administrao, esses compostos so parcialmente metabolizados e excretados na urina e fezes e, posteriormente, entram nas estaes de tratamento de esgoto (ETEs), onde so tratadas em conjunto com outros constituintes orgnicos e inorgnicos contidos em guas residuais. No entanto, tem sido demonstrado que alguns destes compostos farmacuticos, presentes em concentraotrao (ng/L), no so totalmente removidos durante o tratamento e, como resultado, podem ser observados nos efluentes das ETEs, guas superficiais e, menos freqentemente, nas guas subterrneas e gua potvel. (Tambosi, Yamanaka et al., 2010). Os frmacos de uso tpico, assim como os detergentes e os aditivos industriais lixiviados de produtos plastificantes da mesma forma que os frmacos de uso oral

tambm so descartados no esgoto alcanando as ETES no sendo tambm completamente removidos e podendo dessa forma contaminar o meio ambiente. A remoo de compostos qumicos advindos de frmacos, produtos de limpeza e de higiene pessoal em sistemas simplificados de tratamento de esgotos altamente desejvel, uma vez que tais sistemas tm grande potencial em termos de sua disseminao e aplicabilidade no Brasil, principalmente em pequenas comunidades e comunidades de baixa renda, onde se observa um pequeno aporte de recursos financeiros destinados ao tratamento de guas residurias. Nesse sentido, a remoo de microcontaminantes no tratamento de esgotos situa-se como uma medida de preveno em termos de contaminao de guas superficiais e subterrneas, que atua diretamente nos aspectos de minimizao dos riscos sade pblica. Os efeitos sade humana provocados pela ingesto de gua potvel contendo frmacos ainda no esto completamente elucidados. Pouco se sabe sobre os possveis efeitos crnicos de sade associados com a ingesto em longo prazo das misturas destes compostos. Segundo Kmmerer (2004), os efeitos adversos causados por compostos farmacuticos incluem toxicidade aqutica, desenvolvimento de resistncia em bactrias patognicas (no caso de antibiticos), genotoxicidade e distrbios endcrinos. Os chamados perturbadores endcrinos podem apresentar atividade estrognica ou outros efeitos biolgicos em concentraes muito baixas (ng/L) (Girotto et al., 2007). Uma vez que muitos destes compostos esto presentes em potenciais mananciais de abastecimento de gua, relevante a preocupao com estes compostos por serem uma ameaa potencial sade pblica, Desta forma, a freqente ocorrncia de frmacos no ambiente aqutico e na gua que entra nas estaes de tratamento de gua (ETA) tem levantado a questo sobre o seu impacto no ambiente e na sade humana. Pesquisadores de vrios pases vm se empenhando no desenvolvimento de mtodos analticos suficientemente sensveis, com limites de deteco na ordem de g/L e ng/L para determinao desses compostos em diversas matrizes ambientais. O esgoto por ser uma matriz bastante complexa do ponto de vista analtico, por conter muitas substncias que podem interferir na quantificao dos analitos de interesse, requer um pr-tratamento adequado das amostras para a concentrao, deteco e quantificao destes compostos, encontrados frequentemente em concentraes muito baixas. No Brasil, estudos de monitoramento de microcontaminantes em guas e efluentes ainda so incipientes, e a reviso da literatura mostra que h poucos trabalhos nacionais

publicados abordando a presena de tais contaminantes em efluentes sanitrios, em guas superficiais e subterrneas. nesse contexto que este trabalho se insere e ser dividido em 6 captulos. No captulo 2, sero apresentados os objetivos e as metas principais desta dissertao. No captulo 3 ser apresentada uma reviso bibliogrfica da ocorrncia dos compostos avaliados no meio ambiente em diversas partes do mundo, bem como as metodologias analticas existentes para deteco desses compostos, suas dificuldades e desafios analticos. O captulo 4 expe a metodologia de anlise desenvolvida e sua validao. O captulo 5 apresenta os resultados obtidos nesse trabalho e suas discusses. E por fim o captulo 6 apresenta as concluses e no captulo 7 so apresentadas propostas para trabalhos futuros.

2- OBJETIVOS

2.1 - Objetivo Geral

O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analtica, utilizando extrao em fase slida e cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas, para identificao e quantificao de microcontaminantes em diversas etapas de sistemas de tratamento simplificado de esgotos. Os microcontaminantes selecionados foram cinco frmacos: sulfametoxazol, trimetoprima, diclofenaco, bezafibrato e miconazol; e quatro perturbadores endcrinos pertencentes a diferentes classes como hormnio natural (estradiol), hormnio sinttico (etinilestradiol), surfactante (nonilfenol) e plastificante (bisfenol A).

2.1.1 - Objetivos Especficos

Desenvolver um mtodo de anlise por cromatografia lquida acoplado espectrometria de massas para a separao e quantificao desses

microcontaminantes; Desenvolver uma metodologia de extrao, limpeza (clean-up) e concentrao dos microcontaminantes utilizando extrao em fase slida; Validar o mtodo desenvolvido; Determinar a ocorrncia e a concentrao desses microcontaminantes em amostras de esgotos brutos e efluentes da Estao Experimental de Tratamento de Esgotos da UFMG-COPASA, localizada junto ETE Arrudas, em Belo Horizonte, MG.

3 - REVISO BIBLIOGRFICA 3.1 - Introduo

Recentemente vrias substncias qumicas de uso comum em atividades humanas e/ou seus metablitos foram classificados como contaminantes emergentes, ou microcontaminantes emergentes (USEPA, 2008). Estas substncias so produtos qumicos e componentes microbianos que at recentemente no eram tradicionalmente considerados como contaminantes ambientais, apesar de estarem presentes no meio ambiente em escala global. So geralmente provenientes de fontes de guas resdurias municipais, agrcolas e industriais. Incluem no s as substncias originais, mas tambm seus subprodutos ou metablitos, ou seja, produtos da degradao qumica e biolgica dos compostos originais. Eles representam uma mudana no conceito tradicional sobre contaminao ambiental, pois muitos so produzidos industrialmente e esto dispersos no ambiente pelo uso domstico, comercial e industrial. O termo microcontaminantes emergentes tambm utilizado, pois estas substncias se encontram, geralmente, em baixas concentraes (ng/L) nas amostras ambientais. De maneira geral so substncias originrias de diversas fontes e podem apresentar efeitos txicos no longo prazo. Seus efeitos para a sade de animais e seres humanos no esto ainda bem estabelecidos. So poucos os dados de testes biolgicos padronizados para avaliar seus efeitos. Devido a sua diversidade no existem mtodos oficiais para detectar e quantificar muitos deles. Ainda, segundo a USEPA (2008) estas substncias podem ser classificadas como Substncias Persistentes Bioacumulativas e Txicas; Contaminantes Orgnicos Globais; Produtos de Higiene Pessoal e Produtos Farmacuticos (PPCPs); Perturbadores Endcrinos e ainda mais recentemente foram includas as nanopartculas. As substncias persistentes, bioacumulativas e txicas (POPs) so os compostos orgnicos resistentes degradao ambiental por meio qumico, biolgico e ou processos fotolticos. Dentre elas se incluem substncias de comprovada toxidade tais como pesticidas clorados (aldrin, chlordane, DDT, dieldrin, endrin, heptacloro, hexaclorobenzeno, mirex, etc); os produtos da combusto (dibenzo-p-dioxinas, dibenzofuranos e os policclicos aromticos carcinognicos HPAs ); os retardantes de chama bromados e muitos compostos organometlicos. Estas substncias persistem no ambiente, so transportados a longas distncias, bioacumulam nos tecidos humanos e 5

animais, ocorre biomagnificao nas cadeias alimentares, tem o potencial de causar impactos significativos sobre a sade humana e o meio ambiente. A classe de Produtos de Higiene Pessoal e Produtos Farmacuticos (PPCPs) a mais diversa categoria de substncias emergentes. Muitos destes compostos so solveis em gua e so expostos aos compartimentos ambientais atravs de guas residurias (industriais e municipais), fossas spticas, drenagem do lodo de esgotos, estrume de animais e lixiviado de aterros sanitrios. A rota de contaminao passa, na maioria das vezes, pela ingesto e uso tpico por humanos e animais, ou pela exposio involuntria nas guas e alimentos. Devido as suas propriedades recalcitrantes e antibiticas, as estaes de tratamento de esgotos (ETE) podem no ser eficazes no tratamento e remoo destes compostos. Nesta classe de microcontaminantes se encontram as drogas de prescrio teraputica, medicamentos veterinrios, fragrncias, aditivos de cosmticos, protetores solares, agentes de diagnstico, nutracuticos (ex. vitaminas) e drogas ilcitas (anfetaminas, cocana, etc.). Os microcontaminantes classificados como perturbadores endcrinos (EDCs) tambm conhecidos como disruptores endcrinos, desreguladores endcrinosou interferentes endcrinos so substncias (ou mistura de substncias) exgenas capazes de assumir ou inibir a funo de hormnios naturais nos seres vivos, alterando assim as funes do sistema endcrino e consequentemente prejudicando a sade dos organismos de sua descendncia ou de subpopulaes (Nogueira, 2003). Segundo a USEPA um interferente endcrino um agente exgeno que interfere na sntese, secreo, transporte, ligao, ao ou eliminao de hormnios naturais que so responsveis pela manuteno da homeostase, reproduo, desenvolvimento e/ou comportamento. Nesta classe se enquadram substncias como alguns hormnios naturais e sintticos, alguns surfactantes, alguns plastificantes e alguns pesticidas. A reviso bibliogrfica sobre a ocorrncia e procedimentos analticos para alguns compostos das classes de EDCs e PPCPs, avaliados neste trabalho, sero discutidos a seguir.

3.2 - Perturbadores Endcrinos

A vinculao de patologias como conseqncias da exposio aos perturbadores endcrinos surgiu depois de acontecimentos importantes, tais como, o aparecimento de 6

cncer no sistema reprodutivo de filhas de mulheres que usaram dietilestilbestrol na gravidez, entre os anos de 1940 a 1970 (Birkett e Lester, 2003) anomalias no sistema reprodutivo observadas em jacars que habitavam um lago na Flrida contaminado com o pesticida DDT e seu metablito DDE (Guillette et al, 1996) e um estudo na Dinamarca que relata o declnio da qualidade do smen de homens durante aproximadamente 50 anos, entre os anos de 1938 e 1990 (Carlsen et al, 1992). A literatura cita vrios efeitos associados exposio de espcies animais aos perturbadores endcrinos como: diminuio na ecloso de ovos de pssaros, peixes e tartarugas; feminizao de peixes machos; problemas no sistema reprodutivo em peixes, rpteis, pssaros e mamferos e, alteraes no sistema imunolgico de mamferos marinhos. Em seres humanos alguns dos efeitos observados foram: a reduo da quantidade de esperma, o aumento da incidncia de cncer de mama, de testculo e de prstata e a endometriose - doena provocada pela presena do endomtrio em locais fora do tero (Bila e Dezotti, 2007). Os EDCs abrangem uma grande faixa de classe de substncias com estruturas similares distintas. Dentre as substncias que possuem a capacidade de afetar o sistema endcrino podemos citar: substncias sintticas (alquilfenis, pesticidas, ftalatos, bifenilas policlorados (PCB), bisfenol A, substncias farmacuticas, entre outras) e substncias naturais (estrognios naturais e fitoestrognios). A Tabela 3.1 apresenta alguns EDCs e suas respectivas classes.

Tabela 3.1: Substncias qumicas classificadas como EDCs Ftalatos dietil ftalato (DEP) di-iso-butil ftalato (DIBP) di-n-butil ftalato (DBP) butilbenzil ftalato (BBP) diciclohexilo ftalato (DCHP) di-2-(2-etil-hexil) ftalato (DEHP) di-n-octil ftalato (DOP) di-isooctil ftalato (DIOP) di-iso-nonil ftalato (DINP) di-iso-decil ftalato (DIDP Alquilfenis nonilfenol nonilfenol etoxilado octilfenol octilfenol etoxilado Furanos e Dioxinas dibenzo-p-dioxina TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-pdioxina) TCDF (2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano) Bisfenol Bisfenol A Parabenos benzilparabeno isobutilparabeno butilparabeno n-propilparabeno etilparabeno metilparabeno Hidrocarbonetos aromticos policclicos Naftalina Benzo[a]antraceno Acenaftileno Criseno Fluoreno Benzo[b]fluoranteno Fenantreno Benzo[k]fluoranteno Antraceno Benzo[a]pireno Fluoranteno Indeno[123-cd] Pireno pireno Dibenzo[ah]antraceno Benzo[ghi]perileno Metais pesados Cdmio Mercrio Chumbo Zinco Agentes teraputicos e farmacuticos Dietilestilbestrol (DES) 17-etinilestradiol (EE2) Estrognios naturais estrona (E1) 17-estradiol (E2) Fonte: (Bila e Dezotti, 2007) adaptada. Pesticidas Inseticida DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1tricloroetano) DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1dicloroetileno) Lindano (1,2,3,4,5,6-hexacloroexano) deltametrin carbofurano Herbicidas atrazina linuron Fungicidas vinclozolina tridemorfos carbendazina procimidona penconazol epoxiconazol procloraz Compostos orgnicos de estanho Tributilestanho (TBT) Trifenilestanho (TPT) Policlorados de bifenilas (PCB) 2,4,4-triclorobifenil 2,2,5,5-tetraclorobifenol 2,2,4,5,5-pentaclorobifenil 2,3,4,4,5-hexaclorobifenil 2,23,4,4,5- hexaclorobifenil 2,2,4,4,5,5-hexaclorobifenil 2,2,3,4,4,5,5-heptaclorobifenil Retardantes de chama bromado polibromobifenila( PBB) 2,2,4,4-tetrabromodifenil ter 2,2,4,4,5-pentabromodifenil ter 2,2,4,4,6-pentabromodifenil ter 2,2,4,4,5,5-hexabromodifenil ter 2,2,4,4,5,6-hexabromodifenil ter 2,2,3,4,4,5,6-heptabromodifenil ter octabromodifenil ter (BDE octa) decabromociclodifenil ter (BDE 209) hexabromociclododecano (HBCD) tetrabromobisfenol A (TBBA) Fitoestrognios Isoflavona: daidzena e genistena Lignanas: metaresinol e enterodiol

3.3- Frmacos
Frmacos so compostos qumicos moderadamente solveis em gua, lipoflicos e biologicamente ativos. Podem ser administrados oralmente, topicamente (aplicao na pele e mucosas), ou parenteralmente (injees e infuses). Depois da administrao, essas substncias so absorvidas, distribudas, parcialmente metabolizadas, e finalmente excretadas do corpo na forma original, associada ou como metablitos. Uma quantidade significativa dessas substncias originais e seus metablitos so excretados na urina, fezes ou esterco animal, sendo freqentemente encontrados no esgoto domstico. A principal rota de entrada de frmacos no ambiente o lanamento de esgotos domsticos, tratados ou no, em cursos de gua. Eles tambm podem ser introduzidos atravs dos efluentes de indstrias farmacuticas, efluentes rurais e tambm pela disposio inadequada de produtos no usados ou com o prazo de validade expirado (Melo et al, 2008). A Figura 3.1 apresenta as principais rotas de contaminao de frmacos no meio ambiente Percebe-se que nas ltimas dcadas houve um aumento significativo em todo o mundo no consumo de medicamentos de diversas classes tais como antipirticos, analgsicos, anti-inflamatrio, reguladores lipdicos, antibiticos, drogas contraceptivas e outras. A preocupao da comunidade cientfica com a presena de frmacos no meio ambiente tem se tornado cada vez maior. Como essas drogas so substncias biologicamente ativas, a presena dos mesmos no ambiente aqutico significa um risco potencial para a sade humana se estiverem presentes na gua de consumo (Lee et al, 2005). Alm de oferecerem riscos para os animais aquticos podem, como no caso dos antibiticos, provocarem resistncia bacteriana.

Figura 3.1: Principais rotas de frmacos no meio-ambiente (Tambosi, 2008)

Vrias so as classes de frmacos detectados no meio ambiente. A figura 3.2 ilustra as principais classes teraputicas de frmacos encontradas no meio ambiente por vrios pesquisadores de todo o mundo. Pode-se perceber que as classes teraputicas mais encontradas no meio ambiente so: antiinflamatrios no esteroidais, antibiticos, reguladores lipdicos e hormnios sexuais.

10

Figura 3.2: Classes teraputicas detectadas no meio-ambiente, expresso em % relativa. Dados coletados de 134 artigos publicados entre 1997 e 2009. Adaptado de Santos et al, 2009

3.4 Caractersticas e Toxicidade

Anualmente, toneladas de substncias sintticas e naturais so lanadas no meio ambiente, das quais, um nmero considervel de potenciais perturbadores endcrinos. Alm de estarem associados aos efeitos no sistema endcrino, alguns so persistentes e bioacumulativos, o que facilita a disperso e difuso no meio ambiente. As propriedades fsico-qumicas dos compostos iro influenciar no seu comportamento no meioambiente. Compostos com baixa solubilidade e alto coeficiente de partio octanol/gua (Kow), geralmente esto presentes em tecidos gordurosos da biota, o que promove a bioacumulao na cadeia alimentar. O Kow pode determinar a soro efetiva e a afinidade dessas substncias pela matria orgnica. So verificados dois mecanismos de soro: a absoro, que trata de interaes hidrofbicas caracterizadas pelo valor de Kow; e a adsoro que est relacionada com interaes eletrosttica e a tendncia da substncia de se dissociar no meio aquoso (Raimundo, 2007). Condies tais como, temperatura, pH, fora inica, existncia de substncias hmicas ou material particulado, influenciam significativamente na solubilidade e destino desses compostos, facilitando ou dificultando sua degradao no meio natural. A tabela 3.2 apresenta a estrutura e caractersticas dos compostos estudados neste trabalho.

11

Tabela 3.2: Estrutura e propriedades fsico-qumicas dos compostos estudados Composto Frmula estrutural MM pka Log Kow Solub. em gua (mg/L) 120

Bisfenol A (BPA)
HO
OH

228.29
OH

10,2

3.32

17-Estradiol (E2)
H HO

272.38
H

10,4

3.94

13

OH

17-Etinilestradiol (EE)
HO

296.40
H

10,4

4.8

4.83

OH

4-Nonilfenol (NP)
H3C(H2C)7H2C

220.35

10,7

4.48

5,43

Sulfametoxazol (SMZ)

O H2N S O H N N

253.28

5,8

0,9-2,5

610

HN N

Miconazol (MCZ)
Cl Cl

479,14
Cl Cl

6,7

6,1

0,01

COOH

Cl

Diclofenaco (DCF)

NH

296,14

4,2

4,2 -4,5

2,4

Cl

Bezafibrato (BZF)
Cl

O O

COOH

361.82
N H

3,3

4,3

0,335

NH2 OCH3

Trimetoprima (TMP)

290.32
H3N N OCH3 OCH3

7,1

0,8-1,4

0,4

Fontes: Vega-Morales et al., 2010; Nodler et al., 2010; Huang et al, 2010; KasprzykHordern et al., 2008; Raimundo, 2007; SRC PhysProp Database. 12

Frmacos so substncias biologicamente ativas e persistentes reconhecidas como uma ameaa permanente para a estabilidade ambiental. Dados de ecotoxicidade crnica, bem como informaes sobre os nveis atuais de distribuio nos diferentes compartimentos ambientais continuam a ser escassos e concentram a ateno nessas classes teraputicas mais freqentemente prescritos e consumidos. No entanto, eles indicam o impacto negativo que estes contaminantes qumicos podem ter sobre os organismos vivos, ecossistemas e, finalmente, a sade pblica. Atualmente na Europa e Estados Unidos a legislao exige estudos de impactos ambientais de novos medicamentos e consequentemente avaliao dos efeitos agudos e crnicos. No entanto ainda persiste a falta de conhecimentos sobre dados toxicolgicos e efeitos sinrgicos dos frmacos (Santos et al, 2007). No que diz respeito aos efeitos na sade humana, o Comit Cientfico da Toxicidade, Ecotoxicidade e Ambiente da Agncia Internacional para Pesquisa de Cncer (IARC) concluiu que h relao direta entre alguns perturbadores endcrinos e alteraes na sade humana, como o cncer de testculo, de mama e de prstata, no declnio das taxas de espermatozides, deformidades dos rgos reprodutivos e disfuno da tiride (Bila e Dezotti, 2007). Ainda de acordo com a Agncia Internacional para Pesquisa de Cncer (IARC), apenas os estrognios so considerados cancergenos para humanos, as outras classes ainda no foram classificadas quanto a carcinogenicidade em seres humanos. As funes do sistema reprodutivo feminino dependem do balano e das concentraes dos hormnios (estrognios, andrgenos e tireoidianos), assim, uma disfuno no sistema endcrino pode resultar em algumas anomalias, tais como, irregularidade no ciclo menstrual, endometriose e infertilidade (Nicolopoulou-Stamati e Pitsos, 2001). Um biomarcador muito utilizado para avaliar a exposio de alguns tipos de organismos s substncias com atividade estrognica a determinao de nveis de vitelogenina-VGT (protena que desempenha um importante papel no sistema reprodutivo de vertebrados ovparos fmeas) no plasma sanguneo de um organismo. O gene do vitelogenina tambm est presente em organismos machos, mas sob condies normais no expresso, possivelmente regulado pela baixa concentrao de estrognio no sangue. Vrios estudos demonstram que organismos aquticos respondem com aumento da sntese de VTG exposio a determinadas concentraes de estrognios. Rodgres-Gray et al (2000) observaram um aumento nos nveis de VTG no plasma de 13

peixes da espcie Rutilus rutilus quando expostos ao efluente de ETE do Reino Unido. Neste efluente foi detectada a presena dos estrognios 17 -estradiol, estrona e 17etinilestradiol nas concentraes de 4, 50 e 1,7-3,4 ng/L, respectivamente. Um experimento com tartarugas da espcie Chrysemys picta, mostrou que as tartarugas fmeas expostas a estrognios respondem com altos nveis de vitelogenina no plasma, levando a alteraes no sistema reprodutivo desses animais. Outros estudos mostraram que vrios xenoestrognios tais como bisfenol A e os alquilfenis, possuem a capacidade de estimular a produo de vitelogenina, principalmente em peixes, onde esse tipo de ensaio comumente realizado (Bila e Dezotti, 2003). O impacto dos interferentes endcrinos sobre algumas espcies de seres vivos somente observado quando os organismos so continuamente expostos. Um dos exemplos mais conhecidos no meio cientfico o episdio envolvendo a contaminao de crocodilos no lago Apopka (Flrida/EUA), na dcada de 80. Na ocasio, alguns pesquisadores notaram que a populao desses animais estava diminuindo ano a ano. Estudos subseqentes demonstraram que a exposio contnua a alguns praguicidas, mesmo em concentraes baixas, sobre os ovos da espcie interferiu no desenvolvimento do sistema reprodutor dos animais, tornando-os infrteis (Sumpter e Johnson, 2005). Segundo a USEPA, atualmente, existem diversas substncias qumicas suspeitas de causar efeitos adversos sade humana os quais esto relacionados a alteraes no sistema endcrino, incluindo efeitos no sistema reprodutivo feminino, como a diferenciao sexual, aumento do risco de cncer de mama e de vagina, ovrios policsticos e endometriose; e no sistema reprodutivo masculino so associados efeitos como a reduo na produo de espermatozides, aumento do risco de cncer testicular e de prstata, infertilidade e alteraes nos nveis hormonais da tireide (USEPA, 1997). No presente trabalho buscou-se avaliar alguns compostos representativos de vrias classes de frmacos/perturbadores endcrinos. A seleo dos frmacos estudados nesse trabalho baseou-se em uma lista de compostos relacionados no Mtodo 1694 da USEPA. A seleo das outras substncias a serem incorporadas ao mtodo 1694 foi efetuada levando em considerao aspectos como grande produo e utilizao, aspectos toxicolgicos e ecotoxicolgicos e degradabilidade. Alguns destes grupos, tais como os esterides, produtos de higiene pessoal, algumas classes de frmacos, surfactantes e aditivos industriais, receberam certo destaque da comunidade acadmica 14

devido quantidade em que foram encontrados no meio ambiente. Em particular, surfactantes alquilfenis etoxilados (APEO), bisfenol-A (BPA), hormnios esterides, como o 17-estradiol (E2) e seus metablitos, incluindo estrona (E1), estriol (E3) e 16hidroxiestrone e esterides sintticos, como 17-etinilestradiol (EE), tm despertado um enorme interesse na comunidade cientfica devido produo mundial, o uso extensivo em aplicaes industriais, agrcolas e domsticas, e toxicidade crnica (Shao et al, 2007).

3.4.1 - Estrognios
Os estrognios naturais fazem parte de um grupo de hormnios esterides lipoflicos produzidos, principalmente nos ovrios e nos testculos em humanos e outros vertebrados (Tapiero et al., 2002). O estrgeno mais potente e abundante de ocorrncia natural nos seres humanos o 17-estradiol, seguido pela estrona e estriol (principal forma de excreo do hormnio) (Raimundo, 2007). O 17-estradiol doze vezes mais ativo que a estrona e oitenta vezes mais ativo que o estriol (Lark, 1999). Eles so responsveis pelas caractersticas secundrias femininas, agem no controle da ovulao, no desenvolvimento e preparo cclico do sistema reprodutor feminino para a fertilizao e implantao do vulo, e podem tambm influenciar no crescimento, desenvolvimento e o comportamento das fmeas (Nassif et al., 2005). O 17-etinilestradiol um estrognio sinttico usado em plulas anticoncepcionais, em terapias de reposio hormonal para controle da menopausa, e em mulheres em ps-menopausa. Nestes tratamentos as mulheres ingerem diariamente entre 20 e 50 g de estrognios. Em alguns anticoncepcionais orais so ingeridos at 500 g dirios. O17-etinilestradiol cerca de 2,5 vezes mais potente que o 17-estradiol. Estrognios naturais como o 17 -estradiol ou estradiol - E2 (tabela 3.2) so diariamente excretados na urina das mulheres e de animais fmeas, sendo assim descartados no esgoto domstico. O etinilestradiol - EE (tabela 3.2) tambm excretado pelas mulheres que fazem uso de tal medicamento contaminando o esgoto domstico. Apesar de grande parte dos estrgenos serem metabolizados e excretados na forma inativa, conjugada com glucurondeos e sulfatos, a ao de enzimas produzidas por bactrias comumente encontradas no meio ambiente facilmente os biotransformam em compostos biologicamente ativos e passveis de desencadearem efeitos a biota (Baronti

15

et al., 2000). A Tabela 3.3 apresenta as taxas de excreo dirias dos principais estrgenos naturais e do 17 -etinilestradiol em seres humanos.

Tabela 3.3: Excreo diria (g) per capta de estrognios por humanos
Categoria Homens Mulheres menstruando Mulheres na menopausa Mulheres grvidas Mulheres tomando anticoncepcional Estrona 3,9 8 4 600 17 -estradiol 1,6 3,5 2,3 259 Estriol 1,5 4,8 1 6000 17etinilestradiol 35

Fonte: Bila e Dezotti, 2007 adaptada

3.4.2 - Alquilfenis
Os alquilfenis so basicamente grupos alquila de diferentes tipos e tamanhos ligados a um anel aromtico contendo uma hidroxila (fenis) (tabela 3.2). Os produtos industriais mais importantes so os alquilfenis etoxilados e carboxilados, representados na figura 3.3.(Raimundo, 2007).

OH

p-nonilfenol

O OH O O OH

p-nonilfenol etoxilado

p-nonilfenol carboxilado

O O

H n

p-nonilfenol polietoxilado

Figura 3.3: Estrutura qumica dos alquilfenis

16

Os alquilfenis etoxilados so surfactantes no-inicos amplamente usados em formulaes de detergentes de uso industrial e domstico em todo mundo. Alm de detergentes, podem ser utilizados como lubrificantes, emulsificantes e esto presentes em formulaes de pesticidas, de tintas e de produtos de uso pessoal como maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e banho (Birkett e Lester, 2003). A produo anual de alquilfenis etoxilados no mundo alcanou 390.000 toneladas em 2002 (Lintelmann et al., 2003). As possveis rotas de entrada dessas substncias no meio ambiente so durante sua produo, uso e disposio. Nas ETE, os alquilfenis polietoxilatos APEO (figura 3.3) so inicialmente biodegradados, derivando em metablitos persistentes e altamente lipoflicos, incluindo alquilfenis etoxilatos e, finalmente, nos alquilfenis tais como nonilfenol (NP) (figura 3.3), e octilfenol (OP) (Routledge e Sumpter, 1996). Estes metablitos so freqentemente detectados nos efluentes de ETE e guas superficiais, sendo relatada sua atividade estrognica em organismos expostos a essas substncias (Sanchez-Avila et al 2009; Zafra-Gmez et al, 2008; Cespedes et al 2006) A toxicidade dos alquilfenis aumenta com a diminuio do tamanho da cadeia alqulica. Dessa forma, o octilfenol e o nonilfenol so os compostos que apresentam o maior potencial estrognico. Os alquilfenis etoxilados so facilmente biodegradados em estaes de tratamento de esgoto e produtos txicos como o p-nonilfenol e pnonilfenol etoxilados so formados, os quais apresentam atividade estrognica. Animais como peixes, patos, mexilho e caranguejo, todos bioacumulam nonilfenol e seus derivados (Lintelmann et al., 2003).

3.4.3 - Aditivos industriais

Muitos aditivos utilizados em produtos industriais possuem potencial estrognico. Dentre esses aditivos, destaca-se o bisfenol A (tabela 3.2) uma substncia amplamente utilizada nos processos industrial sendo sua principal aplicao na produo de policarbonatos e resinas-epxi. Alm disso, pode ser utilizado, em retardantes de chama e tambm podem estar presente em revestimentos de latas de conservas e frascos de alimentos, podendo ser liberado destes causando problemas para a sade humana. Devido a sua alta produo e pelo fato de ser um produto com diversas aplicaes, seu aporte no ambiente ocorre por diferentes fontes. A maior contribuio devida aos processos de produo e manufatura do bisfenol A, despejos de efluentes 17

industriais sem tratamento adequado, e uma pequena contribuio pode ser atribuda lixiviao dos produtos finais de consumo. Os bisfenis so compostos persistentes biodegradao sendo que a exposio humana a esse composto considervel e sua atividade estrognica tem sido frequentemente relatada (Beresford et al, 2000; Gaido et al, 1997). O bisfenol A distribudo entre ar, gua, solo, sedimento e compartimentos da biota. Com base nos valores de log de Kow (3,32) pode-se esperar que haja adsoro pelos materiais particulados, alm de serem lipoflicos e terem o potencial de bioacumulao. Pesquisas realizadas em peixes da espcie Pimephales promelas, expostos a concentraes entre 1 e 1280 g/L de bisfenol A, mostraram uma reduo na fertilidade desses animais, a qual aumentou com o passar das geraes (Lintelmann et al., 2003).

3.4.4 - Frmacos
Anti-inflamatrios Uma das classes de frmacos mais detectados em guas residurias no mundo a dos antiinflamatrios no-esteroidal (AINES). O diclofenaco um AINE muito prescrito no Brasil. Os AINEs apresentam trs grandes efeitos: diminuir a resposta inflamatria; diminuir a dor de causas inflamatrias (efeito analgsico) e diminuir a febre (efeito antipirtico). O diclofenaco (tabela 3.2) bastante persistente em condies naturais e aos processos de tratamento de esgoto convencionais e tem sido detectado em mais de 50 % dos efluentes municipais da Alemanha em concentraes de aproximadamente 2,5 g/L (Ravina et al., 2002). Dentre os AINEs, o diclofenaco mostrou mais natureza txica aguda, com efeitos sendo observados em concentraes abaixo de 100 mg/L (Fent et al.; 2005). Em geral, no se sabe muito sobre a toxicidade aguda para peixes. Ensaios de toxicidade crnica realizados em truta arco-ris (Oncorhynchus mykiss) evidenciaram alteraes citolgicas no fgado, rins e brnquias aps 28 dias de exposio a 1 g/L de diclofenaco. Para uma concentrao de 5 g/L leses renais foram evidentes, assim como a bioacumulao de drogas no fgado, rins e brnquias muscular ( Schwaiger et al., 2004; Triebskorn et al., 2004).

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Reguladores lipdicos

Frmacos moduladores do metabolismo de lipdeos so frequentemente prescritos no mundo e tm como objetivo diminuir a concentrao de triglicrides e colesterol no sangue sendo conhecidos assim como reguladores lipdicos. Essa classe de frmacos pode ser dividida em dois grupos: o das estatinas e o dos fibratos. Os fibratos constituem uma importante classe largamente utilizada para o tratamento de hiperlipidemias (elevao dos nveis plasmticos de colesterol e triglicrides). Dentro do grupo dos fibratos, podemos destacar o bezafibrato (tabela 3.2) e o gemfibrozil. Recentemente, bezafibrato (BZF) foi includo na lista dos medicamentos mais utilizados no mundo (Cermola et al., 2005). Foi evidenciado que o gembrozil e o bezabrato afetam significativamente a alimentao e o crescimento do cnidrio Hidra attenuate (Quinn et al., 2008). De acordo com Quinn e colaboradores (2008), o gemfibrozil pode ser classificado como txico e o bezafibrato como prejudicial para organismos no-alvo. Quando o peixe dourado (Carassius auratus) foi exposto a 1,5 g/L de gemfibrozil por 14 dias, uma diminuio de mais de 50% nos nveis de testosterona plasmtica foi observada, assim provando que este frmaco tambm pode atuar como um perturbador endcrino (Mimeault et al., 2005). Um estudo realizado por Isidori e coloboradores (2007) observou que a concentrao encontrada no meio ambiente para o bezafibrato, no induziu efeitos agudos ou crnicos em organismos no-alvos. Entretanto sua nocividade no pode ser excluda devido ao possvel sinergismo, efeito aditivos, bioacumulao e biomagnificao que devem ser avaliados.

Antibiticos e Antifngicos

Os antibiticos so um grupo de frmacos usado para o tratamento infeces provocados por bactrias. So amplamente utilizados em todo o mundo e seu consumo anual foi estimado entre 100.000 e 200.000 ton (Kumerer, 2003). Nos EUA, mais de 20.000 ton. de antibiticos so produzidos por ano, cerca de 60% para uso humano e 40% para uso veterinrio (Brown et al., 2006). Dentro desse grupo podemos destacar a sulfametoxazol e a trimetoprima (tabela 3.2) presentes no popular Bactrim amplamente utilizado para o tratamento de infeces respiratrias, urinrias, gastrintestinais e outros tipos de infeces. 19

Os antibiticos tm diferentes efeitos sobre o meio ambiente, em um deles a contribuio no desenvolvimento de bactrias resistentes, assunto que tem sido largamente discutido na literatura. Segundo Halling-Sorensen e colaboradores (1998) h indcios de que o desenvolvimento de resistncia microbiana favorecido por baixas concentraes dos antibiticos. Miranda e Castilo (1998) investigaram a incidncia de resistncia microbiana em uma espcie de Aeromonas isolada de ambientes aquticos, constatando que a resistncia ocorreu com vrios antibiticos testados, dentre esses, cloranfenicol, trimetoprima, sulfametoxazol e tetraciclina. Eguchi e colaboradores (2004) estudaram a influncia de diversos agentes antimicrobianos utilizados como medicamentos veterinrios no Japo sobre o crescimento da alga verde Selenastrum capricornutum e Chlorella vulgaris considerando a atividade inibitria de crescimento. Os autores tambm mostraram o aparecimento de uma atividade inibitria de crescimento sinrgico da combinao sulfametoxazol com trimetoprima, quando comparado com as respectivas atividades individuais. Isidori e colaboradores (2005) testaram a eritromicina, oxitetraciclina, sulfametoxazol, ofloxacina lincomicina e claritromicina nos organismos aquticos pertencentes a diferentes nveis trficos (bactrias, algas, rotferos, crustceos e peixes). Os resultados mostraram que os antibiticos testados apresentam efeitos txicos para os organismos testados. Os resultados mostraram que a toxicidade aguda foi da ordem de mg/L enquanto que a toxicidade crnica apareceu em concentraes na ordem de g/L, principalmente para as algas. Demostrando assim, que existe um risco potencial associado a exposio de organismos a baixas concentraes de frmacos em guas superficiais. Substncias azlicas so muito utilizadas como princpio ativo em

medicamentos antifngicos para homens e animais. Pesquisas tm revelado potencial impacto de alguns antifngicos no sistema endcrino de organismos aquticos (ZARN, et al 2003). Alguns antifngicos azlicos como o miconazol (tabela 3.2), itraconazol e clotrimazol tm sido detectados em gua residurias e superficiais (Huang, Q. X. et al., 2010; Kahle et al 2008; Roberts e Bersuder, 2006; Berezen et al, 2005). Alguns compostos azlicos possuem de moderada a alta hidrofobicidade podendo ficar acumulados em matrizes slidas (Kahle et al, 2008). Entretanto, so poucos os dados na literatura sobre sua presena em matrizes slidas (sedimentos e lodos) e em outras matrizes ambientais. Uma importante razo para esse fato que existem poucos mtodos disponveis para se detectar esse composto em matrizes ambientais.

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O miconazol um frmaco utilizado para o tratamento tpico de infeces de pele e unhas causadas por fungos e tambm para o tratamento de diversas micoses de pele como, a popular frieira e o pano branco ou micose de praia. o princpio ativo do popular Vodol muito utilizado para combate das mais diversas micoses.

3.5 - Ocorrncia no meio-ambiente

Perturbadores endcrinos como o estradiol, o etinilestradiol, bisfenol A e nonilfenol e frmacos de diversas classes teraputicas tm sido detectados em esgoto domstico, guas superficiais, subterrneas e at mesmo em gua potvel em vrias partes do mundo. Zucato et al. (2010) detectaram o antibitico sulfametoxazol na concentrao de 246ng/L e outros compostos em gua residurias italianas. J o antibitico trimetoprima foi detectado em guas superficiais americanas na concentrao de 150ng/L. Em Taiwan a concentrao detectada desse antibitico no esgoto bruto foi de 259 a 949ng/L. Nodler et al. (2010) detectaram entre outros compostos, sulfametoxazol (509ng/L), trimetoprima (681ng/L), bezafibrato (168ng/L) e diclofenaco (149 ng/L) em efluentes de esgoto tratado na Alemanha. No reino Unido, Kasprzy-Hordern et al. (2008d) detectaram sulfametoxazol (<LQ), trimetoprima (1879ng/L), bezafibrato (971 ng/L), diclofenaco (70ng/L) e bisfenol A (540ng/L) em amostras de esgoto bruto. Para o antifngico miconazol a literatura apresenta poucos resultados de monitoramento. Roberts e Bersuder (2006) detectaram miconazol em amostras de efluente de esgoto no Reino Unido na concentrao de 9ng/L. Bruchet et al. (2002) detectaram estradiol e etinilestradiol em amostras de esgoto da Frana nas concentraes de 10ng/L para o estradiol e 2,5ng/L para o etinilestradiol. Nie et al. (2009) verificaram a presena de vrios compostos no esgoto bruto da China podendo citar bisfenol A na concentrao mdia de 135ng/L e nonilfenol na concentrao mdia de 200ng/L. Entre os primeiros trabalhos realizados em guas brasileiras pode-se citar o de Stumpf et al. (1999) que detectaram antilipmicos, antiinflamatrios e alguns metablitos em esgoto, em efluente de ETE e em guas de rios no estado do Rio de Janeiro. A concentrao mdia, nos efluentes da ETE, da maioria dos frmacos investigados esteve na faixa de 0,1 a 1,0g/L. Nos rios, as concentraes mdias situaram-se entre 0,02 e 0,04g/L, como conseqncia da remoo incompleta dos 21

frmacos durante sua passagem pela ETE e pelo descarte de esgoto in natura. Em outro estudo tambm relacionado ao Brasil, realizado por Ternes et al., em 1999, foram encontrados estrognios naturais e contraceptivos sintticos na ETE da Penha/RJ. Em esgoto bruto, os estrognios 17 -estradiol e estrona foram detectados nas concentraes de 0,021g/L e 0,04g/L, respectivamente. Em 2006, Ghiselle (2006) monitorou perturbadores endcrinos em guas de rios de Campinas e as quantidades encontradas, de estradiol foi de 1,8 a 6,0g/L; etinilestradiol 1,3 a 3,5g/L; nonilfenol 1,1 a 1,8g/L e de bisfenol A 2,0 a 64,0g/L. Em Minas Gerais os nicos trabalhos realizados sobre a ocorrncia de perturbadores endcrinos e frmacos em gua foram o de Moreira et al. (2009) que monitoraram o estradiol, etinilestradiol e nonilfenol nos principais mananciais de abastecimento da regio metropolitana de Belo Horizonte e o de Moreira et al. (2011) que monitoraram estradiol, etinilestradiol e nonilfenol e bisfenol A no Rio das Velhas. A concentrao mdia encontrada por Moreira et al. (2009) de nonilfenol foi de 402,9 ng/L, sendo que estradiol e etinilestradiol foram encontrados em apenas 15% das amostras analisadas em uma faixa de concentrao de 2 a 54ng/L. Da mesma forma o trabalho de Moreira et al. (2011) mostrou que o etinilestradiol foi encontrado apenas em algumas amostras em concentraes que variaram de 5,6 a 63,8ng/L. A concentrao encontrada para o Bisfenol A foi de 8,6 a 168,3 ng/L. Para o nonilfenol foi encontrado em altas concentraes que variaram de 25,9 a 1435,3ng/L. Possivelmente, as altas concentraes encontradas para o nonifenol podem estar associadas lixiviao de reas agrcolas. A Tabela 3.4 apresenta alguns dados de monitoramento realizado no mundo para os compostos estudados nesse trabalho. Devido grande diversidade de compostos monitorados em diversas matrizes ambientais, a tabela apresenta uma reviso apenas dos compostos estudados nesse trabalho na matriz esgoto. Foram apresentados tambm alguns dados de monitoramento em gua superficiais apenas para ilustrar a ocorrncia ambiental dos contaminantes.

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Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BZF (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E2 (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais Localizao Matriz Tipo de Tipo de Fonte SMZ TMP BZF DCF BPA E2 EE2 NP MCZ Referncias extra detec Ionizao ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L o o LC/MS/ Efluente SPE ESI 2200 810 Ternes, 1998 Alemanha MS de ETE GC/MS/ Ternes et al., MS Esgoto Alemanha SPE GC/MS 15 1999 bruto Ternes et al., Esgoto Brasil SPE CG/MS 21 1999 bruto Hirsch et al., Efluente Liofiliza LC/MS/ 1999 Alemanha de ESI 400 320 o MS esgoto SPE e Bruchet et al., Esgoto Frana GC/MS 10 2,5 <LD Lq-Lq 2002 bruto Estados Unidos Japo Espanha Esgoto bruto Esgoto Bruto LqLq SPE (Oasis HLB) GC/MS LCMS/MS 0,1412 x103 1,62,0 x102 5,7 7,383,1 x10 <LD (0,840) x10 Kolpin et al., 2002 Komori et al., 2004 Carballa et al., 2004 Carballa et al., 2004

Esgoto LC/MS/ SPE ESI 580 Bruto MS Efluente LC/MS/ Espanha de lodo SPE ESI 250 MS ativado <LD: menor que o limite de deteco; (-) no determinado/analisado

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Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BZF (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E2 (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais Localizao Matriz Tipo de Tipo de Fonte SMZ TMP BZF DCF BPA E2 EE2 NP MCZ Referncias extrao deteco Ionizao ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L Efluente SPE turbo ion Castiglioni et LC/MS/ 46 0,3 Itlia <LQ <LQ de lodo (Oasis spray al., 2005 MS 317 117 ativado MCX) source Efluente Roberts e Reino LC/MS/ Strata X ESI 9 de Bersuder, Unido MS Esgoto 2006 Cespedes et SPE Esgoto 60 5500 Espanha LC/MS ESI Lichrolut al., 2006 bruto 1500 -7500
RP-18

Efluente Espanha Afluente de ETE Afluente de ETE Afluente de ETE

SPE Lichrolut RP-18

LC/MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS

ESI

70 270 -

3302070 -

Cespedes et al., 2006 Brown et al., 2006 Brown et al., 2006 Brown et al., 2006 Brown et al., 2006

Mxico Mxico Mxico

Oasis HLB Oasis HLB Oasis HLB

390 1000 400

590 1400 1000

Efluente LC/MS/ Oasis Mxico 310 180 de lodo MS HLB ativado <LQ: menor que o limite de quantificao; (-) no determinado/analisado ativid ativado)

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Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BZF (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E2 (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais Localizao Matriz Tipo de Tipo de Fonte SMZ TMP BZF DCF BPA E2 EE2 NP MCZ Referncias extrao deteco Ionizao ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L SPE Reino Esgoto LC/MS/ 213901Roberts e ESI <LD (Strata Unido bruto MS 300 1036 Thomas, 2006 X) Efluente SPE Reino LC/MS/ 388120Roberts e ESI <LD de lodo (Strata Unido MS 414 499 Thomas, 2006 ativado X) Esgoto SPE Reino LC/MS/ 218261Roberts e ESI <LD tratado(Strata Unido MS 322 598 Thomas, 2006 radiao X) LC/MS/ Farre et al., UV) Esgoto 0,5Espanha SPE <LD MS 2007 bruto 1,1 Mxico Coreia do Sul Alemanha Esgoto bruto Efluente de lodo ativado ativado Esgoto ebruto RBC) SPE SPE (Waters HLB) SPE (C18) GC/MS/ MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS ESI APCI ESI 136 (3,8407) 58 (10188) < 10 76 40 (8,8127) 15 x102 < 0,5 -85
0,772,5 x103

18,022,0 <1,0 -

<LD 1,3 -

11,022,4 x103 -

Gibson et al., 2007 Kim et al., 2007 Gebhardt e Schrder, 2007 KasprzykHordern et al., 2008d

< 668

Wales SPE UPLC/ < 0,5 < 1,5 Rio ESI (Reino (OASIS MS -4 -183 Unido) MCX) <LD: menor que o limite de deteco; (-) no determinado/analisado

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Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BZF (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E2 (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais Localizao Matriz Tipo de Tipo de Fonte Referncias SMZ TMP BZF DCF BPA E2 EE2 NP MCZ extrao deteco Ionizao ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L ng/L KasprzyReino Esgoto OASIS UPLC/M ESI <LQ 1879 971 70 540 Hordern et al., Unido bruto MCX S/MS 2008d SPE (1,2 Esgoto Zafra-Gomez et Espanha Lichrolu LC/MS APCI <LD 1,5) bruto al., 2008 t RP-18 x102 SPE Gulkowska et Esgoto LC/MS Turbo Ion 120China (Oasis al., 2008 bruto /MS Spray 320 HLB) SPE Impacto Esgoto 24,0 102 Sanchez-Avila Espanha (Oasis GC/MS de bruto x102 x103 et al., 2009 60 mg) eltrons 134,0 199,8 Esgoto Nie et al., 2009 China SPE GC/MS bruto 135,3 229,6 Efluente SPE Impacto Sanchez-Avila 6,2 219 Espanha GC/MS de (Oasis de et al., 2009 x102 x102 esgoto 60 mg) eltrons Efluente Impacto Sanchez-Avila domsti SPE 6,2 219 Espanha GC/MS 2 2 de de et al., 2009 co (Oasis) x10 x10 esgoto eltrons /industri domsti Esgoto LC/MS/M Chen et al., al (lodo Taiwan APPI 84 <LD co bruto S 2009 ativado) /industri <LD: menor que o limite de deteco; <LQ: menor que o limite de quantificao; (-) no determinado/analisado al (lodo ativado) 26

Tabela 3.4: Trabalhos publicados sobre o monitoramento dos compostos SMZ (Sulfametoxazol), TMP (Trimetoprima), BEZ (Bezafibrato), DCF (Diclofenaco), BPA (Bisfenol A), E (Estradiol), EE2 (Etinilestradiol), NP (Nonilfenol) e MCZ (Miconazol) em algumas matrizes ambientais
Localizao Matriz Tipo de extrao Tipo de deteco Fonte Ionizao SMZ ng/L TMP ng/L BZF ng/L DCF ng/L BPA ng/L E2 ng/L EE2 ng/L NP ng/L MCZ ng/L Referncias

Espanha China China China Alemanha Alemanha

Esgoto bruto Rio Esgoto bruto Efluente esgoto tratado Rio Efluente de lodo ativado Efluente ativado) tratamen to primario Esgoto bruto

SPE Oasis HLB Oasis HLB Oasis HLB Oasis HLB Oasis HLB SPE C18 Oasis HLB SPE

LC/MS/ MS e GC/MS UPLC/M S/MS UPLC/M S/MS UPLC/M S/MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS LC/MS/ MS

ESI ESI ESI ESI ESI ESI

93 4,4 509 35 -

95 4,2 681 28 -

29 2,5 168 11 -

156 6,0 1492 89 -

(0,542,06) x103 -

(3,317,22) x103 -

2 32 3 1 -

Fernandez et al., 2009 Huang et al., 2010 Huang et al., 2010 Huang et al., 2010 Nodler, K. et al.,2010 Nodler, K. et al.,2010 Vega-Morales et al., 2010 Zucato et al., 2010

Espanha

ESI Turbo Ion Spray

13,4

16,3

9,3

9,7

Itlia

(OASIS MCX) (-)nodeterminado/analisado

246

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3.6 - Mtodos de Anlise de Microcontaminantes Orgnicos

A pesquisa de microcontaminantes no ambiente assunto de interesse em todo o mundo, e mobilizou vrios grupos de pesquisa a se empenharem no desenvolvimento de mtodos analticos para identificar e quantificar tais compostos. Devido dificuldade de identificao desses microcontaminantes no meio ambiente, muitos mtodos analticos foram desenvolvidos para detectar e quantificar essas substncias em matrizes ambientais complexas, tais como guas superficiais e subterrneas, esgoto bruto, efluentes de ETE, sedimentos marinhos, solo e lodo biolgico. Para a determinao de frmacos e perturbadores endcrinos, diferentes mtodos analticos so reportados na literatura, principalmente para matrizes biolgicas como sangue, tecido e urina, sendo que algumas modificaes nestes mtodos podem ser necessrias para amostras ambientais. Das diversas tcnicas analticas existentes para a quantificao desses compostos destacam-se quelas que empregam cromatografia de fase lquida ou de fase gasosa acoplada espectrometria de massas, as quais oferecem especificidade, sensibilidade e rapidez para as anlises ambientais. Vale destacar que o incio de qualquer procedimento analtico de contaminantes ambientais envolve etapas de preparo das amostras. Tais procedimentos conhecidos como tcnicas de extrao tm como objetivo diminuir interferentes da matriz, bem como concentrar os compostos de interesse a nveis detectveis pelos instrumentos utilizados (Kole et al, 2011)

3.6.1 - Tcnicas de Preparo de Amostra

A preparao das amostras, tambm conhecido como tratamento da amostra, extrao e concentrao dos analitos, limpeza dos extratos (clean-up), permite que a anlise dos componentes de interesse se torne possvel, sendo considerada uma parte integrante e imprescindvel no desenvolvimento do mtodo para garantir a qualidade dos dados. A preparao da amostra tem como objetivo isolar o analito de interesse presente na matriz, eliminar ou minimizar a interferncia de outros componentes da matriz e muitas vezes concentrar o analito que pode estar em baixas concentraes. Nos ltimos tempos, para melhorar a seletividade e sensibilidade, as inovaes tecnolgicas em cincia dos materiais e robtica e a compreenso aprofundada das matrizes abriram um caminho para muitas novas estratgias na preparao de amostras. 28

As tcnicas mais utilizadas para extrao dos microcontaminantes em matrizes ambientais so: a extrao lquido-lquido (ELL) e a extrao em fase slida (EFS) ou Solid Phase Extraction (SPE). Devido ao uso de grandes voulmes de solvente nas ELL, a SPE mais utilizada atualmente. Estas tcnicas podem ser divididas em dois modos: off-line e on-line. No modo off-line, a etapa de extrao e concentrao do analito realizada separadamente do sistema cromatogrfico. J no modo on-line, a etapa de extrao e concentrao do analito realizada no prprio sistema cromatogrfico. Na extrao lquido-lquido ocorre a partio da amostra entre duas fases imiscveis (orgnica e aquosa). A eficincia da extrao depende da afinidade do soluto pelo solvente de extrao, da razo das fases e do nmero de extraes. Essa tcnica possui muitas desvantagens, tais como: volumes relativamente grandes de amostras e de solventes so requeridos, gerando problemas de descartes; as amostras com alta afinidade pela gua so parcialmente extradas pelo solvente orgnico, resultando em perdas do analito; impurezas do solvente so concentradas junto com a amostra, implicando no uso de solventes ultrapuros; pode ocorrer formao de emulses, o que dificulta o processo de extrao e aumento no tempo.

Extrao em Fase Slida (SPE)

A extrao em fase slida tem sido uma das ferramentas mais empregadas para a extrao e pr-concentrao de analitos presentes em matrizes complexas. Esta tcnica emprega sorventes recheados em cartuchos, nas formas de barril ou seringa, e os mecanismos de reteno so semelhantes queles envolvidos em cromatografia lquida em coluna. Um cartucho tpico formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50 a 500 mg do material sorvente (suporte e fase), com 40-60 m de tamanho de partcula, fixado no tubo atravs de dois filtros. Os procedimentos de SPE contm geralmente 5 etapas: 1- ativao dos stios ativos disponveis no material sorvente; 2condicionamento do sorvente com solvente adequado para ajustar as foras do solvente de eluio com o solvente da amostra; 3- introduo da amostra, para reteno do analito e s vezes de alguns interferentes; 4) limpeza do cartucho (clean-up) para retirar os interferentes; 5) eluio do(s) analito(s). Uma grande variedade de sorventes est disponvel comercialmente e podem ser combinados com o objetivo de aumentar a seletividade da extrao. Uma maneira de combinao usando as chamadas fases mistas com vrios grupos funcionais de 29

caractersticas diferentes ligados ao mesmo suporte. Pode-se tambm realizar sucessivas extraes com cartuchos de diferentes recheios, passando o material eluido do primeiro cartucho para o segundo no modo on-line ou off-line (Queiroz, 2001). Dos sorventes disponveis, os mais frequentemente utilizados na extrao e concentrao de frmacos e perturbadores endcrinos so os de C18, que consiste em cadeia aliftica de 18 carbonos em suporte de slica, e HLB Oasis que consiste em um copolmero poroso, o poli(divinilbenzenoco-N-vinilpirrolidona), com uma capacidade de adsoro de compostos hidroflicos e lipoflicos simultaneamente. Devido s diferentes propriedades fsico-qumicas (cidos / bases / anfteros, e os valores de pKa nico ou mltiplos) dos analitos de interesse, esses cartuchos tradicionais nem sempre foram adequados e a disponibilidade de diferentes fases estacionrias foi necessria (Kole, 2010). Atualmente com o desenvolvimento da cincia dos materiais, esto disponveis vrias fases estacionrias para SPE. Embora SPE convencional oferea vrias vantagens, ela tem suas prprias limitaes, como a seletividade limitada e / ou baixa recuperao. Alm disso, muitos componentes da matriz podem ser adsorvidos contribuindo para o efeito matriz em anlises que utiliza o LC/MS/MS (Rodriguez-Mozaz et al., 2007).

Microextrao em Fase Slida (SPME)

A microextrao em fase slida uma tcnica que emprega uma fibra de slica fundida, recoberta com um filme fino de um polmero (polidimetilsiloxano, poliacrilato carbowax, etc.) ou de um adsorvente slido (carvo ativo microparticulado ou carboxen). Esta fibra revestida, que uma fase extratora, acondicionada dentro da agulha de uma microseringa, para a extrao dos analitos (Valente, 2000). A extrao pode ser feita das seguintes maneiras: mergulhando a fibra diretamente na soluo da amostra onde os analitos so concentrados de 2 a 15 min, ou atravs da tcnica de headspace, na qual a amostra aquecida e os componentes volteis so adsorvidos na fibra na frao gasosa. Aps a extrao, os analitos presentes na fibra so dessorvidos termicamente pela sua introduo no injetor aquecido de um cromatgrafo a gs. As vantagens do mtodo de SPME so que o procedimento analtico mais simples e mais rpido que SLL e SPE, e em geral extratos mais limpos so obtidos. Por outro lado o analito necessita ser voltil e termicamente estvel para ser dessorvido e determinado por cromatografia gasosa - CG (Queiroz et al, 2001). 30

Apesar de pouco usual, SPME pode ser utilizado em cromatografia de fase lquida, pela adaptao do injetor para a lavagem da fibra pela fase mvel e eluio dos analitos.

Polmeros com Impresso Molecular (MIPs)

Os polmeros com impresso molecular (MIPs) so polmeros que possuem stios de reconhecimento que so intencionalmente projetados e especficos para uma substncia alvo ou classe de analitos, fornecendo assim alta seletividade e especificidade (Widstrand et al., 2006). Apesar de incipiente, essa tcnica considerada uma das mais seletivas entre todas as disponveis na SPE para preparao de amostra (Masque et al., 2001).

3.6.2 - Tcnicas de Anlise

Nos ltimos anos, muitos mtodos para a anlise de contaminantes emergentes em amostras de guas foram publicados. Dentre as tcnicas instrumentais disponveis para quantificao de perturbadores endcrinos e frmacos em amostras ambientais a cromatografia sem dvida a mais utilizada. A literatura tambm relata o uso de tcnicas biolgicas na identificao e quantificao de estrognios naturais e sintticos, tais como, ensaios de imunoadsoro enzimtica (ELISA) e radioimunoensaio (RIE). O ensaio ELISA que baseado no uso de antgenos tem sido descrito como um mtodo altamente sensvel e seletivo para anlise de estrognios e outros perturbadores endcrinos em amostras ambientais. Apesar das tcnicas biolgicas apresentarem as vantagens de serem rpidas e seletivas, tm como desvantagens a necessidade de se fazer anlises individualizadas dos compostos e tambm o fato de poder ocorrer resultados superestimados em virtude da possibilidade de reaes cruzadas com interferentes da matriz. Farr et al (2007) observaram que para anlise de estrognios como o estradiol, poderia haver interferncia de outros contaminantes como estrona e nonilfenol. Por esses motivos recorre-se usualmente a mtodos cromatogrficos de separao que tm se mostrado mais eficazes e versteis no monitoramento de microcontaminantes.

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Cromatografia gasosa-espectrometria de massas A tcnica de cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massa (GC-MS) uma tcnica muito utilizada em anlises ambientais de substncias termoestveis e volteis ou passveis de derivatizao (que consiste na reao da amostra com um reagente especfico que transforma o analito em uma substncia de maior volatilidade). Dentre os diversos derivatizantes podemos citar: pentauorobenzil (PFBr), N,O-bis (trimetilsilil) triuoroacetamida (BSTFA) e o N-(tert-butildimetilsilil)-N-metil-triuor acetamida (MTBSTFA) que conduzem a formao de derivados contendo grupos trimetilsilil (TMS) e tributilsilil (TBS). No cromatgrafo a gs, a fase mvel um gs que arrasta a mistura de micropoluentes atravs da coluna cromatogrfica onde a separao dos compostos feita com base no equilbrio dos analitos entre as fases, que so determinadas pela temperatura e pelas polaridades do analito e da coluna. As formas de ionizao mais utilizadas para GC-MS so a ionizao por eltrons (EI) e ionizao qumica (CI). Cromatografia lquida-espectrometria de massas

O cromatgrafo de fase lquida usado na pesquisa de analitos menos volteis, ou que podem sofrer degradao quando submetidos a altas temperaturas. Solventes lquidos (fase mvel) transportam os analitos atravs de uma coluna cromatogrfica, onde ocorre a separao pelas diferenas de afinidade dos analitos com a fase estacionria. A principal vantagem da cromatografia lquida em relao gasosa a anlise de compostos termolbeis e a no necessidade de derivatizao. As fontes de ionizao mais utilizadas para anlise de compostos em amostras ambientais aquticas so electrospray (ESI), utilizada para compostos polares, e ionizao qumica por presso atmosfrica (APCI) utilizada para anlise de compostos de baixa e mdia polaridade (de Alda et al., 2003). Um problema comumente encontrado na utilizao de ESI e do APCI para anlise de amostras ambientais a ocorrncia do efeito matriz podendo ocorrer supresso ou intensificao do sinal dos analitos (Mei et al., 2003). Espectrometria de Massas Em ambas as tcnicas, descritas anteriormente, aps a separao na coluna cromatogrfica, os compostos so detectados separadamente e quantificados, em 32

detector especfico. Para anlises ambientais de microcontaminantes utilizando a cromatografia gasosa os detectores de captura de eltrons (ECD), espectrometria de massas (MS), detector de ionizao de chama (FID) so os mais citados. J para a cromatografia lquida os detectores UV, arranjo de diodos, fluorescncia e espectrometria de massas (MS), so frequentemente citados, sendo a espectrometria de massas a mais utilizada devida sua maior sensibilidade e especificidade. Existem atualmente, diversas configuraes de cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas para anlise em amostras ambientais. O triplo-quadrupolo tem sido muito utilizado por diversos pesquisadores. No entanto, a resoluo do triplo quadrupolo no capaz de distinguir ons de compostos com razes massa/carga muito prximas, pois este tipo de aparelho possui resoluo unitria (Farre et al., 2007, Grover et al., 2009). Uma alternativa para aumentar a seletividade e evitar falsos resultados a utilizao de um espectrmetro de massas de alta resoluo como tempo de vo (TOFMS) (Moreira, 2011). Instrumentos que possuem TOF como um de seus analisadores de massa combinam a habilidade da exatido na determinao de massas (m/z) com uma excelente sensibilidade (Niessen, 1999). A espectrometria de massas uma poderosa tcnica analtica, que se encaixa em pesquisas de substncias orgnicas de qualquer natureza, desde pequenas molculas, como metano e cidos de cadeia curta, a enormes protenas. Existem diversos analisadores de massa, que so basicamente sistemas capazes de separar e calcular a relao entre a massa e a carga (m/z) suportada pelos ons das substncias presentes nas amostras. Os espectros de massas geram informaes teis sobre a massa molecular e a estrutura dos analitos, podendo ajudar na elucidao de compostos desconhecidos. A sensibilidade da tcnica, a formao de adducts com ons presentes em tampes, na amostra e na fase mvel, e as fragmentaes geradas dependero da tcnica de ionizao utilizada, que variam de acordo com o modelo do equipamento. Em cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas, os sistemas de ionizao mais difundidos so a ionizao qumica presso atmosfrica (APCI) e a ionizao por eletronspray (ESI), as quais so escolhidas de acordo com as propriedades fsicoqumicas dos analitos, principalmente polaridade e acidez e sobre ionizao positiva ou negativa (Barcel, 2007).

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3.7 - Efeito matriz

Quando a anlise de uma amostra complexa realizada utilizando a tcnica de espectrometria de massas, como amostras biolgicas e ambientais, o efeito matriz uma das desvantagens mais relevantes. O efeito matriz definido pela IUPAC como o efeito combinado de todos os componentes da amostra diferente da substncia sobre a medio da quantidade. Se um componente especfico pode ser identificado como causador de um efeito, ento este conhecido como interferente. A supresso de ons aparece como um tipo de efeito matriz especificamente ligado espectrometria de massas. Segundo Taylor, 2005, o efeito matriz tem sido chamado de calcanhar de Aquiles da tcnica de HPLC-MS. O uso de ESI na determinao quantitativa de espcies inicas e de analitos no inicos requer cuidados. No ESI, a ionizao acontece por transferncia de prtons ou pela formao de ion-analito adduct na fase lquida, os quais provavelmente acontecem prximo ou na superfcie da gotcula do spray (Kebarle, 2009). O efeito matriz em ESI um problema relacionado fase lquida e no aos ons na fase gasosa. A presena de compostos no volteis pode impedir que os ons dos analitos escapem da gotcula do spray para a fase gasosa (King et al., 2000). A atividade surfactante dos interferentes pode suprimir a resposta dos analitos de interesse pelo seu posicionamento preferencial na superfcie das gotculas do spray (Cech and Enke, 2000). A presena de compostos com grande afinidade por prtons podem suprimir a resposta dos analitos, pela transferncia de prtons do analito para o interferente na fase gasosa (Kebarle & Tang, 1993). Aditivos presentes como modificadores da fase lquida podem formar pares inicos com os analitos ionizados suprimindo assim suas respostas (Niessen et al., Matuszewski et al, 2003). Segundo Gosetti e colaboradores (2003), o fluxo da eluio tambm pode interferir no sinal dos analitos. Fluxos baixos e sistemas de nanospray reduzem tais efeitos. Na espectrometria de massas (MS), usando ionizao por ESI e APCI, a presena de interferentes frequentemente leva alterao na eficincia da formao e quantidade de ons de interesse. A eficincia na etapa de ionizao influenciada muitas vezes pela presena na matriz de outros compostos, que so capazes de interferir no mecanismo de ionizao dos analitos, podendo assim afetar o desempenho do mtodo em termos de deteco, seletividade, repetibilidade, linearidade e limite de 34

quantificao. Isso pode acarretar em resultados incertos. Sendo assim a avaliao do efeito de matriz em deteco por MS deve ser includa no desenvolvimento do mtodo analtico. So muitas as possveis origens e mecanismos que alteram a formao dos ons nas tcnicas de ESI e APCI. O principal problema comumente relatado a presena de substncias endgenas, ou seja, compostos orgnicos ou inorgnicos presentes na amostra e que so recuperados no extrato final. Dentro desse primeiro grupo de agentes supressores de ons, podem ser includas espcies inicas (eletrlitos inorgnicos, sais), compostos polares (fenis, pigmentos), e vrias molculas orgnicos incluindo carbohidratos, aminas, uria, lipdios, peptdeos ou metabolitos com estrutura qumica semelhantes do analito-alvo (Antignac et al, 2004). Quando esses compostos co-eluem com o analito de interesse, principalmente se estiverem presentes em altas concentraes, podem afetar a formao de ons dos analitos de interesse pela competio por cargas no processo de ionizao (Kruve et al, 2009). A intensidade dessa supresso depende basicamente da estrutura qumica dos interferentes que determina a sua facilidade de ionizao frente ao analito de interesse. Outra origem do problema, geralmente menos descrita, devido presena de substncias exgenas, ou seja, molculas no presentes na amostra, mas provenientes de vrias fontes externas durante a preparao da amostra. Entre estas podem estar includos plstico e resduos de polmeros, ftalatos, subprodutos de degradao de detergentes (alquilfenis) (Antignac et al, 2004). Diferentes comportamentos so relatados na literatura quando se utiliza como fonte de ionizao o ESI ou o APCI. Historicamente, alguns autores relatam que o ESI estava mais sujeito a supresso de ons. No entanto recentemente, outros autores relataram que APCI foi mais afetado por esse fenmeno (Garcia et al, 2011). Muitos autores observaram supresso do sinal tanto na fonte ESI como em APCI e a maioria deles considerou que o efeito menor em APCI (Vaneeckhaut et al, 2009. Na verdade, as duas tcnicas so consideradas igualmente afetadas, pois em ambos os casos, a natureza e a composio da fase mvel so conhecidos por influenciar em larga medida, o processo de ionizao. Alm disso, devido ionizao ocorrer em fase lquida para ESI e na fase gasosa para APCI, os mecanismos envolvidos na formao dos ons dos analitos devem ser diferentes para as duas tcnicas. A tcnica APPI (fotoionizao a presso atmosfrica) uma tcnica mais recente, restrita a uma classe de substncias de 35

caracter menos polar e, consequentemente, menos investigadas em termos de supresso de ons. Mas, teoricamente, a supresso de ons tambm pode ocorrer com esta tcnica, devido ao papel da fase lquida no processo de ionizao (Antignac et al, 2004). No entanto, a maior sensibilidade para muitos compostos freqentemente detectados em amostras ambientais justifica o uso freqente da ESI em mtodos analticos multiresduos (Nodler et al, 2010). Alguns pesquisadores estudam algumas possveis formas de contornar a questo da variao no sinal dos analitos pelos componentes da matriz. Dentre elas, so propostas modificaes nas condies de operao do espectrmetro de massas, mudana nos parmetros cromatogrficos e finalmente melhorias na etapa de preparo de amostras pela purificao ou clean-up dos extratos. A primeira medida tomada para superar os problemas do efeito da matriz deve ser, se possvel, alterar as condies da espectrometria de massas. Esta abordagem parece ser vantajosa, pois no exige nenhuma mudana no resto do procedimento analtico desenvolvido (preparao de amostras e condies cromatogrficas). Dependendo da disponibilidade, uma alternativa as condies operacionais pode ser o uso de diferentes tcnicas de ionizao (ESI, APCI, APPI), dos modos de ionizao (positiva ou negativa), ou mais raramente no design do equipamento utilizado. (Holcapek et al, 2004; Mei et al, 2003). No que diz respeito a polaridade de ionizao, o modo negativo geralmente considerado como mais especfico e, conseqentemente, menos sujeito a supresso de ons. De fato, o nmero de compostos que se ionizam no modo negativo inferior aos que se ionizam no modo positivo. Por conseguinte, o aspecto dos cromatogramas de ons e da relao sinal / rudo so geralmente melhores no modo negativo (Antignac et al, 2004). Modificao de parmetros cromatogrficos buscando melhorar a eficincia de separao dos compostos uma das alternativas utilizadas para minimizar o efeito da matriz na resposta. Modificaes na composio da fase mvel podem ser interessantes para a melhoria da resoluo cromatogrfica e eficincia na separao, pela adio de baixas concentraes de cidos carboxlicos (como frmico, actico, trifluoroactico), sal de formiato de amnio, de acetato de amnio ou bases como hidrxido de amnio (Gosetti et al, 2009). No entanto, a presena dos modificadores de fase pode influenciar

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na resposta dos analitos. A presena de resduos de cido trifluoroactico na fase lquida diminui substncialmente a eficincia da ionizao e os sinais de ons negativos. As alternativas apontadas acima minimizam o problema, mas dependendo da complexidade das amostras no eliminam a causa. A outra maneira de abordar o efeito matriz seria a melhoria na etapa de preparao da amostra a fim de limitar a presena de interferentes no extrato final. Inmeros autores demonstraram evidncias de tal abordagem. A tendncia de se considerar a recuperao dos analitos de interesse como indicador de desempenho deve ser feito com cautela, pois necessrio avaliar tambm a eficincia do mtodo em termos de remoo de compostos interferentes. Portanto, os interferentes devem ser removidos usando a estratgia analtica adequada. No existe uma estratgia universal, mas apenas solues caso a caso para cada combinao de analito/matriz. O esgoto domstico uma matriz bastante complexa do ponto de vista analtico. Ele pode conter muitos compostos orgnicos tais como, cidos hmicos e flvicos, protenas, lipdeos, alm de detergentes do tipo alquilbenzeno-sulfonados de cadeia linear (LAS), surfactantes aninicos que so amplamente utilizados e esto no esgoto em altas concentraes (cerca de 10mg/L) (Leite, 2010). Devido sua abundncia e atividade surfactante esses compostos so interferentes importantes encontrados na matriz esgoto, que podem competir com os analitos de interesse no processo de ionizao. Outra abordagem atual, que tem a vantagem de ser simples, a diluio da amostra ou uma reduo do volume injetado. No entanto isso pode tambm diminuir a sensibilidade do mtodo, ou mesmo dependendo do tipo de instrumentao levar a no deteco dos compostos de interesse. Outra alternativa que se configura mais como correo do efeito matriz, a utilizao de compostos marcados (deuterados ou C13) como surrogate, na tcnica de diluio isotpica. Entretanto, padres marcados nem sempre esto disponveis para muitos analitos, seja pela dificuldade de sua sntese e/ou seu alto custo. Alguns autores ainda sugerem a realizao de curvas analticas em uma matriz semelhante das amostras a serem investigadas, mas isenta de analitos, quando amostras de matrizes semelhantes forem analisadas. Isso poderia contornar o problema, mas a dificuldade desta abordagem encontrar uma matriz com as mesmas caractersticas da amostra a ser analisada, mesmos interferentes e, alm disso, completamente livre dos analitos de interesse (branco). 37

So poucas as referncias sobre avaliao do efeito da matriz em anlises de microcontaminantes em amostras de esgotos. Uma avaliao do efeito supressivo na anlise de compostos estrognicos foi realizada por Chiu et al. (2009) e mostrou que compostos mais polares como estrona e estriol apresentaram uma supresso de 8 a 18% em amostras de esgoto, ao passo que compostos como estradiol e etinilestradiol apresentaram uma supresso de 10 a 28% em matrizes slidas mais complexas. Para reduo dessa supresso um acrscimo de uma etapa de limpeza na amostra durante o pr-tratamento pode ser realizada. No estudo feito por Chiu et al. (2009) alm desta etapa de limpeza, foi utilizada a adio de padro interno deuterado dos compostos de interesse. A anlise do efeito supressivo em amostras ambientais complexas tambm foi feita por Koh et al. (2008) para alquilfenis. O estudo mostrou que estes compostos podem apresentar uma supresso de 24% em efluentes domsticos. Estes valores foram bem inferiores em relao ao estudo realizado por Jahnke et al. (2004), onde a supresso observada variou de 32% a 79%. Como pode ser observado na reviso acima a determinao quantitativa de compostos emergentes em amostras de esgoto bruto ou tratado demandam abordagens criteriosas do ponto de vista analtico. Elas geralmente envolvem o uso de SPE nas etapas de extrao e concentrao dos analitos em matrizes extremamente complexas e passveis da presena de diversos interferentes, capazes de influenciar na recuperao dos analitos. comum a ocorrncia de produtos de higiene pessoal e medicamentos em amostras de esgoto, sendo a principal via de contaminao destes compostos em compartimentos ambientais. Por isto, muito difcil a obteno de uma matriz isenta dos contaminantes, onde poderiam ser produzidas curvas analticas por calibrao externa na matriz. Apesar de ter sido desconsiderado em muitos trabalhos e mais discutido recentemente, extremamente crtica a influncia da composio da matriz nas respostas dos analitos quando usando as tcnicas convencionais de ionizao em HPLC-MS (ESI, APCI e APPI). Os artifcios para contornar estes efeitos na etapa de ionizao e minimizar os erros analticos passam pela melhoria nas etapas de concentrao e clean-up dos extratos, pela melhoria das condies de cromatografia, pelo uso de diluio isotpica dos analitos, e correes dos resultados pelas respostas de quantidades adicionadas dos analitos. Nesta dissertao foram utilizadas as abordagens descritas na literatura, exceto o uso de diluio isotpica, para otimisar o mtodo e minimizar e corrigir os efeitos da matriz nos resultados analticos. As estratgias utilizadas sero apresentadas nos prximos captulos. 38

4- MATERIAIS E MTODOS
O trabalho experimental foi dividido em trs etapas. Na primeira etapa foi realizado o desenvolvimento da metodologia analtica para quantificao dos compostos estudados utilizando SPE e HPLC/MS/MS. Na segunda etapa do trabalho foi feita a validao da metodologia desenvolvida e na terceira etapa foi realizada a aplicao do mtodo no monitoramento dos compostos estudados em amostras de esgotos brutos e efluentes da Estao Experimental de Tratamento de Esgotos da UFMG-COPASA, localizada junto ETE Arrudas, em Belo Horizonte, MG.

4.1- Primeira etapa: desenvolvimento do mtodo analtico

4.1.1 - Limpeza da vidraria

Todas as vidrarias utilizadas foram inicialmente lavadas com Extram (2,5%), um detergente com baixa concentrao de alquil benzeno sulfonato de cadeia linear (LAS). Posteriormente as vidrarias foram enxaguadas abundantemente com gua deionizada e colocadas em um recipiente contendo cido ntrico (10 %) o qual foi levado em banho ultrassnico durante no mnimo uma hora. Em seguida foi realizado um enxge com gua ultra pura at a completa remoo do cido ntrico e finalmente as vidrarias foram secas em estufa a 60oC e, quando volumtricas, secas ao ar.

4.1.2 - Reagentes e Consumveis

Todos os solventes utilizados foram de grau HPLC, adquiridos da J. T. Baker com exceo do acetato de etila adquirido da Mallinckrodt. A gua utilizada foi obtida atravs de um sistema de purificao com cartuchos de carvo ativo e troca inica (TKA Wasseraufbereitungssysteme, Alemanha). Para a extrao e clean-up das amostras, foi usado um manifold (figura 4.1), cartuchos Strata SAX (Phenomenex) 500mg de 6mL, e Strata X (Phenomenex) 500mg de 6mL (figura 4.1).

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Figura 4.1: a) Aparato de extrao. Manifold com os cartuchos de SPE b) Cartuchos Strata X, e Strata SAX (Phenomenex)

O cartucho Strata X similar ao Oasis HLB (Waters). O cartucho Strata X composto por um monmero contendo dois grupos diferentes, um hidroflico composto pelo grupo pirrolidona e outro lipoflico composto pelo grupo benzila. Sendo assim, ele tem a capacidade de reter analitos polares e no-polares. A figura 4.2 apresenta o grupo ligante do cartucho Strata X. J o cartucho Strata SAX, um cartucho de troca inica contendo como sorvente o trimetilaminopropilsilano (Queiroz et al, 2001). Ele tem a capacidade de reter nions como cidos orgnicos fortes e surfactantes. A figura 4.3 apresenta o grupo ligante do cartucho Strata SAX.

Figura 4.2: Grupo ligante do cartucho Strata X

Figura 4.3: Grupo ligante do cartucho Strata SAX

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A secagem dos cartuchos e dos extratos das amostras foi realizada com nitrognio comercial (White Martins - Praxair). As solues de padres estoque e de trabalho utilizadas foram preparadas em metanol a partir dos padres apresentados na Tabela 4.1.

Tabela 4.1: Caractersticas dos padres utilizados

Composto Frmula Molecular Marca Pureza CAS1

Estrognio Sinttico 17-etinilestradiol Estrognio Natural 17-estradiol Xenoestrognio Bisfenol A Nonilfenol mistura Frmacos Sulfametoxazole Trimetoprima Diclofenaco Sdico Bezafibrato Nitrato de Miconazol
1

C20H24O2 C18H24O2 C15H16O2 C15H24O C10H11N3O3S C14H18N4O3 C14H10Cl2NNaO2 C19H20ClNO4 C18H15Cl4N3O

Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Pestanal USP USP Pharma Nostra Pharma Nostra Pharma Nostra

98% 97% 98% 94% 100% 100% 99,9% 99,9% 98%

57-63-6 50-28-2 80-05-7 84852-15-13 723-46-6 738-70-5 15207-79-6 41859-67-0 22832-87-7

CAS: Chemical Abstract Service,

4.1.3 - Desenvolvimento da etapa de extrao, concentrao e clean-up de extratos

Antes de ser estabelecida a metodologia de extrao utilizada nesse trabalho, foram realizados vrios testes buscando as melhores condies de extrao e clean up dos extratos, para as anlises dos compostos de interesse em matrizes de esgoto. Dentre os diversos compostos, presentes em altas concentraes no esgoto domstico, que podem interferir no processo de extrao e na etapa de ionizao, destacam-se os surfactantes alquilbenzeno-sulfonados de cadeia linear (LAS) e os seus produtos de degradao, os cidos sulfonocarboxlicos (Leite, 2010). Os LAS esto sempre presentes no esgoto domstico, uma vez que so os surfactantes aninicos mais amplamente utilizados. Para a remoo destes interferentes foram realizados testes usando diferentes cartuchos SPE e o uso seqencial dos mesmos conforme descrito a seguir: 41

Primeiro teste

Os primeiros testes realizados foram para a aplicao da metodologia descrita pelo Mtodo 1694 da EPA (Environmental Protection Agency) aos perturbadores endcrinos: bisfenol A, nonilfenois, estradiol e etinilestradiol em amostras de esgoto. Em um primeiro teste, foram realizados trs procedimentos de extraes em cartucho Strata X (Phenomenex) contendo 500mg de recheio em tubos de 6mL, equivalente ao Oasis HLB descrito no mtodo 1694, de trs amostras sintticas contendo LAS na concentrao de 10mg/L (concentrao mdia encontrada no esgoto domstico) e os interferentes endcrinos (estradiol, etinilestradiol, bisfenol A e 4nonilfenol) na concentrao final de 100g/L (ppb). Os procedimentos de extrao consistiram de uma etapa comum sendo: i) condicionamento do cartucho com 10ml de metanol seguido de 10ml de gua ultra pura e 6mL de gua acidificada (pH 2,0) com soluo de HCl 30% v/v; ii) ajuste para pH 2,0 ( 0.5) da soluo sinttica com uma soluo de HCl 30% v/v e acrscimo de 50mg de EDTA; iii) passagem de 100mL das amostras sintticas pelo cartucho no fluxo de 5mL por minuto. Foram introduzidas modificaes na etapa de lavagem dos cartuchos, sendo que para uma das amostras (amostra 1) foi usado 10ml de uma soluo aquosa de NH4OH no pH 8,5; na amostra 2, 10mL de uma soluo metanol em gua a 10% v/v em pH 8,5; e na amostra 3, 10mL de uma soluo metanol em gua a 30% v/v em pH 8,5. Os extratos foram eluidos utilizando 6mL de metanol e 3mL de uma mistura acetona e metanol (1:1) . O extrato metanlico foi evaporado sob fluxo de nitrognio at secura e ressuspendidas com 300L de metanol acrescido de 100L de uma soluo 0,1 % v/v de cido frmico em metanol.

Segundo teste

Um segundo teste foi realizado utilizando um cartucho de troca aninica (Strata SAX - Phenomenex) contendo 500mg de recheio em tubos de 6mL como prtratamento da amostra objetivando remover os LAS antes de ser extrado em cartucho C18 (Phenomenex) com 500mg de recheio em tubos de 6mL. Foram realizados dois diferentes procedimentos de extraes. No primeiro procedimento foi realizada a extrao apenas no cartucho C18. J no segundo procedimento foi realizada a extrao no cartucho Strata SAX (Phenomenex) e em seguida no cartucho C18. Foram 42

preparadas duas amostras sintticas de 100mL contendo LAS na concentrao de 10mg/L (concentrao mdia encontrada no esgoto domstico) e os interferentes endcrinos (estradiol, etinilestradiol, bisfenol A e 4-nonilfenol) na concentrao final de 100g/L (ppb). Uma das amostras aps ter seu pH ajustado para 2,0 ( 0.5) com uma soluo de HCl 30% v/v foi extrada em cartucho C18 (fluxo de 5mL por minuto) que foi previamente condicionado com 5mL de acetato de etila, 5ml de metanol seguido de 5ml de gua ultra pura. A outra amostra foi primeiramente percolada no cartucho Strata SAX (fluxo de 5mL por minuto), que foi previamente condicionado com 5mL de metanol e 5mL de gua ultra-pura. O eludo foi recolhido, teve seu pH ajustado para 2,0 ( 0.5) com uma soluo de HCl 30% e foi submetido a uma outra extrao em cartuchos C18 (fluxo de 5mL por minuto) que foi previamente condicionado com 5 mL de acetato de etila, 5ml de metanol seguido de 5ml de gua ultra pura. Todos os cartuchos foram eludos com acetato de etila. Os extratos foram evaporados sob fluxo de nitrognio at secura e ressuspendidas com 300L de metanol acrescido de100 L de uma soluo 0,1% v/v de cido frmico em metanol.

Terceiro teste

Foi realizado um terceiro teste utilizando o cartucho de troca aninica Strata SAX, da Phenomenex para confirmar a sua contribuio na remoo dos interferentes LAS e consequentemente na diminuio do efeito supressivo provocado por esse tipo de compostos. Esse teste utilizou o Mtodo 1694 da EPA de forma adaptada. Foram realizados procedimentos de extraes em dois cartuchos: o cartucho Strata SAX (Phenomenex) e o cartucho Strata X (Phenomenex) ambos contendo 500mg de recheio em tubos de 6mL. Para isso foram testados trs grupos. O primeiro grupo e segundo grupo foram compostos por amostras sintticas contendo LAS na concentrao de 10mg/L e os compostos estudados (estradiol, etinilestradiol, bisfenol A, diclofenaco, bezafibrato, trimetoprima, sulfametoxazol e miconazol) na concentrao final de 100g/L (ppb). As amostras do primeiro grupo foram extradas utilizando os cartuchos Strata SAX e em seguida o Strata X. As amostras do segundo grupo foram extradas utilizando apenas o cartucho Strata X. O terceiro grupo foi composto por uma soluo aquosa contendo os compostos estudados (estradiol, etinilestradiol, bisfenol A, diclofenaco, bezafibrato, trimetoprima, sulfametoxazol e miconazol) tambm na concentrao final de 100 g/L 43

(ppb) que foram extradas utilizando os cartuchos Strata SAX e em seguida o cartucho Strata X. Para cada grupo os testes foram realizados em triplicata. O procedimento de extrao adotado nas amostras do primeiro e terceiro grupo apresentado a seguir: i) condicionamento dos cartuchos Strata SAX com 10mL de metanol e 10mL de gua; ii) passagem de 100mL das amostras pelo cartucho no fluxo de 5mL/min utilizando um manifold e bomba a vcuo; iii) recolhimento do eludos e ajuste de pH para 2.0 0.5 com uma soluo de HCl 30% v/v e acrscimo de 50mg de EDTA para quelar metais eventualmente presentes na amostra; iv) as amostras foram deixadas em repouso por 2 horas sendo agitadas ocasionalmente; v) condicionamento dos cartuchos Strata X com 10mL de metanol, 10mL de gua e 6mL de gua acidificada com HCl (pH 2.0 0.5); vi) passagem das amostras pelo cartucho no fluxo de 5mL/min utilizando um manifold e bomba a vcuo; vii) lavagem do cartucho com, o 10mL de gua; viii) eluio dos cartuchos Strata SAX com 10mL de acetato de etila em um frasco mbar e separadamente eluio dos cartuchos Strata X com 6 mL de metanol e 3mL de uma mistura acetona e metanol (1:1) em outro frasco mbar. Os extratos foram evaporados sob fluxo de nitrognio at secura e ressuspendidas com 300L de metanol acrescido de 100L de uma soluo 0,1% v/v de cido frmico em metanol. A figura 4.3 apresenta o fluxograma dos procedimentos de pr-tratamento e extrao dos analitos de interesse. Para o segundo grupo de amostras tambm foi utilizado um volume de 100mL. As amostras tiverem seu pH ajustado para 2.0 0.5 tambm com uma soluo de HCl 30% v/v, receberam 50 mg de EDTA e ficaram em repouso por 2 horas. A seguir realizou-se a extrao no cartucho Strata X utilizando o mesmo procedimento descrito acima a partir do item v para extrao do cartucho Strata X. O ltimo procedimento de extrao descrito acima utilizando o cartucho Strata SAX e em seguida o cartucho Strata X foi utilizado para validao da metodologia utilizando amostras de esgoto e para aplicao nas amostras monitoradas nesse estudo. A figura 4.4 apresenta o procedimento de extrao adotado nesse estudo.

44

Figura 4.4 : Procedimento de extrao

4.1.4 - Anlise Cromatogrfica

Para a anlise dos compostos, utilizou-se um cromatgrafo lquido de alto desempenho acoplado a um espectrmetro de massas hbrido contendo Ion trap-TOF (HPLC-MS-IT-TOF). O cromatgrafo lquido consiste em um sistema Prominence, equipado com bombas binrias, modelo LC-20AD (Shimadzu Corp., Quioto, Japo) e um amostrador automtico modelo SIL 20AC (Shimadzu Corp). Foram avaliadas cinco fases mveis: 1- gua com 5mM cido oxlico e metanol/acetonitrila (1:1) 2 - Acetato de amnio e cido actico 0,1% v/v e metanol/acetonitrila (1:1); 3- gua e metanol /acetonitrila (1:1); 4 gua e metanol; 5 - gua com 3mM NH4OH e metanol com 3mM NH4OH. Algumas dessas fases mveis so recomendadas no mtodo EPA 1694. Para a separao cromatogrfica foram utilizadas duas colunas C18 em srie, Shim-pack VP ODS da Shimadzu (150mm x 2mm x 3m de dimetro de partcula). A Figura 4.5 apresenta as colunas utilizadas.

45

Figura 4.5: Colunas C18 (Shimadzu) acopladas A fase mvel escolhida foi metanol e gua, adicionadas 3mM de hidrxido de amnio. O volume de amostra injetado foi de 5L e o fluxo da fase mvel igual a 0,2 mL/min. A corrida cromatogrfica foi feita no modo gradiente onde as razes entre os solventes (gua/metanol) foram modificadas da seguinte forma: a proporo de metanol em gua variou 40 a 80 % em 6 minutos. Estabilizou a 80% de metanol em 4 minutos. Em seguida em 10 minutos aumentou para 100% de metanol e estabilizou por 8 minutos. Finalmente reduziu e estabilizou para 40% de metanol em 7 minutos totalizando 35 minutos de anlise cromatogrfica. O espectrmetro de massas (Shimadzu LC-IT-TOF) utilizado neste estudo equipado com fonte de ionizao electrospray (modo negativo: -3,5kV; modo positivo: +4,5kV). O aparelho possui dois analisadores de massa em srie um on trap (IT) seguido de um TOF time of flight, que confere alta sensibilidade e resoluo na obteno de espectros. O CDL (Curved Dessolvation Line) foi mantido a 200C. A Figura 4.6 representa o esquema do espectrmetro de massas utilizado.

IT ESI: -3.5KV, +4,5KV Gs de nebulizao Octapolo

TOF

CDL Acumulao de ons: 100ms Acumulao de ons selecionados: 20ms

Figura 4.6: Esquema do LCMS-IT-TOF

Aps a separao pela cromatografia, a amostra chega fonte de ionizao electrospray onde ocorre a nebulizao atravs da aplicao de gs nitrognio em um fluxo de 1,5L/min. Nesse momento, tambm aplicada uma diferena de potencial para 46

gerao e transferncia de cargas aos compostos presentes na amostra e assim ocorrer a formao dos ons. Concomitamente, h a dessolvatao, a repulso coulombica, a reduo das gotculas e transferncia de cargas aos analitos atravs da aplicao de gs nitrognio aquecido a uma presso de 100KPa. Aps a ionizao, os ons so introduzidos no espectrmetro de massas atravs da interface CDL aquecida a 200oC e passam por lentes colimadoras at alcanarem o octapolo. No octapolo, atravs de uma variao nas razes entre

radiofreqncia/voltagem e inverso nas voltagens em dois segmentos distintos, os ons de interesse so acumulados e enviados para o primeiro analisador de massas, o on-trap (IT). No IT, os ons de interesse, em um determinado intervalo de tempo, ficam orbitando devido a uma variao nas razes entre as radiofreqncia/voltagem aplicadas. Posteriormente, os ons so enviados para um segundo analisador de massas, o time of flight (TOF). No TOF, a separao dos ons feita por mecanismos cinticos onde os ons so acelerados por um campo eltrico. A separao ocorre pela diferena entre a razo m/z de cada analito e um campo eltrico refletor confere alta resoluo tcnica. A deteco feita por um detector do tipo micro-channel plate onde os ons que chegam ao detector gerando um sinal amplificado. A figura 4.7 apresenta a foto do HPLC/MS/MS utilizado nesse trabalho.

Figura 4.7: Cromatgrafo lquido acoplado ao espectrmetro de massas - HPLC-MS IT-TOF (Shimadzu)

A anlise dos compostos foi realizada de forma simultnea (modo positivo e negativo). O equipamento utilizado permite a segmentao no tempo de corrida para 47

melhorar a resposta obtida. Assim, a anlise dos ons foi feita no modo SIM (Selected Ion Monitoring) e no modo SCAN simultaneamente, no qual a corrida foi subdividida em 6 segmentos mostrados na Tabela 4.2 . O tempo de acumulao para cada on foi de 100 milisegundos. A anlise no modo SCAN foi feita em todos os segmentos para possvel identificao de outros compostos que poderiam estar presentes nas amostras.

Tabela 4.2: Segmentos e ons monitorados Segmento 1 Tempo 0,0 4,0 min SCAN Sulfametoxazol (254,0594 (M + H)+) 2 4,0 10,5 min SCAN Trimetoprima (291,1452 (M + H)+) Bezafibrato (360,1008 (M - H)-) Diclofenaco (294,0091 (M - H)-) 10,5 14,5 min on Monitorado

SCAN Bisfenol A (227,1070 (M - H)-) Estradiol (271,1704 (M - H)-) Etinilestradiol (295,1704 (M - H)-)

4 5

14,5 18,0 min 18,0 25,0 min

SCAN SCAN Miconazol (416,9913 (M + H)+) Nonilfenol mistura(219,1754 (M - H)-)

25,0 35,0 min

SCAN

A escolha do modo de ionizao para cada on foi baseada em suas propriedades qumicas, sendo os compostos sulfametoxazol, trimetoprima e miconazol, analisados no modo positivo de ionizao e os demais compostos no modo negativo de ionizao. Para a aquisio de dados do espectrmetro de massas, foi utilizado o programa de computador LabSolutions/LCMS Real Time Analisys (Shimadzu Corporation). Os 48

clculos para as massas exatas foram realizados com o programa Accurate Mass Calculator (Shimadzu Corporation). As condies de anlise esto resumidas e apresentadas na tabela 4.3. . Tabela 4.3: Condies de anlise de microcontaminantes por cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas Sistema Shimadzu LCMS-IT-TOF Pr - coluna Phenomenex - Cartucho Carbo - H (4mm x 3.0mm) Coluna Vazo da fase mvel Gradiente de concentrao (A: gua com 3mM NH4OH B: metanol com 3mM NH4OH) Volume de injeo da amostra Gs utilizado Temperatura do CDL Voltagem do detector Interface Duas colunas C18 em srie - Shimpack VP ODS da Shimadzu (150mm x 2mm x 3m) 0.2mL/min Variao de 40 a 80% da fase B em 6 min.; Estabilizao a 80% da fase B 4 min.; Aumento para 100% fase B em 10 min. e estabilizao por 8 min.; Reduo para 40% de fase B e estabilizao por 7 min. Tempo total de anlise: 35 min. 5L Nitrognio (100 kPA) 200C 1.70kV Eletronspray ionization (ESI) - modo positivo e negativo Etinilestradiol: m/z = 295.1704(M - H)Estradiol: m/z = 271.1704(M - H)Bisfenol A: m/z = 227.1070(M - H)Nonilfenol: m/z = 219.1754(M - H)Diclofenaco: m/z = 294.0091(M - H)Bezafibrato: m/z = 360.1011(M - H)Trimetoprima: m/z = 291,1452(M + H)+ Sulfametoxazole m/z = 254,0592 (M + H)+ Miconazol m/z = 416,9913 (M + H)+ 100 milisegundos 40C

ons monitorados

Tempo de acumulao de ons Temperatura do forno

49

4.1.5 Avaliao do efeito da matriz

Devido possibilidade de ocorrncia de alterao na resposta do sinal dos analitos de interesse durante a ionizao, quando se utiliza como fonte de ionizao o ESI em matrizes complexas, foi necessrio a realizao de correes das reas encontradas de todas as amostras como descrito por Vieno et al. (2006). O procedimento consiste na anlise das amostras e a sua re-anlise aps adio de uma concentrao conhecida dos analitos no extrato. Assim, aps a anlise de cada extrato das amostras, foi realizada uma fortificao dos mesmos com uma mistura de padres sendo que, para cada composto, a concentrao final adicionada nos extratos correspondesse a 30ng/mL. A comparao entre as reas de amostra fortificada e a amostra no fortificada permite avaliar o efeito da matriz no sinal dos analitos e calcular a concentrao real dos mesmos na amostra. A porcentagem de supresso ou aumento do sinal foi calculada de acordo com a equao 4.1 proposta por Vieno et al. (2006): % de variao do sinal = (Ap (Aas- Aa)/Ap ) *100 Onde: Ap = rea do pico do analito em soluo padro pura Aas = rea do pico do analito do extrato fortificado Aa = rea do pico do analito do extrato no fortificado.

( 4.1)

4.2 - Segunda etapa: Validao do mtodo

A validao a comprovao, pelo fornecimento de evidncia objetiva de que os requisitos para uma aplicao ou uso especfico pretendido so atendidos. A validao de mtodos analticos tem por finalidade garantir, por meio de estudos experimentais, que a metodologia atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (ANVISA Resoluo RE 899, 2003). Existem vrios guias e documentos orientadores publicados nacional e internacionalmente. Podemos citar o protocolo harmonizado pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC Internacional), International Standards Organization (ISO) e International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC); protocolos propostos pela United States Food and Drug Administration (FDA), United States Pharmacopeia (USP), International 50

Conference on Harmonization (ICH), EURACHEM, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) e Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (INMETRO) (Bernardes e Souza, 2011). Apesar da existncia de muitos guias, no h um procedimento oficial padro para anlise de compostos como os frmacos, hormnios e os xenoestrognios em matrizes aquticas, bem como uma legislao que aponte valores de concentraes permitidas para esses compostos considerados contaminantes emergentes nos ambientes aquticos. Alm disso, existem muitas divergncias entre as recomendaes e muitas vezes elas so muito vagas permitindo assim ao analista a flexibilidade de adapt-los de acordo com o mtodo a ser utilizado. No Brasil h duas agncias credenciadoras responsveis por verificar a competncia dos laboratrios de ensaio, a ANVISA e o INMETRO. A ANVISA criou a Resoluo ANVISA RE n 899, de 29 de maio de 2003, onde esto apresentados os parmetros de validao e seus respectivos limites que garantam confiabilidade dos resultados obtidos por determinado mtodo para a determinao de frmacos em produtos farmacuticos. J o INMETRO disponibiliza um documento guia mais abrangente para o procedimento de validao de mtodos analticos, o INMETRO DOQ-CGCRE-008, de 2007, o qual sugere uma conduta de validao sendo aberta a interpretao e adaptao do analista de acordo com o mtodo a ser usado. Os critrios apresentados nesse trabalho tiveram como principais referncias a resoluo RE n 899, 2003 da ANVISA e o DOQ-CGCRE-008, 2007 do INMETRO. Os parmetros de validao utilizados neste estudo so descritos de forma detalhadas a seguir.

4.2.1 Seletividade
A seletividade de um mtodo instrumental de separao a capacidade de avaliar, de forma inequvoca, as substncias em exame na presena de componentes que podem interferir com a sua determinao em uma amostra complexa (Ribani et al, 2004). No presente trabalho, a anlise dos compostos pesquisados foi realizada monitorando-se ons selecionados (SIM- Selected Ion Monitoring) em alta resoluo (< 10.000 com incerteza de 20ppm). A seletividade foi obtida pelos tempos de reteno na cromatografia lquida e pelos cromatogramas de ons das espcies protonadas e 51

deprotonadas em alta resoluo. Assim tem-se uma metodologia altamente seletiva, visto que apenas os ons de interesse numa faixa muito restrita ( 20ppm) so monitorados e detectados pelo analisador de massas.

4.2.2 Ajuste de curva analtica/Linearidade e faixa de trabalho

O ajuste de curva analtica/linearidade de um mtodo analtico a capacidade de obter resultados proporcionais s concentraes dos analitos nas amostras (ICH, 2005). Os modelos de calibrao utilizadas foram baseados em regresses quadrticas obtidas por padronizao externa, onde foram realizadas injees de sete replicatas dos padres nas concentraes de 5, 10, 30, 50, 100, 130, 200 e 250g/L em metanol, para obteno das curvas analticas. Os ajustes das curvas/linearidade foram avaliados com base nos grficos de distribuio normal dos resduos e o coeficiente de correlao que segundo o INMETRO, um valor de r maior que 0,90 aceitvel.

4.2.3 - Limite de Deteco/Limite de quantificao

Segundo a ANVISA (2003) o limite de deteco (LD) a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas. O LD pode ser calculado de trs maneiras diferentes: mtodo visual, mtodo relao sinal-rudo e o mtodo baseado em parmetros da curva analtica (Ribani et al, 2004). Neste estudo para determinao do LD foi utilizado o mtodo de relao sinal/rudo. Para tal, foi feita a anlise dos padres em baixas concentraes e os valores de LD foram calculados usando um aplicativo no software do equipamento. Foram consideradas para a estimativa dos limites de deteco do equipamento as concentraes de padro cuja relao sinal/rudo fosse maior que 3. O procedimento experimental adotado para determinao do LQ foi idntico ao citado anteriormente para o LD, entretanto, foram considerados como limite de quantificao as concentraes de padro cuja relao sinal/rudo fosse maior que 10. Vale destacar que para o clculo do LD do mtodo assim como do LQ do mtodo tambm foram considerados o fator de concentrao da amostra, o ndice de recuperao e o efeito da interferncia da matriz. 52

4.2.4 Preciso
A preciso a medida da concordncia entre os valores experimentais de ensaios independentes, repetidos de amostras semelhantes ou padres, sob condies definidas. Normalmente esta medida expressa pelo desvio-padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV) para resultados de valores de concentraes conhecidos. A preciso do equipamento foi avaliada em termos de repetibilidade atravs do clculo do coeficiente de variao (CV) para um nmero de sete repeties de padres preparados em metanol, onde foram aceitos CV de at 20%, dependendo do nvel de concentrao da amostra (INMETRO, 2007). A preciso do mtodo tambm foi avaliada em termos de repetibilidade em ensaios de recuperao, onde foram utilizadas 3 amostras de esgoto fortificadas para uma concentrao final de 100ng/mL.

4.2.5 - Exatido
A exatido representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referncia aceito como verdadeiro (INMETRO, 2007) Segundo Ribani (2004), os processos mais utilizados para avaliar a exatido de um mtodo so os materiais de referncia, ensaios de recuperao, adio de padro e comparao de mtodos. A recuperao est relacionada com a exatido, pois indica a quantidade de determinado analito recuperado no processo em relao quantidade real contida na amostra (Silva, 2010). A limitao do procedimento de recuperao a de que a substncia adicionada no est, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra. Isso pode implicar, por exemplo, na presena de substncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor recuperao e deteco, ocasionando avaliaes excessivamente otimistas da recuperao. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem interferir na separao, deteco ou na quantificao da substncia, efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados. Devido a esse fato nos clculos do ensaio de recuperao tambm foram considerados o efeitos no sinal dos analitos pela matriz. Os intervalos aceitveis de recuperao para anlise de resduos geralmente esto entre 70 e 120%, com preciso de at 20%. Porm, dependendo da complexidade analtica e da amostra, este valor pode ser de 50 a 120%, com preciso de at 15% (Ribani, 2004). 53

No presente estudo, a exatido foi avaliada atravs do ensaio de recuperao. Foi utilizado um volume de 100mL de amostras de esgoto que foram previamente fortificadas para uma concentrao final de 100ng/mL de todos os compostos. As amostras fortificadas foram posteriormente extradas de acordo com o procedimento de extrao j descrito no item 4.1.3 (terceiro teste). As anlises foram realizadas em triplicata. A porcentagem de recuperao foi calculada de acordo com a equao 4.2

% de recuperao = [(C1- C2) / C3] x 100

(4.2)

onde: C1 = concentrao determinada na amostra fortificada; C2 = concentrao determinada na amostra no fortificada; C3 = concentrao adicionada.

4.3 - Terceira etapa: Monitoramento em amostras reais diversas etapas em sistemas simplificados de tratamento de esgoto

4.3.1 - rea de estudo e Amostragem

As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) da UFMG, contgua estao de tratamento de esgotos (ETE) da bacia do ribeiro Arrudas, em Belo Horizonte. Essa ETE recebe grande parte do esgoto sanitrio gerado pela regio metropolitana de Belo Horizonte e uma pequena frao retirada para alimentar as unidades experimentais, aps o esgoto bruto passar pelo tratamento preliminar (gradeamento e desarenao). O sistema de esgoto investigado consiste de reator UASB (reator anaerbio de fluxo ascendente) seguido por lagoas de polimento e reator UASB seguido por Wetland no plantada. Foram realizadas 12 coletas em dias distintos no perodo de junho a agosto de 2010. Em cada ponto foi coletado 10L de amostra de forma composta em perodo de 24 horas. As amostras foram coletadas nos pontos designados P1 (esgoto sanitrio aps tratamento preliminar), P2 e P4 (efluentes de reatores UASB), P3 (efluente do sistema wetlands) e P5 (efluente da Lagoa de Polimento). A Figura 4.8 ilustra os pontos de coleta.

54

Esgoto Bruto

P1

Reator UASB 1

Reator UASB 2

P2 Wetland no plantado

P4

Lagoa de Polimento P3 P5

Figura 4.8: Esquema dos pontos de coleta

Aps o perodo de amostragem, foi retirada uma alquota de cerca 300 mL que, em seguida, foi filtrada em filtros de celulose de 8 m e em seguida em filtros de fibra de vidro de 0,7 m. Depois de filtradas, as amostras foram extradas e analisadas no HPLC/MS/MS conforme procedimento descrito no item 4.1.3 (terceiro teste).

4.3.2 - Caractersticas dos Sistemas de tratamento simplificados avaliados

Sistema UASB-wetland As caractersticas e condies operacionais mdias impostas ao sistema UASB-wetland no plantada esto apresentadas na Tabela 4.4. A Wetland no-plantada possui fluxo horizontal e subsuperficial, sendo dimensionada para um equivalente populacional de 50 habitantes recebendo continuamente efluente pr-tratado pelo reator UASB (R1). A inclinao de fundo da unidade e a altura do leito foram dispostas de acordo com recomendaes sugeridas pela literatura, da ordem de 0,5% (EPA, 2005; 55

MIDDLEBROOKS et al., 2005). A unidade foi preenchida por escria de alto-forno previamente britada e livre de fragmentos de pequenas dimenses, onde a granulometria foi especificada como brita 0. Tabela 4.4 : Caractersticas e condies operacionais do sistema UASB-Wetland no plantada Caractersticas e condies operacionais Material de construo Seo transversal (m) Altura til (m) Volume reacional (m) Inclinao longitudinal do fundo Vazo mdia DP (m/d) TDH mdio DP (h)** Reator UASB (R1) Ao carbono 1,2 x 1,2 5,0 7,2 32,3 1,5 5,4 0,3 Wetland no plantada Escria 3 x 24,1 0,3 9,0* 0,5% 7,4 0,8 29,2 2,9*

* Volume e TDH reais considerando a porosidade da escria ** TDH=Tempo de Deteno Hidrulica

Sistema UASB-lagoas de polimento O sistema UASB-lagoas de polimento foi composto das seguintes unidades em srie: um reator anaerbio tipo UASB e trs lagoas de polimento, sendo a ltima lagoa composta com filtro grosseiro de pedras (brita 3) locado no final da unidade. O filtro grosseiro objetiva a remoo parcial das algas, contribuindo para a remoo adicional de slidos em suspenso e matria orgnica. As principais caractersticas e condies operacionais do sistema UASB seguido das lagoas de polimento so apresentados na Tabela 4.5. Tabela 4.5: Caractersticas e condies operacionais do sistema UASB-Lagoas de polimento Caractersticas e condies operacionais Material de construo Seo transversal (m) Altura til (m) Volume reacional (m) Vazo mdia DP (m/d) TDH mdio DP (h)*** Reator UASB R2 Ferrocimento D = 2,00 4,5 14,2 30,9 2,2 11,0 0,8 Lagoas de polimento L1 L2 L3* 5,25 x 16,56** 0,50 42,0 30,9 2,2 32,8 2,4

5,25 x 25,00 5,25 x 25,00 0,75 64,7 30,9 2,2 50,5 3,7 0,70 60,3 30,9 2,2 47,1 3,4

* Lagoa de polimento com filtro grosseiro locado dentro da unidade ** Valor excluido do comprimento do filtro grosseiro *** Tempo de Deteno Hidrulica

56

5 - Resultados e Discusses
Neste captulo sero apresentados os resultados de acordo com as trs etapas descritas no captulo 4: desenvolvimento do mtodo analtico, validao do mtodo analtico e aplicao do mtodo no monitoramento de amostras para avaliao da remoo dos microcontaminantes em sistemas simplificados de tratamento de esgoto.

5.1- Desenvolvimento da etapa de extrao, concentrao e clean-up de extratos

Na literatura existem alguns mtodos descritos para extrao e concentrao dos analitos de interesse. No entanto, a presena de interferentes em altas concentraes na matriz esgoto pode comprometer a identificao e quantificao desses analitos quando se utiliza a tcnica da espectrometria de massa (especialmente o eletrospray) fenmeno conhecido como efeito matriz. Portanto uma etapa de clean-up de amostra se torna muito importante antes da anlise cromatogrfica. O chamado efeito matriz tem sido discutido na literatura nos ltimos anos. No entanto, poucas referncias sobre anlises de esgoto abordam esse problema. Diante do exposto, durante o desenvolvimento da etapa de preparo de amostra, vrios testes foram realizados, buscando na etapa de extrao diminuir a concentrao dos interferentes presentes na matriz esgoto. Especialmente, para a remoo dos detergentes LAS (alquilbenzeno-sulfonados de cadeia linear), presentes em altas concentraes nos esgotos. Esta classe de compostos conhecida pelos seus efeitos na supresso do sinal de analitos no ESI (Leite, 2010). Eles se encontram ionizados em soluo (pKa <1) e apresentam propriedades tensoativas, o que provavelmente os coloca na regio superficial das gotculas formadas durante o processo de ionizao no ESI, diminuindo, assim, as reaes de transferncia de cargas e ionizao dos analitos de interesse. 5.1.1 Primeiro Teste

Esse primeiro teste tinha como objetivo avaliar se lavagens finais com diferentes concentraes de solues de metanol e em pH bsico, seriam capazes de remover seletivamente os interferentes, como os LAS (C10-13-LAS) durante a etapa de extrao. 57

Foram utilizadas amostras sintticas de LAS e a extrao foi realizada utilizando o cartucho Strata X. Como os LAS tm pka <1, as lavagens bsicas (em pH=8,5) poderiam favorecer o retirada dos LAS ligados ao cartucho Strata-X j que eles estariam na sua forma de sal em meio levemente bsico. A tabela 5.1 apresenta os resultados em termos de rea obtidos aps a etapa de lavagem dos cartuchos. Na amostra sem clean-up no foi realizada nenhuma lavagem ao final; na amostra 1, foi usado na lavagem final 10mL de uma soluo aquosa de NH4OH no pH 8,5; na amostra 2, 10mL de uma soluo metanol em gua a 10% v/v em pH 8,5; e na amostra 3, 10mL de uma soluo metanol em gua a 30% v/v em pH 8,5. A tabela 5.1 apresenta os resultados obtidos das reas dos picos cromatogrficos dos LAS. Pode-se observar pelos resultados que a lavagem final com soluo aquosa de NH4OH em pH 8,5 propiciou uma pequena diminuio na rea do C10 LAS e uma dimuio um pouco mais significativa do C11 LAS. J para os C12 LAS e C13 - LAS no foram observadas diminuio nas reas dos picos cromatogrficos. A lavagem final com soluo de metanol em gua a 10% v/v pH 8,5 diminuiu apenas a rea do C10 LAS. A lavagem final com soluo de metanol em gua a 30% v/v pH 8,5 no diminuiu a concentrao de nenhum dos LAS avaliados.

Tabela 5.1: Resultado por rea do teste de lavagens (clean-up) do cartucho com solues metanlicas em diferentes concentraes Resultados do teste (rea dos picos) Amostra 2 Amostra 3 Amostra 1 (lavagem 10mL (lavagem 10mL Amostra Compostos (lavagem 10mL sol. metanol em sol. metanol em sem clean- soluo aquosa gua a 10% v/v gua a 30% v/v up NH4OH pH 8,5) pH 8,5) pH 8,5 ) C10 - LAS C11 - LAS C12 - LAS C13 - LAS 12.284.595 56.853.400 52.505.047 117.579.470 11.492.555 32.980.421 65.574.612 121.710.660 6.576.754 60.462.552 56.326.839 123.441.036 29.910.232 67.462.114 83.429.420 157.102.916

5.1.2 Segundo teste

O segundo teste tambm tinha como objetivo diminuir a concentrao dos interferentes LAS. Os experimentos consistiram na preparao de dois protocolos de 58

extrao sendo: (i) produo de um extrato pela passagem apenas no cartucho C18 de uma amostra sinttica, contendo LAS e analitos na concentrao de 10mg/L e 100 g/L, respectivamente, e sua eluio com 10 mL de acetato de etila; (ii) produo de dois extratos pela passagem de uma amostra sinttica em sequncia por dois cartuchos de extrao de fase slida (Strata SAX e C18), e eluio utilizando 10 mL de acetato de etila para ambos os cartuchos. A eluio do cartucho de troca inica visava avaliar a capacidade de reteno dos analitos por este cartucho. Por serem cidos fortes esperavase que os LAS ficassem retidos no cartucho de troca aninica (amina quaternria) e os outros compostos neutros de interesse passasem pelo cartucho e ficassem retidos no prximo cartucho (C18), para posterior eluio. A tabela 5.2 apresenta os resultados obtidos das reas dos picos cromatogrficos dos LAS e dos analitos.

Tabela 5.2: Resultados do teste utilizando cartucho Strata SAX e C18 (Valores em reas dos picos cromatogrficos) Resultados do teste (rea dos picos encontrada) Eluio do cartucho C18 (10 Eluio do Eluio do mL AcEt (amostra passada cartucho C18 (10 cartucho SAX anteriormente pelo cartucho mL AcEt) (10 ml de AcEt) SAX) 66.792.010 282.079.657 581.840.142 639.794.118 18.862.921 16.505.301 11.442.222 18.373.919 11.410.597 67.272.307 116.439.832 155.203.033 9.583.489 969.890 7.314.419 44.428.043 19.731.288 21.100.321 19.789.170

Compostos

C10 - LAS C11 - LAS C12 - LAS C13 - LAS Bisfenol A Etinilestradiol Estradiol 4-nonilfenol

Pode-se observar pelos resultados da tabela 5.2, a diminuio das reas dos picos dos LAS (C10-13-LAS) quando a amostra foi eluida do cartucho C18 previamente tratado pelo cartucho de troca inica SAX, indicando que os LAS foram significativamente retidos no cartucho de troca inica. No entanto, foi observada tambm uma diminuio nas reas dos picos referentes aos analitos interferentes endcrinos (bisfenol A, etinilestradiol, estradiol e 4-nonilfenol). Para os resultados de eluio do cartucho SAX utilizao de acetato de etila, observa-se que ele reteve parte significativa dos analitos 59

de interesse (aumento nas reas dos interferentes endcrinos) evidenciando claramente a remoo significativa dos sinais dos LAS. A reteno dos analitos no cartucho de troca inica, com valores maiores de reas pode ser explicada pela partio dos mesmos nas cadeias apolares do LAS e ou pela interao com os grupos CH3 das aminas quaternrias e com o grupo propil da fase ligante do cartucho SAX. Outra explicao para o aumento das reas dos analitos a diminuio do efeito de supresso pela diminiuio dos interferentes LAS nos extratos. Sendo assim, o cartucho Strata SAX poderia ser utilizado como cartucho de clean-up de amostra e tambm de concentrao dos analitos. 5.1.3 - Terceiro teste Para confirmar os resultados obtidos nos testes anteriores foi realizado um terceiro teste para avaliar a importncia do cartucho Strata SAX na remoo dos interferentes LAS e consequentemente na sua contribuio para diminuio do efeito supressivo provocado por esse tipo de composto. Nesse teste foi utilizado o cartucho Strata-X (similar ao Oasis HLB utilizado no mtodo EPA-1694). Os analitos avaliados foram o sulfametoxazol, a trimetoprima, o miconazol, o diclofenaco, o bezafibrato, o estradiol, o etinilestradiol e o bisfenol A. Nesse teste foram realizados dois procedimentos de extrao em triplicata de 100mL de amostras sintticas de LAS a 10 mg/L e dos analitos a 100 g/L e de 100 ml de outra amostra sinttica contendo apenas os analitos a 100 /L em gua. Para um dos procedimentos foi usado apenas o cartucho Strata X e eluio, segundo EPA Mtodo 1694, com 6 mL de metanol seguido de 3 mL de metanol/acetona (1/1). Para o outro procedimento foi utilizado os cartuchos Strata SAX e o Strata X em sequncia sendo que para a eluio do Strata SAX foi usado 10 mL de acetato de etila e para a eluio do Strata X o mesmo procedimento descrito pelo EPA Mtodo 1694. Para verificar a eficincia do cartucho Strata SAX na remoo dos LAS, foram avaliadas as intensidades dos picos dos ons [M-H]- dos LAS nos dois extratos da amostra sinttica. Na figura 5.1 so apresentados os cromatogramas para os ons especficos dos quatro LAS (C10-LAS a C13-LAS m/z 297,1530, m/z 311,1686, m/z 325,1843, 339,1999) nos extratos da amostra sinttica, obtidos das extraes usando o cartucho strata X (a) e em sequncia Strata SAX + Strata X (b). Pelos cromatogramas 60

podese observar que no extrato obtido pela passagem da amostra apenas pelo cartucho Strata X (figura 5.1.a) h uma grande concentrao residual dos LAS, saturando os picos. No cromatograma do extrato obtido pela passagem da soluo pelos cartuchos Strata SAX e Strata X, em sequncia, houve uma reduo significativa na intensidade dos ons dos LAS (Figura 5.1 b). Apesar de incompleta, os cromatogramas mostram claramente a remoo significativa dos LAS pela utilizao do cartucho Strata SAX seguido do cartucho Strata X, evidenciando que parte significativa dos LAS ficou retida no primeiro cartucho Strata SAX.

Figura 5.1 : a Cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- de amostra extrada apenas pelo cartucho Strata X; b cromatograma dos ons dos LAS [M-H]- de amostra extrada pelos cartuchos Strata SAX e Strata X. Compostos apresentados: C10-LAS (m/z
297,1530), C11-LAS ( m/z 311,1686), C12-LAS (m/z 325,1843), C13-LAS ( m/z 339,1999)

61

Para os analitos em que foram avaliadas as eficincias dos dois procedimentos de extrao, os dados de indices de recuperao nas duas amostras pelos dois cartuchos so apresentados na tabela 5.3. Os dados apresentados foram obtidos pelo uso de curvas analticas dos padres, corrigidos pelo efeito da matriz, conforme descrito em 4.1.7. Tabela 5.3: ndice de Recuperao dos analitos em diferentes cartuchos e procedimentos de extrao
Compostos Soluo Sinttica de LAS (10 mg/L) + analitos Soluo Aquosa dos analitos (100 g/L) (100 g/L) Strata X Strata SAX + Strata X Strata SAX + Strata X Recuperao CV (%) Strata X Strata SAX Strata X Strata SAX Strata X 12,2 10,5 26,1 8,5 35,9 6,7 56,6 3,6 36,3 7,5 53,2 4,3 2,46 7,3 51,8 9,8 54,3 8,6 60,8 2,7 86,3 3,7 53,4 5,7 53,4 10,2 57,1 4,9 45,4 2,7 118,5 4,7 27,2 6,4 73,8 2,3 6,9 3,2 89,4 1,5 3,7 7,5 85,7 4,4 6,1 4,3 84,3 1,3 4,2 2,4 39,3 0,4 67,1 6,7 81,5 8,3 -

Sulfametoxazole Trimetoprima Diclofenaco Bezafibrato Bisfenol A Estradiol Etinilestradiol Miconazol

A partir dos dados da tabela acima, pode-se observar que pelo procedimento descrito no EPA Mtodo 1694, que usa apenas uma etapa de extrao em cartucho equivalente ao Strata X, apenas 4 entre os nove compostos analisados apresentaram sinal e atingiram ndices de recuperao variando entre 12 a 87%, quando na presena de LAS nas solues em concentraes normalmente encontradas em amostras de esgotos brasileiros (10 mg/L). Em dados da literatura, o sulfametoxazole apresenta ndices de recuperao normalmente baixos. Kasprzyk-Hordern et al (2008a) relata ndice de recuperao de 32 a 39%, utilizando cartuchos MCX, em amostras de esgoto para o referido composto. Vanderford et al (2003) relatou recuperao de 13-35%, utilizando cartucho Oasis HLB, em amostras de guas superficiais e Sacher et al (2001) relatou recuperao de 21-23%, utilizando cartuchos Isolute ENV+, tambm em amostras de guas superficiais conforme reviso apresentada por Kasprzyk-Hordern et al (2008b). No entanto, outros autores relatam ndices maiores de recuperao para o sulfametoxazole como no trabalho de Castiglioni e colaboradores (2005) que relata ndice de recuperao de 60% em amostras de esgoto utilizando cartuchos MCX. Observa-se que para os compostos diclofenaco, estradiol, etinilestradiol e bisfenol A no houve sinal analtico nas amostras sintticas contendo LAS extradas apenas pelo cartucho Strata X. Enquanto as amostras extradas sequencialmente pelos 62

cartuchos Strata SAX e Strata X observa-se o sinal analtico desses compostos sendo possvel sua quantificao. A figura 5.2-a apresenta os cromatogramas obtidos das amostras extradas apenas pelo cartucho Strata X, onde podemos observar ausncia de sinal analtico dos compostos bisfenol A, estradiol e etinilestradiol no tempo de reteno desses compostos e os cromatogramas de alguns LAS. A figura 5.2-b e 5.2-c apresenta cromatogramas obtidos das amostras extradas sequencialmente pelos dois cartuchos, Strata SAX e Strata X onde podemos observar os picos cromatogrficos dos compostos bisfenol A, estradiol e etinilestradiol e de alguns LAS.

63

Figura 5.2: a: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada apenas pelo cartucho Strata X. b: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada pelo cartucho Strata SAX c: cromatogramas dos ons dos LAS [M-H]- e de ons [M-H]- do Estradiol, Etinilestradiol e Bisfenol A de amostra extrada pelo cartucho Strata X (forma seqencial). Compostos apresentados: C10-LAS (m/z 297,1530), C11LAS (m/z 311,1686), C12-LAS (m/z 325,1843), C13-LAS (m/z 339,1999), Bisfenol A (m/z 227,1070), Estradiol (m/z 271,1704), Etinilestradiol (m/z 295,1704)

64

A no obteno de sinais para os compostos diclofenaco, bisfenol A, estradiol e etinilestradiol nos extratos obtidos apenas pelo cartucho Strata X, poderia ser explicada pela competio na etapa de extrao ou pela supresso total do sinal dos analitos devido presena de grande quantidade de LAS nos extratos, influenciando assim a eficincia de ionizao. interessante observar tambm que na avaliao do procedimento de extrao, usando dois cartuchos, onde as solues passam primeiramente pelo cartucho de troca inica Strata SAX e posteriormente pelo cartucho Strata X, houve uma reteno significativa de todos os analitos avaliados, ainda no primeiro cartucho de troca inica, tanto na presena e na ausncia de LAS. Numa avaliao de dados da literatura no foi encontrada nenhuma referncia onde reportada a utilizao deste tipo de fase, troca inica forte com amina quartenria, como tcnica de concentrao destes compostos em amostras de esgoto. Ainda conforme os dados da tabela 5.3, tanto para a soluo contendo LAS quanto para soluo aquosa, foram obtidos no cartucho Strata SAX ndices de recuperao superiores a 50% para 6 dos nove compostos analisados, diclofenaco, bezafibrato, bisfenol A, estradiol, etinilestradiol e miconazol. Os ndices de recuperao para o sulfametoxazol 26 e 36% so compatveis com outros autores, usando cartuchos C18 (HILTON e THOMAS, 2003). Para a trimetropina, observa-se uma baixa afinidade para com a fase de troca inica, com ndice de recuperao abaixo de 3% e alto coeficiente de variao, quando em soluo aquosa sem LAS. No entanto, houve uma reteno significativa da trimetropima no cartucho Strata SAX (ndice de recuperao de aproximadamente 36%) para as solues contendo LAS. Observa-se tambm que os ndices de recuperao da trimetropina so sempre em torno de 50% em todos os as etapas de extrao usando o cartucho Strata X, provavelmente pelas suas caractersticas fsico-qumicas e estruturais. Apesar de ainda no ser conclusiva, uma possvel explicao para a reteno da trimetropima no cartucho SAX, na presena de LAS, sua interao com as cadeias lineares dos LAS, que esto ligados ionicamente com as aminas quartenrias deste tipo de cartucho. A soma das recuperaes pela passagem das solues contendo LAS nos dois cartuchos para os compostos trimetoprima, bisfenol A, estradiol, etinilestradiol foram superiores a 80%. Para o bisfenol A foi observado um ndice de recuperao excessivo 65

quando da anlise nos extratos obtidos da soluo aquosa dos analitos, mesmo considerando que esses resultados foram corrigidos para os efeitos da matriz. A tabela 5.4 apresenta a resposta em rea cromatogrfica dos compostos LAS e dos compostos estradiol, etinilestradiol e bisfenol A eludos dos cartuchos Strata SAX e Strata X das amostras sintticas contendo LAS e os compostos citados na concentrao de 10mg e 100 g/L, respectivamente. Pode-se observar uma maior resposta em termos de rea tanto dos LAS quanto dos compostos estradiol, etinilestradiol e bisfenol A da amostra eluda do cartucho Strata SAX comparada a amostra eluda do Strata X. Isso confirma o fato demonstrado nos cromatogramas apresentados na figura 5.7 que o cartucho Strata SAX reteve quantidade significativa de LAS. Parte deste LAS apesar de ter sido eludo do cartucho juntamente com os analitos de interesse, no suprimiu o sinal dos analitos a ponto dos sinais no serem detectados como foi observado nas amostras extradas apenas com cartucho Strata X. Tabela 5.4: Resposta em rea cromatogrfica dos compostos LAS e dos compostos estradiol, etinilestradiol e bisfenol eludos dos cartuchos Strata SAX e Strata X Soluo Sinttica de LAS (10 mg/L) + analitos (100 g/L) Compostos C10-LAS C11-LAS C12-LAS Estradiol Etinilestradiol Bisfenol A Strata SAX ( rea dos picos encontrada) 140.334.985 171.202.988 257.462.005 21.891.533 18.197.192 14.622.650 Strata X (rea dos picos encontrada) 19.426.198 29.684.166 73.401.373 1.554.188 1.358.886 10.665.642

Para verificarmos como seria a reteno dos analitos de interesse nos cartuchos Strata SAX e Strata X em amostras reais (esgoto sanitrio), foi realizada uma extrao utilizando os dois cartuchos Strata SAX e Strata X de forma sequencial. Nesse teste foi realizado extrao em triplicata de 100 ml de esgoto sanitrio fortificado os compostos trimetoprima, diclofenaco, bezafibrato, estradiol, etinilestradiol e bisfenol A para obteno de uma concentrao final de 100g/L. Foi realizado o mesmo procedimento de extrao descrito para o terceiro teste que utilizou amostras sintticas 66

de LAS. Para os analitos em que foram avaliadas as eficincias de extrao, os dados de ndices de recuperao obtidos em cada cartucho so apresentados na tabela 5.5. Os dados apresentados foram obtidos pelo uso de curvas analticas dos padres, corrigidos pelo efeito da matriz, conforme descrito em 4.1.7.

Tabela 5.5: ndice de Recuperao dos compostos estudados (concentrao de 100 ng/L) Compostos ndice de Recuperao (%) Cartucho Strata SAX Trimetoprima Diclofenaco Bezafibrato Estradiol Etinilestradiol Bisfenol A 29,21,9 26,77,9 17,32,6 35,45,5 23,29,5 24,99,0 Cartucho Strata X 38,55,5 19,96,8 38,36,1 8,06,5 6,68,5 37,65,5

A partir dos dados da tabela acima 5.5, pode-se notar que assim como observado para as amostras sintticas, houve reteno de todos os analitos avaliados, ainda no primeiro cartucho de troca inica. Essa reteno variou de 17 a 35% no cartucho Strata SAX. A soma das recuperaes pela passagem das amostras nos dois cartuchos variou de 30 a 68% para todos os compostos. No entanto, diferente do observado para as amostras sintticas, os compostos diclofenaco e bezafibrato ficaram retidos tambm no cartucho Strata X. O composto bisfenol A apresentou um padro de reteno um pouco diferente do observado nas amostras sintticas. Nas amostras reais o bisfenol A ficou mais retido no cartucho Srata X. Para os outros compostos, estradiol, etinilestradiol e trimetoprima a reteno nos compostos foi semelhante ao observado nas amostras sintticas de LAS. As recuperaes totais obtidas foram mais baixas que as observadas nas amostras sintticas. Esse fato era se esperar devido ao fato da matriz real de esgoto ser muito mais complexa que as amostras sintticas. Alm dos surfactantes LAS, o esgoto pode conter tambm protenas, aminocidos, leos, gorduras, enzimas, cidos orgnicos e uma srie de outros componetes, que podem diminuir a eficincia de soro dos cartuchos de SPE (Kasprzyk-Hordern et al , 2008c). Apesar dos baixos ndices de recuperao dos analitos, observa-se coeficientes de variao menores que 10%, considerados como satisfatrios em procedimento 67

manual e uso de manifold sob vcuo no processo de extrao. O protocolo de extrao, concentrao e clean-up desenvolvido foi validado e utilizado nas anlises de amostras reais de esgotos.

5.2 - Desenvolvimento do mtodo analtico: HPLC/MS 5.2.1 - Fases mveis

A escolha da fase mvel na anlise cromatogrfica depende de alguns fatores. A afinidade que esta apresenta com os analitos de interesse e a compatibilidade da coluna com o solvente escolhido determinante para uma boa resposta cromatogrfica. Outro fator que deve ser considerado composio da fase mvel no comportamento dos modos de ionizao. Foram testadas algumas fases mveis na tentativa de se encontrar a que apresentasse melhor resposta para a maioria dos analitos. As composies das fases mveis testadas foram: Fase 1: gua com 5mM cido oxlico; metanol e acetonitrila (1:1) com 5mM cido oxlico ; Fase 2: Acetato de amnio e cido actico 0,1% v/v em gua ; metanol e acetonitrila (1:1); Fase 3: gua; metanol e acetonitrila (1:1); Fase 4: gua; metanol; Fase 5: gua com 3mM de NH4OH; metanol com 3mM de NH4OH. Inicialmente, o mtodo estava sendo desenvolvido para anlise do estradiol, etinilestradiol e bisfenol A. Em virtude disso a seleo da fase mvel contemplou apenas o trs compostos acrescidos do miconazol. Depois, na etapa de desenvolvimento do mtodo, foram acrescentados os outros compostos avaliados. A figura 5.3 apresenta os resultados em reas dos picos obtidos para os 5 tipos de composio de fase testadas.

68

Figura 5.3: Resultados por rea. Fase 1: gua com 5mM cido oxlico; metanol/ acetonitrila (1:1) com 5mM cido oxlico ; Fase 2: Acetato de amnio e cido actico 0,1% v/v em gua ; metanol/acetonitrila (1:1); Fase 3: gua; metanol/acetonitrila (1:1); Fase 4: gua; metanol; Fase 5: gua com 3 mM NH4OH; metanol com 3mM NH4OH Pelos resultados obtidos, observa-se que para os compostos estradiol, etinilestradiol e bisfenol A, a fase composta por gua e metanol basificadas com 3mM de NH4OH apresentou melhor resposta em termos de rea. Para o composto miconazol a resposta foi um pouco menor que os obtidos na Fase 4: contendo apenas gua/metanol. Desta forma, a fase mvel constituda por metanol e gua basificadas com 3mM de NH4OH foi escolhida para anlise dos compostos.

5.2.2 Colunas utilizadas

Inicialmente foi utilizada uma nica coluna para separao cromatogrfica. No entanto, foi observado que o LAS um interferente importante presente na matriz esgoto, possua o mesmo tempo de reteno de alguns analitos, sendo capaz assim de interferir na quantificao dos compostos devido supresso ocorrida na ionizao. Foram testadas vrias modificaes nos gradientes da composio das fases na tentativa de mudar o tempo de reteno desses interferentes. Contudo, essa alterao no foi suficiente para separar os interferentes dos analitos de interesse. Como o equipamento possui limitaes de presso de trabalho, foi descartada a possibilidade de utilizar colunas com menores dimetros de partcula. Uma alternativa avaliada foi a utilizao de duas colunas cromatogrficas em sequncia, pois assim seria possvel aumentar o 69

nmero de pratos tericos e consequentemente melhorar eficincia na separao cromatogrfica. Foi observado, que com a utilizao de duas colunas em srie, alguns dos interferentes presentes na matriz tiveram seus tempos de reteno alterados e o efeito supressivo da matriz poderia ser minimizado.

5.2.3- Anlise de nonilfenol

Devido ao fato do nonilfenol apresentar cerca 550 ismeros os quais muitos so ismeros de posio (Guenther et al, 2006) uma total separao desses compostos e consequentemente sua quantificao se torna invivel. Nesse trabalho, a quantificao do nonilfenol foi realizada pela rea das respostas para o seu on [M-H]- em determinado intervalo de tempo do cromatograma. O intervalo escolhido para quantificao foi o mesmo intervalo apresentado para o pico do padro de uma mistura de ismeros do nonilfenol. Devido a essas dificuldades analticas, o composto nonilfenol no pode ser quantificado em termos de concentrao real e no foi validado juntamente com os outros compostos. Por ser um dos contaminantes prevalentes em guas residurias os resultados de suas respostas em rea foram utilizados como uma estimativa da quantidade real deste composto nas diversas etapas dos sistemas de tratamento de esgotos.

5.3 - Validao do Mtodo

5.3.1 Seletividade
A tcnica utilizada nesse trabalho para quantificao dos compostos altamente seletiva, pois a anlise foi realizada monitorando-se ons selecionados (SIM- Selected Ion Monitoring) em alta resoluo (> 10.000) com erros relativos a massa absoluta menores que 20 ppm. A seletividade obtida tambm pelos tempos de reteno nos cromatogramas de ons das espcies protonadas e deprotonadas em alta resoluo dos padres. Assim tem-se uma metodologia altamente seletiva, visto que apenas os ons de interesse numa faixa muito restrita ( 20 ppm) so monitorados pelo espectrmetro de de massas. 70

Para exemplificar a seletividade do mtodo os cromatogramas de todos os compostos estudados com seus respectivos espectros de massas MS1 obtidos so apresentados nas Figuras 5.4 a 5.15.

2:254.0598 (14.78)
7.5

2.615

(x1,000,000)

5.0

2.5

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Event#: 2 (E+) Ret. Time : 2.625 Scan# : 752 Precursor : 254.0594

Inten. (x1,000,000) 1.5

254.0598

1.0

b
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

0.5

0.0 100

Figura 5.4: (a) Cromatograma de ons [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Sulfametoxazole , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o Sulfametoxazole
1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

5:360.1012 (40.12)

6.603

(x10,000,000)

Event#: 5 (E-) Ret. Time : 6.565 Scan# : 1958 Precursor : 360.1008

Inten. (x100,000) 5.0

360.1012

2.5

b
358.8247
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

0.0 100

Figura 5.5: (a) Cromatograma de ions [M-H] de um padro de 50 ng/mL para o Bezafibrato , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Bezafibrato

Event#: 2 (E+) Ret. Time : 8.503 Scan# : 2567 Precursor : 291.1452

71

Inten. (x1,000,000) 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 100

291.1455

b
400 500 m/z

200

300

Figura 5.6: (a) Cromatograma de ons [M+H]+ de um padro de 50 ng/mL para o Trimetoprima , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o Trimetoprima
2.5

4:294.0099 (51.63)

7.629

(x10,000,000)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Event#: 4 (E-) Ret. Time : 7.420 -7.838 Scan# : 2227 Precursor : 294.0091
Inten. (x100,000) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 100

294.0099

b
350 400 450 500 550 m/z

274.8780(1)
150 200 250 300

Figura 5.7: (a) Cromatograma de ions [M-H] de um padro de 50 ng/mL para o Diclofenaco , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Diclofenaco
6.641
1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Figura 5.8: (a) Cromatograma de ions [M+H] de um padro de 50 ng/mL para o Trimetoprima (m/z 291,1459), e de de ions [M-H]- de uma pdro de 50 ng/mL para o Diclofenaco (m/z 294,0096) e Bezafibrato (m/z 360,1009)
3:227.1075 (22.72)
2.0

11.577

(x10,000,000)

7.743

2:291.1459 (3.47) 4:294.0096 (100.00) 5:360.1009 (54.36)

8.313

(x10,000,000)

1.5

1.0

0.5

0.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0

Event#: 3 (E-) Ret. Time : 11.624 Scan# : 3559 Precursor : 227.1070

72

Inten. (x1,000,000) 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 100

227.1075

150

200

250

300

350

400

450

500

550

m/z

Figura 5.9: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Bisfenol A , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Bisfenol A
4:271.1702 (26.17)
2.0

12.843

(x10,000,000)

1.5

1.0

0.5

0.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0

Event#: 4 (E-) Ret. Time : 12.812 Scan# : 3935 Precursor : 271.1704

Inten. (x100,000) 7.5

271.1702

5.0

2.5

0.0 100

200

300

400

500

m/z

Figura 5.10: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Estradiol , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Estradiol

5:295.1702 (30.28)
2.0

12.590

(x10,000,000)

1.5

1.0

0.5

0.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0

Event#: 5 (E-) Ret. Time : 12.638 Scan# : 3881 Precursor : 295.1704

Inten. (x1,000,000) 1.00

295.1702
0.75 0.50 0.25 0.00 100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

m/z

73

Figura 5.11: (a) Cromatograma de ions [M-H]- de um padro de 50 ng/mL para o Etinilestradiol , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Etinilestradiol
11.561 12.606
12.0 12.5 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 10.5 11.0 11.5 13.0 13.5 14.0

3:227.1072 (16.54) 4:271.1707 (21.29) 5:295.1707 (24.17)

Figura 5.12: (a) Cromatograma de ions [M-H] de um padro de 50 ng/mL para o Bisfenol A (m/z 227,1072), Estradiol (m/z 271,1707) e Etinilestradiol (m/z 295,1707)
4:219.1759 (6.59)
7.5

21.042

(x1,000,000)

12.812

(x10,000,000)

5.0

2.5

0.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0

Event#: 4 (E-) Ret. Time : 21.067 Scan# : 6474 Precursor : 219.1754

Inten. (x1,000,000)

219.1759
1.5 1.0 0.5 0.0 100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

m/z

Figura 5.13: (a) Cromatograma de ions [M-H] de um padro de 50 ng/mL para o Nonilfenol mistura , (b) Espectro de massas [M-H]- para o Nonilfenol mistura
2:416.9917 (2.43)
7.5

21.901

(x1,000,000)

5.0

2.5

0.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0

Event#: 2 (E+) Ret. Time : 21.863 Scan# : 6720 Precursor : 416.9913

Inten. (x1,000,000) 1.5

416.9917(1)

1.0

b
500 550 m/z

0.5

0.0 100

150

200

250

300

350

400

450

Figura 5.14: (a) Cromatograma de ions [M+H] de um padro de 50 ng/mL para o Miconazol , (b) Espectro de massas [M+H]+ para o Miconazol

74

21.067

1.00

2:416.9914 (3.93) 4:219.1759 (16.23)

0.75

0.50

0.25

0.00 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0

Figura 5.15: (a) Cromatograma de ions [M-H] de um padro de 50 ng/mL para o Nonilfenol mistura (m/z 219,1759) e de de ions [M+H]+ de uma padro de 50 ng/mL para o Miconazol (m/z 416,9914)

Pelos cromatogramas apresentados, possvel observar a distino entre os picos dos diferentes compostos. O estradiol e etilestradiol sofrem coeluio, contudo, a distino entre as massas permite a quantificao destes compostos.

5.3.2 - Ajuste de curva analtica /Linearidade e faixa de trabalho

Neste trabalho, a padronizao externa foi empregada para a quantificao dos compostos de interesse nas amostras de esgoto. As solues de trabalho foram preparadas em metanol. Foi preparada uma soluo estoque 1.000mg/L para cada composto pela pesagem dos padres slidos. A partir das solues estoque foi preparada uma soluo 1mg/L contendo os nove compostos. As solues de trabalho foram preparadas pela diluio direta dessas solues de 1mg/L. Os modelos de calibrao utilizadas foram baseados em regresses quadrticas obtidas por padronizao externa, onde foram realizadas injees de sete replicatas dos padres nas concentraes de 5, 10, 30, 50, 100, 130, 200 e 250 g/L em metanol, para obteno das curvas analticas. Os ajustes das curvas/linearidade foram avaliados com base nos grficos de distribuio normal dos resduos e o coeficiente de correlao que segundo o INMETRO, um valor de r maior que 0,90 aceitvel. No estudo da linearidade dessa metodologia foram empregados para construo da curva de calibrao 6 pontos para o miconazol e 8 pontos para os demais compostos. Foram preparados 7 padres de cada ponto e injetados. As reas mdias obtidas para cada composto com o seu respectivo desvio-padro so apresentadas na Tabela 5.6.

21.901

(x10,000,000)

75

Os valores obtidos mostram uma pequena variao nas respostas das anlises de sete replicatas nas vrias concentraes dos padres dos compostos estudados. O desvio-padro em todas as concentraes est abaixo de 14 %, sendo, portanto aceitvel. Os intervalos de concentrao onde foi possvel o ajuste das curvas variaram de 5 a 250 g/L para os compostos estradiol, etinilestradiol, sulfametoxazol e trimetoprima; de 5 a 100 g/L para o miconazol e de 10 a 250g/L para os compostos bezafibrato e diclofenaco.

76

Tabela 5.6: rea Mdia e o desvio padro relativo (DPR) das sete repeties de cada concentrao dos padres da curva de calibrao
Conc. (ng/mL) 5,0 10,0 30,0 50,0 100,0 130,0 200,0 250,0 Sulfametoxazole rea Mdia 1.530.171 3.362.895 9.373.458 14.470.801 24.345.232 28.636.945 37.926.822 43.807.803 DPR(%) 8,4 12,6 12,7 9,9 9,1 8,5 6,7 5,1 Trimetoprima rea Mdia 11.572.208 22.580.276 49.334.756 71.415.297 128.044.825 158.285.115 203.541.649 227.153.675 DPR(%) 10,0 7,0 4,2 4,2 8,1 5,8 4,6 1,7 Estradiol rea Mdia 1.381.058 3.285.540 9.187.940 15.460.020 29.852.603 37.871.749 56.618.400 67.543.805 DPR(%) 13,2 8,3 9,5 3,6 2,0 3,1 2,7 2,4 Etinilestradiol rea Mdia 1.018.010 2.527.342 7.311.738 11.648.516 22.610.990 29.336.794 43.514.442 51.780.629 DPR(%) 13,1 5,1 8,5 7,3 2,1 3,3 3,5 2,3 Bisfenol A rea Mdia 2.863.294 4.494.955 10.309.818 15.611.910 26.245.075 31.751.669 45.788.496 55.063.437 DPR(%) 6,4 6,4 7,3 2,8 3,6 2,0 4,0 2,1

77

Tabela 5.6: rea Mdia e o desvio padro relativo (DPR) das sete repeties de cada concentrao dos padres da curva de calibrao
Conc. (ng/mL) 10,0 30,0 50,0 70,0 100,0 130,0 200,0 250,0 Diclofenaco rea Mdia 260.382 1.230.721 1.888.773 2.548.151 3.605.733 4.657.877 6.607.320 7.702.007 DPR(%) 12,6 10,1 13,6 7,5 5,6 6,9 3,9 3,5 Bezafibrato rea Mdia 883.683 2.578.828 4.066.343 5.778.971 8.229.485 10.212.385 15.019.022 17.947.231 DPR(%) 12,8 6,5 10,5 9,6 5,1 5,4 6,6 3,3 Conc. Terica (ng/mL) 5,0 10,0 30,0 50,0 90,0 100,0 Miconazol rea Mdia 9.141.812 17.865.560 37.274.910 50.085.023 61.464.383 67.833.722 DPR(%) 8,4 2,9 10,9 3,4 7,0 5,8 -

78

As curvas analticas foram obtidas relacionando as concentraes dos compostos estudados com as reas dos picos obtidos atravs de uma equao quadrtica. Os parmetros das equaes quadrticas e os respectivos coeficientes de correlao esto apresentados na Tabela 5.7. A Figura 5.16 exemplifica as curvas analticas obtidas.

Tabela 5.7: Parmetros das equaes das curvas analticas dos compostos estudados e seus respectivos coeficientes de correlao (Sulfametoxazol(SMZ), Trimetoprima (TMP), Miconazol (MCZ), Diclofenaco (DCF), Bezafibrato (BZF), Estradiol (E2), Etinilestradiol (EE) e Bisfenol A (BPA)

Compostos analisados SMZ TMP MCZ DCF BZF E2 EE2 BPA

a - 415,8194 - 2.278,037 - 6.024,822 - 41,6123 - 61,7254 - 186,6826 - 146,8259 - 243,0556

Parmetros da equao b c 271.625,80 1.449.933 1.202.588 41.668,76 87.380,42 318.443,10 245.123,10 267.592,70 981.172,90 6.361.271 5.109.965 - 94.684,26 - 23.384,9 - 78.963,91 - 85.325,04 1.895.709

r 0,99 0,99 0,97 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99

79

Estradiol
Area 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 0 50 100 150 200 Conc. 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0

Etinilestradiol
Area

50

100

150

200

Conc.

Bisfenol A
60000000 50000000 40000000
5000000

Diclofenaco
Area 7500000

Area

30000000 20000000 10000000 0 0 50 100 150 200 Conc.

0 0 50 100 150 200 Conc. 2500000

Sulfametoxazole
Area

Trimetoprima

40000000

30000000

20000000

10000000

0 0 50 100 150 200 Conc.

Bezafibrato
Area

Miconazol
Area

15000000

50000000
10000000

25000000
5000000

0 0 50 100 150 200 Conc.

0 0.0

25.0

50.0

75.0

Conc.

Figura 5.16: Curvas analticas dos compostos estudados.Concentrao em ng/L. 80

Segundo o INMETRO, valores de coeficiente de correlao (r) maiores que 0,90 so aceitveis, portanto, pode-se dizer que os valores obtidos atendem aos critrios exigidos, pois todos eles foram maiores que 0,99 com exceo do miconazol que apresentou valor de r = 0,97.

Alm do valor do coeficiente de correlao, a avaliao do ajuste da curva tambm foi feito com base no teste de normalidade dos resduos da regresso e grfico de resduos do sinal analtico. As figuras 5.17, 5.18, 5.19 e 5.20 exemplificam os resultados obtidos para os compostos diclofenaco e bisfenol A. Pode-se observar que o valor de p para os compostos est acima de 0,05 (nvel de significncia adotado) indicado assim que os dados seguem uma distribuio normal.

Diclofenaco
A nderson-D arling N ormality Test A -S quared P -V alue M ean S tD ev V ariance S kew ness Kurtosis N M inimum 1st Q uartile M edian 3rd Q uartile M aximum -53830 -39038 0,36 0,441 2610 214652 46075308099 0,214808 0,361735 58 -508168 -123164 -15897 116523 542097 59049 72251 262801

-400000

-200000

200000

400000

95% C onfidence Interv al for M ean 95% C onfidence Interv al for M edian 95% C onfidence Interv al for S tD ev 181468

95% Confidence Intervals

Mean Median -50000 -25000 0 25000 50000 75000

Figura 5.17: Grfico sumrio da estatstica bsica dos resduos com teste de normalidade de Anderson-Darling do composto diclofenaco

81

Figura 5.18: Grfico de resduos do composto diclofenaco

Bisfenol A
A nderson-D arling N ormality Test A -S quared P -V alue M ean S tD ev V ariance S kew ness Kurtosis N M inimum 1st Q uartile M edian 3rd Q uartile M aximum -58388 -202315 0,54 0,164 235851 1098720 1,20718E +12 0,07031 2,42535 56 -3263060 -428497 254844 857437 3800205 530090 594980 1350606

-3200000

-1600000

1600000

3200000

95% C onfidence Interv al for M ean 95% C onfidence Interv al for M edian 95% C onfidence Interv al for S tD ev 926302

95% Confidence Intervals

Mean Median -200000 0 200000 400000 600000

Figura 5.19: Grfico sumrio da estatstica bsica dos resduos com teste de normalidade de Anderson-Darling do composto bisfenol A

82

Figura 5.20: Grfico de resduos do composto Bisfenol A

5.3.3 - Limite de Deteco/Limite de quantificao

Os valores dos limites de deteco e quantificao da metodologia foram determinados pela relao sinal/rudo e esto apresentados na Tabela 5.8. Foram injetados padres em baixas concentraes at o limite de deteco do equipamento. Os valores obtidos para os limites de deteco e quantificao do mtodo foram calculados considerando fator de concentrao de 250 vezes, ndice de recuperao e efeito supressivo de amostras reais. Como os efeitos supressivos variam de uma amostra para outra, os valores encontrados esto descritos dentro de uma determinada faixa de variao.

Tabela 5.8: Limites de Deteco e Limites de Quantificao do Mtodo considerando limites do equipamento, correes de diluio, rendimento de extrao e efeitos da matriz Compostos Limite de Limite de Deteco (ng/L) Quantificao (ng/L) Sulfametoxazole 1,5-2,2 5,1-7,4 Trimetoprima 1,0-1,4 3,3-4,7 Miconazol 2,6-4,1 8,7-13,8 Diclofenaco 5,0-8,8 16,5-29,3 Bezafibrato 3,4-5,1 11,3-17,1 Estradiol 9,3 31,0 Etinilestradiol 12,4 41,3 Bisfenol A 1,2-2,1 4,0-7,1

83

Os limites de deteco e quantificao obtidos para alguns compostos mostraram-se inferiores a alguns outros estudos. Em um estudo realizado por Carballa et al, (2004) utilizando LC-MS/MS e ESI como fonte de ionizao, os limites de deteco e quantificao do mtodo obtido para o sulfametoxazole foram de 6,7 e 20 ng/L, respectivamente. Em outro estudo realizado por Kasprzyk-Hordern et al. (2008a), utilizando UPLC/MS e o ESI o limite de quantificao para bezafibrato encontrado foi de 94ng/L. Nesse mesmo trabalho, os limites de quantificao para a trimetoprima e o diclofenaco foram de 3ng/L e 17ng/L, respectivamente, valores prximos ao encontrado nesse trabalho. Para o bisfenol, a literatura reporta limites de quantificao em valores de 10 e 63ng/L (Trenholm, 2008; Kasprzyk-Hordern et al, 2008a) na matriz esgoto. Em um trabalho realizado por Vega Morales (2010), utilizando ESI e LC-MS/MS, o limite de deteco encontrado para o bisfenol foi de 5,5ng/L. Nesse mesmo trabalho, os limites de deteco para os compostos estradiol e etinilestradiol foram de 3,3 e 2,8ng/L respectivamente. J para o miconazol, a literatura reporta valores de 2ng/L em um trabalho realizado por Huang et al (2010) que tambm utilizou UPLC/MS e ESI.

5.3.4 - Preciso
A preciso pode ser obtida atravs da reprodutibilidade ou da repetibilidade. Neste estudo, foram utilizados testes de repetibilidade para verificar a preciso do mtodo. As amostras foram injetadas por um mesmo analista, no mesmo instrumento, sob as mesmas condies de anlise, mesmo local, em um curto intervalo de tempo. A Tabela 5.9 apresenta as reas mdias obtidas e o desvio-padro relativo referente s injees de sete replicadas de padres de 10, 50 e 100g/L.

84

Tabela 5.9: Resultados teste de Preciso

Compostos Sulfametoxazole

Trimetoprima

Miconazol

Diclofenaco

Bezafibrato

Estradiol

Etinilestradiol

Bisfenol A

Concentrao 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100

rea mdia 3.362.895 14.470.801 24.345.232 23.048.641 71.415.297 128.044.825 17.865.560 50.085.023 67.833.722 260.382 1.888.773 3.605.733 833.683 4.066.343 8.229.485 3.285.540 15.460.020 29.852.603 2.527.342 11.648.516 22.610.990 4.494.955 15.611.910 26.245.075

DPR 12,6 9,97 9,13 7,0 4,2 8,1 3,3 3,4 5,8 12,6 13,6 5,6 12,1 10,5 5,1 8,6 3,6 2,0 5,1 7,3 2,1 5,9 2,8 3,6

Segundo o INMETRO valores abaixo de 20% de desvio-padro relativo so aceitveis. Assim, de acordo com os valores determinados, o mtodo utilizado preciso, pois todos os compostos estudados apresentam desvio-padro relativo menor que 14%.

5.3.5 - Exatido

A exatido da metodologia foi avaliada atravs de um teste de recuperao feito em triplicata em amostras de esgoto. As amostras de esgoto foram fortificadas com os compostos sulfametoxazol, trimetoprima, diclofenaco, bezafibrato, estradiol,

etinilestradiol, bisfenol A e miconazol, para obteno de uma concentrao final de 100 ng/L. As amostras foram extradas conforme procedimento descrito no terceiro teste do item 4.1.3. Para os compostos sulfametoxazol e miconazol, as recuperaes foram obtidas atravs de um extrato nico obtido pela eluio dois cartuchos Strata SAX e 85

Strata X. O ndice de recuperao encontrado para o sulfametoxazole foi de 39,62,3 e para o miconazol de 33,62. A tabela 5.10 apresenta os resultados obtidos para o teste de recuperao em cada cartucho separadamente.

Tabela 5.10: ndice de Recuperao dos compostos estudados (concentrao de 100 ng/L) Compostos ndice de Recuperao (%) Cartucho Strata SAX Trimetoprima Diclofenaco Bezafibrato Estradiol Etinilestradiol Bisfenol A 29,21,9 26,77,9 17,32,6 35,45,5 23,29,5 24,99,0 Cartucho Strata X 38,55,5 19,96,8 38,36,1 8,06,5 6,68,5 37,65,5 SAX +X 67,7 46,6 55,6 43,4 29,8 62,5

A recuperao dos compostos variou de 17 a 35% no cartucho Strata SAX e de 6 a 38% no cartucho Strata X. A soma das recuperaes pela passagem das amostras nos dois cartuchos variou de 30 a 63% para todos os compostos. As recuperaes obtidas nesse trabalho esto de acordo com alguns valores de recuperao reportadas na literatura para amostras de esgoto para alguns compostos. Em um trabalho realizado por Kasprzyk-Hordern et al, (2007a) a porcentagem de recuperao encontrada para o composto bisfenol A foi de 32 a 41%, para o composto sulfametoxazol foi de 32 a 39%, para a trimetoprima de 53 a 69 % e para o bezafibrato 64 a 101%. J para o diclofenaco, foi encontrada uma porcentagem de recuperao mais baixa em relao ao presente trabalho de 14 a 26%. Para os compostos estradiol e etinilestradiol, as recuperaes reportadas na literatura so mais altas que as encontradas nesse trabalho. Vega-Morales (2010) reporta uma recuperao de 91 e 79% para os compostos estradiol e etinilestradiol, respectivamente, em matriz esgoto utilizando o cartucho BondElut Plexa. Castiglioni e colaboradores (2004) reportam uma recuperao de 92% para o estradiol e de 81% para os etinilestradiol utilizando cartuchos MCX tambm na matriz esgoto. Para o composto miconazol, a literatura reporta ndice de recuperao de 89% utilizando cartucho HLB e matriz esgoto

86

(Huang et al, 2010). Roberts e colaboradores (2006) reportam uma recuperao de 92% utilizando o cartucho Strata X e como matriz guas superficiais.

5.3.6 Avaliao do efeito da matriz nas respostas

Como visto no item 3.9, em matrizes complexas, como o esgoto, a anlise de compostos de interesse pode sofrer interferncia de outras substncias. Essa interferncia ocorre no momento da ionizao em decorrncia da competio no processo de ionizao, fazendo com que o sinal do analito em questo seja intensificado ou suprimido (Moreira, 2010). Este tipo de efeito foi observado por outros pesquisadores (Garcia et al (2011); Viglino et al (2011); Remane et al (2010); Kruve et al (2009); et al (2008c); Vieno et al (2006); Antignac et al (2004)). Na tentativa de minimizar este efeito, foram necessrias correes das reas encontradas de todas as amostras. O procedimento foi realizado adicionando uma quantidade conhecida de padro dos compostos de interesse para uma concentrao final de 30 ng/mL em todos os extratos da amostras. Assim a porcentagem de supresso foi calculada de acordo com a equao 4.1 e corrigida para cada composto. Devido ao fato das amostras serem diferentes, a intensidade do efeito matriz sofre variao de uma amostra para outra. Por esse motivo, as correes foram realizadas em todas as amostras. A Tabela 5.11 apresenta a porcentagem na variao dos sinais nas amostras de esgoto bruto analisadas em cada cartucho.

Tabela 5.11: Variao percentual nos sinais de cada composto nas amostras analisadas Compostos Sulfametoxazole Trimetoprima Diclofenaco Bezafibrato Bisfenol A Miconazol Variao no sinal (%)* Strata SAX -27,7 a 49,5 42,2 a 69,5 -9,4 a 79,4 -27,3 a 42,2 68,6 a 81,5 60,5 a 93,8 Strata X 68,3 a 82,7 18,6 a 86,5 30,4 a 58,5 -55,2 a 46,2 49,4 a 65,8

Nota: * Valores negativos - aumento no sinal * Valores positivos - supresso do sinal 87

5.4 - Aplicao da metodologia no monitoramento de amostras de esgoto

Aps o desenvolvimento da metodologia, foi realizado um monitoramento da ocorrncia desses compostos no esgoto sanitrio gerado pela regio metropolitana de Belo Horizonte e uma avaliao da eficincia de remoo desses compostos em sistemas simplificados de tratamento de esgoto. Um total de 12 amostras foi coletado de cada ponto de amostragem. Todas as amostras aps coletadas foram filtradas, extradas e analisadas conforme procedimento descrito no item 4.1.3 (terceiro teste). Os seguintes compostos foram investigados nas amostras: sulfametoxazol, trimetoprima, diclofenaco, bezafibrato, bisfenol A, estradiol, etinilestradiol, miconazol e nonilfenol mistura.

5.4.1 - Ocorrncia de frmacos e perturbadores endcrinos no esgoto bruto

Alguns compostos como os perturbadores endcrinos bisfenol A, o nonilfenol e o antibitico trimetoprima foram encontrados em todas as amostras. O perturbador endcrino nonilfenol, subproduto da degradao de alquilfenis polietoxilados foi apenas estimado devido ao fato de que h cerca de 550 ismeros de tal composto (Guenther et al, 2006), de forma que o nonilfenol detectado nas amostras de esgoto bruto e tratado refere-se a uma estimativa de concentrao baseada numa curva analtica de solues padro de uma mistura de ismeros. A Figura 5.21 mostra a variao das concentraes dos antibiticos trimetoprima e sulfametoxazol, do antilipmico bezafibrato, do antiinflamatrio diclofenaco, do antifngico miconazol e do perturbador endcrino bisfenol A nas amostras de esgoto bruto durante a campanha de coleta.

88

350 300

Concentrao (ng/L)

250 200 150 100 50 0

Trimetoprima

Sulfametoxazol

Diclofenaco

Bezafibrato

Figura 5.21: Concentrao dos frmacos e perturbadores endcrinos encontrados nas amostras de esgoto Os perturbadores endcrinos etinilestradiol (EE2) e estradiol (E2) foram raramente detectados nas amostras de esgoto bruto, sempre em concentraes inferiores ao limite de quantificao do mtodo, determinado em 12,4 e 9,3ng/L respectivamente. O fato de os hormnios natural (estradiol) e sinttico (etinilestradiol) no terem sido detectados no esgoto bruto que alimenta a ETE-Arrudas pode ser justificado pela razo de serem o estriol e a estrona as principais formas de excreo desses hormnios. Portanto, o estradiol pode estar presente em baixas concentraes no tendo sido detectado pelo mtodo. Estudos realizados por diversos autores encontraram em amostras de esgoto quantidades maiores da estrona comparada ao estradiol e etinilestradiol. Em um estudo realizado por Ternes e colaboradores (1999) foi encontrada a estrona na concentrao de mxima de 70ng/L e valor mdio de 9ng/L. J para o etinilestradiol a concentrao mxima encontrada foi de apenas 15ng/L e concentraes mdias na ordem de apenas 1ng/L. J para o estradiol foram encontradas mximas concentraes de 3ng/L, sendo o valor mdio no indicado. Outra hiptese para a no deteco desses hormnios nas amostras pode estar relacionada ao fato deles terem sido degradados durante o escoamento na rede e nos interceptores de esgoto da cidade de Belo Horizonte, nos quais estimasse um tempo mdio de percurso da ordem de 2 a 3 horas. Segundo Ribeiro et al. (2010) e Cajthaml et al. (2009) o hormnio estrona (E1) subproduto da degradao de estradiol (E2), sendo que a biodegradao do etinilestradiol (EE) envolve a formao de subprodutos ou conjugados hidroxilados (EE-OH). 89

Bisfenol A

Miconazol

Outra explicao para a baixa ocorrncia do etinilestradiol nas amostras de gua e esgoto analisadas em diferentes estudos pode estar relacionada baixa dose diria ingerida por mulheres que utilizam tal composto como anticoncepcional. Como exemplo cada drgea de Microvlar contm 0,03mg de etinilestradiol, de forma que a dose diria ingerida bem inferior comparada quelas dos antibiticos e antiinflamatrios. Plosz et al. (2010) tambm verificaram que a concentrao de estradiol e etinilestradiol ficaram abaixo do limite de deteco em todas as amostras de esgoto bruto analisadas na estao de tratamento de esgotos de Oslo, Noruega. Desbrow et al. (1998) reportaram concentraes de E2 em esgoto domstico que variaram de 1 a 50ng/L. Kim et al. (2007) apud Tambosi (2008) tambm encontraram baixa concentrao de etinilestradiol (1,3ng/L) e de estradiol (< 1,0ng/L) em amostras de esgoto bruto, sendo que a concentrao de estrona foi maior, variando de 2,2 a 36ng/L. Da mesma forma outros pesquisadores, de distintos grupos de pesquisa (Nie et al., 2009, Bruchet et al., 2002, Farre et al., 2007) verificaram que os hormnios estradiol e etinilestradiol foram apenas ocasionalmente detectados em amostras de esgoto bruto. Sendo assim, a degradao, ainda que parcial, dos hormnios estradiol e etinilestradiol, levaria a formao de subprodutos (Ex. estrona, estradiis hidroxilados) que no foram monitorados pelo mtodo de anlise desenvolvido nesta pesquisa. Uma vez que a presena de estradiol e etinilestradiol em corpos dgua provm basicamente do lanamento de esgotos, os dados obtidos neste estudo esto de acordo com os resultados de Moreira et al. (2009) e Moreira et al. (2011) que verificaram que tais hormnios foram detectados em poucas amostras de gua superficial do Rio das Velhas e outros mananciais da regio metropolitana de Belo Horizonte. Moreira et al. (2009) mostrou que, no ponto de captao da ETA-Rio das Velhas, em Nova Lima, os compostos estradiol e etinilestradiol foram encontrados apenas ocasionalmente em concentraes de 1,5 a 36,8ng/L e 3,0 15,58ng/L respectivamente. Por sua vez Moreira et al. (2011) detectaram o etinilestradiol em apenas 8 das 56 amostras de gua do Rio das Velhas analisadas, e em quantidades que variam de 5,6 a 63,8ng/L, ao passo que, o estradiol foi encontrado em apenas uma amostra. O antibitico sulfametoxazol foi encontrado em 92% das amostras. A concentrao mediana verificada no esgoto bruto para o sulfametoxazol foi de 13ng/L e 61ng/L para trimetoprima. Esses valores se encontram dentro das faixas reportadas por Andreozzi et al. (2003); Castiglioni et al. (2005), Kim et al. (2007), conforme reviso apresentada em Tambosi (2008). J Zucato et al, 2010 encontrou sulfametoxazol no 90

esgoto bruto da Itlia na concentrao de 246ng/L. J na Espanha a concentrao encontrada de sulfametoxazol por Carballa et al (2004) foi de 580ng/L. Nodler et al. (2010) detectaram entre outros compostos sulfametoxazol na concentrao de 509ng/L e trimetoprima, 681ng/L. Roberts e Thomas (2006) detectaram trimetoprima no esgoto bruto do Reino Unido em concentraes que variaram de 213 a 300ng/L. O medicamento Bactrim, uma associao da trimetoprima com o sulfametoxazole, um antibitico muito utilizado para o tratamento de infeces respiratrias, urinrias, gastrointestinais e outros tipos de infeces. A dose diria habitual de consumo da trimetoprima de 320mg e do sulfametoxazol de 1600mg. Considerando que 80 % e 30 % da trimetoprima e sulfametoxazole respectivamente, so excretados nas suas formas inalteradas (Kasprzyk-Hordern et al, 2008d), a quantidade excretada por dia por cada indivduo que faz uso dessa associao de antibiticos pode ser de 256mg para a trimetoprima e de 480mg para o sulfametoxazol. O antiinflamatrio diclofenaco tambm foi detectado em 92% das amostras na concentrao mediana de 100ng/L. Esse valor est dentro da faixa reportada por Kim et al. (2007) que variou de 8,8 a 127ng/L, e de 70ng/L reportada por Kasprzy-Hordern et al (2008a) mas inferior ao limite inferior das faixas 250 a 5450ng/L e 1200 a 1400ng/L respectivamente reportadas, de acordo com Tambosi (2008), por Andreozzi et al. (2003) e Gebhardt e Schroder (2007). Neste estudo o antilipmico bezafibrato foi detectado em 92% das amostras de esgoto bruto na concentrao mediana de 95ng/L, o que coerente com o estudo de Rosal et al. (2010) que verificaram concentraes de bezafibrato de 48 a 361ng/L (mdia = 141ng/L) no esgoto bruto que alimenta a ETE Alcal de Henares em Madri, Espanha. E tambm coerente com o reportado por Nodler et al. (2010) que detectaram esse composto na concentrao de 168ng/L em efluentes de esgoto tratado na Alemanha. Entretanto, outro estudo, tambm realizado na Espanha (Catalonia), reportou concentraes de bezafibrato afluente a trs ETEs variando entre 400 e 1.400ng/L (JELIC et al., 2011). Kasprzy-Hordern, et al (2008a) tambm reporta uma concentrao superior de bezafibrato no esgoto do Reino Unido, 971ng/L. Em relao ao antifngico miconazol, verificou-se neste estudo que ele foi raramente detectado ou quantificado no esgoto bruto. Somente 16,7% das amostras estiveram acima do limite de quantificao do mtodo, estimado em 3ng/L. As amostras quantificadas apresentaram baixas concentraes, sendo que a concentrao mxima encontrada foi de 13,9ng/L. Lindberg et al. (2010) realizaram um estudo em ETEs da 91

Sucia para avaliar a concentrao de seis antifngicos, dentre eles o miconazol. Todos os dados obtidos no estudo estiveram abaixo do limite de quantificao de 100ng/L, o que de certa forma mostra uma coerncia com o presente estudo, apesar do elevado limite de quantificao obtido por Lindberg et al. (2010). Huang et al. (2010) tambm reportaram baixa concentrao (31 ng/L) de miconazol em amostras de esgoto bruto na China, ao passo que Roberts e Bersuder (2006), analisando efluentes domsticos do Reino Unido encontraram concentraes mximas de 9ng/L de tal antifngico. Vale destacar que o miconazol um medicamento de uso tpico utilizado em baixas concentraes. Um paciente que faz uso desse medicamento utiliza em mdia 12mg por dia do miconazol. Se compararmos com a concentrao de dose diria de outros medicamentos pesquisados nesse trabalho como o bezafibrato (dose diria entre 400 e 600mg), diclofenaco (dose diria entre 100 e 200mg) sulfametoxazole (dose diria de 400 a 3200mg) e trimetoprima (dose diria de 80 a 640mg), veremos que a concentrao do miconazol deveria estar muito abaixo dos outros medicamentos o que poderia justificar a baixa concentrao desse composto nas amostras analisadas. Para o bisfenol A, a concentrao mediana encontrada no esgoto bruto foi de 165ng/L. Um amplo estudo realizado por Tan et al. (2007), o composto foi encontrado em amostras afluentes de cinco ETEs na Austrlia em concentraes variando entre 104 e 2.847ng/L. Adicionalmente, em pesquisa realizada na Itlia (Balest et al. 2008) foi observado a ocorrncia de bisfenol A no esgoto bruto em concentraes prximas s encontradas nesta pesquisa, variando entre 62 e 160ng/L. Entretanto, em outros estudos foram reportadas concentraes de bisfenol A no esgoto bruto em maior magnitude. Clara et al. (2005) encontraram concentraes afluentes em diversas ETEs variando entre 720 e 2.376ng/L, e recentemente Froehner et al. (2011) identificaram uma faixa de variao da concentrao de bisfenol A ainda maior, que variou de 970 a 88.310ng/L em esgoto sanitrio. Segundo Sodr et al. (2010) a concentrao mdia do bisfenol A encontrada nos esgotos gerados pela cidade de Campinas no estado de So Paulo de 8.600ng/L. J a concentrao desse composto nos esgotos gerados pela regio metropolitana de Belo Horizonte no estado de Minas Gerais, conforme verificado nesta pesquisa, se aproxima da concentrao mdia mundial reportada pelos autores. As diversas faixas de valores encontrados na literatura, resultantes de pesquisas em outros pases, mostraram a necessidade de mais estudos sobre o tema. Dessa forma, esta pesquisa teve carter de contribuir com a caracterizao do esgoto domstico em ETEs brasileiras, j que no nosso pas ainda existem poucos trabalhos de quantificao 92

desses compostos no esgoto bruto. As figuras 5.22, 5.23 e 5.24 ilustram alguns cromatogramas de compostos encontrados na amostras analisadas.

1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00

2:291.1449 (17.60) 5:360.0998 (18.41)

4.0

5.0

6.0

6.717

7.0

8.0

8.351

(x10,000,000)

9.0

10.0

Figura 5.22: Cromatograma de ions [M+H]+ do composto trimetoprima (m/z 291,144) e de ons [M-H]- do composto bezafibrato (m/z 360,0998) encontrados em amostra de esgoto bruto

3:227.1048 (100.00)
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 10.5 11.0

11.5

11.529

(x10,000,000)

12.0

12.5

13.0

13.5

14.0

Figura 5.23: Cromatograma de ons [M-H]- do composto bisfenol A encontrado na amostra de esgoto
2.5

3:219.1759 (4.24)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0

Figura 5.24: Cromatograma de ons [M-H]- do composto Nonilfenol mistura encontrado em amostra de esgoto bruto

20.965

(x10,000,000)

93

5.4.2 - Aplicao na avaliao da eficincia de remoo dos microcontaminantes pelos sistemas de tratamento de esgotos
A metodologia desenvolvida foi aplicada para quantificao dos

microcontaminantes em diversas etapas de tratamento de esgotos sendo possvel assim avaliar a eficincia de remoo dos microcontaminantes em cada etapa de tratamento. A tabela 5.12 apresenta os resultados encontrados de 5 microcontaminantes no esgoto bruto; sistema UASB 1 seguido pela Lagoa de Polimento e sistema UASB 2 seguido pelo sistema Wetlands. Os resultados esto apresentados em termos de mediana de um total de 12 amostras coletas no perodo de junho a agosto de 2010.

Tabela 5.12: Concentrao dos microcontaminantes em vrias etapas de tratamento de esgoto (n=12) Concentrao mediana (ng/L) Compostos Esgoto Bruto Sulfametoxazole Trimetoprima Diclofenaco Bezafibrato Bisfenol A 13 61 100 95 165 UASB 1 (TDH=5,4h) <LD 14 130 43 292 Lagoa de Polimento <LD <LQ <LD <LQ 271 UASB 2 Wetlands (TDH=11h) 6,8 38 91 54 166 <LD <LD 113 26 78

Em relao ao antibitico sulfametoxazol percebe-se na tabela 5.12 que todos os sistemas removeram, em termos medianos, praticamente toda carga de antibitico presente no esgoto bruto, sendo que apenas no sistema UASB-Lagoa o reator anaerbio foi decisivo na remoo de tal antibitico. Em relao ao antibitico trimetoprima, percebe-se na tabela 5.12 que os sistemas UASB-wetland e UASB-lagoa foram muito eficientes na remoo de tal frmaco. A tabela 5.12 mostra que o antiinflamatrio diclofenaco no foi removido eficientemente em nenhum dos dois reatores anaerbios estudados, indicando elevada 94

recalcitrncia e coerncia com o estudo de Kujawa-Roeleveld et al. (2008) que classificam tal frmaco como (semi)persistente. Dentre as modalidades de pstratamento estudadas, o sistema de lagoas de polimento foi eficiente na remoo do antiinflamatrio, com remoo mediana de 100% da carga de diclofenaco efluente do reator UASB. J o sistemas wetland, foi ineficiente na remoo mediana da carga efluente do reator UASB. A tabela 5.12 mostra que a eficincia de remoo do regulador lipdico bezafibrato foi, em termos medianos, de 42% no UASB 2 (TDH = 5,4h) e 53% no UASB 1 (TDH = 11h), indicando que o tempo de deteno hidrulica tem pouco efeito sobre a remoo de tal contaminante no UASB. A etapa aerbia aumentou a eficincia de remoo para 70% no sistema UASB-wetland; e para 100% no sistema UASB-lagoa. Em relao ao plastificante bisfenol A (tabela 5.12) percebe-se, para os dois sistemas de tratamento estudados, a ineficincia da etapa anaerbia na degradao de tal composto. Houve inclusive aumento, em termos medianos, da concentrao de bisfenol A no reator UASB 2, operado com o maior TDH (11h). Como o bisfenol A usado como inibidor de polimerizao durante a fabricao do PVC, possvel que tal composto seja lixiviado de tubulaes de PVC, especialmente as novas. O sistema UASB-wetland apresentou eficincia de aproximadamente 53% na remoo de bisfenol A, sendo que no sistema UASB-lagoa houve, em termos medianos, aumento na concentrao de tal contaminante em relao ao esgoto bruto. A figura 5.25 apresenta a variao da rea cromatogrfica do composto nonilfenol mistura presente nas amostras coletadas nos sistemas de tratamento investigados. Como discutido anteriormente o termo nonilfenol refere-se a uma mistura de ismeros que no puderam ser identificados e quantificados individualmente. Dessa forma, sua concentrao em cada sistema de tratameto foi estimada pela rea do pico cromatogrfico da mistura de ismeros desse composto.

95

Figura 5.25: Variao da rea cromatogrfica do composto nonilfenol mistura em cada sistema de tratamento investigado

A Figura 5.25 mostra que h produo de nonilfenol nos reatores anaerbios (UASB 1 e UASB 2). Isso ocorreu em funo da degradao dos alquil fenis polietoxilados (APEOs) presentes nas formulaes de produtos de limpeza. Como a degradao de alquil fenis em ambientes aerbios de cintica mais favorvel quando comparada a ambientes anaerbios, percebe-se uma tendncia de reduo de nonilfenol mistura nos sistemas lagoa e wetlands. Sendo o sistema UASB/lagoa mais eficiente para remoo do nonilfenol mistura.

96

6 - CONCLUSES
Neste trabalho, foi desenvolvido um mtodo analtico para o monitoramento ambiental dos perturbadores endcrinos (nonilfenol, bisfenol-A, 17 -etinilestradiol e 17- estradiol) e dos frmacos (sulfametoxazol, trimetoprima, bezafibrato, diclofenaco e miconazol) na matriz esgoto. O mtodo envolveu extrao em fase slida utilizando dois cartuchos seqenciais o Strata SAX e o Strata X e subseqente anlise utilizando LC/MS. O mtodo desenvolvido se mostrou eficiente na determinao dos compostos de interesse tendo em vista os parmetros de validao: preciso, especificidade, exatido (recuperao), limite de deteco e quantificao e linearidade. Os coeficientes de correlao (R) das curvas de calibrao foram maiores que 0,99 (exceto para o miconazol que foi maior que 0,97) apresentando boa linearidade do mtodo na faixa de trabalho que variou de 5 a 250 ng/mL. Foram obtidos baixos limites de deteco e quantificao que variaram de 1 a 12,4 ng/L e 3,3 a 41,3 ng/L respectivamente. O RDS da preciso intra-dia foi menor que 14% para todos os compostos em todos os nveis testados. Apesar das baixas recuperaes para alguns compostos, o mtodo apresentou boa preciso dos resultados mostrando exatido do mtodo. Apesar da existncia de tcnicas modernas de separao onde se pode obter alta seletividade e sensibilidade em termos de deteco para determinado analito presente em matrizes complexas como o esgoto domstico, o preparo de amostra ainda necessrio e constitui uma etapa importante da anlise. A utilizao do cartucho Strata SAX se mostrou eficiente para diminuio da concentrao do interferente LAS. O cartucho Strata SAX alm de diminuir a quantidade de LAS tambm foi capaz de reter os analitos de interesse. Os ndices de recuperaes conseguidos com esse cartucho foram baixos, no entanto apresentaram baixos coeficientes de variao. Mais estudos so necessrios, para avaliar a possibilidade de usar o cartucho Strata SAX como cartucho de clean-up, extrao e concentrao de analitos. Alm do clean-up de amostra realizado pelo cartucho Strata SAX, outras formas utilizadas para minimizar e corrigir os efeitos de matriz se mostraram eficientes como: melhoria das condies cromatogrficas e correes dos resultados pelas respostas de quantidades adicionadas dos analitos aos extratos. 97

A avaliao do efeito matriz constitui uma importante etapa da validao de mtodos quantitativos utilizando LC/MS. A exatido dos resultados de anlise est condicionada s correes dos rendimentos de extrao e do efeito supressivo da matriz que nesse trabalho foi realizado pelos clculos das taxas de resposta de padres adicionados nos extratos da matriz. O mtodo foi aplicado para determinao dos compostos em amostras de esgoto e para avaliao da eficincia de remoo em sistemas simplificados de tratamento de esgoto. Os perturbadores endcrinos etinilestradiol e estradiol foram raramente detectados nas amostras de esgoto bruto. A ocorrncia do perturbador endcrino bisfenol A e do antifngico miconazol no esgoto bruto foi similar a encontrada em outros estudos, sendo que o miconazol foi raramente detectado ou quantificado. J em relao aos outros frmacos estudados (sulfametoxazol, trimetoprima, diclofenaco e bezafibrato), foi verificada de um modo geral, uma menor ocorrncia no esgoto bruto quando comparada com outros estudos. O Brasil, assim como em outros pases, no possui nenhum parmetro de regulao dos perturbadores endcrinos e frmacos em guas utilizadas para consumo, e nem para o descarte seguro desses compostos pelas ETEs. Uma avaliao criteriosa das quantidades desses compostos capazes de afetar organismos aquticos e a sade humana necessria. Posteriormente devero ser estabelecidos limites de concentrao seguros para descarte de efluentes domsticos tratados em corpos receptores. A avaliao da remoo desses compostos pelos sistemas de tratamento convencionais de efluentes domsticos das ETEs de grande importncia para se conhecer sua eficincia em termos de remoo desses microcontaminantes j que esses sistemas no foram projetados para tal fim.

98

7 - PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS

Sero apresentadas nos tpicos a seguir, algumas sugestes para novos trabalhos envolvendo a ocorrncia de frmacos e perturbadores endcrinos no meio ambiente:

Aprimoramento dos procedimentos analticos como desenvolvimento de novos procedimentos de extrao e clean-up de amostra objetivando obter extratos mais livres de interferentes, na tentativa de minimizar o efeito matriz;

Utilizao de outras fontes de ionizao como o APCI para avaliar a ocorrncia do efeito matriz em outras fontes de ionizao; Avaliao de outros compostos que podem estar presentes no esgoto estudado mas, que no foram contemplados neste trabalho como outros frmacos (especialmente outras classes de antibiticos), drogas ilcitas, produtos utilizados em cosmticos e produtos de higiene pessoal que esto classificados como perturbadores endcrinos mas no so contemplados nas legislaes ambientais. E tambm pesquisa dos metablitos desses compostos que tambm esto presentes no meio aqutico, assim como seus efeitos toxicolgicos a organismos aquticos e sade humana;

Monitoramento da ocorrncia desses e outros microcontaminantes em guas residurias, guas superficiais e subterrneas brasileiras visto que poucos monitoramentos foram realizados no Brasil;

Realizao de mais estudos ecotoxicolgicos e toxicolgicos para se conhecer melhor os efeitos provocados aos organismos aquticos e sade humana pela exposio crnica aos compostos estudados nesse trabalho.

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8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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