INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURIVEGETALE Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a biotehnologieiîn viaţa omului, în toate

domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-aufăcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu însuşirifavorabile şi cu randamente sporite faţă de materialul de la care s-a plecat.Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organismeunicelulare. Odată cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunileacumulate anterior erau valabile şi dacă existau şi alte procese specifice modului complex deorganizare. Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să segândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar celule. Problemacare a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de la prelevarea de pe plantamamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe până la regenerarea(refacerea) unei noi plante.Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi multe cercetări, la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat.În 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizeazăsubstanţele ce determină formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primeleîncercări de culturi de ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire, fărărezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să apară din anul1922, când Knudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in vitro Iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale.Pe baza conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţineinformaţia genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, înanul
1

1952 Morel şi Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe mediiaseptice a explantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze.În acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritmimposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitându-se şi degenerarea soiurilor din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.În anul 1962, după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit săelaboreze un mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate fiutilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi.Reuşita experienţelor lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor dinmezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producereade hibrizi somatici.Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a cercetărilor privind culturade explante vegetale in vitro. Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea detehnici eficiente în generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmiţătoride gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.Atât pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro suntfolosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicareaspeciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetică.

2

Astfel. fibrele libero-lemnoase. părţi deorgane. prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale.Totipotenţa. Acest aspect este explicat chiar prin faptulcă întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai multe plante . Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă. o parte din celule îşi 3 . iar pe de altă parte gradului mare despecializare al acelor celule.Explantul. numit şi inocul. la carelipseşte citoplasma şi nucleul.neoplantule). sclereidele. a unor organe. sau poate formacalus. datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii. prinstimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii. odată cu înaintarea în vârstă. încondiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi.Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor. de exemplu: traheidele. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi estevizibilă în momentul în care explantul creşte. este însuşirea celulelor vegetale de a se divide. CARACTERIZARE ŞIAPLICABILITATE 1. şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediuartificial de cultură. ţesut. s-a demonstrat practic că.plantă matură. celulă) care sedesprinde de pe planta donor (planta mamă). Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. celulele specializate careconstituie ţesuturile. DEFINIŢIE. ţesuturi sau celule vegetale.1.La plantele cormofite. nu sunt totipotente. este porţiunea de plantă (organ. de a se reproduce şi de aforma o plantă identică cu planta mamă. într.CULTURILE IN VITRO 1. etc. însă în practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter. Definiţie În sens general. prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor.

Rămân.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiţională.asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro . au vacuolămică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică. având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noicelule. poligonale. anumite zone în careactivitatea celulelor este intensă. pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectateurmătoarele condiţii:-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului. în funcţie de cerinţele acestora şi scopulurmărit. 4 . 1. deordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule. soi şi fază de creştere. protoplaşti).Din acest motiv. prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor. fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini. -asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosimea plantelor. sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură.pierdcapacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. însă. Aceste celule sunt mici în dimensiuni. explante care în condiţiinormale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şisintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. umiditate) în limiteleoptime pentru fiecare specie. la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici. lumină. altoi). folosind instrumentar sterilizat prin flambare. formând ţesutul cudenumirea de meristem. prin dezinfecţiamaterialului vegetal. butaşi.-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizareacorespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere. unde se operează cu seminţe sau porţiunimari de plantă (marcote. precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril. bogate în citoplasmă.

-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro . se asigură o multiplicare exponenţială. hibrizi sau clone valoroase pornindde la cantităţi mici de material vegetal.-se evită efectul sezonier de pepinieră. În agricultură. silvicultură. culturile de ţesuturi şi celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii. prin cultura de polen.etc. princare în circa 6 luni se pot obţine 1 milion de plante.-selecţia de plante rezistente la stres. Teoretic. antere sau alte explante de ţesuturigenerative (cu n cromozomi). dintre care amintim:-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri.-asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenziferme de multiplicare. pentru obţinerea de metaboliţisecundari.-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme.-se pot obţine seminţe artificiale.Avantajele culturii in vitro sunt multiple. soiuri sau clone valoroase.-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire. precoce şi productiv. industria alimentară. farmacie.Cu toate aceste avantaje.deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura peverticală pe 3-5 nivele suprapuse.1. suntutilizate în prezent în agricultură. există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care.Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea înmasă a plantelor. material mai viguros. boli şi dăunători.-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normalede cultură. hibrizi careîn condiţii normale sunt imposibil de obţinut. în general şi în horticultură în special. cum ar fi:-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate 5 .3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitroau răspuns afirmativ. industria uşoară.-obţinerea de plante haploide. pentru conservarea germoplasmei horticole. pentru ameliorareaspeciilor cultivate.

ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire.-utilizarea fitohormonilor.-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive. protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). şi la orhidee meristemeledezvoltă.-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri. de asemenea. care nu răspundla metodele cunoscute de multiplicare. Se pare că citochininele sunt implicate.Cultivarea organelor reproductive in vitro. însă uneori sunt necesare mai multesubculturi pentru a obţine aceste efect.-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro . Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplincunoscute. Rejuvenilizareaobservată este deseori obţinută din prima subcultură. s-au observat fenomene similare la meristeme.Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă. Se pare că schimbările ce apar în ritmul defuncţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro .Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmaticesau datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării denoi celule. 6 . în cultura in vitro .indispensabileactivităţilor de micropropagare.La culturile in vitro . cel puţin parţial. în acest proces. Prima frunzuliţăce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie arecaracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă. cu afectarea autenticităţiisoiurilor. se poate realiza cu succes atunci când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. în funcţie de specie.dar rezultatele sunt în general slabe sau incomplete. care sunt costisitoare. creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie. După mai multe altoiri altoiulîncepe să prezinte caracterele juvenile. dar ele nuacţionează singure.

Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare sediminuează.La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante‖ la cultura in vitro . De aceea. nu e surprinzător faptulcă explantele. în special dacă sunt excizate în perioada devegetaţie. pentru o perioadă scurtă. unui tratament cutemperaturi scăzute.2.Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. pentru realizarearejuvenilizării se poate supune planta mamă. au eşuat atuncicând s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri învegetaţie.De-a lungul unui ciclu anual. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atuncicând sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie. unui regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentrumodificarea echilibrului lor intern în vederea stimulării rizogenezei. vor darăspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu. echilibrul intern al plantelor se schimbă. După tipulde organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare douăcazuri: 7 . prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei. dar au avut succes atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguridorminzi. iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii.Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poatedistinge un stadiu activ şi unul lent. între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel. 2.giberelinelor şi citochininelor.De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vederemicropropagarea speciilor lemnoase.1. Primăvaraorganele cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor. latent. ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase. primele experimente. când concentraţia de auxină este maximă.

cum ar fi fragmente de tulpină. Dar. flori şi fructe. ovule). s-a dovedit că toate părţile plantei suntcapabile să urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. cum ar fi violetele de Parma. la care rezultatenotabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii. limb.Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica celmai des folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii. stamine.sunt capabile să regenereze din toate părţile plantei (peţiol. inoculate pe mediu de cultură. polen. organe). meristemelor şi apexurilor florale.La mai multe plante la care corelaţiile de creştere sunt puternice. cum ar fi Actinidia sinensis . Unele specii sunt total recalcitrante.Pentru aceste explante.generând cu uşurinţă. generând calus.frunze. în funcţie de specie. iar la unele conifere s-areuşit obţinerea de propaguli doar din 8 . explantele provenite dinramuri laterale au generat plante cu rădăcini. acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. rădăcini. cărora. deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme. diferenţele între specii sunt uriaşe. sunt cele mai utilizate pentru iniţiereaunei culturi de ţesuturi.2.în acest caz. structuri organizate (deexemplu.nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele amintite. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această „memorie‖aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi.Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului decreştere ce l-au prezentat in vivo . li se induce o reversie completăcu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din noucapacitatea organogenică. petale. alte specii sunt mai recalcitrante. cum e cazul mugurilor. sub forma unor planteculcate la pământ şi nu erecte.apexurilor caulinare.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată. în condiţiile unui mediu de cultură adecvat. dar de tipul lianelor. Dacă mediul de cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantuluişi conduce la dediferenţierea celulelor.

dinfragmente de limb foliar şi tulpini tinere. peste această dimensiune. însă în detrimentul eliminării virusurilor. a mai multefragmente de peţiol de Saintpaulia . s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale.Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal. sau în cazul diferenţierii axilare. În cazul explantelor de dimensiuni micidirecţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor.5. Cu câtexplantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şimediul de cultură va avea o influenţă limitată. şi anume la regulatorii de creştere existenţi. deoarece explantul este receptiv lasubstanţele din mediul de cultură. pe când în cazulfragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii endogeni. parenchimmedular. Fragmentele de 1. la cele mai multe specii. Cel mai 9 .Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm. fasonării şiinoculării acestora. 3. cele mai bune rezultate au fost obţinute. iar altele au format doar rădăcini. ceea ce corespunde uneimanipulări uşoare a materialului vegetal. de 1. un apex sau un mugure (solzii protectori sunt înlăturaţi).În general. există o mărime minimă ce conţine domulmeristematic cu două primordii foliare. fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favorizacreşterea. va bloca creşterea apicală. Sub această mărime supravieţuirea explantului estefoarte dificilă şi pierderile sunt mari. Fără îndoială.cotiledoane. în ultimul caz. De exemplu. Pentru meristemele cetrebuie să aibă dimensiuni foarte mici. răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun . auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol. sub aspectul excizării sau prelevării.2 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. cortical. dar şi răspunsurile vor varia. prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură.5 mm au generat două tipuri derezultate: unele explante s-au veştejit. 2.Explantele organizate cuprind în general un nod. 5 şi 7 mm.

Parenchimul medular este ţesutul cel mai puţin regenerant.Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă de asemenea rezultate bune. atunci când se iniţiază o cultură in vitro estemenţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. 2. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor. fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu. Deseori se poate observa.mai ales a celor ce vin în contact directcu mediul de cultură.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ Prima problemă ce trebuie rezolvată.oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Acestexperiment confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor dedimensiuni reduse. celulele moarte pot diminua sauanula schimburile dintre explant şi mediul de cultură. cum e cazul protoplaştilor izolaţi mecanic sau enzimatic.Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă.Odată 10 . calusogenic sau reproductiv. dar rămân deseori înstadiul de calus. cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).05%). Mai mult.regenerativ tip de ţesut este cel epidermal.dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerăriispre stadiul caulogenic (lăstari). Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante. care afolosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi citochinine. o brunificare a celulelor. deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersiaexplantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de0. un exemplu fiind dat de Skoog. imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură aunor substanţe adsorbante sau detoxificante.5 % respectiv 0. rizogenic (rădăcini). aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii de creştere.după fasonarea explantului.

4. După formareacalusului. imposibil de realizat în alte condiţii. garoafe) sau pe două medii succesive. serveşte ca mediu de înrădăcinare ( Actinidia . măr. la speciile lemnoase. îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici. ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se formează primafrunzuliţă. 2. a mediilor de 11 .După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza explantelor. indică existenţa unuidezechilibru între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. de a realiza culturi de protoplaşti. permite unele manipulări genetice (fuziuni celulare. în funcţie denatura sa. Explante cu structură rudimentară Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode. acidul indolilacetic). mai ales. numeroase specii lemnoase). apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). în direcţia dorită de operator. deoarecedacă acest calus creşte în dimensiune. ceea ce deseori se întâmplă. transfer de gene). foarte rar se pot adăuga şicitochinine. Primulmediu va iniţia creşterea. Al doilea mediu. Practicarea culturii in vitro presupune existenţa unui spaţiu amenajat şi echipat în acest scop. putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu unnod (microbutăşire).Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură afitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor. Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele speciiornamentale (crizanteme. a unor vase din sticlă sau material plastic. Cultura plantelor superioare in vitro Posibilitatea de a cultiva celule izolate şi. întotdeauna într-o doză foarte mică.rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului.

cum sunt hipocloritul de sodiu sau calciu. - chimice. Sterilizarea se poate realiza prin două tipuri de metode: - fizice. sursele de infecţie pot fi: - aerul. clorura mercurică. aer uscat fierbinte (180°C) ori iradierea (raze ultraviolete sau gamma) . care vehiculează pe piele sau prin aerul expirat numeroase microorganisme. instrumentelor şi materialului biologic adecvat.22 microni. Huang (1982).metode care distrug microorganismele .sau efectuând filtrarea sub presiune. vaselor de cultură. ţesutul vegetal. bacteriile şi ciupercile invadează culturile in vitro într-un timp foarte scurt dacă nu se asigură asepsia spaţiilor de transfer. organe sau plante. După J. ţesuturi. sub formă de celule. la suprafaţa căruia se pot găsi ciuperci şi/sau bacterii. desigur. Asepsia (absenţa microorganismelor) este o condiţie sine qua non a reuşitei fiecărei culturi in vitro. a materialului biologic. care conţine o mare cantitate de microorganisme sub formă de spori. care constau în tratamente cu compuşi sterilizanţi. alcoolul. mediului. Pentru funcţionarea eficientă a unui laborator de culturi in vitro. folosind vapori de apă sub presiune (121°C). care elimină microorganismele al căror diametru depăşeşte 0. Deoarece mediile nutritive folosite cu această ocazie le oferă condiţii foarte bune de dezvoltare. amenajate şi echipate corespunzător pentru executarea următoarelor activităţi: 12 .cultură adecvate şi. diversele produse bactericide şi fungicide. este nevoie de spaţii repartizate. corpul uman.

dulapuri climatizate. microscoape inversate. aparate pentru distilat şi demineralizat apa.►prepararea ►pregătirea. prin spălare şi sterilizare. orizontal sau vertical. balanţe de precizie (0. culturilor. mese cu flux de aer laminar. congelatoare. mediilor de cultură. pH-metru. ►iniţierea şi transferul culturilor. maşini de spălat sticlăria. Dotarea minimă a unui asemenea laborator include: - lupe binoculare. 13 . etc.27°C) şi ►incubarea fotoperioadă. frigidere.0001 g).01 g) şi analitice (0. în condiţii de temperatură controlată (17. ►depozitarea sticlăriei. mediilor nutritive. a sticlăriei necesare pen tru prepararea mediilor şi realizarea culturilor. substanţelor chimice. autoclave. etuve pentru sterilizat sticlăria..

spaţiul destinat spălării şi sterilizării trebuie echipat corespunzător. distilată şi bidistilată. pipete. baloane cotate. cât şi sterilizarea acestora la 121°C. folosite în mod curent pentru ambalarea alimentelor. Vasele din sticlă utilizabile atât pentru prepararea mediilor cât şi pentru cultură sunt cele existente în cele mai multe laboratoare: baloane Erlenmayer.Cultura in vitro poate fi practicată în vase de sticlă sau din material plastic de forme şi mărimi diferite. se recurge însă şi la borcane din sticlă obişnuită. Sticlăria uscată se sterilizează prin expunerea la aer 14 . E„ 2001). se recomandă folosirea celor confecţionate din sticlă Pyrex sau borosilicat (Badea. absolut adaptate cerinţelor. Din această cauză. Calitatea materialului face posibilă atât confecţionarea unor recipiente foarte variate ca formă şi dimensiuni. Pregătirea sticlăriei ocupă un loc important în activitatea unui la borator de cultură in vitro. deoarece prezintă numeroase avantaje. Vasele de cultură din sticlă nu trebuie să elibereze cationi toxici. ca şi cu diferite tipuri de etuve. Din această cauză. pahare Berzelius. vasele de cultură din material plastic au început să înlocuiască vasele de sticlă. în laboratoarele comerciale. cilindrii gradaţi. Vase de cultură şi sticlărie de laborator Deşi scumpe. cu surse de apă deionozată. Figura 12. vase Petri.

Celulele şi ţesuturile cultivate in vitro nu sunt autotrofe. Zn. Ni. filtrată. Mo.. deionizată. 2001). etc. E. Mn. Diferiţi cercetători au studiat cerinţele de elemente minerale ale ţesuturilor cultivate şi au elaborat medii cu compoziţii bine definite care le poartă numele: White. la care se adaugă uneori. Apa folosită pentru prepararea mediilor trebuie să fie purificată. Componenta anorganică a mediilor de cultură in vitro include elementele esenţiale pentru creşterea plantelor. timp de 15 -20 de minute. S. Medii de cultură in vitro Un mediu de cultură in vitro are o componentă anorganică. Ca) microelemente (B. Fe). Toate elementele sunt incluse în mediu sub formă de săruri. Cu.4. distilată. acestea se împart în: - macroelemente (N. Mg. constituită din săruri minerale şi o componentă organică. O serie de alte materiale (filtre.fierbinte (180°C). adică nu sunt capabile să sintetizeze carbohidraţi prin asimilarea CO 2 în timpul fotosintezei. Componenta organică. apă distilată. aluminiul şi nichelul. în etuve. ce include carbo. la 121°C (Badea. Nitsch. timp de 2-3 ore. Gamborg.2. în mediile în care sunt cultivate trebuie 15 . Al. dopuri din bumbac sau tifon) se sterilizează prin autoclavare (cu vapori de apă sub presiune). Schenck şi Hildenbrandt. capace din material plastic. Murashige şi Skoog. I. vitamine şi substanţe reglatoare ala creşterii. este agarul. în funcţie de cantităţile care se găsesc în diferitele formule de mediu. P. Mediile folosite pentru culturi statice conţin şi un agent gelifiant. alese îndeosebi după criteriul solubilităţii. K.1.hidraţi. care de obicei. Din această cauză.

4 diclorofenoxiacetic) . Mai precis.. formarea căluşului fiind indusă numai de auxine (Gegenbach.sunt folosite în concentraţii de 0. absenţa sau insuficienţa unor vitamine constituie tot atâţia factori limitativi ai creşterii. Se mai utilizează biotina (H). Fitohormonii orientează procesele de dezvoltare in vitro.. 1995).0 mg/l.kinetina.1-5. ele induc alungirea intemodurilor şi creşterea meristemelor. M. embriogeneza şi calusogeneza. 1975). m-inositolul. Au fost semnalate însă şi cazuri în care răspunsurile culturilor in vitro la apprtul de fitohormoni în mediu nu au fost cele aşteptate.1-10.0.sunt adiţionate în mediu în cantităţi ce oscilează între 1 şi 10 mg/l. 2IP (2 izopentenil adenina) şi zeatina .proliferarea mugurilor axilari şi organogeneza. riboflavina (B2) şi.3%. AIB (acidul indolil butiric). frecvent.se folosesc în mod frecvent.0 mg/l. la unele specii lăstărirea axilară este favorizată de prezenţa auxinei în cantităţi ce depăşesc nivelul citochininei. acidul folie (M).1-1. BAP (benzii aminopurina).introdusă zaharoză.4-D (acidul 2. De exemplu. acidul pantotenic. piridoxină (B6) . s-a constatat că. Citochininele . tipul de morfogeneză dintr-o cultură depinde de concentraţiile auxinelor şi citochininelor şi de raportul dintre aceste categorii de hormoni. De asemenea. Dintre cele cinci clase de reglatori de creştere (fitohormoni sau hormoni vegetali) existenţi în plante. Auxinele .0 mg/l. directă sau indirectă. 16 . Giberelinele nu sunt esenţiale pentru cultura plantelor in vitro. In culturile de celule sau de ţesuturi in vitro. deoarece induc ieşirea din latenţă. ANA (acidul naftil acetic) sau 2. drept pentru care în mediile de cultură se adaugă în mod curent tiamină (B1) . se folosesc frecvent pentru germinarea embrionilor. In general. o valoare mare a raportului auxină/citochinină favorizează rizogeneza. într-o concentraţie de 2. De exemplu. numai două .0 mg/l.auxinele şi citochininele . cholina. B.AIA.0. acid nicotinic (PP) . Mult mai rar se recurge la gibereline şi extrem de rar la acidul abscisic (Schrott.0. iar o valoare mică .01-10.

025 0.025 CaCI 0.75 0.25 0.2 ZnS04.05 0.2H70 440 0 ? 2PO4 NH4H MgS04.3 MnS04. L.7H20 27.8 37.H 1962) CaCI?.025 100 100 10 10 30000 Schenk şi Hildebran dt (1972) 2500 200 300 400 15 20 13.5H20 0. tipul de cultură şi implicit de explant. De exemplu.5 0. explantele care sintetizează auxina nu mai necesită adiţionarea în mediu a acestui hormon pentru alungirea şi/sau diviziunea celulelor (Wess.2 5 1 1 0.025 H22.1 0.H2 kh.5 5 0.6 Kl 0.3 H3BO3 6.3 13.25 CUS04.5 2 20000 Bs Gamborg 2500 (1976) 134 150 250 27.83 Na?Mo04.1 Thiamina Piridoxina 0.8 0 Na2EDTA 37.5 5 30000 mediului (Murashige Săruri minerale KNO3 şi 1900 Skoog.5 Acid 0. determină tipurile şi concentraţiile hormonilor ce vor fi folosiţi.2 0.4H?0 22.8 37. pot exista următoarele tipuri de culturi: 17 .25 0.7H20 8.H20 370 NaH2P04.6H 0 20 Vitamine m-lnositol 100 0. Din acest punct de vedere. 2000).Tabelul 4 Compoziţia celor mai importante medii folosite pentru cultura in vitro Compoziţia MS Nitsch (1972) 950 720 220 185 150 68 27.3 25 10 10 0.2 0.025 100 0.po4 170 FeS04 . NH4NO3 1650 (NH4)?S04..5 HCI Biotina HCI Acid folie nicotinic Glicina 2 Zaharoză 30000 De obicei.1 100 5 0.2 3 2 0.

Celulele cultivate sunt capabile să sintetizeze toţi aminoacizii necesari. iar prin răcire sub 40°C formează un gel transparent. de la o sursă la alta. substanţe chimice pure şi o atentă dozare a tuturor componentelor. Creşterea in vitro poate fi stimulată şi prin adăugarea în mediul de cultură a unor extracte organice. extracte de drojdii. poate favoriza creşterea. Este o etapă esenţială. cât şi de citochinine. apă de calitate corespunzătoare. marcă şi pH. endosperm lichid din nuci de cocos. Concentraţia agarului în mediile de cultură in vitro este de 5-10 g/l.este cel mai folosit agent de gelificare a mediilor de cultură.chefia din nou. de cartof şi tomate. mai mult sau mai puţin solid. Totuşi. puritate. separat sau în amestecuri. nevoie numai de auxine. includerea unor aminoacizi în mediul de cultură. erorile de preparare a mediului de cultură fiind printre cauzele majore ale eşecurilor. în funcţie de concentraţie. pentru a se li. dar odată gelifi. 18 .cată. hidrolizate proteice. etc.- culturi care nu culturi care au culturi care au necesită nici un hormon. deoarece se dizolvă în apă la 90°C. deoarece constituie o sursă de azot mai accesibilă celulelor decât aportul de azot anorganic. limitează însă folosirea acestor extracte la cazurile în care nu au fost obţinute rezultate pozitive cu medii definite chimic.un polizaharid extras din algele genului Gelidium . Prepararea mediului de cultură necesită sticlărie curată. culturi care au nevoie atât de auxine. trebuie reîncălzită (la microunde sau în bain-marie). pipetată. Marea lor variabi.litate. Soluţia de agar poate fi turnată. nevoie numai de citochinine. Agarul .

Mediile şi apa distilată pot fi autoclavate la 121°C şi un timp variabil în funcţie de volum: 20 de minute pentru volume de 20-50 ml.5. antibioticele. Prin filtrare. şi Gibco Inc. GA3). din S.C.. - din soluţii stoc. - cântărind. păstrate în frigider. de zece sau de o sută de ori mai concentrate (în funcţie de solubilitatea substanţei şi de concentraţia finală în mediul de cultură). Soluţia sterilizată se adaugă în mediul de cultură care a fost autoclavat şi răcit (la 45-50°C). se sterilizează vitaminele.0 şi 6. 25 de minute în cazul volumelor de 250-500 ml şi 35 de minute pentru volume de 500-5000 ml.sterilizare. 19 . la 4-5°C. din Scoţia).Mediile de cultură se pot prepara astfel: - din amestecuri de săruri.A. Unitatea filtrantă se sterilizează prin autoclavare. ataşate la o seringă ce conţine lichidul. Flow Laboratory. se ajustează valoarea pH la cote cuprinse între 5. Biological Inc. se pot folosi fi ltre la care se adaugă membrane filtrante standard existente pe piaţă. filtrul se ataşează la un vas colector. Pentru volume mai mari. enzimele. unii hormoni (AIA. aminoacizii. Volumul de lichid trebuie să conţină cantităţile prevăzute de reţeta pentru soluţia finală. prin filtrare sub presiune pozitivă.U. după adăugarea zaharozei şi a hormonilor termostabili. Presiunea nu trebuie să depăşească 1 atmosferă. extractele vegetale. înainte de . preambalate (producători: K. iar cea a componentelor termolabile. sub formă de pudră. Se pot utiliza filtre de unică folosinţă. una câte una şi dizolvând sărurile prevăzute în reţeta tipului de mediu dorit. cu o pipetă sterilă. pentru a nu favoriza descompunerea zaharozei sau a altor componente. în asemenea cazuri. Sterilizarea componentelor termostabile se face prin autoclavare.

cu apă distilată sterilă. Din această cauză. Există însă 20 . distilată de minute Pregătirea materialului vegetal presupune eliminarea timp de 1 bacteriilor. materialul vegetal provenit din câmp este extrem de greu de sterilizat.1%). se recurge frecvent la obţinerea lui în laborator. minute soluţie de timp de 20-30 cu apă HgCfe (0. asigurându-se un mediu aseptic încă din faza de germinare.spălarea De obicei. de Posttratame Trei spălări nte cu apă m ti m distilată sterilă m jj ― ―w" curentă. Un protocol standard de sterilizare include următoarele etape: . contaminările devin vizibile după 7 -10 zile.imersia cu apă curentă. ştergerea cu timp soluţie dede de 10 minute Organe vată Spălarea Imersia în îmbibatătimp în alcool NaClO (2%).Tabelul 5 Tratamente aplicate pentru sterilizare Orga Semin nane ţe Fruct r e.spălarea . timp Imersia în NaClO 20-30(2%). . minute de reîndelungat cu apă (70%) Ştergerea fetei curentă superioare cu alcool (70%) ’ Frunz zervă e soluţie de de timp de 5-30 Imersia în Şase spălări NaClO (2%). sterilă ciupercilor şi altor microorganisme. fără a afecta însă integritatea materialului vegetal. într-o soluţie sterilizantă (hipoclorit de sodiu sau de calciu). toate acestea necesitând minut o sterilizare de suprafaţă completă. în general. Tulpi flori na Pretratamente Tratamente imersia în alcool (70%) Imersia în timp de 10-20 de Spălarea cu vată secunde îmbibată în alcool Spălarea cu apă (70%) soluţie de Imersia în Ca(CIO) 2 soluţie de de (10%).

Tot aici.contaminanţi interni care nu se manifestă timp de mai multe subcultivări. E. lăstarii. Sterilizarea materialului vegetal se face în hote cu flux laminar. etc. pe medii proaspete (Badea.. se repartizează şi mediul în spaţiile de cultură (dacă nu a fost repartizat înainte de sterilizare). 21 . adică se transferă căluşurile. 2001). folosind instrumente sterile. Iniţierea unei culturi in vitro presupune: confecţionarea explantelor din material vegetal sterilizat. Timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiei sterilizante se aleg pentru fi ecare material experimental în parte. La intervale regulate de timp se fac subcultivări. trecerea explantelor în vasele de cultură prin inocularea la suprafaţa mediului şi transferarea în dulapurile sau camerele climatizate. embrionii.

. 22 . ciuperci) Clonarea plantelor Lăstărirea axilară pentru obţinerea donare Sursă de explante pentru Conservarea germoplasmei Stocarea adventive Izolarea mutantelor Clonarea planielor prin formarea Obţinerea poliploizilor mugurilor sau embrionilor Cultura Clonarea prin formarea organelor şi noduriexplantelor Crioprezervarea căluşurilor plantelor libere de virusuri suspensie variantelor Cultura de antere şi Obţinerea Producerea haploizilorsomaclonale şi liniilor mi. interacţiunea gazdă-parazit. ales pentru selecţia transferul genelor. etc.studierea suspensii). neorganizate (căluşuri. postzigotice Producerea haploizilor bacterii. etc.organizate (plante întregi. celule. Studii de fiziologie: studierea ciclului celular.Tabelul 6 Tipuri de culturi in vitro ___________ Tipul de cultură Scopul Cultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare Prevenirea avortării embrionilor Cultura de meristeme Cultura de apexuri fără muguri Cultura de preformaţi calus/celule în Depăşirea incompatibilităţii Eliminarea patogenilor (virusuri. embrioni. în funcţie de gradul de organizare. funcţionării realizate mai promotorilor. organe). culturile in vitro pot fi: efectele stresului abiotic. - inginerie genetică: izolarea genelor. ţesuturi şi organe Selecţia mutantelor Producerea homozigotice Producerea plantelor Depăşirea incompatibilităţii pre şi metaboliţilor supermasculesecundari Selecţia mutantelor postzigotice Prevenirea absciziei Hibridarea somatică şi crearea florilor Realizarea fecundării in vitro cibrizilor Transferul de gene şi crearea Studii de frtopatologie: pătrunderea şi variabilităţii somaclonale replicarea virusurilor. realizate mai ales şi în scopul Experimente de biologie moleculară micropropagării. etc. studierea metabolismului.crospori Cultura de ovule şi flori excizate Cultura de protoplaşti Cultura de protoplaşti.

5.. embrionilor sau prin înrădăcinarea lăstarilor). care generează o masă de celule izolate şi de agregate celulare mici). culturi de organe (apexuri.mutantelor. culturi de calus (în care ţesuturile diferenţiate dediferenţiază şi produc o masă de celule numită calus). - neorganizate/organizate. - culturi de protoplaşti (celule lipsite de peretele celular). care permit parcurgerea etapelor: explant -> calus/suspensie —► embrioni/muguri -> plante. cultivate în mediu lichid. culturi de explante (porţiuni de organe. etc.). etc. - culturi de embrioni. antere. izolarea protoplaştilor. 2. acest tip de culturi fac posibile dediferenţierea şi rediferenţierea. rădăcini. agitat. Tipurile de culturi in vitro mai pot fi clasificate şi în funcţie de natura materialului vegetal în: - culturi de plante (obţinute prin germinarea seminţelor. Cu alte cuvinte.). ţesuturi. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro Celulele plantelor posedă două caracteristici pe care se bazează 23 . etc. - culturi de celule în suspensie (căluşuri sau explante de diferite origini.

Organul îşi pierde treptat structura. temperatură şi umiditate. orice celulă diferenţiată putând deveni. cu toate aplicaţiile lor: - pot fi cultivate in vitro. în decursul a 3-4 săptămâni. în anumite condiţii. pot regenera organisme complete.biotehnologiile. este proprie numai plantelor superioare. totipotentă. capabile să se reproducă. 24 . organe. Această a doua caracteristică. pe medii sintetice. Atunci când se realizează culturi de fragmente de organe sau culturi de celule pe medii adecvate. ceea ce demonstrează că programul de diferenţiere este flexibil. în condiţii controlate de lumină. fragmente de organe. se pot cultiva plante întregi. celule izolate şi protoplaşti. Pe un mediu nutritiv sintetic. Cultura in vitro este un ansamblu de tehnici care presupune folosirea unor elemente de asepsie şi realizarea unui mediu perfect controlat. ţesuturi şi bineînţeles. care încep apoi să se dividă. numită totipotenţă. prin acţiunea componentei hormonale a mediului se induce dediferenţierea celulelor diferenţiate. Materialul vegetal folosit p entru iniţierea culturilor in vitro poartă numele de explant.

www.bioresurse. 1988 – Ingineria Genetică Editura.L. Editura Sitech 5.agbioview. www.Bibliografie 1.ro 2. Bonciu Elena.org 3.referat.ro 4. ştiinţifică şi enciclopedică. www.Noţiuni de bioinginerie şi biotehnologii. Bucureşti 25 . Popa. Iancu Paula 2011 . Strategii şi aplicaţii.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful