You are on page 1of 23

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NC VÀ PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

---  ---

BÀI BÁO CÁO
MÔN: DI TRUYỀN PHÂN TỬ

KỸ THUẬT AFLP
(Amplified Fragments Length Polymorphism)

Người hướng dẫn Gs.Ts. NGUYỄN THỊ LANG Viện lúa ĐBSCL

Nhóm thực hiện: Lê Thị Thái Bạch (051004) Trần Thị Mỹ Nhung (051019) Nguyễn Thị Tố Quyên (051022) Trần Chí Công (051005) Bùi Minh Trường (051029)

Tháng 10/2010

PHẦN MỞ ĐẦU

Công tác lai tạo giống theo phương pháp truyền thống có hệ số nhân chậm và có nhiều trở ngại vì cơ chế sinh học sinh sản của giống cây trồng và vật nuôi rất phức tạp. Kiểm soát một số tính trạng của các giống này làm tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí cho chương trình lai tạo giống. Hơn nữa, nhà đầu tư quan tâm nhiều đến các tính trạng liên quan đến số lượng hơn là chất lượng. Gần đây, nhờ sự phát triển của sinh học phân tử cùng với sự hỗ trợ của marker chọn lọc cho phép phát triển những qui trình dựa trên kiểu gen (không chịu ảnh hưởng khi điều kiện môi trường biến đổi) hơn là chọn lọc dựa trên kiểu hình như phép chọn lọc truyền thống vẫn thực hiện. Bằng kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism), một phương pháp có hiệu quả để nhân dòng và giải trình tự những marker liên kết này để xác định đặc điểm của chúng. AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài).

PHẦN NỘI DUNG
A. GIỚI THIỆU
I. KỸ THUẬT AFLP 1. Khái quát Về căn bản, bất cứ một chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau, đều được xem như là một DNA marker. DNA marker được chia làm bốn nhóm như sau:

- PCR based ( ALP, AFLP, SSR, SSCP, STS).
- DNA- không phải là PCR base như: DNA/DNA hybrybization: RFLP minysatellite. RFLP thường có hệ di truyền là Dominant. - Genomic base: Thí dụ SNP dùng để tách các vùng đột biến. - Protein base và proteomic: các marker chia ra 3 kiểu. + Isozyme là enzyme marker + Protein dự trữ + PTLs protein quantitative luci: protein thể hiện như là marker và như là các tính trạng trong bản đồ. Tùy theo tính chất của genomic mà chúng ta có thể áp dụng các marker để khai thác da dạng hóa nguồn gen phát hiện gen, xây dựng bản đồ gen. Trong các marker trên kỹ thuật AFLP thuộc nhóm PCR based được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA (DNA fingerprinting) được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995. Fingerprinting đã và đang được phát triển khá thành công với hai hướng chiến lược nghiên cứu như sau :

- Fingerprinting trên cơ sở lai, có tính chất kinh điển: Bao gồm kỹ thuật cắt DNA, kỹ thuật điện di, RFLP được phát hiện bởi kỹ thuật lai với probe thông qua xét nghiệm Southern. - Fingerprinting trên cơ sở PCR: Bao gồm kỹ thuật khuếch đại DNA in vitro bằng primer đặc biệt hay primer ngẫu nhiên. Kỹ thuật AFLP là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều loại của đa hình DNA mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng (Michelmore và ctv., 1998), phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau (Breyen và ctv., 1997; Cervera và ctv.,1996). Nghiên cứu đa hình của DNA nhờ AFLP là mô hình mẫu trong nghiên cứu di truyền Menden, do đó nó có thể được dùng trong việc xây dựng bản đồ gen của các sinh vật, trong đó có con người để chẩn đoán và chữa trị các bệnh di truyền, cũng như tạo ra ngân hàng gen phục vụ lợi ích cho con người. 2. Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp AFLP là dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt giới hạn (restriction enzym – RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là: - Cắt DNA bằng enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI - MseI. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Khi sử dụng chúng chung với nhau, những enzym này sẽ tạo ra những đoạn DNA rất ngắn, chúng được khuếch đại khá tốt, và đạt được kích thước tối hảo (<1Kb) chạy điện di trên gel polyacrylamide. Do việc thiết kế primer và kỹ thuật

khuếch đại, người ta thường dùng phối hợp EcoRI - MseI hơn là phối hợp EcoRI - EcoRI hoặc MseI - MseI. - Khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhau. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. Phương pháp này tạo ra một lượng lớn các band trong điện di, làm cho việc phát hiện thể đa hình thuận lợi hơn rất nhiều. Số đoạn phân tử DNA khuếch đại có thể được kiểm soát bằng cách chọn lọc base khác nhau và thành phần nucleotide trong adaptor. 3. Ưu điểm và nhược điểm * Ưu điểm - Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome. - AFLP không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. - Có tính lặp lại cao hơn RAPD và chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban đầu (2.5pg-25ng). - Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình (polymorphism) trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa các quần thể có quan hệ gần nhau. - Không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, không cần sử dụng nhiều loại primer. - Là kỹ thuật in dấu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể in dấu DNA của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thực vật, động vật đến con người. *Nhược điểm

- Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. - Qui trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện. - Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diện các phân đoạn DNA lý tưởng. II. ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RE) 1. Khái quát: Trong phân tích genome, enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng là nhóm restriction endonuclease (enzyme nội sinh, phân cắt giới hạn). Đó là nhóm của Dnase, ghi nhận các chuỗi trình tự đặc biệt của các nucleotide và cắt DNA tại vị trí đặc biệt. Người ta xem nó như chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật “recombinant DNA”. Enzyme giới hạn được Werner Arber tìm thấy ở vi khuẩn vào năm 1962. Ông cho rằng các RE có khả năng rất đặc biệt đó là khả năng nhận biết DNA chủ và DNA lạ. Enzyme này hạn chế sự nhân lên của DNA lạ khi chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bằng cách cắt chúng ra thành từng đoạn một cách đặc hiệu, vì thế ông gọi là restriction có nghĩa là hạn chế. Với phát minh này ông cùng các cộng sự (Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành giải thưởng Nobel vào năm 1978. Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào sơ hạch (procaryote), một câu hỏi đặt ra là vì sao các RE chỉ cắt DNA của các phage mà không cắt DNA của tế bào vi khuẩn? Câu trả lời là nhờ Methylase đây là enzyme giúp vi khuẩn có khả năng này, chính enzyme này chịu trách nhiệm gắn nhóm metyl (CH 3) vào các nucleotides ở vị trí cắt của các RE trên DNA của vi khuẩn vì thế bảo vệ DNA của vi khuẩn khỏi sự phân cắt của RE. Tuy vậy đôi lúc methylase lại gắn nhằm cả nhóm metyl vào chính DNA của phage, điều này giải thích vì sao đối với các dòng vi khuẩn kháng phage vẫn có các tế bào bị phân hủy.

Enzyme ngoài chức năng phân cắt, nó còn có chức năng kết nối các phân tử DNA lại với nhau. 2. Tên gọi của enzyme cắt giới hạn Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên vi khuẩn từ đó RE được ly trích. Hai chữ kế không viết hoa tương đương với tên loài của vi khuẩn. Cả 3 chữ nầy đều viết in nghiêng. Kế đến là chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện trong trường hợp nhiều RE được tìm thấy trong cùng một vi khuẩn. Đôi khi còn có thêm chữ viết hoa (viết thẳng) để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng. VD : Escherichia chi coli loài Ry13 chủng

EcoRI: là enzym đầu tiên tìm thấy trên vi khuẩn E. coli EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy trên vi khuẩn E.coli 3. Các loại enzyme cắt giới hạn Loại I: khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nu. Loại II: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó. Loại III: enzym nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20 nu. Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được phân lập vào năm 1968, cho đến nay có khoảng 3.400 RE được khám phá. Trong số này có khoảng 540 RE đã được thương mại hóa. Adapter Pst I adapter sequence 1 (96) Pst I adapter sequence 2(97) MseI adapter sequence 1 (A 18) MseI adapter sequence 1 (A 19) Oligonucleoside sequence 5 CTCGTAGACTGCGTACACATGCA-3’

3’ CATCTGACGCATGT’ -5’ 5’ GACGATGAGTCCTGAG – 3’ 3’ TACTCAGGAGCTGAG- 5’

Primer / trước khi khuếch đại: Pst I primer (96) MseI primer (H 18) Primer/ khuếch đại chọn lọc: Pst I primer (90) Pst I primer (91) Pst I primer (98) Pst I primer (99) MseI primer (F 10) MseI primer (F 38) MseI primer (F 39) MseI primer (F 41) MseI primer (G08) MseI primer (G 23) MseI primer (G 24) MseI primer (G 25) MseI primer (G26) MseI primer (G 27) 5’ GACTGCGTACATGCACCA -3’ 5’GACGTCGTACATGCAGTT -3’ 5’GACGTCGTACATGCAGAC -3’ 5’GACGTCGTACATGCATGG -3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACAC-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAAACC-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACCA-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACAA-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAAACG-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACAG-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACGA-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’ 5’GATGAGTCCTGAGTAACCT-3’ 5’ CTCGTAGACTGCGTACATGCA- 3’ 5’ GACGATGAGTCCTGAG- 3’

Chuỗi mã của adapter và primer dùng trong phân tích AFLP III. KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) 1. Khái quát PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp - phản ứng khuếch đại gen). Đây là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus; mặc dù nguyên tắc này đã được

mô tả chi tiết trước đó một thập niên bởi Khorana và ctv., (Kleppe và ctv., 1971; Panet và ctv., 1974), và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. Kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. 2. Nguyên lý DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định lên đặc tính của cơ thể (ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với những sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan tử như ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid. Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt enzyme DNA polymerase, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn tách thành các sợi DNA sợi đơn. Dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn. Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt: + Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase. + Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp. + Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động.

3. Các giai đoạn phản ứng PCR Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ). * Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng : 1-2 phút. * Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45-60°C. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1-2phút. * Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc 1000bp/ 1 phút . Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 1000C. Ở nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng). Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.

B. PHƯƠNG PHÁP KỸ THUẬT AFLP Kỹ thuật AFLP gồm các bước sau: -Phân lập DNA -Cắt bằng enzyme cắt giới hạn và nối bằng adapter -Tiền khuếch đại -Khuếch đại -Chạy điện di và phân tích kết quả

Sơ đồ chung của kỹ thuật AFLP I. PHÂN LẬP DNA Thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất Rnase. DNA được kết tủa trong Ethanol 100% và thu lại nhờ ly tâm. Trước hết chúng ta phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai. Đó là giai đoạn có tính quyết định trong phân tích AFLP. Ví dụ chúng ta cần có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt. Trong quá trình phân lập DNA, người Ta phải lấy mô lúa từ trong nhà kính hoặc trên đồng ruộng, mô này được nghiền bằng cối trong Nitơ lỏng. Chất đệm khi li trích DNA có chứa SDS,

chất này có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung dịch, SDS là một chất tẩy khá mạnh, nó có thể biến đổi protein ở nhiệt độ 650C. Sự biến đổi này làm cho các DNA gắn với protein tích rời với DNA cần nghiên cứu. Protein và chất cặn bã của tế bào được tách khỏi DNA bằng phenol/Chlorophom. DNA ở pha lỏng sẽ dược kết tủa bằng cách tiêm Isopropanol. Phân lập DNA bằng phương pháp nói trên chỉ áp dụng với DNA có kích thước lớn hơn 30 kb có một ít tạp chất như polysachcaric. Chúng sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó chúng ta phải hết sức thận trọng trong phân lập DNA. DNA được phân lập có thể được tồn trữ ở âm 20 0C. Nhưng chúng ta phải lưu ý rằng, một chút thay đổi nhỏ nào trong quá trình đông lạnh cũng có thể làm thay đổi DNA, tránh đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần DNA. Trong quá trình phân lập người ta phải sử dụng nhiều dung môi. Có hai dung môi rất quan trọng là EDTA và Tris. Tris( trisma, base) đã được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trong dung môi. Ở ph=8 DNA rất ổn dịnh. Trong môi trường axít, purine rất dễ bị phân hủy. cầu nối phosphodieste dễ bị phá vỡ tạo ra kết quả purine hóa. Do đó người ta phải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris. DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme làm cho mẫu DNA bị tạp. Chỉ cần chất gây tạp ở thể vệt cũng đủ để gây cho DNA bị hỏng, do vậy chúng ta phải rất cẩn trọng. Để ngăn ngừa DNA bị phân hủy bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. EDTA có thể kiềm giữ Mg2+ và làm bất hoạt nó trong dung môi. Không có Mg2+, enzyme không thể hoạt động. II.CẮT BẰNG ENZYME VÀ NỐI DNA BẰNG ADAPTER * Một số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE

Nồng độ NaCl của dung dịch đệm, nếu phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl của dung dịch đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao hơn. RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -200C, nên thêm vào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốt. Thể tích phản ứng càng nhỏ càng có hiệu quả vì RE và DNA tiếp xúc với nhau càng tốt tuy nhiên phải bảo đảm thể tích RE không quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của RE.

Digestion:

Eco RI

Mse I

GAATT C CTTAA G
Eco RI

T TAA AAT T
Mse I
7

Dùng 2 enzyme giới hạn EcoRI (ít có = 4096 bases) có trình tự nhận biết 6 base và MseI (thường có = 256 bases) có trình tự nhận biết 4 base, cắt DNA khuôn thành những phân đoạn. Hai enzym giới hạn này được dùng để sắp xếp lại DNA nhờ kết hợp với 2 adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA không trở lại hình dạng ban đầu

AATTC G

T

AAT

Ligation:
Nối với EcoRI adaptor và MseI adaptor, là những oligonucleotide sợi đôi gắn vào 2 đầu phân đoạn DNA. Cấu trúc của hai adapter như sau :
EcoRI Adapter

G CTTAA

TAA T

MseI Adapter

EcoRI Adapter

G AATTC

CTTAA G

TTAA AAT T

MseI Adapter

III. TIỀN KHUẾCH ĐẠI: - Chạy PCR với các mồi (primer) chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3 phần: trình tự nồng cốt (CORE) + trình tự theo enzyme (ENZ) + trình tự chọn lọc (EXT) (theo định hướng của người nghiên cứu ký hiệu là NNN, có thể là TGA hoặc AAC hoặc CTG...). - Nhờ vậy, chỉ những phân đoạn có nu bổ sung được với nu chọn lọc được nhân lên. Sự khuếch đại chọn lọc như vậy làm giảm số lượng phân đoạn hàng ngàn lần. Chỉ những đoạn DNA ngắn có một đầu là primer MseI và một đầu là primer EcoRI là được khuếch đại đáng kể, các đoạn có hai đầu là EcoRI bị mất đi do số lượng ít và hai đầu là MseI tự tạo thành vòng nhỏ DNA do cạnh tranh với primer. Sản phẩm tiền phản ứng được pha loãng và được dùng làm vật liệu để khuếch đại với đoạn mồi chọn lọc màu huỳnh quang. - Phản ứng tiền khuếch đại DNA được thực hiện trong thể tích 50 µl gồm: nước cất 2 lần, PCR buffer, MgCl2, mồi EcoRI-O và MseI-G, dNTPs, taq polymerase và 5µl, DNA đã qua cắt nối.

28 chu kỳ Nhiệt độ 94o 94o 72o 1:00 60o 1:00 4o ∞

Thời gian 2:00 0:30

Chu kỳ nhiệt của phản ứng tiền khuếch đại

IV. KHUẾCH ĐẠI : Sản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được dùng làm khuôn cho bước khuếch đại sau đó, sử dụng primer có gắn 3 nu chọn lọc ở đầu 3’ và chỉ EcoRI primer được đánh dấu huỳnh quang ở đầu 5’. Vì vậy, chỉ những sợi chứa EcoRI được phát hiện trên máy ABI 310. PCR được xảy ra với thông số miêu tả bởi Cervera và ctv (1996). Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc. Nhiệt độ này giảm dần sẽ làm tăng sự kết hợp. Sử dụng primer gắn với 3 nu chọn lọc sẽ giúp hạn chế việc bắt cặp sai (mismatch), chỉ nhân lên một số lượng lớn những băng chuyên biệt. Thành phần phản ứng gồm: nước cất 2 lần, PCR buffer, MgCl2, mồi EcoRIATC được nhuộm với màu NED hoặc HEX và MseI-GGC, dNTPs, taq polymerase và 5µl DNA đã qua tiền khuếch đại. Đánh dấu phóng xạ. Sau đó thêm 15µl dung dịch đệm formamide vào 1,5µl DNA và đun nóng 5 phút ở 950C. Ngoài ra, việc khuếch đại qua 2 bước có những thuận lợi hơn khuếch đại trực tiếp như: - Phổ diện rõ hơn vì không có quá nhiều loại marker. - Qua bước tiền khuếch đại, tạo lượng DNA khuôn cho sự khuếch đại dễ dàng và hiệu quả hơn.

- Sau khi xong phản ứng, mẫu được biến tính bằng cách thêm một lượng tương đương thể tích 15µl dung dịch đệm Formamide và đun nóng 5’ ở 95oC. 1ml mỗi mẫu được nạp tự động vào ống mao quản (capilary) polymer ABI 310.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng khuếch đại

V. ĐIỆN DI VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ Trong quá trình điện di do có điện tích và khối lượng khác nhau, những phân tử và những hạt trong một hỗn hợp sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và phân tách thành những tiểu phần khác nhau. Những đoạn DNA có kích thước khác nhau cũng sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau trong điện trường, tạo nên những tiểu phần khác nhau. Có nhiều phương pháp khác nhau để có thể phát hiện các băng DNA sau điện di. * Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di DNA:
- Bản chất và nồng độ gel: Gel Polyacrylamide (PA) được sử dụng đầu tiên

bởi Raymond và W EINTRAU (1959). Gel có tích chất trơ và ổn định về mặt hóa học. Gel được tạo thành qua phản ứng polymer hóa từ các monomer của acrylamide và N, N-methylen bis acrylamide khi có chất xúc tác là ammonium persulfat (APS) và TEMED trong phản ứng . Kích thước lỗ của gel PA có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi nồng độ tổng số acrylamide và mức độ liên kết ngang. Gel PA biến tính được polymer hóa với sự có mặt của các thành phần như urea

hay là foocmamide. DNA biến tính di chuyển qua gel này với tốc độ gần như độc lập với thành phần và trình tự của bazơ. Gel PA biến tính thường được sử dụng trong việc tinh khiết các mẫu dò(probe) DNA có gắn phóng xạ , phân tích các sản phẩm phân cắt bởi nucleaza S1 và phân tích các sản phẩm của quá trình giải trình tự DNA. Gel PA khi được pha chế với một số hóa chất khác tạo thành một chất có tên gọi là POP, dùng để làm môi trường điện di trong mao quản ở các máy giải trình tự bằng mao quản. Đây là những máy giải trình tự tự động rất hiệu quả nhưng lại quá đắt. Trong điều kiện Việt Nam hiện tại thì chúng ta chỉ tham khảo khả năng phân tách của gel PA trên bản gel. Phạm vi phân tách của gel PA biến tính được thể hiện ở bảng sau: Nồng độ % gel PA/ure 4 6 8 10 12 Khả năng phân tách(bp) >250 60- 250 40- 120 20-60 10-50

Tuy gel acrylamide đắt và độc hơn so với gel agarose nhưng nó có những ưu điểm nổi bật so vớ gel agarose: Khả năng phân tách rất tốt, có thể phân tách được những đoạn DNA chỉ khác nhau 1bp. Chạy được với điện áp cao nên tiết kiệm được thời gian. - Hiệu điện thế và cường độ dòng điện. - Quan hệ giữa hiệu điện thế và chiều dài gel: Để tạo ra một điện trường cần phải có một hiêu điện thế. Hiệu điện thế được tính bằng tích của điện trường với chiều dài phân tách. Như vậy, gel càng dài thì hiệu điện thế sử dụng càng phải lớn để tạo ra được một điện trường nhất định trên toàn bộ bản gel.

- Nhiệt độ đối với quá trình điện di: Quá trình điện di sẽ sinh ra năng lượng mà hầu hêt năng lượng này chuyển thành nhiệt năng. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phân tách các sơi DNA trên gel PA biến tính trong khoảng 500C. Nhiệt độ này được điều khiển bằng việc tăng giảm các giá trị hiệu điện thế và công suất khi điện di. * Thành phần dung dịch đệm điện di: Sự di chuyển của DNA trong điện trường bị ảnh hưởng bởi thành phần và lực ion của đệm điện di. Có một vài loài đệm khác nhau dùng cho điện di DNA như TAE, TPE, TBE. Những đệm này có chứa EDTA pH=8 với Tris- acetat (TAE), Tris- borate(TBE) hoặc Tris- Photphat (đệm TPE) có nộng độ xấp xỉ 50ml (pH =7.5-7.8). Hiện nay thì đệm TBE được sử dụng rộng rãi hơn cả vì sự ổn định về thành phần của nó. * Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích formamide dye được thêm vào phản ứng. Mẫu được biến tính bằng nhiệt ở 950C trong 3 phút và đặt ngay vào đá. Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide: bisacrylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ). Bản gel được cố định trong axit axêtic 10%, nhuộm trong bạc nitrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5% và cố định lại trong axit axêtic 10%. C. MỘT ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT AFLP Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao và được nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam Á. Ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giống thuần hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc. Cá thương phẩm có giá trị trên thị trường cả trong và ngoài nước. Hiện cả nước có trên 14 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra, ba sa với kim ngạch hàng năm trên 60 triệu USD. Nâng cao hiệu suất nuôi trồng để tăng lợi nhuận luôn là mục tiêu của các nhà sản xuất. Bên cạnh những nghiên cứu nhằm tăng hiệu quả sinh sản, dinh dưỡng, việc cải tạo giống để tạo những dòng cá có

năng suất cao được chú trọng. Chương trình lai tạo, chọn giống truyền thống luôn đóng vai trò chủ đạo trong cải tạo giống. Nhờ vào kỹ thuật cho phép tuyển chọn đồng thời trên toàn bộ hệ gen và tạo ra một số lượng lớn chỉ thị có thể chuyển đổi thành chỉ thị đặc hiệu vị trí đơn giản (simple locus-specific markers) mà không cần biết trước thông tin của trình tự đặc hiệu đó. Phát triển chỉ thị AFLP liên quan tính trạng quan tâm có thể dựa trên sự phân bố ngoại hình của hai quần thể đối lập nhau hoặc dựa trên đa hình di truyền ở hai nhóm cá thể đối lập nhau. Phương pháp này có ưu điểm không cần thiết lập bản đồ di truyền và tạo ra các phả hệ đặc biệt, nên thích hợp cho phát hiện vị trí tính trạng định lượng (QTL) trực tiếp từ các quần đàn thương phẩm có tuổi thành thục dài như cá tra (2-3 năm). Với mục đích phát triển chỉ thị AFLP trực tiếp từ quần đàn thương phẩm, phân tích đa hình AFLP giữa hai nhóm cá tra có trọng lượng cực lớn và cực nhỏ.

Đa hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/MCAG. ( 1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần số khác nhau) Tổng cộng có 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là 4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác nhau nên chúng tôi đã tính tần số khác biệt giữa hai nhóm. Kết quả được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhóm cá tra Những băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% được thể hiện ở bảng 3.

Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt trên 50 %. Kết quả trên cho thấy, chỉ có 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. Để kiểm tra mức độ ổn định và tin cậy của các băng AFLP, người ta đã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng mẫu lớn hơn (18 mẫu). Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA đạt độ chênh lệch giữa 2 nhóm cá thí nghiệm là 56% và 50%. Do có tính ổn định tương đối, rõ nét và ưu thế cho nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng AFLP này được tách dòng và đọc trình tự

nhằm mục đích xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng của cá tra. Phân tích đa hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ đa hình trong loài tương đối thấp, trung bình 1,35%. Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin cậy trong việc xác định các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế. So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%. Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi E-ACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định, và vẫn giữ được tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn. Hai băng này sẽ được sử dụng để tuyển chọn lại trong quần đàn.
Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

PHẦN KẾT LUẬN

Marker phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và cải tiến di truyền ở nhiều loại cây trồng và vật nuôi. Nhờ markers phân tử chúng ta có thể đánh giá được sự đa dạng sinh học, xây dựng lại phả hệ và hiểu cấu trúc, sự tiến hóa và mối quan hệ giữa các cá thể trong quần thể cây trồng. Hệ thống marker phân tử cho biết sự biến thiên về trật tự ADN trong hệ genome. Trên thế giới, các nghiên cứu về di truyền đã sử dụng nhiều loại marker khác nhau như RFLP, RAPD, SSR và ISSR, trong đó có AFLP. AFLP là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, dùng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. AFLP nhanh, đơn giản, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. AFLP được sử dụng trong việc xác định tính đa hình giữa các các giống loài, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và ctv., 1995), tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống, đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống, là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể. Đồng thời thông tin di truyền từ các vật liệu nghiên cứu sẽ góp phần giúp định hướng cho các phép lai trong công tác chọn giống.