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Diferenciacion y deteccion de microorganismos usando espectroscopa fotoacstica infrarroja con transformada de Fourier

La espectroscopia fotoacustica infrarroja con transformada de Fourier (FTIR-PAS) fue usada para diferenciar e identificar microorganismos en la superficie de algn alimento (manzana). Los microorganismos considerados van desde bacterias (Lactobacillus casei, Basillus cereus y Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y hasta hongos (Aspergillus niger y Fusarium verticilliodes). Un anlisis discriminador serva para diferenciar a las manzanas contaminadas con microorganismos de las que no lo estn. Se calcularon las distancias de Mahalanobis para cuantificar las diferencias. Cuanto mayor sea el valor mtrico de Mahalanobis entre los diferentes microorganismo, mayores son sus diferencias. Adicionalmente fue posible diferenciar la E. coli patognica de las cepas no patgenas. Resultados demuestran que la espectroscopa FTIR-PAS tiene el potencial para llegar a ser una herramienta de anlisis no destructiva en la investigacin relacionada con la seguridad alimentaria. 1. Introduccin La determinacin microbial es una consideracin primaria con respecto a la seguridad y calidad del alimento en el proceso, venta por menor, o en el entorno de produccin. Metodos convencionales de diferenciacin dependen de ensayos serolgicos o bioqumicos que involucran realizar un cultivo en un agar especial, o un caldo, por varios das y luego realizar un test especial para determinar la presencia de ciertos tipos de bacteria. El riesgo que tiene tal retraso de la determinacin puede posiblemente disuadir la intervencin oportuna y la medida correctora apropiada para contrarrestar la contaminacin en el alimento. Por lo tanto, una proyeccin rpida de microorganismo en los productos alimenticios podra ser una esencial y valiosa herramienta para la industria de la comida. Con la mejora de la instrumentacin analtica, la Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR), ha sido aplicada para diferenciar qumicamente clulas microbianas sin destruirlas, con procesos complejos, podemos obtener las distintas huellas digitales bioqumicas de bacterias diferentes, de manera reproducible. FTIR ha sido usada por Naumann y sus colaboradores para clasificar microorganismos. Los autores han demostrado su capacidad de discriminar y clasificar clulas microbiales a nivel de cepa. Naumann caracteriz el espectro infrarrojo de bacterias en 5 areas espectrales o ventanas (W1-W5), las que son potencialmente informativas para la identificacin bacteriana. Estas ventanas espectrales estn asociadas a grupos qumicos especficos de los diferentes campos bacterianos. Los factores crticos en el FTIR microbial de acuerdo a los autores es el pre tratamiento de los datos, seleccin de la longitud de onda por una extraccin

algortmica caracterstica, tipo de red y la funcin de aprendizaje utilizada para la formacin de ANN. FTIR-PAS ha sido usada para obtener huellas digitales qumicas de la superficie de la comida y de las capas que subsiguientes con mnima o ninguna preparacin de la muestra. FTIR-PAS se basa en el efecto fotoacustico que es causado cuando un haz infrarrojo modulado incide sobre la superficie de una muestra en un ambiente sellado. La seales fotoacustica proporcionales a la presin de oscilacin, debido a un proceso de desexcitacion no radioactivo correspondiente del haz infrarrojo modulado, pueden ser detectadas por un micrfono selectivo y tranferido a un espectro adecuado por una conversin A/D. FTIR-PAS espectroscopia ha sido utilizada para determinar directamente la contaminacin fungica en la superficie del maz. El espectro FTIR-PAS del maz con o sin hongos fueron divididos en 2 areas distintivas para identificacin. Las regiones del espectro fueron identificadas y comparadas con la composicin qumica relativa del maz y de los hongos. Un modelo ANN fue entrenado para distinguir un maz contaminado de otro no contaminado con un patrn de reconocimiento. Los resultados demostraron que FTIR-PAS con su capacidad de anlisis multicomponente era ms confiable que el mtodo del brillo fluorescente amarillo verdoso. En otro experimento, la biomasa de protenas de E. coli y S. cerevisiae fueron medidas con FTIR-PAS desde microorganismos secos puestos sobre un filtro. El incremento de la biomasa proteica, en el periodo de crecimiento de los microorganismos, fue detectada gracias a la espectrografa FTIR-PAS. El trabajo propuesto es una de las primeras aplicaciones de FTIR-PAS para distinguir y caracterizar microorganismos en la superficie de los alimentos. El enfoque global de la investigacin era explorar el concepto de exanimacin directa de la piel de la manzana para comprobar contaminacin por microorganismos con FTIR-PAS. El objetivo especifico era (1) caracterizar y discriminar la piel de la manzana con diferentes contaminaciones por microorganismos, (2) caracterizar superficies de la fruta con diferentes cepas de E. coli, y (3) diferenciar cepas patgenas (OH157:H7) de las no patgenas (JM101, JM107, HB101, K12, y DH5). 2. Experimental 2.1. Preparacin de las muestras. Los microorganismos en estudio fueron S. cerevisiae (ATCC 24859), Lactobacillus casei (ATC 11443), Bacillus cereus (NRRLB-3711), Escherichia coli (JM101, JM107, HB101, K12, DH5 y OH157:H7), Aspergillus niger (NRRL 326) y Fusarium verticilliodes (NRRL 13586).

Cultivos congelados se descongelaron para que los microorganismos crecieran en su respectiva media (Tabla 1). Los cultivos crecidos se centrifugaron a 5000rpm por 15 minutos, y lavados dos veces con agua destilada. Las muestras de F. verticillioides fueron cosechadas desde 10 dias en un cultivo inclinado de un plato con agar dextrosa patata que fueron incubados a 25C, suspendidos en agua destilada esteril. La concentracin de microorganismos fue presentada como densidad ptica celular medida con un espectometro Bausch and Lomb 20, espectrofotmetro de 620nm (tabla 2). La piel de manzana fue seccionada desde una manzana a temperatura ambiente en la misma habitacin y los microorganismos fueron suavemente untados y usados para medidas. 2.2. Medicin FTIR-PAS

Un espectrmetro FTIR-PAS Bio-Rad 6000 FTS (Cambridge, MA) con un demodulador Bio-Rad y una celda fotoacustica helio-purgada (Modelo MTEC 100 PA Ames, IA) fue usado. El espectrmetro contiene una fuente cermica enfriada de Mid-IR y un divisor del haz de KBr. Un modelo de generador purgado con gas modelo 7552 (Whatmann, Inc., Haverhill, MA) fue usado para proveer CO2 y H2O libre en aire seco al interfermetro. El interfermetro puede actuar de formade escaneo rpida o a paso. Un carbono negro de referencia fue usado para recoger el respectivo espectro de referencia para la intensidad de espectro normalizado. Alicuotas de suspensiones microbiales resuspendidas fueron igualmente puestas en la superficie de la fruta, mantenidas a la temperatura de la habitacin para equilibrar, y luego usadas para anlisis espectroscpico. Las celdas de acero inoxidable PA con secciones pequeas de muestra (3x3mm) fue purgada con helio por 5 minutos para proveer CO2 y humedad al ambiente libre. El espectro fue recogido a una alta velocidad de escaneo de 5KHz, una resolucin de 16cm-1, a 256 scans/muestra. El experimento fue realizado 10 veces. 2.3. Analisis quimiometrico

Analisis de componente principal (CP) y variable canonica aleatoria (CV) fueron aplicados a los espectros obtenidos de los experimentos de caracterizacin microbial. Software WINDAS (Wiley, CHichester, UK) fue usado para un anlisis discriminante. En general, las combinaciones de lneas pesadas del espectro estn estructuradas para maximizar las diferencias entre los grupos supuestos, relativo a sus varianzas. Las combinaciones lineares de varianzas, conocidas como variantes canonicas, se trazan para agrupar los datos en diferentes grupos basados en similitudes espectrales. La distancia

Mahalanobis (DM) definida por la matiz Eq 1 fue usada para un anlisis discriminante. En notacin vectorial la distancia Mahalanobis, DM entre la observacion jth xj y el grupo central kth k est dada por:

Donde xj y k son ambos vectores de fila (1xr) y W es el promedio dentro del grupo de la matriz de convarianza, calculado separadamente para cada grupo, y T es el transpuesto. Por lo tanto, si hay g grupos entonces W esta dado por: Aqu nk es el nmero de observaciones y sk es la matriz de covarianza de grupo kth.

3. Resultados y discusin En el primer paso, las manzanas untadas con hongos y bacterias, fueron analizadas para demostras si el FTRI-PAS poda diferenciar entre los distintos tipos de microorganismos. FTRI-PAS de la superficie pura de la manzana junto a los diferentes tipos de microorganismos son mostrados en la figura 1. Los peaks mas alto que representan la piel de la manzana pueden observarse a 3372cm-1 (extensin OH) 2928 y 2856 cm-1 (extensin CH) 1732cm-1 (Extension CO) 1557 cm-1 (extensin CO y CH anillos) 1466 cm-1 (flexin CH). La asignacin de peak en FTRI-PAS fue consistente con las asignaciones dadas por Silverstain y Webster. La apariencia visual del espectro de las manzanas con microorganismo es similar a la de las manzanas sin ellos. Sin embargo, en una inspecion ms cercana se divisan pequeas diferencias de los espectros de los diferentes microorganismos. Por lo tanto, una interpretacin ms de la complejidad, an, cuando espectros similares usualmente requieren la aplicacin de tcnicas de multivariables estadstica. Cuando el anlisis discriminador fue aplicado para analizas espectros FTRI-PAS de diferentes microorganismos, las elipses de los grupos en la figura 2 muestra el 95% de regin de confianza para cada grupo. En este estudio, el 100% de las clasificaciones fueron logradas sin considerar las regiones de superposicin. La figura 2 grfica el resultado obtenido luego de un anlisis discriminante basado en los dos primeros valores de variantes canonicas (CV) mientras que la distancia Mahalanobis (DM) entre los medios de diferentes tipos de microorganismos estn puestas en la tabla 3. El valor DM mas grande es la diferencia mayor entre los diferentes grupos. De DM mtrico indica la extensin de las similitudes o disimilitudes de los diferentes grupos de microorganismos. Consecuentemente, menor distancia mayor similitud y mayor distancia mayor disimilitud. Comparando la figura dos y la tabla 3 se puede notar que L. casei y la superficie pura estn muy lejanos y por consecuencia tienen los valores DM mayores de 11.25. La segunda distancia mas grande es entre E. coli HB101 y la superficie pura de 9.15. La S. cerevisiae y E. coli HB101 estan muy cercas con la DM ms baja, 4.36, por lo tanto se sobreponen significativamente. DM entre E. coli HB101 y L. casei es de 4.69.

El anlisis demostr que la piel de las manzanas puras puede ser diferenciada de la que se encontraba contaminada con microorganismos. (Figura 2 y Tabla 3). Esta clasificacin de datos FTRI-PAS usando grupos puede ser usada no solo puede ser una herramienta til no solo para cuantificar diferencias sino que tambin similitudes entre materiales biolgicos. La tcnica FTRI-PAS con un apropiado tcnica de anlisis puede ser utilizada para diferencias una amplia variedad de microorganismos y contaminacin en la superficie del alimento siempre y cuando est bien calibrada. Sin embargo, es necesario realizar una gran formacin de test con diferentes superficies de alimentos y microorganismos. En el segundo paso, FTRI fue usado para examinar diferentes tipos de cepas de E. coli incluyendo la patogenica OH157:H7 JM101 y las no patogenicas JM107, HB101, K12 y DH5. Fig. 3 muestra el espectro de diferentes cepas de E. coli en la superficie de las manzanas junto con el de una manzana pura junto con los peaks claves discutidos en la figura 1 .

Figura 4 muestra la clasificacin de las cepas de E. coli no patgenas y la figura 5 la clasificacin de las patognicas junto a las no patgenas. Los peaks en la figura 4 son similares a los de la figura 1, sin embargo, se observaron ligeros cambios en la regin indicada. Evaluaciones adicionales requieren el uso de mtodos estadsticos. La DM mtrica en la tabla 4 cuantifica las diferencias entre las diferentes cepas bacterianas. Es de notar que la separacin ms grande fue obtenida entre E. coli O157:H7 patogenica y las

cepas no patognicas consideradas (indicado por las DM altas en la columna 6 de la tabla 4). La figura 5 muestra clarmente la separacin de los grupos. Las similitudes entre las E. coli no patognicas (JM107, HB101, K12 y DH5) se observa en los grupos e la figura 4. DM entre las diferente E. coli no patognicas (columna 5 tabla 4) es mucho mas pequea comparada con la distancia de E. coli O157:H7 patogenica (columna 6 tabla 4). Los resultados mostrados, muestran un novedoso y nico enfoque para diferenciar diferentes cepas de microorganismo incluyendo patognicas y no patognicas, en la superficie de los alimentos con pruebas directas usando espectroscopia FRTI-PAS. Los resultados se muestran prometedores y con un potencial excelente en la seguridad de los alimentos y estudios de calidad.

4. Conclusin Hemos demostrados que FRTI-PAS con anlisis multivariado puede ser usado para discriminar los microorganismos que contaminan la superficie de una manzana. Discriminacin de E. coli patognica y no patognica con pruebas no destructivas fue exitosamente demostrado con FRTI-PAS y quimometrica. Con pruebas y anlisis extensivos, el procedimiento tiene el potencial de convertirse en una herramienta rpida, no destructiva, para la identificacin y clasificacin de bacterias en un sistema alimentario.