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COEXIXTENCIA ENTRE DOS CEPAS DE Caldicellulosiruptor, ESPECIES PRODUCTORAS DE BIOHIDROGENOS RESUMEN Antecedentes: el enriquecimiento de este cultivo mixto se ha utilizado

con frecuencia para la produccin de biohidrogeno apartir de distintos sustratos. A pesar de las ventajas hay un rendimiento pobre de H2. Las cepas conocidas como productoras de hidrogeno ofrencen mejores rendimientos que el enriquecimiento de esta poblacin mixta, superano las limitaciones de algunos cultivos puros basados en la sinergia entre los microorganismos implicados. Resultados: Los termfilos extremos Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 y C. kristjanssonii DSM 12137 se combinaron en un co-cultivo para la produccin de H2 a partir de glucosa y xilosa en un flujo continuo en un reactor de tanque agitado. El cocultivo mostr una notable estabilidad durante un perodo de 70 das bajo condiciones suficientes de carbono, en el sistema coexisten las dos cepas en estado estacionario a diferentes diluciones, segn lo revelado por el anlisis cuantitacivo de PCR para cada especie. Las dos cepas mantienen la capacidad de convivir de forma estable en el reactor, incluso cuando la glucosa fue utilizada como nico sustrato limitante de crecimiento. Por otra parte, los rendimientos de H2 fueron superiores a los obtenidos con un solo microorganismo en las mismas condiciones, en alusin a un efecto sinrgico de las dos cepas productoras de H2. Un rendimiento mximo de 3,7 mol de H2 (1mol-glucosa) fue obtenida por el co-cultivo a una tasa de dilucin de 0,06 a 1 h, con un rendimiento superior a la reportada para cualquier cultivo mixto hasta la fecha. Un modelo reproducible de la dinmica poblacional se observ en el co-cultivo, tanto en condiciones de carbono y sin carbono limitada, con C. kristjanssonii superando C. saccharolyticus durante la fase inicial y vigente en las tasas de dilucin altas. Un modelo bsico de la cultura continua asumiendo la capacidad de C. saccharolyticus para mejorar el crecimiento de C. kristjanssonii podra imitar el modelo de dinmica de la poblacin observada experimentalmente y proporcionar pistas sobre la naturaleza de la interaccin entre los dos cepas. Como prueba, el sobrenadante libre de clulas en el crecimiento de C. saccharolyticus se encontr capaz de mejorar el crecimiento de C. kristjanssonii en los proceso por lotes a travs de acortar su tiempo de latencia y aumentar su concentracin mxima de biomasa por ca. 18% Conclusiones: Este estudio proporciona pruebas experimentales sobre la convivencia estable de dos organismos estrechamente relacionados pero aislados de hbitats geogrficamente diferentes bajo condiciones de operacin continua, con el rendimiento en la produccin de H2. Se cree que la interacion entre estas especie es debida a la capacidad de estas dos cepas de Caldicellulosiruptor a coexistir en un sistema sin competir por el sustrato limitante de crecimiento. Antecedentes En los ecosistemas naturales, las mezclas de las poblaciones microbianas son la regla y no la excepcin. Distintas poblaciones microbianas con frecuencia interactan entre s en una variedad de manera que dan lugar a muchos efectos beneficiosos y, por tanto, no es sorprendente que las culturas mixtas poseen mayores capacidades metablicas y mostrar ms solidez a las fluctuaciones ambientales que las poblaciones individuales [1]. En la biotecnologa, las tcnicas de enriquecimiento continuo se han utilizado para la obtencin de estabilidad microbiana consorcios adaptados a las condiciones de cultivo continuo, lo cual es especialmente valioso en un flujo continuo del proceso comercial. El uso de las tcnicas de enriquecimiento ha sido demostrado mediante su uso en diversas aplicaciones, tales como la digestin

anaerbica y la produccin biopolmeros y solvente [3].

de

Por otra parte, las comunidades microbianas se pueden construir, donde la diversidad y la capacidad metablica de la comunidad se puede ajustar mediante una cuidadosa seleccin de estos miembros individuales para el lograr nuevas y mejores estructuras y funciones [4]. Este enfoque ha sido ampliamente adaptado en la fermentacin de los alimentos [5,6] y con xito para la produccin a escala de laboratorio del bioetanol [7-9], cido actico [10] y el cido lctico [11]. Tambin proporciona una herramienta esencial para los estudios fundamentales sobre los diferentes mecanismos de las interacciones microbianas [12-16]. Aunque el enfoque parece interesante, la estabilidad de estas comunidades artificial es muy difcil de lograr por diversas razones, como lo discuti por Weibel [4]. Hasta la fecha, parece que hay muy pocos estudios que informan sobre la construccin de co-cultivos que consta de dos o ms especies de bacterias que pueden coexistir de manera estable durante un largo perodo de tiempo [17-21]. Debido a su alto valor econmico y una amplia gama de aplicaciones en la industria qumica, el H2 ha sido un tema de inters creciente en los ltimos aos. Los considerables esfuerzos de investigacin se han dedicado a la produccin de H2 por la conversin biolgica de la biomasa a travs de la fermentacin oscura, con un nfasis notable en el uso de cultivos mixtos de enriquecimiento [22-25]. La muestra de estos cultivos suelen ser a partir de derivados de compost o de lodos de tratamiento anaerbico a pesar de las altas tasas en la produccin de H2 alcanzados por estos cultivos el rendimiento no es superior a dos moles por mol de hexosa [3]. Dado que el proceso es siempre junto a los residuos biolgicos de tratamiento,

los altos rendimientos no pueden ser vistos como esenciales. Sin embargo, la fermentacin oscura permite la liberacin de hasta 4 moles de H2 por mol de hexosa [27] por lo tanto, si el H2 se produce a partir de cultivos energticos, el rendimiento es mximo. La construccin y el diseo de comunidades productoras de H2 se puede prever como una posible forma de superar algunas de las cuestiones inherentes a la utilizacin de los consorcios no definidos, en particular los rendimientos bajos de H2 [22,28]. En un estudio anterior, los termfilo extremos C.saccharolyticus y C.kristjanssonii se han combinado en un co-cultivo productor de H2 de con el objetivo principal de mejorar la tasa de consumo de glucosa durante la cofermentacin de xilosa [28]. Un resultado ms interesante de esta cooperacin, es su capacidad de produccir H2 con un rendimiento superior al de cualquier organismo solo. Sin embargo, las fermentaciones se llevaron a cabo en el modo por lotes y la estabilidad de la co-cultivo en un sistema continuo. Esto es particularmente importante ya que en las condiciones prcticas de aplicacin del quimiostato son ms susceptibles. En el presente trabajo, demostramos la produccin de H2 a un alto rendimiento en una reactor continuo de tanque agitado (CSTR) por un cocultivo estable de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii en condiciones de quimiostato. Debido a las diferencias morfolgicas entre las dos especies, se desarroll un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) para el seguimiento del crecimiento de cada organismo en el co-cultivo. Adems, una prueba de la capacidad de uno o varios productos de las clulas C.saccharolyticus para mejorar el crecimiento de C. kristjanssonii se podra obtener. es notable la estrecha relacin de las dos cepas que conviven de forma estable bajo condiciones de nutrientes limitados, como podra ser demostrado un simple modelo matemtico que describa el sistema.

Materiales y mtodos Microorganismos C. saccharolyticus DSM 8903 (tambin, ATCC 43494) y C. kristjanssonii cepa I77R1B (DSM 12137, ATCC 700853) fueron adquiridos de la Deutsche Sammlung Mikroorganismen von und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Desarrollo del Inculo C.Saccharolyticus y C.kristjanssonii se subcultivaron individual dos veces a 70 C en 50 ml de medio modificado DSM[28] que contiene el mismo azcar utilizado (s) en la posterior fermentacin (10g/L-1) en atmsfera de N2 en botellas sellada spor prensado de 250ml. Despus de la densidad ptica a 620nm (OD620) de la subcultura, la segunda ha llegado de 0,3 a 0,4 se utiliza para inocular el fermentador en un nivel del 15% (v v-1). Para iniciar el co-cultivo, se utiliz un volumen igual de cada organismo. configuracin del Biorreactor Los organismos se cultivan en un biorreactor con camisa, 3-L stirredtank (Applikon, Schiedam, Pases Bajos) a 70 1C. El biorreactor fue equipado con una IDA 1025 Bio-consola y una IDA 1010 Bio-Regulador (Applikon, Schiedam, Pases Bajos). Una modificacin del medio DSM 640 fue utilizado para todos los cultivos en un volumen de 1L. Una solucin estril de glucosa y / o xilosa fue agregada al medio despus de la esterilizacin a la concentracin requerida. El medio se sparged continuamente gas N2 con un contenido inferior a 5 ppm O2 (AGA Gas AB, Sundbyberg, Suecia) se agitaron 100 ml por 1min a 300 rpm. El pH se mantiene en 6,7 0,1 a la temperatura de funcionamiento, con 3 M de NaOH como titulante. El medio se hizo totalmente anaerbico por la adicin de HCl cistena a una concentracin final de 1g/L-1 antes de la inoculacin. Despus de un crecimiento inicial en el modo por lotes, el biorreactor fue alimentado al final de la fase de crecimiento exponencial con un medio

nuevo, que tiene una composicin similar al medio inicial, excepto por la omisin de la cistena-HCl, a 0,04 h-1. El bibern se burbuje con N2 continuamente para evitar el desplazamiento medio por el aire. Despus se alcanzo un estado de equilibrioy se llevo a cabo un aumento gradual en la tasa de dilucin (D). los estados estacionarios fueron evaluados despus de al menos cinco cambios de volumen a travs de tasa constantede CO2 y las tasas de produccin de H2 y una concentracin de biomasa constante. Muestreo Las muestras de gas del espacio de cabeza del biorreactor se analizaron peridicamente de la composicin de H2 y CO2. Muestras de colonias fueron retirados peridicamente para supervisar la concentracin de biomasa. Adems, se tomaron 10/ mL del cultivo de manera asptica y se recogieron las clulas por centrifugacin a 5000 x g y 4 C durante 12 min, se lavaron dos veces con 1 tampn fosfato salino (PBS) por centrifugacin y se almacenan a 20 C durante extraccin de ADN genmico. El sobrenadante se aclar an ms al pasar a travs de una celulosa de 0,2 micras filtro de acetato (Advantec, Tokio, Japn) y se analiza para el consumo de azcar y la formacin de metabolitos. Efecto del sobrenadante del crecimiento de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii. El sobrenadante crecimiento de C.saccharolyticus fue evaluado por su capacidad para mejorar el crecimiento de C.kristjanssonii en cultivos discontinuos. El sobrenadantes del crecimiento a partir de cultivos de 50 mL de cada organismo se recogieron por centrifugacin a 12.000 x g y 4 C durante 6 minutos. El sobrenadante de C. kristjanssonii fue descartado y el sedimento celular fue retenido. El sobrenadante de C.saccharolyticus se filtr a travs filtro estrile con poro de tamao de 0,2m (Sarstedt,

Nmbrecht, Alemania) para obtener un caldo en el que las clulas de C. kristjanssonii se volvieron a suspender. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo dentro de una caja de guantes anaerobia (Plas Labs Inc., MI, EE.UU.), bajo una atmsfera de N2-H2-CO2 (0.85:0.10:0.05). La cultivo de C.kristjanssonii fue resuspendido en 50 ml y se combin con 50 o 100 mL de inculo sin tratamiento C.kristjanssonii para inocular en el medio modificado DSM 640 que contiene 10 g L-1 de glucosa como sustrato, en el biorreactor. Las fermentaciones se realizaron en el modo de proceso por lotes en las mismas condiciones descritas anteriormente y la concentracin de biomasa fue monitoreada a intervalos regulares. Mtodos analticos Las concentraciones de H2 y el CO2 se determinaron por cromatografa de gases, con un doble canal CP 4900 Micro-GC (Varian, Middelburg, Holanda). El H2 se analiz en una columna de tamiz molecular (CP-5 MolSieve PLOT) con las temperaturas de 80 y 100C en el inyector y la columna respectivamente, mientras que el CO2 se analiz en una columna de CP-PoraPLOT Q con la temperatura de 80C en el inyector y la columna. Los gases de transportista por la MolSieve y las columnas PoraPLOT Q fueron N2 y He, respectivamente, a 150 kPa. Cada canal est equipado con un detector de conductividad trmica de micromecanizado. Azcares, cidos orgnicos y etanol fueron separados por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC, Waters Corporation, Milford, MA) en una Aminex HPX-87H columna (BioRad, Hercules, CA) a 45 C. El cido sulfrico (5 mM) se utiliz como fase mvil a un caudal de 0,6 ml/min-1. Los analitos fueron detectados en un detector de ndice de refraccin (IDR6A, Shimadzu, Tokio, Japn).

Determinacin de la biomasa Un espectrofotmetro U-1800 (Hitachi, Tokio, Japn) se utiliz para el seguimiento regular de la OD620. Para el peso seco de clulas (CDW) el tomaron 10 ml de cultivo y fueron transferidos tubos Falcon de 15 mL previamente pesado y secos, se centrifuga a 5.000 g durante 15 minutos, se lava con H2O desionizada y se seca a 70C hasta peso constante . La enumeracin de C.saccharolyticus y C. kristjanssonii en sus cultivos puros se realiz mediante recuento microscpico directo, usando una cmara de recuento Brker-patrn (Marienfeld Lauda-Knigshofen, Alemania). Extraccin de ADN El ADN genmico se extrajo del sedimento lavado de clulas congeladas con el kit de fcil ADN (Invitrogen, San Diego, CA), segn el protocolo del fabricante. Para completar la degradacin del ARN, se preparo el tampn Tris-EDTA (tampn TE, pH 8) se incubaron con RNasa A (40mg/mL-1) durante 30 min a 37C. La concentracin y la pureza de ADN fueron analizadas por espectrofotometra en un BioPhotometer Eppendorf (Hamburgo, Alemania). Alcuotas de ADN en tampn TE se almacenaron a-20 C hasta su uso. PCR en tiempo real Los ensayos de PCR cuantitativa fueron desarrollados para cuantificar C.saccharolyticus y C.kristjanssonii en su co-cultivo. Para ello, pares de primers de oligonucletidos especficos basados en las diferencias en la secuencia del gen 16S ARNr de las dos especies, una vez recuperados de la secuencia de bases de datos Gen Bank fueron diseados http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/,

(Tabla 1). Las diferentes secuencias de genes se compararon con el Clusta lW2 secuencias mltiples programa de alineacin http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/. La amplificacin de PCR en tiempo real y la deteccin se realizaron en el instrumento LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La mezcla de PCR (20 ml) contiene 1 TTerm PCR buffer, 1 U TTerm ADN polimerasa (ambos, Roche Diagnostics), 1.5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs (ambos, Fermentas, St. Leon Rot, Alemania), 1 solucin SYBR Green I (Roche Diagnostics) y 4 ul de solucin de plantilla de ADN, adems de los iniciadores forward y reverse. La concentracin de los cebadores en la mezcla de PCR fue 0.125m (cada uno) para el ensayo C.saccharolyticusspecific y 0,5mM (cada uno) para el ensayo de C.kristjanssoniispecific. Los espacios en blanco que contiene agua estril MilliQ (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) en lugar del ADN de las plantillas y controles negativos que contiene los moldes de ADN de las especies noobjetivo se incluyeron en cada ejecucin. El protocolo de amplificacin LightCycler comenz con una desnaturalizacin inicial a 95C durante 60s, seguido por 45 ciclos de desnaturalizacin a 95C durante 0s, el recocido y la adquisicin de fluorescencia a 63C durante 5s, y elongacin a 72C durante 25s. La

especificidad de los cebadores se valid de manera que las seales detectadas cuantitativos para la cepa de destino no se vieron afectados por la presencia de ADN genmico de la cepa otros. Para ello, un anlisis de la curva de fusin, que consiste en el calentamiento a 95C durante 0s y 50C durante 15s seguida de un aumento de la temperatura en 0,2C/s hasta 90C, se llev a cabo. Adems, los productos de PCR fueron confirmados por electroforesis en gel de agarosa. La cuantificacin se logra mediante la determinacin del punto de paso (CP) de la muestra - es decir, el nmero del ciclo que corresponde al mximo de la segunda derivada de la curva de amplificacin - y comparando con las normas. Para la preparacin de las normas, cultivos puros de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii se cultivaron de forma individual sobre la glucosa en 3-L biorreactores en las mismas condiciones descritas anteriormente, aunque en modo batch. se recogieron muestras del cultivo de cada organismo en diferentes intervalos de tiempo para el recuento de clulas y la extraccin de ADN genmico. Una primera curva estndar entre la concentracin de ADN y el nmero de clulas se traz para validar el protocolo de extraccin de ADN y la capacidad del kit de extraccin. La preparaciones de ADN de las muestras utilizo un nmero variable de clulas, una vez diluidas, como plantillas para qPCR. El Cp media de dos repeticiones independientes de PCR en tiempo real se traza contra el logaritmo de la cantidad de elementos correspondientes para obtener una segunda curva estndar. Para la determinacin cuantitativa C.saccharolyticus y C.kristjanssonii en diferentes muestrasdel cultivo, la segunda norma se regener para cada especie con todas las carreras del LightCycler para superar cualquier variabilidad en la eficiencia de la amplificacin. Co-cultivo modelo

Un modelo matemtico fue construido para simular la cooperacin estable existente entre C.saccharolyticus (organismo 1) y C. kristjanssonii (organismo 2) en el co-cultivo, con la glucosa como la principal fuente de carbn y energa. El modelo se basa en las ecuaciones de equilibrio general de comunicacin y la liberacin propuesta de un compuesto (E) por C.saccharolyticus con la capacidad de mejorar el rendimiento de biomasa y la tasa mxima de crecimiento especfico de C.kristjanssonii. El sistema continuo de co-cultivo puede ser descrito por tres ecuaciones diferenciales relevantes (crecimiento de C.saccharolyticus, el crecimiento de C.kristjanssonii y el consumo de glucosa, respectivamente):

En el que max1 y max2 es la velocidad mxima de crecimiento especfico (1 h) de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii respectivamente, y Ks1 y Ks2 son las constantes Monod de la glucosa (mmol/L-1) para C.saccharolyticus y C.kristjanssonii respectivamente. La relacin entre la concentracin del producto propuesto elimina (E) y la concentracin de biomasa de C. saccharolyticus es el siguiente: E = x1 (6) con el factor de rendimiento especfico (mmol gcdw-1). El aumento de la tasa de crecimiento especfica mxima y el rendimiento de biomasa de C.kristjanssonii por el efecto del compuesto E puede ser descrito como:

donde X1 es la concentracin de biomasa de C.saccharolyticu (gcdw L1), X2 es la concentracin de biomasa de C.kristjanssonii (gcdw L-1), S0 es la concentracin de glucosa en la alimentacin (mmol/L-1), S es la concentracin de glucosa residual (mmol/-1), y t es el tiempo de fermentacin (h). El rendimiento de biomasa gcdw coeficiente [Ysx1(mmol glucosa-1)], se considera que es constante, mientras que YSX2 y las tasas de crecimiento (1 y 2) son cada uno en funcin de diversas variables, como se explica a continuacin. La tasa de crecimiento de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii puede ser descrita por las ecuaciones de Monod:

con 0max2 y max12 como el mximo especfico de tasas de crecimiento en ausencia de compuesto E y en presencia en la concentracin crtica (CE), respectivamente. Del mismo modo, Y0sx2 y Ysx2 son los factores de produccin de biomasa en ausencia de compuesto E y en su presencia en la concentracin crtica, respectivamente. Los valores de los distintos parmetros incluidos en el modelo se muestran en la disposicin 1 (Tabla S1). El conjunto de ecuaciones diferenciales se resolvi

con Matlab (R2009a; The MathWorks, Inc.). RESULTADOS Produccin de hidrgeno y la estabilidad del co-cultivo sin limitacin de carbono C.saccharolyticus y C. kristjanssonii se cultivaron juntos en un CSTR en diversas tasas de dilucin, que van de 0,04 a 0,3 h-1, durante un perodo de 70 das. La concentracin total de la alimentacin del azcar fue de 10 g L-1 (glucosa y xilosa; 1:1). Por lo menos 8 cambios de volumen fueron necesarios para alcanzar un estado estable en las tasas de dilucin menor, mientras que hasta 20 cambios de volumen se requiere en las diluciones superiores. Ni la glucosa ni xilosa en la alimentacin era completamente consumida en cualquiera de los tipos de dilucin que ser analizada, lo que sugiere que la co-cultura no se limita de carbono (Cuadro 2). Un aumento en la concentracin de azcar residual, con la tasa de dilucin, y tendencia similar se observ para la concentracin de la biomasa. El consumo de tasa xilosa fue considerablemente superior a la de la glucosa en todas las tasas de dilucin (vase el cuadro S2.1 en la disposicin 2). Los principales productos finales del metabolismo (fermentacin) de la glucosa y xilosa fueron CO2, H2 y acetato, mientras que el lactato se formaron cantidades menores de carbono y se obtuvo una recuperacin completa de electrones (ver Tabla S2.2 en la disposicin 2). Tanto las tasas de produccin de H2 y especficos de (QH2 y qH2, respectivamente) aument notablemente con la tasa de dilucin (Tabla 2). El mximo tasa de produccin de hidrgeno obtenido fue de 11.6 mmol L1 en 0.25h-1 y 0.3h-1. Por otra parte, la produccin de H2 (YH2) fue inversamente proporcional a la tasa de

dilucin, con el mximo de 3,6mol de H2 por mol de hexosa equivalente obtenido en 0.06h-1 (Tabla 2). Esta produccin representa el 90% del rendimiento mximo terico que puede obtenerse a partir de glucosa durante la produccin de hidrgeno en la fermentacin oscura. El rendimiento de biomasa (Ysx) aument de forma pronunciada en D> h 0,15 a 1 (Cuadro 2), lo que podra deberse a la acumulacin de un material de almacenamiento, por ejemplo, el glucgeno. Los ensayos de PCR cuantitativa se utilizaron para evaluar la capacidad de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii de convivir en las mismas condiciones en fase estacionario y para controlar la dinmica de la poblacin durante la operacin continua del reactor. Los resultados mostraron que, a pesar de la variacin en la dinmica de la poblacin en las diferentes fases estacionarios, los dos organismos pueden coexistir de manera estable en todo el rango de las tasas de dilucin de prueba (Figura 1 C.kristjanssonii super a C.saccharolyticus a finales del lote de la fase inicial, y en fases estacionarios de D>0,06h1. Por otra parte, C.saccharolyticus prevalecido en el ms bajo de la categora D, es decir, 0.04h -1. La especificidad de los cebadores diseados fue confirmada a lo largo de los ensayos de fusin mediante el anlisis de la curva, donde slo se detect un ampliacin con la temperatura de fusin esperada. Adems, los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa, donde se podra detectar una banda del tamao esperado (datos no presentados). Limitacin de carbono con dos azcares Con el fin de estudiar el efecto de la limitacin de carbono en la produccin de H2 y la posibilidad de coexistencia de las dos especies, la concentracin total de azcar en la alimentacin se redujo a 4g L-1 (glucosa y xilosa; 1:1). Con base en el desempeo de co-

cultivo con limitacin en la fuente de carbono, slo dos tipos de dilucin fueron elegidos como una plataforma para la evaluacin de eficiencia de la produccin de H2 y el anlisis de la cinetica de la poblacin, es decir, 0,06 y 0,15 h-1. La glucosa residual y la xilosa no pueden ser detectado en la fase estacionario de D = 0.06 a h1, lo que confirma que el co-cultivo fue limitado por el carbono (Tabla 3). El rendimiento de H2 disminuye la tasa de dilucin y es comparable a la obtenida en virtud de la limitacin de la

fuente de carbono en las dos fases estacionarias evaluadas. La tasa de produccin de H2 seguio una tendencia opuesta, ya que aument la tasa de dilucin, como se vio en la limitacin de la fuente de carbono. los rendimientos del producto y el consumo de azcar y las tasas de formacin de metabolitos, as como las recuperaciones de carbono y de electrones en las dos tasas de dilucin se detallan en la disposicin 2 (Tablas S3.1 y S3.2).

En estado de equilibrio la concentracin de azcar residual aument en un aumento de D (Cuadro 3), mientras que la concentracin global de la fase estacionario de la biomasa se redujo de 0.44 0,03 gCDW L-1: 0,06 h-1 a 0,35 0,03 gCDW L-1 a 0,15 h-1, lo que podra indicar que el cultivo se acercaba a su D crtica. Aunque en el co-cultivo con limitacion de carbono, ni C.saccharolyticus ni C.kristjanssonii segn lo revelado por el anlisis de PCR cuantitativa (Figura 2). Las clulas de C.kristjanssonii constituan alrededor del 85% de la poblacin total en el inicio del cultivo en el modo de cultivo continuo, mientras que su recuento en fase estacionario relativa fue inferior al 10% en D = h 0.06 a 1., sin embargo el microorganismo recuper su predominio cuando D se increment a 0,15h1, que representa su

comportamiento en caso de limitacin de la fuente de carbono. La competencia por limitacin de sustrato crecimiento La capacidad de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii a convivir de forma estable en condiciones de quimiostato fue cuestionado ms por el crecimiento del co-cultivo en un solo azcar, como el sustrato limitnate de crecimiento. La glucosa se aadi a la alimentacin en una concentracin de 4 g L-1, y el desempeo de las co-cultivo tambin se compar con la de las especies individuales en las mismas condiciones. La glucosa fue completamente agotada en las tasas de dilucin por el co-cultivo y por el cultivo puro de C.kristjanssonii (Tabla 4).

Figura 1 Control de la dinmica de la poblacin en el co-cultivo por qPCR. La abundancia relativa de saccharolyticus C. (barras de color negro) y C.kristjanssonii (barras grises) en el co-cultivo en los estados estacionarios de las tasas de dilucin diferentes durante el crecimiento de la glucosa y xilosa (10 g L-1; 1:1) a pH 6.7 y 70 C. Los valores expresados son los medios de PCR en tiempo real duplicados que variaron menos del 10%.

En cultivo puro de C.saccharolyticus en fase estacionario tiene una concentracin de glucosa residual de 8,6 0,6 mM se detect en el efluente mediante el aumento de D de 0,06 a 0,15 a 1h, con una disminucin concomitante de la concentracin de biomasa. Los rendimientos de H2 obtenidos por el co-cultivo fueron ms altos que los rendimientos obtenidos por cualquiera de las especies en cultivo puro, tanto en las tasas de dilucin. La ms alta tasa de produccin de H2 se logr en el cultivo puro de C.kristjanssonii y en su cocultivo con C.saccharolyticus a D = 0.15 a hd, mientras ms alta es la tasa

especfica de produccin de H2 nicamente logrado por la cultura antigua en el mismo D (Cuadro 4). Una comparacin minuciosa de la distribucin del producto en el cultivo puro de cada cepa y en el cocultivo, as como las recuperaciones de carbono y el electrn se encuentra en la disposicin 2 (Tablas S4.1 y S4.2). Curiosamente, ambos organismos coexisten en el sistema cultivo a pesar de ser verdaderamente limitada la fuente de carbono, es decir, la glucosa. C.kristjanssonii fue la especie predominante en el co-cultivo en la fase inicial y en la mayor D (Figura 3), lo que subraya un patrn similar a lo obtenida durante la co-fermentacin de la

glucosa y xilosa. Cabe destacar que un patrn similar de la dinmica de la poblacin se obtuvo tambin con un sentido contrario de las tasas de dilucin de este experimento, donde se logr un estado estable por primera vez en D = 0,15 a h1 y luego a no D = 0,05 h-1 (datos muestra). ambas las tasas de dilucin. Lo mismo ocurre con las tasas de produccin especficas de todos los productos de la fermentacin de otros (vase la disposicin adicional 2: Tabla S5.1), lo que podra atribuirse a la baja concentracin obtenida de biomasa en xilosa. La notable capacidad de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii a coexistir de manera estable se mantuvo durante el crecimiento en xilosa. Aunque las clulas de C. saccharolyticus constituan menos del 5% de la poblacin total en el cocultivo durante la fase inicial, el organismo podra superar a C.kristjanssonii en el co-cultivo en la fase estacionario de D = 0,06 h-1 (Figura 4), como se vio en la glucosa y la xilosa y la mezcla de glucosa y xilosa. La relativa abundancia de C.kristjanssonii en el co-cultivo de xilosa en la final del lote y la fase inicial en las tasas de dilucin un comportamiento emparejad del organismo en toda la fermentaciones. Captura de la dinmica de la poblacin en el co-cultivo in silico Se inform previamente que C.kristjanssonii presenta una menor tasa de crecimiento especfico que C.saccharolyticus durante el crecimiento de lote en la glucosa y xilosa [28]. El predominio constante de C.kristjanssonii en el co-cultivo durante el crecimiento del lote y un mayor desarrollo en todas las condiciones evaluadas en este estudio se refiri a la posibilidad que el crecimiento del organismo est mejorando por uno o varios compuestos liberados por C.saccharolyticus. Esta interaccin podra ser una posible razn de la convivencia estable de las dos cepas, incluso en presencia de un solo sustrato limitando crecimiento.

Figura 2 La abundancia relativa de C.saccharolyticus (barras de color negro) y C.kristjanssonii (barras grises) en el co-cultivo de la glucosa y xilosa (4 g L-1; 1:1) a pH 6.7 y 70 C al final del lote en fase inicial y durante el crecimiento del estado estacionario a dos tipos diferentes de dilucin. Los valores expresados son los medios de PCR en tiempo real duplicados que variaron menos del 10%. La cifra es un representante de la dinmica de la poblacin en dos culturas quimiostato independiente. A diferencia de la glucosa, la xilosa no puede ser completamente utilizada por el co-cultivo, ya sea cuando se utiliza nicamente este azcar en la tasa de dilucin como alimentacin a 4 g L-1 (26,7 milmetros; Tabla 5). La razn de que no se use la xilosa parece ser que el azcar preferible durante la cofermentacin es la glucosa (vase el cuadro 2). Al aumentar D, la xilosa fue consumida y la concentracin en la fase estacionario de la biomasa se ha duplicado prcticamente. Rendimiento de H2 del co-cultivo de xilosa no parecen variar con la tasa de dilucin, y fue menor que la obtenida de la glucosa. sin embargo,la tasa especfica de produccin de H2 sigui una tendencia opuesta, ya que fue significativamente mayor en xilosa en

Para probar esta hiptesis se uso un modelo matemtico basado en ecuaciones diferenciales ordinarias de un sistema de cultivo continuo se implicaron ecuaciones que describen el aumento de la produccin de biomasa y la tasa mxima de crecimiento especfico de C.kristjanssonii y C.saccharolyticus por un modelo propuestas y publicadas por (ver Materiales y la seccin Mtodos). De hecho, el modelo fue capaz de imitar la dinmica de la poblacin en el cocultivo de la glucosa (Figura 5), siempre empleando valores muy estimados de cada parmetro (vase la disposicin adicional 1: Tabla S1). Prueba del modelo, que revel el aumento de la tasa mxima de crecimiento especfico fue el ms efecto profundo, es decir, en ausencia de cualquier mejora efecto sobre esta variable C.kristjanssonii habra todos los D's (datos no presentados).

Efecto del sobrenadante de cultivo C.saccharolyticus en el crecimiento de C.kristjanssonii El resultado de las simulaciones en silico provocado un inters para confirmar la presencia de productos de secrecin de C.saccharolyticus que podran mejorar el crecimiento de C.kristjanssonii. Para ello, un volumen total de inculo C.kristjanssoni, de 15% (v / v), en los cuales un tercio de la fase lquida fue sustituido por un C.saccharolyticus libre de clulas, se utilizan para iniciar una cultivo de la relativo a la glucosa (10 g L-1). Como se ilustra en la Figura 6, el cultivo puro de C.kristjanssonii complementado con el sobrenadante de C.saccharolyticus, una fase de latencia ms corta que el cultivo control que carecan de sobrenadante C.saccharolyticus. Por otra parte, el cultivo tratado exhibido alrededor de un mximo de 18% mayor concentracin de biomasa, lo que corresponde a un aumento de CDW de 0,16 g L-1. Ningn cambio significativo fue observado en la tasa de crecimiento especfica de C.kristjanssonii.

Discusin El hidrgeno que produce el co-cultivo construido de novo puede ofrecer un rendimiento mejor que el enriquecimiento de poblacin mixta, mientras que la superacin de algunas de las limitaciones de los cultivos puros basado en las sinergias entre los microorganismos involucrados. En varios estudios anteriores el cocultivos, se define como una estrategia comn para continuar aislando a los miembros dominantes de un enriquecimiento de mezcla de colonias y la recombinacin de cepas con el fin de reproducir la estabilidad y la funcin de la microflora original [17,21,29,30]. A continuacin, se combinaron dos cepas relacionadas en sus hbitas geogrficas distantes, aunque similar, es decir, C.saccharolyticus DSM 8903 y C.kristjanssonii DSM 12137. La primera bacteria fue aislada de una piscina termal en Nueva Zelanda [31,32], mientras que el segundo fue aislado de una muestra de un Biomat islandesa termales [33]. Ambos organismos son estrictamente anaerobios, termfilos hetertrofos extremos con la capacidad para degradar los polisacridos complejos y fermentar los azcares como las hexosas y pentosas. Un CSTR sembrada con C.saccharolyticus y C.kristjanssonii podra ser operado con xito durante un perodo de 70 das con las diferentes diluciones y con ambas especies cuando la glucosa y la xilosa

son utilizadas como principal fuente de carbono y de energa. Segn el anlisis del azcar residual como fuente de carbono en la fase estacionaria del cultivo en todas las dilucin, lo que indica que otro nutriente debe haber sido el limitante del crecimiento. Sobre la base de la frmula estndar de la biomasa, es decir, CH1.8O0.5N0.2 [35], y la concentracin mxima de biomasa obtenida por cualquier organismo de fermentacin por lotes (alrededor de un gcdw L-1), la cantidad de materias inorgnicas presente en el alimento como nitrgeno y NH4Cl se considera en exceso. Un factor de crecimiento como por ejemplo el extracto de levadura (YE), es ms probable implicado como limitante del crecimiento y la utilizacin incompleta del azcar por el co-cultivo, ya que la relacin YE y azcar en la alimentacin era slo 1/10. Este tipo de limitacin se ha sugerido anteriormente para C.saccharolyticus [36] y para Thermoanaerobacter ethanolicus [37] durante la fermentacin continua de la glucosa y xilosa, respectivamente. En nuestro estudio, esto fue verificado por el aumento de la proporcin de YE y azcar en la alimentacin de 1/4, donde el co-cultivo podra limitarse el carbono cuando se cultiva con una mezcla de glucosa y xilosa (Tabla 3) o glucosa solamente (Tabla 4).

Figura 4 La abundancia relativa de C.saccharolyticus (barras de color negro) y C.kristjanssonii (barras grises) en el cocultivo de xilosa (gL 4-1) a un pH de 6.7 y 70 C al final del lote fase inicial y durante el crecimiento de la fase estacionaria a dos diferentes tipos de dilucin. Los valores expresados son los medios de PCR en tiempo real duplicados que variaron menos del 10%. La cifra es un representante de la dinmica de la poblacin en dos cultivos independientes quimiostato

En general, los rendimientos obtenidos de H2 en C.saccharolyticus y C.kristjanssonii co-cultivos en este estudio bajo las dos condiciones de carbono y sin limitados de carbono son significativamente superior a los rendimientos reportados previamente para co-cultivos definido [29,38-40] o

enriquecimiento del co-cultivo mixto [3,23,41], independientemente del tipo de reactor utilizado. La disminucin en el rendimiento del H2 con la tasa de dilucin observada en las fermentaciones de co-cultivo, as como en los cultivos puros de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii fue, en parte, resultado de la formacin de lactato mayor (vase la disposicin 2), que drena algunos de los electrones necesarios para la produccin de H2. El mayor rendimiento de H2 del co-cultivo fue de 3,7 mol por mol de hexosa (es decir, el 92,5% de la produccin de H2 mximo terico que se puede lograr a travs de la fermentacin oscura).

Figura 5 cultivos in silico limitado de glucosa quimiostato. Simulacin de la dinmica de la poblacin en el co-cultivo de la glucosa (4 g L-1) en cultivos quimiostato en D de 0,06 h-1 (A), y D de 0,15 h-1 (B), utilizando el modelo matemtico desarrollado. Lneas verdes representan C.saccharolyticus y las lneas rojas representan C.kristjanssonii

Esta produccin slo puede lograrse mediante la limitacin del co-cultivo de con la glucosa baja en D (es decir, h 0.06 a 1) y fue mayor que la obtenida por cualquier

organismo en cultivo puro en las mismas condiciones experimentales (Tabla 4), en alusin a una posible efecto sinrgico de las dos cepas en la produccin de H 2. Esto

tambin indica que la limitacin de carbono puede ser una estrategia exitosa para mejorar la eficiencia de conversin de azcar y aumentar el rendimiento de H2 del co-cultivo. Aunque no est claro por qu limitar las clulas por la glucosa conduce a lo que parece ser la utilizacin de sustratos ms eficiente y una mayor produccin de H2, Bisaillon et al [42] sugiere la posibilidad de flujo de carbono a las vas metablicas, por ejemplo, la sntesis de glucgeno, limitndose a las bajas concentraciones de glucosa lo que la mayora de maniobra el carbono a la catablicos, H2-generacin, las vas. A diferencia del rendimiento de H2, la tasa volumtrica de produccin de H2 del cocultivo construido en este estudio aument la tasa de dilucin, lo que concuerda con los datos de informes anteriores sobre la produccin de H2 fermentativa en las cultivos de quimiostato [36,43]. La tasa mxima de produccin de H2 realizados por el co-cultivo en la ms alta de la categora D probado en este estudio (tabla 2) es -1 equivalente a 0,28 LH2 L culture h-1, que se encuentra en el rango superior de productividad previamente informado de la fermentacin en cultivo mixto CSTRs [41,44-46]. El equilibrio ptimo entre el rendimiento y la productividad se observ en la limitacin de glucosa en estado de equilibrio de la ms alta D (Cuadro 4), lo que implica que tanto la limitacin de carbono y la tasa de dilucin son factores crticos para optimizar la eficiencia de produccin de H2 por el co-cultivo. En esas condiciones, el caudal volumtrico de produccin de H2 del co-cultivo fue equivalente a la de C.kristjanssonii, que de hecho era el organismo predominante en el co-cultivo. Sin embargo el rendimiento de H2 fue significativamente mayor en C.kristjanssonii, apuntando de nuevo a un posible efecto sinrgico de las dos cepas en la produccin de H2.

una cepa en el co-cultivo completamente desplazando a los otros en el desarrollo hacia un estado estable en una determinada condicin. Desde YE, que es un complejo de nutrientes, ya se conoca de la limitacin del crecimiento en el cocultivo en condiciones suficientes de carbono,la convivencia se podra explicar en que cada especie se limita a un componente diferente en YE. Sin embargo, la convivencia estable de las dos cepas observado en condiciones de estado estable con la glucosa como nico sustrato que limita el crecimiento no se puede explicar sobre esa base. Como veremos ms adelante, el patrn reproductivo de la dinmica demogrfica observada en condiciones diferentes en el presente estudio proporciona una pista sobre la presencia de interaccin entre especies en el co-cultivo, lo que podra ser la razn detrs de la convivencia estable de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii

Un resultado interesante de este estudio es la capacidad de las dos especies relacionadas Caldicellulosiruptor a convivir de forma estable en todas las condiciones de prueba. Dado que ambas especies ocupan el mismo nivel trfico [31,33], se espera que compitan por el mismo sustrato que limita el crecimiento del cultivo en el quimiostato. Basado en el principio de exclusin competitiva [47], esta competencia debera dar lugar a

La prevalencia de un organismo en una cultura de lote depende de su tasa mxima de crecimiento especfico en comparacin con la de los otros organismos, capaz de crecer en el inculo [2]. Desde exposiciones C. kristjanssonii un mximo de 40% menor tasa de crecimiento especfico que el de saccharolyticus C. durante el crecimiento de lote en la glucosa y xilosa [28], la prevalencia del primero en sus compaeros de la cultura en el lote fase inicial y en mayor las tasas de dilucin implica que adquiere una mayor tasa de crecimiento especfico en la presencia de de este ltimo. Adems, el rendimiento de biomasa de la kristjanssonii C. dominada co-cultivo en cultivos quimiostato limitada de glucosa en una D de 0,15 a 1 h fue significativamente mayor que el de C. kristjanssonii solo en lo contrario las mismas condiciones (Tabla 4), que apunta a un efecto potenciador de C.saccharolyticus en la produccin de biomasa de C. kristjanssonii. En efecto, el hecho de que ninguna de las cepas fue desplazado totalmente por el otro en cualquiera de los estados estacionarios evaluado apoya la hiptesis de la aparicin de una especie de interaccin entre especies beneficiosas

en el co-cultivo en lugar de la competencia slo para el mismo nutriente que limita el crecimiento. El modelo matemtico simple que hemos desarrollado para describir esta interaccin potencial, en trminos de E compuesto que tiene un efecto de crecimiento que mejora el C.kristjanssonii, con xito podra imitar la convivencia estable y predecir la dinmica de la poblacin en el co-cultivo, descartando cualquier otro mecanismo necesario (Figura 5).

Figura 6 Efecto del sobrenadante C. El crecimiento saccharolyticus en C.kristjanssonii. Comparacin de la fase de registro y la concentracin mxima de biomasa de C.kristjanssonii relativo a la glucosa (10 g L-1) a pH 6.7 y 70 C en modo batch, en presencia (A) y ausencia (B) de crecimiento C.saccharolyticus libre de clulas sobrenadante. Smbolos: "", la biomasa (OD620); "", H2 acumulativo. El experimento es un representante de dos repeticiones independientes.

Por otra parte, es la combinacin de la mejora de la tasa de crecimiento y rendimiento de biomasa de Kristjanssonii C. que crea las condiciones para la convivencia estable como se observa en el quimiostato-cultivos. Esta condicin slo es vlida siempre y cuando C.saccharomyces permanece en el sistema para proporcionar la propuesta aumentar el crecimiento compuesto. La reduccin en la fase de adaptacin y el aumento en la concentracin de biomasa mxima de C.kristjanssonii en presencia del sobrenadante crecimiento C.saccharolyticus (Figura 6) aport pruebas experimentales de la presencia de una

molcula de compuesto o de sealizacin que pueden mejorar el crecimiento de C . kristjanssonii. Aunque la tasa mxima de crecimiento especfico no se vio afectada en estas condiciones, esto podra ser debido a la ausencia de clulas C.saccharolyticus en el reactor, por lo tanto se prohbe el suministro continuo de los compuestos que fomenten el crecimiento. No puede descartarse que este compuesto es en realidad un producto de la lisis celular en lugar de una producto ya que las clulas secretoras C.saccharolyticus son propensos a lisar de forma significativa [48,49]. A la luz de la teora de la evolucin social de los microorganismos [50], la capacidad de C.saccharolyticus para mejorar el crecimiento de C.kristjanssonii podra ser clasificado como un la cooperacin altruista. Una explicacin para la cooperacin altruista entre parientes cercanos est mejor servido por la teora de la seleccin de parentesco, en una especie individual todava puede transmitir sus propios genes a la siguiente generacin indirectamente, al ayudar a una especie estrechamente relacionada con la reproduccin. Desentraar el mecanismo exacto de esta interaccin o la naturaleza de las molculas involucradas, sin embargo, sigue siendo un reto conceptual y metodolgico. Es bien sabido que cada poblacin o individuo detecta y responde a la presencia de otros en un consorcio por los metabolitos de comercio o el intercambio de seales moleculares dedicada [1,51]. El crecimiento de mejora como consecuencia de las interacciones entre especies de bacterias puede ocurrir en respuesta a algunas molculas de sealizacin [52]. oligopptidos procesados se conocen las molculas de la deteccin de qurum, o autoinductores, que son utilizados por las bacterias Gram-positivas para la comunicacin [53]. Nichols et al [54] present pruebas de que los pptidos cortos pueden ser factores esenciales para iniciar el crecimiento de 'sin cultivar' las clulas. La existencia de qurum a base de pptidos de deteccin en bacterias hyperthermophilic tambin fue demostrado previamente en un co-cultivo de Thermotoga maritima y Methanococcus jannaschii y fue responsable de inducir la produccin de exopolisacridos y la mejora de la formacin de biopelculas por el organismo ex-[13].

Por otra parte, recientemente se ha sugerido que la adicin de un segundo microbio, a saber. Tm. maritima, a un cultivo puro de C.saccharolyticus desencadena hechos causantes de la presencia, ausencia y la expresin diferencial de protenas de las especies dentro del sistema [15]. Aunque el genoma de C.saccharolyticus ha sido totalmente secuenciado y anotado [34], es difcil para examinar la presencia de pptidos pequeos supuesta molculas de sealizacin desde pptidos seales son a menudo los productos de los genes que codifican protenas de menos de 100 aminocidos de longitud. En el genoma C.saccharolyticus, hay 496 de estos genes, alrededor del 55% de los que codifican para las protenas hipotticas (NCBI Entrez Si bien la informacin genmica no fue enfoques tiles, otras, como la genmica funcional a partir de microarrays enfoques [12,14] o fraccionamiento bioensayo dirigida y el anlisis del crecimiento sobrenadante [54], se pueden adoptar para la identificacin de candidatos molculas de sealizacin y comprender los mecanismos moleculares mecanismos que subyacen a las interacciones en el co-cultivo. Este es, sin embargo, ms all del alcance del presente estudio y pueden llegar a ser ms factible por la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de C.kristjanssonii Conclusiones El presente estudio proporciona pruebas esenciales sobre la posibilidad de estable coexistencia de dos bacterias estrechamente relacionadas aislados de hbitats distantes en un sistema continuousflow bajo condiciones de estado estacionario. Esto aumenta la sugerencia de novo construidos o "de diseo" cocultivos como alternativas potenciales para varias aplicaciones biotecnolgicas que, de lo contrario, lleva a cabo utilizando enriquecimientos mezcla la cultura. Aunque el aumento en la produccin de H2 por el co-cultivo construidos en este estudio no fue espectacular, en comparacin con la de las cepas individuales, sigue siendo superior al rendimiento de H2 informado para cualquier cultivo mixto hasta la fecha. En general, los beneficios de la utilizacin de la co-cultivo que no sea mejorar el rendimiento del producto puede incluir una mayor resistencia a la invasin de otras especies y mayor probabilidad de

formacin de biopelculas [55], siendo esta ltima una caracterstica deseable en varios sistemas de fermentacin industrial. Ampliacin de la gama de la utilizacin de sustratos es otra de las ventajas que se pueden obtener mediante la combinacin de C.saccharolyticus y C.kristjanssonii en un co-cultivo. Por ejemplo, C.saccharolyticus fermentos L-arabinosa y ramnosa L, mientras que C.kristjanssonii no crece en estos azcares [33] y, probablemente, el ltimo sera capaz de utilizar algunos no sustratos fcilmente consumidos por los primeros, lo que amerita una mayor investigacin . Material adicional Disposicin adicional 1: Valores de diferentes parmetros incluidos en el cocultivo modelo. La disposicin 2: Detalles de la fermentacin de diferentes quimiostato cultivos. Rendimientos del producto, las tasas especficas de consumo de sustrato y formacin de metabolitos y de carbono y las recuperaciones de electrones en diferentes cultivos quimiostato de saccharolyticus C., kristjanssonii C y / o sus co-cultivo (8 mesas).