CROMATOGRAFIA

Cromatografia separrilor analitice. Toate metodele cromatografice implic: faz staionar; o faz mobil. Componentele unui amestec sunt trecute peste faza staionar cu ajutorul fluxului fazei mobile. Separrile se bazeaz pe diferenele dintre vitezele de migrare ale componentelor probei. Componentele ce urmeaz a fi separate trebuie s fie solubile n faza mobil, astfel incat n timpul separrii ele sunt distribuite ntre cele dou faze. Cromatografia pe coloan Faza staionar este depus ntr-un tub ngust de sticl sau metal. Faza mobil care poate fi lichid sau gaz, este forat s treac prin solid cu ajutorul presiunii sau este lsat s treac (s se infiltreze) datorit forei gravitaionale. este o metod de realizare a

Cromatografia plan Faza staionar este depus pe o plac de sticl sau plastic. Faza mobil se deplaseaz prin solid, fie prin aciune capilar, fie sub aciunea gravitaiei.

Clasificarea separrilor cromatografice

Denumire Tipul fazei mobile Gaz Tipul fazei staio nare Lichid Metoda de fixare a fazei staionare Adsorbit ntr-un solid poros fixat ntr-un tub, sau adsorbit pe suprafaa intern a unui tub capilar. Fixat ntr-o coloan tubular Adsorbit ntr-un solid poros fixat ntr-o coloan tubular

Gaz-lichid

Gaz-solid Lichid sau de repartiie Adsorbie Hrtie Start subire Gel Schimb ionic

Gaz Lichid Lichid Lichid Lichid Lichid Lichid

Solid Lichid Solid Lichid

Fixat ntr-o coloan tubular Fixat n porii unei hrtii groase Lichid Solid fin divizat depus pe o sau plac de sticl; lichidul poate fi solid adsorbit pe particule Lichid Fixat n interstiiile unui solid polimeric Solid Rin schimbtoare de ioni fin divizat fixat ntr-o coloan tubular

Toate separrile cromatografice se bazeaz pe diferenele de repartiie ale soluilor ntre faza mobil i faza staionar. Echilibrul implicat poate fi descris cantitativ cu ajutorul coeficientului de repartiie K, care pentru cromatografie este definit astfel:

K
Unde:

C S C M

CS este concentraia analitic a solutului n faza staionar; CM este concentraia sa n faza mobil. La concentraiile sczute folosite n cromatografie, K va fi aproximativ constant astfel nct va exista o relaie liniar ntre CS i CM. Cromatografia realizat n aceste condiii se numete cromatografie liniara. n cromatografia de eluie, se introduce o singur poriune a probei dizolvate n faza mobil pe la captul coloanei n care componentele probei se vor distribui ntre cele dou faze. Intoducerea unei faze mobile adionale (eluentul) foreaz solventul coninnd o parte a probei n josul

coloanei, unde apare o repartiie suplimentar ntre faza mobil i zonele "proaspete" ale fazei staionare. Prin adugarea unor noi poriuni de solvent se va realiza trecerea moleculelor solutului n josul coloanei printr-o serie continu de tranziii ntre faza mobil i faza staionar. Deoarece deplasarea solutului poate avea loc doar n faza mobil, viteza medie de migrare a solutului depinde de fracia de timp pe care o petrece n acea faz. Viteza de deplasare a unui component, reprezint o fraciune din viteza de migrare a solventului. Viteza frontal de migrare, caracterizat de factorul Rf, se definete prin raportul:

Rf =

viteza frontului adsorbit viteza fazei mobile

<1

P ro b A + B A B

S o lv e n t

Reprezentare schematic a eluiei

A B

C o lo a n c u u m p lu tu r

separrii cromatografice a
A

componentelor A i
A

D e te c to r

B ale unui amestec.

A

S e m n a l B T im p s a u V o lu m

Separarea a doi componeni A i B ai unei probe, este cu att mai bun cu ct raportul valorilor RfA/RfB este mai diferit de unitate. n cazul n care ambele valori RfA i RfB sunt apropiate de unitate, nu se pot realiza separri eficace, deoarece compuii vor migra ntr-un interval de timp doar cu puin mai lung dect cel necesar deplasrii fazei mobile de-a lungul coloanei. Procesul descris anterior n decursul cruia solutul este "splat" prin coloan prin adugarea de solvent proaspt se numete eluie.

Izotermele de repartiie sunt curbele ce redau concentraia componentului cromatografic n faza staionar (CSA) n funcie de concentraia aceluiai component n faza mobil (CMA). Ele sunt dependente de temperatur. Deoarece n cromatografia uzual, afinitatea componenilor fa de faza staionar este determinat de adsorbie, aceste tipuri de curbe se numesc izoterme de adsorbie.
CSA CS t1
A

t1 < t2 CSA t1 t1 t2

t2

t2

CM

CMA

CM

Izoterme de repartiie Deoarece procesul de adsorbie este exoterm, creterea temperaturii defavorizeaz fixarea componentului, i n consecin izotermele vor avea pante mai accentuate la temperaturi mai joase. Fixarea componentului cromatografic este reversibil; prin urmare, la o valoare CMA =0 va

corespunde CSA =0, adic toate izotermele trec prin origine. O cromatogram furnizeaz doar o singur informaie calitativ despre fiecare specie din prob, i anume timpul su de retenie sau poziia sa n faza staionar dup o anumit perioad de eluie. Numrul datelor obinute pentru o specie chimic prin cromatografie este mic n comparaie cu cele furnizate dintr-o singur analiz de IR, RMN sau spectroscopie de mas. CROMATOGRAFIA PLAN Exist dou tipuri de cromatografie plan:

cromatografia pe hrtie cromatografia pe strat subire n cromatografia pe hrtie, se folosete drept mediu o foaie sau o bucat de hrtie de filtru groas. n cromatografia pe strat subire, separarea are loc ntr-un strat de solid fin divizat care a fost fixat pe o suprafa suport plan.

Att cromatografia pe hrtie ct i cea n strat subire ofer mijloace deosebit de simple i ieftine pentru separarea i identificarea componentelor unor mici probe complexe de substane anorganice, organice sau biochimice.

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBIRE

Prezint unele avantaje fa de cromatografia pe hrtie, deoarece se pot realiza separri mai nete i mai rapide, are o sensibilitate mai ridicat i se poate adapta i la separarea unor amestecuri avnd concentraii mai mari. Separrile pe strat subtire sunt influenate de procesele de adsorbie, repartiie, excludere (difuzie) i schimb ionic. Stratul este o faz staionar subire depus pe o plac de sticl, de plastic sau de metal. Faza staionar Solidele adsorbante (i uneori absorbante) utilizate pentru cromatografia pe strat subire sunt similare din punct de vedere al compoziiei chimice i a dimensiunii

particulelor cu cele folosite la realizarea diferitelor faze staionare n cromatografia pe coloan. Stratul subire este realizat dintr-un suport activ i un liant, ce confer printre altele rezisten stratului. Substana cel mai des utilizat drept suport este silicagelul. Acesta este frecvent folosit ca suport pentru ap sau ali solveni polari n separrile lichid-lichid. Un alt suport des utilizat este alumina. Drept supori, mai pot fi folosii celuloza, diatomita i diveri polimeri organici. Dou tipuri de dispozitive pentru cromatografia pe strat subire:

B S C C Flux S D Flux

a. flux ascendent; b. flux descendent; S: D: C: B: poziia iniial a probei (start); developator; suprafaa cromatografic; mpletitur de

a.

b.

bumbac.

ALEGEREA SOLVENTILOR Condiia general impus solvenilor cromatografici este anhidritatea perfect. Aezarea solvenilor uzuali n ordinea puterii de eluare se numete serie eluotropic. Seria eluotropic, dup Trappe 1. eter de petrol 2. hexan 3. ciclohexan 8. cloroform 9. eter etilic 10. acetat de etil

4. tetraclorur de 11. aceton carbon 5. toluen 6. benzen 7. clorur metilen 12. alcool etilic 13. alcool metilic de 14. ap

Valorile Rf depind de polaritatea fazei mobile, crescnd odat cu aceasta.

Solveni utilizai frecvent n cromatografia pe strat subire Solveni hexan hexan + eter etilic + amoniac (1%) cloroform (70%) + metanol (25%) compui cu caracter + amoniac (5%) - saturat n NH3 acid bazic cloroform (50%) + benzen (50%) compui cu caracter Tipuri de amestecuri hidrocarburi, compui carbonilici Alcooli cloroform (85%) + metanol (14%) solvent universal

Se depune o pictur de prob pe o plac cromatografic, dup care, peste spotul format se pipeteaz puin eluent. Test preliminar pentru alegerea solventului optim n cromatografia pe strat subire

a.

b.

c.

Eluentul cel mai indicat va forma mai multe zone inelare, separate i suficient de apropiate de centru (a), n timp ce un solvent ce conduce la o zon punctiform nu are o putere de eluie suficient (b), iar unul ce formeaz un inel mare cu componenii plasai spre periferie arat o putere de eluare prea mare (c).

ANALIZA CANTITATIVA
Cantitatea unui component este caracterizat de suprafaa i intensitatea spoturilor. O estimare semicantitativ a cantitii unui component prezent, poate fi obinut prin compararea ariei spotului cu cea a unui standard. Dup vizualizarea spotului, se calculeaz imediat valorile Rf, datorit posibilitii de apariie a fenomenului de atenuare, mai ales n cazul relevrii (vizualizrii) chimice. Zona este ncercuit cu un creion (sau se zgrie stratul subire), se msoar distanele parcurse de zone i frontul de solvent, iar valoarea Rf se calculeaz astfel:

Rf = hs hf
hf hS Frontul de solvent

Linia de start

hS - Distana parcurs de solut. hf - Distana parcurs de solvent. Evaluarea valorilor Rf poate fi utilizat i n scopuri calitative prin compararea cu valorile Rf ale unor compui cunoscui.

CROMATOGRAFIA PE HRTIE
Cromatografia pe hrtie este, n mod deosebit, o cromatografie de repartiie. Aceast metod poate fi descris ntr-o manier simplificat ca fiind trecerea unei faze mobile lichide prin structura poroas a hrtiei, care conine faza staionar. Developarea se termin

nainte ca faza mobil s ating marginea superioar a hrtiei, astfel nct zonele sunt distribuite de-a curmeziul hrtiei. Fa de cromatografia pe strat subire, aceast metod are o serie de dezavantaje, cum ar fi: timpii de developare mai lungi, delimitarea destul de slab a zonelor, exactitatea destul de slab n analizele cantitative, iar uneori dificultatea de reproducere a condiiilor de developare. FAZA STAIONAR n general, hrtia este compus din fibre de celuloz direcionate n mod dezordonat. Se folosesc de obicei hrtii speciale de nalt puritate i reproductibile din punct de vedere al porozitii i grosimii. Astfel de hrtii conin suficient de mult ap, astfel nct s putem considera cromatografia pe hrtie ca fiind de tip lichid-lichid.

Tipuri de faze staionare folosite n cromatografia pe hrtie Faza staionar Apoas Hidrofil Hidrofob apa; soluii tamponate atmosfer saturat cu ap alcool metilic; formamida; glicolii; glicerolul dimetilformamida; hidrocarburi aromatice i alifatice; kerosen; solveni oxigenai + Solveni utilizai

FAZA MOBIL Exist o larg varietate de combinaii de faze staionare i mobile, nefiind neaprat necesar ca cele dou sisteme s fie nemiscibile. Faza mobil utilizat este format de obicei din diferite combinaii de solveni, soluii de sruri i soluii tampon Alegerea optim a condiiilor de eluie se face n urma unor testri preliminare.

Tipuri de faze mobile utilizate n cromatografia pe hrtie Faza mobil Ap - fenol Tipuri de amestecuri separate Substane hidrofile

Izopropanol - amoniac - Substane hidrofile ap (9:1:2) n-Butanol - acid acetic - Substane hidrofile ap (4:1:5) Formamid - benzen Formamid - benzen ciclohexan Formamid - cloroform Formamid - cloroform - benzen Dimetilformamid ciclohexan Kerosen - izopropanol Substane intermediar hidrofile Substane intermediar hidrofile Substane intermediar hidrofile Substane intermediar hidrofile Substane hidrofobe Substane hidrofobe

PROCEDEE CARACTERISTICE CROMATOGRAFIEI PLANE

Dup obinerea hrtiei sau a stratului dorit,

procedeele experimentale pot fi mprite n cinci etape de baz, i anume: tratamentul pregtitor; aplicarea probei; developarea; vizualizarea; interpretarea datelor. TRATAMENTUL PREGATITOR Se realizeaz n funcie de tipul cromatografiei (de repartiie sau de adsorbie) i aplicarea final. Adsorbanii au poziii adsorbante cu activiti diferite i rein, mai puternic, apa. Pentru ca adsorbia s fie folosit la capacitatea sa maxim, adsorbantul trebuie s fie ntr-un anumit grad de uscare (s fie activat). Adsorbanii nu trebuie s fie supui la o temperatur de uscare prea nalt sau un timp de uscare prea

ndelungat, deoarece pot avea loc transformri chimice, care vor conduce la un comportament adsorbant modificat. APLICAREA PROBEI nainte de aplicarea probei, pe hrtie sau pe plac se traseaz linia de start, care reprezint locul unde va fi aplicat proba, i care trebuie s fie suficient de departe de marginea hrtiei sau plcii, astfel nct s nu fie scufundat n sistemul de solvent utilizat pentru developare. Instrumentele cele mai utilizate la aplicarea probelor sunt pipetele (micropipete), capilarele de precizie i microseringile. DEVELOPAREA n vederea realizrii unei separri corespunztoare, este necesar ca procesul cromatografic s aib loc ntro camer de developare saturat n faz mobil.

De

remarcat

asigurarea

unei

developri

corespunztoare presupune o bun etanare la aer a camerelor de developare. Developarea ascendent presupune urcarea fazei mobile din rezervor pe hrtie sau pe stratul subire, n timp ce developarea descendent are loc atunci cnd faza mobil coboar din rezervor. Datorit rezistenei mecanice convenabile este preferat developarea ascendent n cazul cromatografiei pe strat subire, spre deosebire de cromatografia pe hrtie cnd se prefer developrarea descendent ca urmare a unei rezistene mecanice slabe.
S up ort

Sup ort H H Flu x P S Flux

Camere de developare folosite n cromatografia pe hrtie. a. Developare ascendent. b. Developare descendent. H - hrtie de filtru; P - prob; S - solvent de developare; Flux - curgerea solventului.

a.

b.

RELEVAREA Dup terminarea developrii, se procedeaz la

relevarea (vizualizarea) spoturilor. Detectarea se poate face direct dac compuii sunt colorai sau fluoresceni. O alt metod des utilizat este aceea a pulverizrii unei soluii care s conduc la formarea unor compui colorai cu speciile prezente pe hrtie sau plac. Dup vizualizarea spotului se calculeaz valoarea Rf. Aceste valori Rf se pot utiliza n scopuri calitative, prin compararea cu valorile Rf ale unor compui cunoscui. Cromatografia plan are numeroase aplicaii n monitorizarea biologie. calitii mediului,biochimie, farmacie,

CROMATOGRAFIA DE GAZE

Cromatografia

de

gaze

este

variant

cromatografic folosit pentru separarea amestecurilor de gaze sau lichide volatile, bazat pe repartiia diferit a componenilor amestecului de analizat ntre dou faze: o faz staionar solid (cromatografia de adsorbie) sau lichid depus pe un suport solid inert (cromatografia de repartiie) i o faz mobil gazoas (gazul purttor). Ca urmare a repartiiei diferite a componenilor din amestec ntre cele dou faze i a fenomenelor de transfer de mas prin difuzie ce au loc n coloana cromatografic, se realizeaz o deplasare cu viteze diferite a acestora prin coloan, componenii prsind coloana ealonat n timp. Acetia ajung apoi ntr-un sistem de detecie, dnd natere unui semnal electric proporional cu concentraia (masa) lor, care, ulterior este amplificat i nregistrat sub forma unei cromatograme. Pentru un component "i" prezent n amestec, constanta de distribuie ntre cele dou faze este dat de relaia:

Ki =

concentratie component in faza satationara concentratie component in faza mobila

Cu ct componenii amestecului de analizat au constante de distribuie mai diferite, cu att separarea cromatografic realizat este mai bun. Valorile acestor constante de distribuie depind de natura componenilor de separat, de ansamblul faza staionar - faz mobil ales i de temperatura din coloan.
5 7 8 3 2

<<

4 1 6

Schema bloc a unei instalaii gaz cromatografice rezervorul cu gaz purtator care joac rol de faza mobil (1); dispozitivul de msurare i reglare a presiunii gazului purttor (2); dispozitiv de injectare a probei n coloan (3); coloana cromatografic (4); detector (5); termostat (6); amplificator (7); nregistrator (8).

Faza mobil, care este de obicei un gaz inert (heliu sau azot) trece continuu prin sistemul cromatografic transportnd proba aflat n stare de vapori. n coloan, separarea are loc datorit adsorbiei sau respectiv, repartiiei componenilor probei pe faza stationar solid sau lichid. Dup separare, fiecare component este detectat pe masur ce prsete coloana cromatografic i este nregistrat sub forma unui pic cromatografic. Gazul purtator utilizat drept faz mobil trebuie s fie un gaz inert, care s nu interacioneze cu proba, i care s permit o funcionare adecvata a detectorului utilizat. Presiunea i debitul acestuia n coloan sunt controlate cu ajutorul unui reductor de presiune i a unui debitmetru.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE PE COLOAN

Cromatografia de lichide pe coloan este o variant cromatografic n care componenii amestecului de analizat se separ datorit migrrii lor difereniale de-a lungul unei coloane umplut cu o faz staionar solid sau lichid pe suport inert sub influena unei faze mobile lichide. Separarea are loc pe baza unui proces de adsorbie (cromatografia solid lichid, CLS) sau repartiie (cromatografia lichid - lichid, CLL) al componenilor ntre cele dou faze, proces ce se produce n mod repetat pn la prsirea coloanei cromatografice. n funcie de modul de lucru exist mai multe tehnici de lucru care se deosebesc ntre ele prin modul de realizare a separrii cromatografice, i anume: (1) Cromatografia prin eluie (2) Cromatografia frontal (3) Cromatografia prin deplasare Dintre aceste procedee, cel mai utilizat este primul. n cromatografia prin eluie, proba se introduce cu ajutorul unei micropipete sau al unei microseringi n cantitate mic la captul coloanei, dup care se adaug

lichidul ce funcioneaza drept faz mobil, numit eluent. Componenii probei sunt antrenai de faza mobil de-a lungul coloanei, realizndu-se astfel separarea lor, datorit constantelor de repartiie/adsorbie K = [Ci]S/[Ci]M diferite. La baza coloanei, componenii sunt colectai sub forma unor fraciuni i analizai, metoda permind att determinarea calitativ ct i cantitativ a componenilor dintr-un amestec.

R1

R2 3 P

1 2 4

a b

5 D I C

6 8 CF

Schema bloc a unui cromatograf de lichide sub presiune

1 - rezervoare de solveni (faze mobile); 2 - dispozitiv de pompare i producere a gradientului de faza mobil; 3 - injector; 4 - coloana analitic (a) i coloana de referin (b); 5 - detector; 6 - nregistrator; 7 - calculator; 8 - colector de fraciuni. n cromatografia de lichide sub presiune, coloanele trebuie s reziste la presiuni ridicate, ceea ce impune etaneizari la capete. Aceste coloane cromatografice sunt umplute cu faze staionare solide sau lichide depuse pe suport solid inert. n cromatografia de adsorbie, ca faza staionar solid se folosesc diferite materiale pulverulente, dintre care cele mai utilizate sunt alumina i silicagelul. ntr-o msur mai mic se folosesc, de asemenea, silicatul de magneziu, pmntul diatomitic, pulberea de zahr, precum i o serie de adsorbeni modificai.

cromatografia frecvent

de

repartiie,

ca

suport

se

folosete diatomitic.

celuloza,

silicagelul,

pmntul

CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic este o metod de separare bazat pe echilibre de schimb ionic ntre o faz staionar schimbtoare de ioni i o faz mobil lichid ce conine substane ionizabile supuse procesului de analiz. Reacia de schimb ionic ce are loc n cazul unei astfel de separri este o reacie reversibil i pe aceast proprietate de reversibilitate se bazeaz posibilitatea de regenerare a fazei staionare schimbtoare de ioni. O astfel de reacie poate fi reprezentat prin ecuaia:

RX

s c him b ionic regenerare

RY

unde X i Y sunt specii ionice cu aceeai sarcin electric.

Schimbtorii de ioni utilizai drept faze staionare sunt materiale insolubile n cei mai muli solveni avnd grefate grupe funcionale ionizabile a cror sarcin electrostatic este neutralizat de ioni mobili (contraioni) ce pot fi nlocuii cu ioni de aceeai sarcin, prezeni n soluia de analizat. Dintre acestea, cel mai des utilizate sunt rinile sintetice schimbtoare de ioni, datorit proprietilor lor mecanice bune, a stabilitii lor chimice i a uniformitii lor granulometrice. Ele sunt constituite dintr-o reea polimeric tridimensional (obinut printr-o reacie de copolimerizare sau policondensare) pe care sunt grefate gruprile Dup funcional ionizabile semnul ce le confer purtat fixat proprieti de pe de schimbtori de ioni. sarcinii gruparea reeaua ionizabil

macromolecular, se disting dou categorii de rini schimbtoare de ioni: rini schimbtoare de cationi (cationii) avnd grefate grupri sulfonice - SO3-, carboxilice - COO-, aminodiacetice - N(CH2COO-)2, fosforice - PO32-, etc.

 rini schimbtoare de anioni (anionii) avnd grupri de amoniu cuaternar - NR3+, amoniu teriar - NHR2+, fosfoniu - PR3+, etc.