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Aula 1 Encontrar a molcula Fluorescente Verde Anlise da Transformao gentica No Bio-Rad Kit 1, realizou-se uma transformao gentica de clulas

s de E. coli bacterianas. O resultado deste processo foram as colnias de clulas que fluorescem quando exposta radiao ultravioleta. Este no um fentipo normal (caracterstico) para E. coli. Foi ento convidados a descobrir uma maneira de determinar qual molcula se foi tornando fluorescente sob luz ultravioleta. Aps a determinao de que o DNA do plasmdeo pGLO no era responsvel pela fluorescncia sob a Luz UV, concluiu-se que no era o DNA de plasmdeo que foi fluorescente em resposta a luz ultravioleta no interior das clulas. Isto leva-nos hiptese de que no a se no o DNA que fluoresce quando exposto Luz UV, ento deve ser uma protena que o novo DNA produz dentro das clulas. Perguntas: 1. Protenas. a. O que uma protena? A protena, ou polipptido, uma macromolcula, ou seja, um polmero, constituda por subunidades (monmeros) denominadas -aminocidos. Desempenha funes biolgicas essenciais, nomeadamente na estrutura, funo e reproduo dos seres vivos. b. Liste 3 exemplos de protenas encontradas no corpo. Insulina (pncreas), hemoglobina (sangue) e albumina (sangue). c. Explique a relao entre genes e protenas. Os genes so segmentos de DNA que, aquando da sntese protena so convertidos em RNA mensageiro e posteriormente originam uma protena especifica. Assim, cada gene codifica uma determinada protena, que ter uma funo no organismo. As protenas so formadas por vrios aminocidos e, segundo o cdigo gentico, a cada aminocido corresponde um codo. 2. Usando as suas prprias palavras, descreva clonagem. Por clonagem entende-se o conjunto de processos pelos quais uma clula-me origina uma ou mais clulas-filhas geneticamente iguais a ela. ento um processo de reproduo assexuada, onde no introduzida variabilidade gentica. Na biotecnologia, frequentemente efectuada clonagem de bactrias, de modo a obtermos vrias cpias geneticamente iguais bactria me para que assim possam expressar uma protena pretendida em larga escala. 3. Descreva como as clulas das bactrias clonadas na placa LB/amp diferem das clulas da placa de LB/amp/ara. Consegue elaborar uma experincia para mostrar que ambas as placas de clulas clonadas se comportam similarmente e contm o mesmo DNA? No meio de cultura com arabinose as clulas bacterianas vo aparecer verdes fluorescentes quando expostas a uma luz UV enquanto as bactrias na placa LB/amp aparecem brancas (fentipo selvagem). Este facto verifica-se j que a arabinose vai ser um indutor da expresso da protena GFP em E.coli e a caracterstica da expresso desta protena a emisso de fluorescncia verde. 4. Descreva como pode recuperar a protena recuperadora de cancro atravs das clulas bacterianas. Transformao Gentica para procurar a GFM; Inoculao para crescer a cultura de clulas; Purificao (Concentrao bacteriana e posterior lise; Remoo do debris bacteriano; Cromatografia da protena).

Procedimento laboratorial para a Aula 2 Tirar as colnias e Crescer uma cultura de clulas Examinar as duas placas de transformao sob a lmpada ultravioleta (UV). Na placa de LB/amp, tem que se escolher uma nica colnia de bactrias que est bem separada das outras na placa. Usar um marcador volta da mesma na parte inferior da placa. Fazer o mesmo para uma nica colnia verde na placa LB/amp/ara. Teoricamente ambas as colnias brancas e verdes foram transformadas com o plasmdeo pGLO? Como se pode ver inferir? Ambas as colnias devem conter o gene para a protena verde fluorescente. Para descobrir, ir colocar cada uma das duas diferentes colnias de bactrias (clones) em dois tubos de cultura diferente e deix-los crescer e multiplicar durante a noite (overnight). Objectivo/tarefa Nesta aula, vai-se retirar uma colnia branca da placa LB /amp e uma colnia verde da placa LB/amp/ara para a propagao em diferentes culturas lquidas. Dado que h a hiptese de as clulas conterem a protena fluorescente verde, e esta protena que queremos produzir e purificar, a primeira considerao pode ser pensar em como produzir um grande nmero de clulas que produzem o GFP. Ser-lhe-o fornecidos dois tubos de cultura nutritiva lquida em que se vai colocar as clulas clonadas que foram previamente transformadas com o plasmdeo pGLO. Material Placas de transformao do Kit 1 (LB/amp/ara e LB/amp) (duas) Ansa de inoculao (duas) Tubos de cultura, contendo 2 mL de meio de crescimento (dois) Caneta de marcao Pina para tubo de ensaio Incubadora de agitao (na bancada comum de trabalho) Luz ultravioleta (na bancada comum de trabalho)

Procedimento 1. Examinar as placas de LB / amp e LB / amp / ara do laboratrio de transformao. Primeiro usando a iluminao normal da sala, em seguida, usando uma luz UV numa rea escura. Anotar as observaes. Para evitar danos na pele ou nos olhos, evitar a exposio luz UV. Nunca olhar diretamente para a luz UV. Usar culos de segurana sempre que possvel. 2. Identificar as vrias colnias verdes que no esto em contacto com as outras colnias na LB / amp / ara da placa. Virar a placa ao contrrio e circundar as diversas colnias verdes. Na outra placa LB / amp de identificar e circundar as vrias colnias brancas que tambm esto isoladas das outras colnias na placa. 3. Obter dois tubos de 15 mililitros de cultura contendo 2 ml de meio de crescimento de nutrientes e rotular um tubo de "+" e um tubo de "-". Usando um ansa de inoculao estril, tocar levemente no fim da ansa para recolher uma colnia de clulas verdes e recolher as clulas sem transportar grandes bocados de agar. Mergulhar a ansa no tubo "+". Dispersar a colnia inteira usando a ansa. Usando uma nova ansa estril, repetir para uma nica colnia branca e mergulh-lo no tubo "-". muito importante escolher a partir de uma nica colnia de clulas bacterianas. 4. Fechar os tubos e coloca-los no agitador ou incubador. Deixar os tubos incubar durante 24h a 32oC ou por dois dias temperatura ambiente. A seguir colocar os tubos na estufa por 24h.

Aula 3 Fase de purificao 1 Concentrao de bactrias e lise At agora estivemos a produzir em massa culturas vivas de duas bactrias clonadas. Ambos contm o gene que produz a protena verde fluorescente. Agora temos de extrair a protena verde a partir do seu hospedeiro bacteriano. Uma vez que so as clulas bacterianas que contaminam a protena verde, primeiro Precisamos pensar sobre como recolher um grande nmero dessas clulas bacterianas. Um bom modo para concentrar uma grande quantidade de clulas o de colocar um tubo que contm o lquido de cultura de clulas em uma centrifuga e centrifuga-lo. Como se pode centrifugar a cultura de clulas, onde que se pode esperar que as clulas se concentrem, na poro de lquido ou na parte inferior do tubo num pellet? Material Microtbulos Pipeta Suporte para os microtbulos Marcador Gobel com gua para enxaguar as pipetas Soluo TE (bancada de trabalho comum) Lisozima (reidratada) (bancada de trabalho comum) Centrifuga (bancada de trabalho comum) Luz Ultravioleta (bancada de trabalho comum)

Procedimento 1. Usando um marcador, marcar o rtulo de um novo microtbulo com o nome e data. 2. Retirar as duas culturas lquidas do agitador ou incubadora e observ-los em condies normais de iluminao ambiente e, em seguida, com a luz UV. Registar as diferenas de cor que se observam. Usando uma pipeta limpa, transferir todo o contedo do lquido de cultura (+) para o microtbulo de 2 mililitros tambm marcado (+), fechando-o de seguida. Agora pode-se pr de lado a cultura (-) para eliminao. 3. Centrifugar o microtubo (+) durante 5 minutos na centrfuga velocidade mxima. 4. Aps a cultura bacteriana lquida ter sido centrifugada, abrir o tubo e lentamente verter o sobrenadante lquido acima do pellet. 5. Observar o pellet sobre luz UV. Registar as observaes. 6. Usando uma nova pipeta, adicionar 250 L de soluo TE a cada tubo. Ressuspender o pellet. 7. Utilizando uma pipeta enxaguada, adicionar 1 gota de lisozima para ressuspender o pellet. Fechar e misturar o contedo. A lisozima comear a digerir a parede celular bacteriana. Observar o tubo sob a luz UV. Colocar o microtbulo no congelador at que aula de laboratrio seguinte. O congelamento ir provocar que as bactrias explodam e entrem em rutura completa.

Aula 4 Fase de purificao 2 Lise bacterial O lisado bacteriano que foi gerado na ltima aula de laboratrio, contm uma mistura de protenas bacterianas endgenas e de GFP. O objetivo separar e purificar a GFP das protenas bacterianas contaminantes. As protenas so cadeias longas de aminocidos, e destes alguns so hidrofbicos. A GFP tem muitos aminocidos hidrofbicos, e todos estes aminocidos fazem com que a protena seja toda hidrofbica. Alm disso, a GFP muito mais hidrofbica do que a maioria das outras protenas bacterianas. Podemos tirar vantagem das propriedades hidrofbicas da GFP para purific-la a partir de outra, protena bacteriana menos hidrofbica (ou mais hidrfila). A cromatografia um poderoso mtodo para a separao de protenas e outras molculas numa mistura complexa e normalmente usado em biotecnologia para purificar protenas geneticamente modificadas. Na cromatografia, uma coluna preenchida com beads esfricos microscpicos. Uma mistura de protenas numa soluo passa atravs da coluna, movendo - se para baixo, atravs dos espaos entre os beads. Ir se usar uma coluna cheia com esferas que foram feitas muito hidrofbicas, a tcnica exacta chamada de cromatografia de interaco hidrofbica (HIC). Quando o lisado aplicado coluna, as protenas hidrofbicas que esto aplicadas na coluna, num tampo de alto teor salino vo ficar com beads enquanto as outras protenas que esto na mistura vo passar. Quando o sal reduzido, as protenas hidrofbicas deixaram de ficar com beads e vo sair pela parte inferior da coluna numa forma purificada. Material Microtbulos Pipeta Suporte para os microtbulos Marcador Gobel com gua para enxaguar as pipetas Coluna de cromatografia HIC Tampa para coluna de cromatografia Copo de resduos ou tubo Tampo de ligao (Bancada de trabalho comum) Tampo de equilbrio (Bancada de trabalho comum) Centrifuga (Bancada de trabalho comum) Luz UV (Bancada de trabalho comum)

Procedimento 1. Retire o seu microtubo do congelador e descongele-lo usando o calor da mo. Coloque o tubo na centrifuga e o pellet de detritos bacteriano insolveis e faa uma centrifugao durante 10 minutos, velocidade mxima. Rotular um microtubo novo com as iniciais do seu grupo. 2. Enquanto espera pela centrifugao, prepare a coluna de cromatografia. Antes de realizar a cromatografia, agite vigorosamente a coluna para ressuspender as beads. De seguida agite a coluna para baixo uma ltima vez, como se fosse um termmetro, para trazer os beads para a parte inferior. Bater a coluna em cima da mesa, isto tambm vai

ajudar a assentar os beads na parte inferior. Remover a tampa do topo e arrancar a parte inferior do separador da coluna de cromatografia. Libertar todo o tampo lquido para drenar a partir da coluna (isto levar -3-5 minutos). 3. Preparar a coluna com a adio de 2 ml de tampo de equilbrio para o topo da coluna, 1 ml de cada vez usando uma pipeta bem enxaguada. Drenar o tampo da coluna at atingir a marca de 1 ml, que um pouco acima do topo do leito branco da coluna. Tapar o topo e a base da coluna e armazenar a coluna temperatura ambiente at prxima experincia de laboratrio. 4. Aps a centrifugao de 10 minutos, remover imediatamente o microtubo da centrifuga. Examinar o tubo com a luz UV. Os detritos bacterianos devem ser visveis como uma pellet na parte inferior do tubo. O lquido que est presente acima da pellet chamado sobrenadante. Note-se a cor do sedimento e do sobrenadante. Utilizando uma nova pipeta, transferir 250 microlitros do sobrenadante para um microtubo novo. Enxaguar novamente a pipeta para as restantes etapas desta experincia.

5. Utilizando a pipeta bem enxaguada, transferir 250 microlitros de Tampo de Ligao para o microtubo contendo o sobrenadante. Coloque o tubo no refrigerador at a prxima etapa experimental.

Aula 5 Fase de Purificao 3 Cromatografia Proteica Nesta etapa final de purificao da protena verde fluorescente, o lisado bacteriano preparado vai ser carregado numa coluna de interao hidrofbica (HIC). Lembre-se que a GFP contm uma abundncia de aminocidos hidrfobos que fazem esta protena muito mais hidrofbico do que a maioria das outras protenas bacterianas. Na primeira etapa, vai passar o sobrenadante contendo as protenas bacterianas e GFP para mais de uma coluna de HIC num tampo altamente salino. O sal faz com que a estrutura tridimensional de protenas mude efetivamente de modo a que as regies hidrofbicas do movimento de protenas para o exterior da protena e as regies hidrfilas se movam para o interior da protena. A coluna de cromatografia na sua estao de trabalho contm uma matriz microscpica de beads hidrofbicas. Quando a amostra carregada nesta matriz para em tampo muito salgado, o protenas hidrofbicas devem untar-se s beads. Quanto mais hidrofbicas, mais as protenas se iro juntar. medida que a concentrao de sal diminuda, a estrutura tridimensional das protenas muda novamente de modo a que o regies hidrofbicas das protenas se movam de volta para o interior e as regies hidroflicas se movam para o exterior. Ir-se- usar quatro solues para completar a cromatografia: Binding BufferA very high salt buffer (4 M (NH4)2SO4) Equilibration BufferA high salt buffer (2 M (NH4)2SO4) Wash BufferA medium salt buffer (1.3 M (NH4)2SO4) Elution BufferA very low salt buffer (10 mM Tris/EDTA) Material Tubos coletores (trs) Pipeta Suporte de Microtbulos Marcador Gobel com gua para enxaguar as pipetas Coluna de cromatografia HIC Tampa para coluna de cromatografia Tubo de ensaio ou gobl para recolher os resduos Wash Buffer (bancada de trabalho comum) Equilibration Buffer (bancada de trabalho comum) TE Buffer (bancada de trabalho comum) UV light (bancada de trabalho comum)

Procedimento 1. Obter trs tubos coletores e rotul-los 1, 2 e 3. Colocar os tubos num suporte. Remover a tampa da parte superior e da parte inferior da coluna e deix-la escorrer completamente para dentro do gobel destinado recolha dos resduos. Quando o ltimo tampo tiver atingido a superfcie do leito da

coluna de HIC, colocar suavemente a coluna para a recolha do tubo 1. 2. Prever o que se acha que vai acontecer nas etapas seguintes. 3. Utilizando uma pipeta de novo, cuidadosamente carregar 250 l do sobrenadante (em Binding Buffer) para a parte superior da coluna. Examinar a coluna usando a luz UV. Registar as observaes. Deixar que a totalidade do volume de sobrenadante flua para dentro do tubo 1.

4. Transferir a coluna de recolha do tubo 2. Utilizando a pipeta enxaguada e a mesma tcnica de carga descrita acima, adicione 250 l de tampo de lavagem e deixar que todo o volume flua para a coluna. Prever os resultados que pode obter com este buffer. Examinar a coluna usando a luz UV e registar os seus resultados.

5. Transferir a coluna para o tubo 3. Utilizando a pipeta enxaguada, adicionar 750 l de tampo TE (elution Buffer) e deixar que todo o volume flua para a coluna. Mais uma vez, fazer uma previso e ento examinar a coluna usando a luz UV. Registar os resultados.

6. Examinar todos os tubos coletores usando a luz UV e observar as diferenas na cor entre os tubos. Vedar os tubos colectores (com Parafilm ou Saran Wrap) e colocar num local refrigerador prxima actividade.