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Microbiologa del petrleo y sus derivados


Brenda Valderrama y Juan Tllez-Sosa,
Instituto de Biotecnologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, AP 510-3, Cuernavaca, Mor. 62250 Mxico.

Introduccin La industria del petrleo es caracterstica de nuestra poca. Cada ao se extraen cerca de un milln de toneladas de petrleo de yacimientos subterrneos, algunos de ellos en mar abierto. La mayor parte se utiliza como combustible en forma de gasolina, diesel, turbosina, etc., y junto con algunas fracciones voltiles (metano, propano y butano) son nuestra principal fuente de energa, tanto industrial como domstica. Alrededor de 15% del petrleo es utilizado como insumo para la sntesis de otros compuestos, principalmente plsticos, un grupo heterogneo que incluye poli alquenos (como el polietileno, poli butileno, polipropileno), poli estirenos y cloruro de polivinilo (PVC). El resto del petrleo, las fracciones ms pesadas y menos valiosas llamados asfaltenos, se utilizan como pavimento. Qumicamente, el petrleo es una mezcla compleja de hidrocarburos, es decir, de compuestos ricos en carbono e hidrgeno, aunque contiene otros elementos minoritarios como azufre, oxgeno y nitrgeno, as como trazas de metales. Es compleja porque dada la capacidad del tomo de carbono de formar cuatro enlaces con otros tomos de carbono, se pueden organizar como cadenas o como ciclos (Tabla 1) . Las cadenas se conocen como compuestos alifticos, y consisten en sucesiones de tomos de carbono unidos entre s por enlaces sencillos (alcanos), dobles (alquenos) o triples (alquinos) mientras que el resto de las valencias son ocupadas por hidrgenos. Los alcanos son la familia ms numerosa en el petrleo crudo y se conocen como parafinas, pueden ser lineales o ramificados y su longitud vara de 1 a 40 carbonos, aunque se ha logrado detectar cadenas de 60 carbonos. Los alquenos son conocidos como olefinas y son una fuente valiosa de reactantes para la industria sinttica. Los ciclos pueden ser saturados, donde varios carbonos se unen entre s por medio de enlaces sencillos, pueden ser aromticos, donde algunos carbonos del ciclo estn unidos por enlaces dobles. Los ciclos saturados se conocen como ciclo-alcanos, ciclo-parafinas o naftenos y son un componente minoritario del petrleo crudo. Los compuestos aromticos son derivados del benceno, un anillo de seis carbonos unidos
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por tres enlaces sencillos y tres enlaces dobles alternados. Los anillos pueden encontrarse fusionados entre ellos o sustituidos con cadenas alifticas. Los hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) poli ncleo-aromticos comprenden del 10 al 25% del petrleo crudo y son las fracciones ms pesadas (Tabla 1). Para la industria petroqumica, la propiedad fsica del petrleo ms importante es la temperatura de ebullicin ya que sus componentes suelen ser separados por destilacin mediante el incremento de la temperatura en etapas. Como pueden observar en la Tabla I las molculas ms pequeas son voltiles a temperatura ambiente y conforme aumenta su masa molecular lo hace tambin su punto de ebullicin. Una vez separadas a temperaturas especficas, cada fraccin es sometida a diferentes procesos de purificacin, dependiendo el uso al que estn destinadas. El contenido de azufre y de metales pesados afecta el valor del petrleo crudo y de sus fracciones, ya que los procesos de remocin son costosos (ver ms adelante). Mxico es un pas exportador de petrleo, tenemos importantes yacimientos en explotacin en las zonas del Golfo de Mxico y en el Istmo de Tehuantepec y otros ms en reserva. Desde la expropiacin de 1936, el petrleo existente bajo el suelo de nuestro pas no puede pertenecer a particulares, sino que es administrado por el gobierno federal a travs de la compaa paraestatal Petrleos Mexicanos (http://www.pemex.com). Las divisas obtenidas por la venta de petrleo crudo y sus derivados son la principal fuente de ingresos para nuestro pas. La produccin y el consumo de petrleo son de vital importancia en las relaciones internacionales y ha sido frecuentemente un factor decisivo en la determinacin de polticas exteriores. La posicin de un pas en el sistema depende en su capacidad de produccin relacionada con su consumo. Para cualquier pas, la presencia o ausencia de yacimientos de petrleo dentro de sus fronteras ha sido de considerables consecuencias en su economa, siendo uno de los factores determinantes entre ser un pas rico un pas pobre. Existen numerosos estudios sobre la composicin y el procesamiento del petrleo por lo que en este captulo nos limitaremos a revisar aquellos aspectos donde se han utilizado microorganismos, ya sea en la produccin y en la depuracin del petrleo, o posteriormente en la descontaminacin por degradacin. Este ltimo tema es especialmente importante para nuestra generacin, ya que el uso masivo de derivados del petrleo ha incrementado la concentracin de compuestos xenobiticos en la biosfera. Por xenobitico entendemos aquellos compuestos que no
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provienen de los ecosistemas y por lo tanto, no existen actividades enzimticas capaces de utilizarlos eficientemente. En algunos casos, los xenobiticos no son biodegradables, es decir que no son utilizados por microorganismos, sino que se van acumulando en la superficie del planeta. Ejemplo de esto son las toneladas de plaguicidas e insecticidas que se aplican cada ao. Si sumamos el petrleo derramado durante la extraccin o el transporte, veremos que uno de los mayores retos en los prximos aos ser la generacin de tecnologa para su eliminacin. Origen biolgico del petrleo Para comenzar, de dnde proviene el petrleo? Los combustibles fsiles, como el petrleo el carbn de mina, reciben este nombre por provenir de estratos geolgicos de origen orgnico formados hace millones de aos. Se cree que el petrleo proviene de grandes cantidades de plantas y animales marinos cuyos restos fueron cubiertos por sedimentos y formaron depsitos subterrneos. El material biolgico que di origen a los depsitos de petrleo se encuentra fuertemente degradado, por lo que no es fcil inferir los primeros pasos de su conversin. Sin embargo, existen otros tipos de yacimientos de hidrocarburos similares al petrleo conocidos como rocas sedimentarias qumicas, a las cules pertenecen la turba, el lignito pardo, el lignito y el carbn o la hulla, y su estudio ha permitido elucubrar sobre las primeras etapas en la conversin de restos orgnicos en hidrocarburos. Las sustancias ricas en hidrocarburos producidas por destilacin de estos materiales son los kerogenos. El kerogeno se define como un complejo de materia vegetal y animal diagenticamente transformada en el estado slido y de origen saproplico (Figura 1). El material de partida para los kerogenos son las plantas como los equisetos, los licopodios, los juncos, las caas, los arbustos, los musgos pantanosos, entre otros. Se cree que las plantas crecieron en pantanos y lagos de agua dulce, los cuales se inundaron ocasionalmente por mares llanos en un clima subtropical hasta tropical. Con la ausencia de aguas subterrneas circulantes la descomposicin normal de los restos vegetales, que se basa en la presencia de oxgeno, termina enseguida bajo la cobertura de sedimentos y de otros restos vegetales y se forman gases como el dixido de carbono y el metano. A travs de largos periodos de tiempo (millones de aos), estos restos pasaron por dos etapas de degradacin, una biolgica y otra abitica. Se piensa que en la primera etapa, los microorganismos
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anaerbicos convirtieron los restos orgnicos en algo parecido al kerogeno actual. Durante la fase abitica siguiente, las altas presiones y el calor cambian los sedimentos a rocas sedimentarias y el kerogeno a petrleo. Esta conversin parece haber sido catalizada por metales y por las mismas arcillas de los estratos. Gracias a la acumulacin de gases (metano principalmente) que funcionan como propulsor, las pozas subterrneas de petrleo se movilizan hacia los poros y fracturas de las rocas y eventualmente afloran de manera espontnea a ras de suelo. Desde el punto de vista microbiolgico, la identificacin de los microorganismos participantes en la formacin del kerogeno es todo un reto, ya que se trata de partculas microscpicas que existieron hace millones de aos y cuyos remanentes se encuentran enterrados a cientos de metros de profundidad. Sin embargo, se ha logrado identificar algunas especies microbianas viables asociadas a depsitos de petrleo en explotacin mediante herramientas moleculares, aunque no es posible asegurar que provienen del yacimiento y no de contaminacin con especies contemporneas (63, 64, 102). Una alternativa novedosa ha sido la bsqueda de microfsiles asociados a yacimientos de kerogeno. Bajo condiciones muy especiales se ha podido identificar algunos de estos microfsiles como miembros de los grupos cianobacterias y protozoarios (http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artoct99/kamast5.html). Como una alternativa, se ha intentado la identificacin de cierto tipo de molculas orgnicas que slo pueden provenir de organismos vivos, ya sean procariotes o eucariotes. Estos fsiles moleculares se conocen como bioindicadores y son derivados de los lpidos celulares y de membranas. Un estudio de este tipo ha sido aplicado a un yacimiento de kerogeno en Australia y permiti establecer que los tres grandes grupos de seres vivos, eubacterias, arqueobacterias y eucariotes, ya existan hace 3,800 millones de aos y que son participantes potenciales en la fase biolgica de la formacin del petrleo (http://cas.bellarmine.edu/tietjen/Evolution/archean_molecular_fossils_an d_th.htm). Procesos microbianos en la industria petrolera La industria del petrleo es eminentemente qumica, es ms, es la industria qumica por excelencia. La abundancia y el relativo bajo precio del petrleo han generado una intrincada red de industrias dedicadas a la refinacin, depuramiento y utilizacin de prcticamente todas las fracciones del petrleo desde hace ms de un siglo. A pesar de esta
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tendencia, nuestra generacin comienza a ver cambios significativos en esta industria, ya que se estima que la explotacin mundial de crudo decaer irreversiblemente cerca del 2020 (97). Esta condicin impondr, eventualmente, la generacin de nuevas tcnicas de exploracin y, alternativamente, de la explotacin de yacimientos alternativos. Adicionalmente, y en respuesta a la presin ejercida por la opinin pblica, la industria petroqumica se ver en la necesidad de renovar sus procesos para ajustarse a criterios ms estrictos de eficiencia y limpieza (97). Es bajo estas circunstancias que los microbiologos podemos tener una participacin relevante en la nueva industria petrolera. A continuacin revisaremos algunos de los procesos donde se han utilizado microorganismos o derivados de ellos como alternativa a los mtodos tradicionales. Extraccin de yacimientos. Bajo circunstancias ideales, el petrleo surge espontneamente de un pozo en el subsuelo. Sin embargo, aunque en muchas ocasiones se utilizan bombas para acelerar la extraccin, solo se recupera un tercio del volumen del yacimiento, aproximadamente. Se ha implementado una variedad de mtodos fsicos para poder acceder al petrleo remanente en estos yacimientos secundarios, por ejemplo la inyeccin de gases o de agua caliente a alta presin para impulsar el petrleo hacia la superficie. Ninguno de estos mtodos permite recuperar la totalidad del volumen del yacimiento y ha sido necesario generar nuevas tecnologas para poder explotar lo que se conoce como yacimientos terciarios. Entre estas estrategias se encuentran la adicin de solventes, surfactantes y polmeros (86). En particular, un polmero producido por Xanthomonas campestris conocido como goma de xantana, ha sido extensivamente usado debido a sus excelentes propiedades fisicoqumicas, que incluyen una sustancial viscosidad, an a bajas concentraciones, combinada con una alta fluidez, lo que le permite pasar libremente a travs de pequeos poros. La goma de xantana es un heteropolisacrido ramificado cuya cadena principal est formada por residuos de glucosa unidos linealmente mediante enlaces b1_4. La cadena ramificada es un trisacrido formado por glucosa, manosa y cido glucurnico (Figura 2). La demanda mundial por goma de xantana supera las 25,000 toneladas anuales. La produccin de ste polmero a estos niveles ha generado grandes retos tanto a nivel microbiolgico como de ingeniera de bioprocesos (36). Desde el punto de vista microbiolgico,

mencionaremos tres de los aspectos que han sido ms estudiados con la finalidad de incrementar la productividad del proceso. Xanthomonas campestris es una bacteria fitopatgena que infecta principalmente a plantas de la familia Cruciferae. Con la intencin de obtener aislados con mejor capacidad natural de produccin se realiz un monitoreo exhaustivo de variedades de Xanthomonas tanto de colecciones pblicas cmo de aislados de calabazas, coliflores, zanahorias y nueces de castilla infectadas. Estas cepas fueron sometidas a pruebas bioqumicas, de produccin de polmero bajo condiciones definidas, as como a evaluaciones de infectividad. No se encontr correlacin aparente entre las caractersticas fenotpicas de los aislados con la capacidad de producir el polmero, a excepcin de la virulencia, lo que sugiere un papel importante para el polmero dentro del proceso infeccioso. Otra alternativa para la recuperacin de yacimientos terciarios es la aplicacin directa (in situ) de microorganismos en un proceso conocido como MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery). El fundamento de ste proceso es que el crecimiento microbiano sobre la superficie de las rocas del depsito promueva el desalojo del petrleo, ya sea directamente por desplazamiento fsico o indirectamente mediante la produccin de metabolitos gaseosos surfactantes. Estos ltimos provienen de la oxidacin de parafinas hasta cidos grasos, los cules actan como detergentes. Antes de iniciar cada proyecto de MEOR se deben analizar muestras del agua coproducida por el yacimiento. A partir de los resultados de ste anlisis, se decidir la composicin de la mezcla nutritiva que se adicionar y que suele consistir en nitratos, fosfatos y sulfatos e inclusive un carbohidrato fermentable. Debido a que las condiciones a las que se encuentran sometidos los microorganismos distan de ser ptimas, no basta con inocular los yacimientos, sino que se deben proveer las condiciones adecuadas para la proliferacin celular, especialmente el oxgeno disuelto. Otros factores difciles de controlar a cientos de metros de profundidad, como la salinidad, el pH, la temperatura as como un bajo potencial redox pueden resultar limitantes en extremo (75). El costo operacional de esta metodologa va de $2.00 a $4.00 dlares americanos de incremento por barril de petrleo proporcion. Finalmente, adems de los pozos profundos, existen otros tipos de depsitos de hidrocarburos, las llamadas tierras y pizarras bituminosas, que contienen cantidades variables de materia orgnica (20% a 60%) en forma de bitumen y kerogeno, embebidas en formaciones rocosas sedimentarias ms o menos compactas. La extraccin de hidrocarburos a
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partir de estos materiales se lleva a cabo mediante mtodos trmicos, resultando en un proceso caro y poco eficiente. Bajo estas circunstancias, la utilizacin de mtodos microbiolgicos, por ejemplo para la produccin de surfactantes in situ, pudiera generar alternativas econmicamente significativas (17). Depuracin de combustibles. Debido a su origen biolgico, el petrleo preserva no solamente el carbono y el hidrgeno de la biomasa original en forma de los hidrocarburos que ya observamos en la Figura 1, sino tambin otros elementos, como el azufre y el nitrgeno e inclusive una variedad de metales de transicin, como hierro, vanadio, nquel, etc. El azufre y el nitrgeno se encuentran incorporados como heterotomos en una variedad de compuestos, pudiendo representar alrededor del 5% de la masa en algunos depsitos (Figura 3). Al quemarse como combustible, el azufre contenido en el diesel se convierte en xidos de azufre que se liberan a la atmsfera. En presencia de agua, los xidos gaseosos se convierten en cidos, que se disuelven y se precipitan junto con el agua de lluvia. Este proceso se conoce como lluvia cida y es frecuente en las ciudades con gran carga vehicular. Actualmente las lluvias cidas han disminuido notablemente, gracias a que las normas sobre el contenido mximo de azufre en combustibles se rigidizan cada vez ms desde finales de los aos 60s. La implementacin de estas normas requiri que se desarrollaran una serie de mtodos para la depuracin del azufre en las fracciones dedicadas a combustibles. El ms comn de estos mtodos es la hidrodesulfuracin cataltica, que consiste en la conversin del azufre orgnico en sulfuro de hidrgeno usando altas temperaturas y presiones de hidrgeno molecular. El oneroso costo de la hidrodesulfuracin cataltica, debido principalmente al alto consumo de hidrgeno y al envenenamiento de los catalizadores por metales pesados, aunado a una limitacin intrnseca de reducir los niveles de azufre por debajo de 500 ppm (partes por milln), muy por arriba de las 15 ppm requeridas por la norma, ha ocasionado que se busquen nuevas alternativas. El azufre es un elemento esencial para la vida. Aunque el azufre inorgnico es la fuente predilecta de azufre para la mayor parte de los microorganismos, en su ausencia, una variedad de compuestos organoazufrados pueden ser metabolizados para proveer el indispensable elemento. Este hecho es el principio bsico de uno de las ms interesantes aplicaciones de la microbiologa en la industria del petrleo, la biodesulfuracin.
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El caso mejor estudiado de biodesulfuracin oxidativa es la utilizacin de dibenzotiofeno (DBT) como nica fuente de azufre por Rhodococcus sp. El DBT y sus derivados alquilados son los organoazufrados ms abundantes en el diesel primario y se han establecido como compuestos modelo para este tipo de estudios. La cepa IGTS8 de Rhododoccus erythropolis se ha destacado por su capacidad para remover selectivamente el azufre del DBT sin degradar el esqueleto carbonado y es la base del proceso comercial propuesto por la compaa norteamericana Energy Biosystems Corporation (37, 65). Esta cepa es el prototipo de microorganismo biodesulfurador, sin embargo, existen aislados de otros gneros que comparten estas caractersticas. La cepa GTIS10 de Mycobacterium phlei presenta la misma va degradatoria que la cepa IGTS8, con la ventaja adicional que es moderadamente termfilo, por lo que la fermentacin puede llevarse a cabo a 50C, mejorando la solubilidad del diesel en agua (35, 55). Se han reportado aislados de Gordona cepa CYKS1 (80) y de Nocardia sp. cepa CYKS2 (21) capaces de crecer en DBT como nica fuente de azufre. En Mxico, investigadores del Instituto Mexicano del Petrleo han aislado cepas de Rhodococcus de sitios contaminados con petrleo en Mxico capaces de desulfurar muestras de diesel (18). La va de degradacin del DBT en la cepa IGTS8 involucra a las monooxigenasas dependientes de FMNH2 (flavin mononucleotido reducido) DszC/DszA. DszC convierte el azufre del DBT en sulfxido y subsecuentemente en sulfona (DBTO2). La sulfona es convertida por DszA en 2-hidroxibifenil-2-sulfinato (HBFS), el cual es modificado por DszB, una desulfinasa, a 2-hidroxibifenil (2HBF) y sulfato, que puede ser asimilado como fuente de azufre. El FMNH2 no est unido covalentemente a la monooxigenasa sino que es reemplazado cada ciclo cataltico por DszD, una FMNH2-oxidoreductasa dependiente de NADH especfica (Figura 4). Este proceso es tpicamente capaz de reducir ms de la mitad del contenido de azufre en diesel, por lo que se considera como una importante alternativa a la hidrodesulfuracin cataltica. Sin embargo, existen dos importantes inconvenientes para la incorporacin de ste proceso a nivel industrial. La primera es que, dado de que el diesel no es soluble en agua, deben mezclarse grandes cantidades del cultivo bacteriano con porciones del combustible a tratar. Debido a los grandes volmenes de diesel que se requiere procesar, el mezclado de los fermentadores se vuelve un factor limitante. La segunda es el tiempo requerido para este proceso, demasiado lento para los flujos habituales en
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una refinera. Una fermentacin tpica requiere de por lo menos siete das para reducir el 60% del contenido de azufre del diesel (18). Como alternativa a las limitaciones intrnsecas de una fermentacin, se podra pensar en purificar las enzimas de la va para usarlas como catalizadores. Muchas enzimas pueden llevar a cabo reacciones en presencia de solventes orgnicos, trabajar a altas temperaturas, son reutilizables y adems pueden ser altamente especficas o, por lo contrario, ser promiscuas, dependiendo del caso. Por todas estas razones constituyen un frente alternativo a muchos procesos industriales, inclusive en la industria petrolera (100). En este caso particular, el obstculo infranqueable para la generacin de un catalizador enzimtico, es la necesidad de un cofactor regenerable para la actividad de DszAC. Mientras que la adicin del FMN reducido de manera exgena es impensable por razones de costo, la actividad in vitro de la FMNreductasa especfica es muy baja, ya que sta misma requiere de la regeneracin de NADH. Por todas estas razones, y a pesar de lo exitosa que pueda ser la biodesulfuracin a nivel de planta piloto, es posible que no se consolide como proceso a nivel de refinera. La opcin actual es la utilizacin de otras actividades enzimticas, que no requieran de la regeneracin de cofactores, como base de los catalizadores. En particular, se ha demostrado que la enzima cloroperoxidasa del hongo Caldariomyces fumago puede oxidar selectivamente el azufre de los organoazufrados del diesel, los cules pueden ser removidos eficientemente de la mezcla mediante una destilacin convencional (5) Biosntesis microbiana de hidrocarburos El petrleo es uno de los recursos naturales no renovables ms importantes, no solo porque es considerado como la fuente energtica por excelencia, sino que tambin porque algunos de sus derivados se utilizan en numerosos procesos de sntesis. Desafortunadamente, la gran demanda energtica en todo el mundo ha propiciado la explotacin masiva de los yacimientos de petrleo, lo cual, adems de provocar que nuestro ambiente se deteriore progresivamente, y lgicamente, se contempla que en un futuro este importante recurso comience a escasear. Por esta razn, resulta prioritaria la bsqueda de fuentes alternativas de energa, preferentemente renovables, cuya generacin tenga un bajo impacto ambiental. En este sentido, la biotecnologa ha jugado un papel muy importante, particularmente con aquellos estudios enfocados a la
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conversin biolgica de la biomasa para generar distintos compuestos energticos tales como el metano, el etanol y el hidrgeno (67). Desde el punto de vista biotecnolgico, los lpidos que se acumulan de manera natural en algunas plantas y microalgas tienen potencial como combustibles alternativos. Estos compuestos pueden ser extrados y transesterificados para generar substitutos de diesel conocidos como biodiesel. Alternativamente, la hidrogenacin de la biomasa de microalgas para producir hidrocarburos (50). Se pude recuperar sustancias aceitosas va la liquefaccin de la biomasa de algunas algas a travs de reacciones realizadas en condiciones de alta presin y temperatura (57, 66). Los hidrocarburos, componentes esenciales del petrleo, suelen utilizarse en sistemas de combustin rutinarios. La microalga verde Botrycoccus braunii ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de producir y acumular elevadas concentraciones de lpidos altamente saturados, es decir, de hidrocarburos. Se ha reportado que de manera natural, algunas variedades B. braunii son capaces de acumular arriba del 86% de su peso seco en hidrocarburos. B. braunii es una microalga planctnica de aguas dulces de distribucin mundial que pertenece al grupo de las Chlorococcales. Estudios de microscopa electrnica han definido que una fraccin pequea de los hidrocarburos producidos por B. braunii son mantenidos en el citoplasma en pequeos cuerpos (vesculas) y que la mayor parte (95%) son secretados a las capas externas de la pared celular formando las llamadas vainas trilaminares. A la fecha se han descrito tres variedades distintas de B. braunii (A, B y L), cada una de estas es capaz de producir, independientemente de la fase y condiciones de cultivo, principalmente solo un tipo de hidrocarburo. Las cepas de la variedad A producen hidrocarburos de cadena larga (entre 25 y 31 carbonos), principalmente alcadienos y alcatrienos. El contenido de estos hidrocarburos en las distintas cepas de la variedad A flucta entre el 15 y el 61% del peso seco. Las cepas de la variedad B generan principalmente isoprenoides cclicos, normalmente ramificados y altamente insaturados, denominados botriococenos, cuya formula general es CnH2n-10 (donde n= 30-37). En estas algas, el contenido de hidrocarburos vara ente el 24 y el 86% del peso seco. Las cepas de la variedad L sintetizan casi exclusivamente un tetraterpenoide de 40 carbonos llamado licopadieno y conforman nicamente entre el 2 y el 8% del peso seco (para una revisin sobre este tema consultar (98) ). Algunos reportes describen que la ruta biosinttica por la cual B. braunii produce estos hidrocarburos es similar a la ruta que se presentan en plantas
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superiores, es decir, los alcanos son sintetizados por la elongacin de cido palmtico, va la adicin de unidades acetil y descarboxilaciones subsecuentes (16, 93). El rompimiento cataltico (Cracking) de los hidrocarburos generados por B. braunii produjo una fraccin del 67% de gasolina, 15% de diesel y 15% de turbosina (39). Sin embargo, a la fecha restan por realizarse estudios enfocados al uso de los hidrocarburos producidos por B. braunii en distintos procesos de sntesis. Finalmente, no obstante la estupenda capacidad de B. braunii para sintetizar hidrocarburos, su potencial biotecnolgico esta limitado principalmente por su baja velocidad de crecimiento y su prolongados tiempos de duplicacin. Existen muy pocos estudios acerca de la produccin de hidrocarburos por bacterias. Recientemente se aisl de una planta de tratamiento de aguas residuales en Osaka, Japn, una bacteria halotolerante capaz de producir y excretar altas cantidades de hidrocarburos (47). La secuencia de ADN de su genes para la partcula 16S ribosomal permiti identificar a este aislado como Vibrio furnissi. Esta bacteria es capaz de excretar al medio hasta un 120% del peso seco de hidrocarburos cuando se encuentra en fase de crecimiento preestacionaria. Esta fraccin est compuesta bsicamente de alcanos alifticos de 15 a 24 carbones (71). En trminos generales se desconocen las rutas biosintticas de estos hidrocarburos. Finalmente, los estudios enfocados a la produccin de hidrocarburos basados en microorganismos como V. furnissi o B. braunii, representan un reto biotecnolgico sumamente atractivo y cuyo potencial para la generacin de hidrocarburos, para uso como combustible o en procesos de sntesis. El petrleo y los problemas ambientales La utilizacin masiva de combustibles fsiles ha provocado cambios sustanciales en el clima. De manera natural, el clima del planeta est determinado por el equilibrio entre la fraccin de la energa solar absorbida por la superficie y la restante, que es mandada de vuelta al espacio. El clima se balancea en funcin de cuanta de sta energa se almacena en la atmsfera al calentar a algunos de los componentes gaseosos. Existe un grupo de gases conocidos como invernadero que comprende al bixido de carbono, al bixido nitroso, al metano, los clorofluoro-carbones, otros compuestos halogenados y al vapor de agua. Estos gases absorben la radiacin reflejada provocando el caliento global de la
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atmsfera baja y cambiando dramticamente el clima del planeta. Los gases invernadero provienen tanto de fuentes naturales como antropognicas, entre las cules se encuentra la utilizacin de combustibles fsiles. Nuestro planeta contiene alrededor de 1.5 x 1012 millones de toneladas de carbono y alrededor de 15% de ste se encuentra en yacimientos subterrneos. Hemos extrado una pequea parte (menos del 0.4% de todo el carbono del planeta) para usarlo como combustible, sin embargo cada ao estamos incorporando 2,800 millones de toneladas de bixido de carbono a las 76,000 millones de toneladas existentes en nuestra atmsfera. La acumulacin de bixido de carbono provoca actualmente una incremento de 1% adicional al calor generado por las radiaciones solares y sigue aumentando. Slo existe una va para incorporar el bixido de carbono atmosfrico a otras formas de menor impacto ambiental y es a travs de la fotosntesis, un proceso exclusivo de las plantas y algunas bacterias. Como podemos ver en la Figura 5, la mayor parte de la fotosntesis se lleva a cabo en el mar, donde se asimilan 2,500 millones de toneladas de carbono al ao, mientras que en la tierra se incorporan 500 millones de toneladas de carbono al ao. La contaminacin de los mares y la tala inmoderada de los bosques, especialmente en las zonas tropicales, reduce nuestras reservas de fotosntesis y agrava el problema. Adicionalmente a los cambios climticos globales, el uso masivo del petrleo como fuente de energa y como materia prima, ha generado el fenmeno de la contaminacin ambiental, desconocido hasta hace 50 aos. La contaminacin ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza real a la salud pblica, as como la extincin de gran cantidad de especies vegetales y animales. Esta condicin reta a nuestra sociedad para buscar medidas efectivas que remedien los efectos negativos del avance tecnolgico (12). Una medida que ha tenido un xito significativo es la aplicacin de tcnicas de biorremediacin. Como un ejemplo bien documentado al respecto, recomendamos la revisin de un caso de contaminacin accidental por petrleo crudo en la costa de Japn recientemente publicado que se remedia con una preparacin microbiana (43, 95, 96). La biorremediacin utiliza generalmente microorganismos (bacterias, hongos, levaduras y algas), y recientemente han comenzado a utilizarse plantas superiores para algunas aplicaciones. Aunque nuevos enfoques en la biorremediacin han surgido basados en la biologa molecular y la ingeniera de bioprocesos, la biorremediacin clsica contina siendo el enfoque favorito para procesar desechos biolgicos y evitar la propagacin de bacterias patgenas (6, 11,
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41, 60). La biorremediacin tambin juega un papel cada vez ms importante en la concentracin de metales y en la recuperacin de materiales radioactivos (15, 81). Algunos microorganismos pueden degradar de manera natural compuestos orgnicos y esta capacidad se explota para facilitar la degradacin de contaminantes y para operaciones de limpieza de desechos in situ. La aplicacin de ensayos de monitoreo sencillos y de alta resolucin ha permitido identificar aquellas especies capaces de degradar contaminantes mientras que el uso de sondas gnicas especficas permite determinar la abundancia relativa de estos microorganismos (83). El uso de novedosas tcnicas y herramientas para la biorremediacin in situ, en bio-filtros y en bio-reactores ha contribuido al rpido crecimiento de este campo. La biorremediacin ha demostrado ser un complemento costeable y benfico para ser usado en combinacin con mtodos qumicos y fsicos tradicionales como el composteo, la incineracin y la extraccin con solventes, en el tratamiento de desechos y en la descontaminacin del medio ambiente. De las diferentes fracciones del petrleo, los hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) son los de mayor toxicidad y al mismo tiempo los ms recalcitrantes a los mtodos convencionales de remediacin. Los HPAs son un grupo de compuestos aromticos conteniendo dos o ms anillos bencnicos fusionados en arreglos angulares, lineales o agrupados (Figura 3) , contaminantes ubicuos que se forman naturalmente en el curso de algunas reacciones geolgicas incluyendo la fosilizacin de plantas o antropognicamente en relacin a las industrias del petrleo, de la produccin de gas y de la preservacin de madera. Los HPAs de bajo peso molecular son susceptibles de biorremediacin, sin embargo, los de alto peso molecular son recalcitrantes a la degradacin biolgica (19, 70, 106). Las tasas de degradacin de HPAs son variables y no dependen solamente de su estructura, sino tambin de los parmetros fisicoqumicos del sitio, as como del nmero y variedad de microorganismos presentes (101). Las variables ms importantes que limitan la biorremediacin de HPAs de alto peso molecular son la transferencia de masa, las heterogeneidades espaciales y las prdidas abiticas. Dada la baja solubilidad de estos compuestos en agua, una de las estrategias para la biorremediacin en suelo es la adicin de surfactantes, naturales o sintticos, que solubilicen a los HPAs y aumenten su biodisponibilidad (4, 7, 27, 78, 85, 86). Una variacin interesante es la identificacin de organismos que degraden tanto los compuestos contaminantes como los surfactantes, de manera de
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no acumular otros compuestos xenobiticos al suelo (32). Es importante considerar que los productos de degradacin de los HPAs no son necesariamente menos txico que las molculas parentales, por lo que es imprescindible incorporar procedimientos de monitoreo de toxicidad en las diferentes etapas de la biorremediacin. Biorremediacin de compuestos recalcitrantes. El desarrollo de qumicos sintticos derivados del petrleo provee muchos materiales extremadamente tiles, tales como plsticos, pesticidas, aislantes, refrigerantes y retardantes de flama. Muchos de estos materiales nunca haban existido en la naturaleza y por lo tanto los microorganismos no poseen enzimas para degradarlos. De aqu que se consideren no biodegradables o recalcitrantes. Los trminos no son completamente precisos sin embargo, ya que ahora se sabe que muchos compuestos clasificados como recalcitrantes son degradados lentamente en el suelo o en medios acuosos. Ejemplos de tales compuestos txicos que han causado desastres ecolgicos incluyen al DDT (diclorofeniltricloroetano), los bifenilos policlorados y el pentaclorofenol (1, 2, 52). Los compuestos recalcitrantes no sirven usualmente como fuentes de carbn de energa para el crecimiento microbiano. Si acaso se degradan, es mediante un proceso de cometabolismo, durante el cual otros compuestos son utilizados como fuente de energa (el cometabolito) con la degradacin lateral del compuesto blanco. La degradacin completa (mineralizacin) de molculas orgnicas relativamente complejas a bixido de carbono o metano requiere el esfuerzo concertado de bacterias de diferentes grupos, por ejemplo, de las fermentativas hidrolticas (eubacterias, p. ej. Chlorobium ), las acetognicas (eubacterias, p. ej. Desulfovibrio y Desulfomatuculum) y las metanognicas (arqueobacterias, p. ej. Methanosaeta y Methanospirillum). Debido a su condicin de asociaciones sintrficas (Figura 6) , el aislamiento de cultivos puros a partir de los consorcios metanognicos es difcil y ha ocasionado errores en la clasificacin taxonmica de sus elementos. El estudio de la diversidad microbiana y las dinmicas de sus poblaciones en consorcios biodegradadores est creciendo notablemente en el rea de la ecologa microbiana (texto adicional ecologa microbiana). El inters en esta rea ha sido catalizado por el rpido avance de mtodos de ecologa molecular ya que a travs de su uso se tiene una mejor perspectiva de la composicin de comunidades microbianas no cultivables. De hecho, se est ha vuelto factible definir las causas de los cambios temporales en la salud de un ecosistema alterado basndose en la
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estructura de su poblacin. En particular, el estudio de comunidades microbianas que toman parte en la biodegradacin in situ de hidrocarburos ha sido un reto para los microbilogos. La razn de esto es que la mayor parte de las especies (~90 a 99%) que componen las comunidades degradadoras no son cultivables. La estimacin de biomarcadores lipdicos, especficamente fosfolpidos, junto con tcnicas de identificacin basadas en la secuencia de la subunidad 16S de los ribosomas es una poderosa combinacin de tcnicas para la elucidacin de la ecologa microbiana de comunidades biorremediadoras. El uso de estas tcnicas provee una apreciacin clara de varias caractersticas importantes de las comunidades microbianas, especficamente la biomasa viable, la estructura de la comunidad y el estado nutricional o la presencia de respuestas a estrs en bacterias Gram-negativas (48). Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminados tienden a ser dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/o de sobrevivir a los compuestos txicos (62). Como resultado, estas comunidades son menos diversas que aquellos sistemas de referencia no contaminados, aunque la diversidad tambin puede estar influenciada por la complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo que las poblaciones han estado expuestas (44, 105). Sin embargo, cuando las bacterias Gram-negativas dominan el sistema (como es frecuente en el caso de ambientes contaminados con hidrocarburos), el conocimiento derivado de los biomarcadores lipdicos se limita al estado nutricional o fisiolgico de la comunidad bacteriana ms que a su diversidad. A pesar de la relativamente larga historia de investigacin en la biorremediacin de derrames de petrleo, sta contina siendo una disciplina esencialmente emprica y muchos de los factores biolgicos que controlan los procesos no han sido adecuadamente comprendidos. Por ejemplo, la adicin de nutrientes es una prctica ampliamente aceptada en la limpieza de derrames aunque es escaso el conocimiento de sus efectos durante el progreso de la biorremediacin Existen evidencias experimentales que indican que los niveles de nutrientes, y su concentracin relativa con respecto a los contaminantes, influencian la composicin de las poblaciones de microorganismos degradadores, lo cual a su vez afecta la tasa de degradacin de los contaminantes (74). Caractersticas de los microorganismos biodegradadores. Como puede observarse en la Tabla 2 existe una gran variedad de microorganismos identificados en la degradacin de compuestos derivados del petrleo. Interesantemente, casi todos son eubacterias,
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aunque en algunos casos se encontraron arqueobacterias y eucariotes. Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que permiten la oxidacin ms menos especficas de algunas fracciones del petrleo. Esta oxidacin cambia las propiedades de los compuestos, hacindolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversin a bixido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralizacin, sino que basta una oxidacin para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad (99). Uno de los gneros bacterianos ms explotados en bioprocesos noconvencionales es Rhodococcus, un grupo nico consistente en microorganismos que presentan una gran diversidad metablica, particularmente hacia la utilizacin de compuestos hidrofbicos tales como hidrocarburos, fenoles clorados, esteroides, lignina, carbn y petrleo. Algunas cepas de Rhodococcus han sido utilizadas en aplicaciones industriales y ambientales, incluyendo la produccin de cido acrlico y acrilamida, conversiones de esteroides y biorremediacin de hidrocarburos clorados y fenoles. Estos microorganismos presentan una notable capacidad de degradar hidrocarburos alifticos halogenados y numerosos compuestos aromticos, incluyendo algunos sustituidos por halgenos, as como hidrocarburos policclicos aromticos (31, 104). Las bacterias del gnero Rhododoccus poseen una gran variedad de vas metablicas para la degradacin y modificacin de compuestos aromticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos as como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan tambin la va del 3-oxoadipato. La tolerancia de stas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia de un sistema de represin catablica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas para los tratamientos de biorremediacin. Algunas cepas producen poli-3hidroxialcanoatos, otras acumulan metales pesados y otras son fuente de enzimas tiles como la fenilalanina deshidrogenasa y endoglucosidasas. Otras aplicaciones potenciales de los Rhodococos incluyen la biodesulfuracin de combustibles, la deshalogenacin de emisiones gaseosas y la construccin de biosensores (29, 31, 37, 104). En este punto quiz ests preguntndote cmo adquirieron los microorganismos la capacidad de degradar compuestos que a los que nunca haban estado expuestos. Para entenderlo hay que tener en consideracin que para cualquier organismo (inclusive para los humanos) lo ms importante es reproducirse y perpetuar sus genes, por lo que
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cualquier condicin ambiental o nutricional que reduzca su probabilidad de reproducirse despertar una reaccin inmediata a nivel metablico y en segunda instancia a nivel gentico. Algunas de las estrategias que se han observado en respuestas de este tipo de retos son: 1.-Reclutamiento. Cuando un organismo se encuentra ante una condicin ambiental completamente desconocida de manera abrupta slo puede utilizar lo que ya tiene. Es decir, que puede explotar alguna actividad enzimtica existente para degradar un compuesto nuevo y sobrevivir al reto. Ejemplo de esto es la utilizacin de enzimas dedicadas a la degradacin de lignna (un componente de la corteza de los rboles) para degradar HPAs por algunos hongos (8, 9). 2.Transferencia horizontal. Sabemos que es comn entre bacterias la incorporacin de material gentico de organismos similares por medio de mecanismos celulares de transferencia (conjugacin), pero tambin pueden incorporarlo de organismos distantes e inclusive completamente diferentes por medio de virus (transduccin) o directamente del medio (transformacin) (24) (Animacin 1 ). El material gentico incorporado puede integrarse al de la bacteria, enriqueciendo su repertorio metablico con nuevas funciones, incluyendo aquellas que le permitan degradar compuestos xenobiticos. Un ejemplo de esto es la transferencia en suelo de los genes para degradar fenol entre diferentes especies de Pseudomonas (73). Estrategias recombinantes. Muchos contaminantes ambientales son degradados eficientemente por microorganismos, sin embargo otros persisten y constituyen un riesgo severo a la salud pblica. En algunas instancias, la persistencia es una consecuencia del inadecuado potencial catablico de los microorganismos disponibles. La tecnologa del ADN recombinante (ADNrc), aunado a un slido conocimiento de vas catablicas y de fisiologa microbiana, capacita el desarrollo experimental de actividades catablicas nuevas o mejoradas sobre esos contaminantes (22, 23, 51, 53, 94). Aunque una gran variedad de microorganismos capaces de degradar xenobiticos txicos altamente estables han sido identificados, todava muchos contaminantes persisten en el ambiente. Avances recientes en el campo de la tecnologa del ADNrc han proporcionado soluciones a estos problemas. Clsicamente, uno de los factores limitantes en la biorremediacin de sitos contaminados ha sido la baja tasa de degradacin. Mediante el uso de mtodos de ADNrc es posible extender el rango de los sustratos que un organismo puede utilizar y la tasa de
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consumo, inclusive se puede ampliar la capacidad de un microorganismo para degradar un grupo predeterminado de xenobiticos. Dado que los procesos biotecnolgicos estn basados en actividades naturales de microorganismos, y slo constituyen variaciones en el tratamiento convencional de deshechos, son aceptados pblicamente. Esta es un rea donde la ingeniera gentica puede hacer importantes aportaciones al manipular los genes catablicos. A diferencia de las bacterias utilizadas en el trabajo de laboratorio, los organismos genticamente modificados destinados a ser liberados al medio ambiente como agentes biorremediadores deben ser capaces de expresar su fenotipo bajo el control de seales externas presentes en el medio al cual van a incorporarse. Esta es una diferencia significativa con respecto a otros procesos biotecnolgicos (por ejemplo un bioreactor) en el cual las condiciones de trabajo pueden establecerse a voluntad del operador. En el campo, las condiciones de operacin se determinan por el ambiente externo. El principal problema es, por lo tanto, como programar fisiolgica y regulatoriamente a las bacterias modificadas genticamente (BMG) para expresar el fenotipo deseado al nivel y en el momento preciso, bajo circunstancias fisicoqumicas sobre las cuales no se tiene control. Este reto ha motivado el desarrollo de una nueva generacin de sistemas de expresin de amplio rango especficamente diseados para bacterias, particularmente Pseudomonas , pero tambin para otros organismos Gram-negativos (25). Impacto ecolgico de la liberacin al medio ambiente de microorganismos modificados genticamente. La transferencia horizontal de genes entre bacterias ha sido ampliamente demostrada bajo condiciones naturales (Animacin 1). En estos casos, el material gentico es transferido entre bacterias mediante los procesos de transformacin, transduccin o conjugacin (24). En muchas ocasiones los genes que codifican para enzimas involucradas en la degradacin de contaminantes se localizan en molculas extracromosomales llamadas plsmidos. El entendimiento de las dinmicas de transferencia horizontal es imprescindible para comprender la evolucin y la ecologa de plsmidos, as como para la evaluacin de riesgos, o sea, del impacto ecolgico de la liberacin intencional de bacterias naturales o recombinantes para usos agronmicos o de biorremediacin. Este impacto ecolgico depende de cmo el nuevo material gentico sea expresado en el organismo receptor y en cmo operen los procesos de seleccin natural en los receptores. Aunque existe la posibilidad de transferencia gentica entre todos los
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miembros de una comunidad bacteriana, se ha encontrado que existe una clara delimitacin entre las especies que efectivamente reciben y expresan una nueva capacidad metablica siempre en funcin de sus propias caractersticas (68). El uso extensivo de plsmidos con determinantes de resistencia a antibiticos podra tener consecuencias en la transferencia horizontal de esta resistencia acoplado a presiones selectivas impuestas por el uso (y el mal uso) de antibiticos en medicina y en ganadera. Por ejemplo, uno de los microorganismos mas usados en biorremediacin es Pseudomonas aeruginosa, bacteria que presenta una serie muy interesante de actividades naturales sobre xenobiticos (73). Lamentablemente, tambin es conocida por ser un patgeno oportunista en humanos y causante de complicaciones graves en personas inmuno-suprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis qustica. Por estas razones existe mucho inters en el estudio de las relaciones filogenticas entre aislados clnicos y ambientales. Recientemente se demostr que la nica diferencia aparente entre estos dos grupos es la presencia de un plsmido que correlaciona con la capacidad de degradar gasolina y aunque no se demostr que las cepas ambientales fueran infecciosas, es una llamada de atencin sobre las posibles consecuencias de liberar sin control bacterias recombinantes en el medio ambiente (33). B u r k h o l d e r i a es otro gnero bacteriano utilizado para biorremediacin de herbicidas y pesticidas recalcitrantes y tambin es usado para proteger cultivos contra hongos. Igual que Pseudomonas, ha sido identificado como patgeno oportunista en humanos, particularmente en pacientes con fibrosis qustica. Debido a su genoma extremadamente flexible, Burkholderia cepacia tiene una gran capacidad de mutacin y adaptacin. Es inherentemente resistente a mltiples antibiticos y sta capacidad es altamente transmisible entre especies. Por todas estas razones, la seleccin de cepas seguras para su uso ambiental no es posible por el momento y su uso en la agricultura tambin debe ser cauteloso (42). Una respuesta muy ingeniosa a este conflicto es la construccin de plsmidos suicidas, que slo puedan propagarse en la cepa receptora original y que no puedan ser transferidos. Usando sofisticados sistemas genticos se han implementado estas funciones suicidas en los plsmidos de tal manera que no sean susceptibles de inactivacin por proceso celulares naturales, como recombinacin, prdida o inactivacin por insercin (58).

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Enfoques genmicos para la microbiologa ambiental Mucho de la historia de la microbiologa se ha basado en tcnicas de cultivo axnico. Aunque esta estrategia ha llevado a descubrimientos notables, ahora sabemos que la historia est incompleta debido a la enorme cantidad de evidencia indicando la existencia de numerosos organismos no cultivables. Se han desarrollado novedosos mtodos que permiten el anlisis de muestras de material gentico aislado directamente de suelo y el uso de tcnicas de amplificacin-clonacin ha permitido identificar una gran cantidad de nuevos microorganismos dndonos una nueva perspectiva de la biodiversidad real de diferentes ecosistemas (89, 103). Con la finalidad de explotar el repertorio de actividades catalticas de organismos no utilizados tradicionalmente, se ha desarrollado una nueva estrategia conocida como bioprospeccin. Esta estrategia no se limita a microorganismos, sino que cualquier miembro de un ecosistema puede ser analizado con modernas herramientas moleculares para detectar nuevas capacidades metablicas. Con respecto a microorganismos, no solo se han explorado ecosistemas convencionales como suelo y agua, sino que los ms espectaculares descubrimientos han surgido del estudio de ecosistemas extremos, como el subsuelo en los polos, crteres de volcanes, manantiales sulfurosos, etc. Colectivamente, los genomas de la microbiota total contenida en la naturaleza, denominado metagenoma, representan mucho ms informacin gentica de la contenida en el subgrupo cultivable. Dada la profunda utilidad e importancia de los microorganismos para todos los sistemas biolgicos, se requieren nuevos mtodos para acceder a la riqueza de informacin contenida en el metagenoma. Una estrategia exitosa propuesta por el grupo dirigido por Jo Handelsman a este respecto, ha sido la clonacin de fragmentos grandes de ADN aislado directamente de los microbios de muestras ambientales (84). La aplicacin de esta estrategia permitir no solo una evaluacin ms realista de la biodiversidad microbiana en diferentes ambientes, sino la recuperacin de un sinfn de nuevas actividades, o de actividades ya conocidas con nuevas propiedades. Adicionalmente al enfoque de bsqueda de diversidad, se esta llevando a cabo un esfuerzo muy interesante para el anlisis computacional de algunos genomas secuenciados completamente que permitan la prediccin de reacciones aisladas o de vas bioqumicas
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completas involucradas en la degradacin de xenobiticos. Hasta el momento, el grupo dirigido por Lynda Ellis tiene identificadas ms de 100 vas metablicas, 650 reacciones, 600 compuestos y 400 enzimas participantes en la degradacin de contaminantes. Toda esta informacin est disponible en la base de datos sobre Biocatlisis y Biodegradacin de la Universidad de Minnesota (http://www.labmed.umn.edu/umbbd/) fundada en 1995 (30). Conclusiones Aunque existan indicios de la complejidad microbiana, no es sino hasta recientemente que estamos adquiriendo conciencia de la enorme cantidad de recursos bioqumicos que estn esperando ser descubiertos. Las principales firmas biotecnolgicas estn invirtiendo grandes cantidades a la bsqueda de nuevas actividades enzimticas que puedan ser aplicadas a productos existentes o que inspiren nuevas formulaciones. Existe la consideracin general de que muchos de los procesos industriales que se implementarn en los prximos 50 aos tendrn su fundamento en recursos biotecnolgicos: debern ser eficientes, limpios y auto sustentables. Los mtodos tradicionales de procesamiento del petrleo tambin se enriquecern con la generacin de nuevas biotecnologas.

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