Citoquímica eritrocitaria Siderocitos y sideroblastos Derivados de la hemoglobina

La degradación de la ferritina la transforma parcialmente en hemosiderina. el bazo sea capaz de eliminar grandes gránulos sideroticos de los hematíes (como los que pueden encontrarse en la enfermedad) por un proceso de extraccion 4. incluso despues de varios anos de almacenamiento. la ferritina. en los sujetos sanos. no es detectable con la reacción de Perls. proteínas e hidratos de carbono. Sundberg y Bromann describieron una tecnica por medio de la cual las extensiones se tenian primero con un colorante de Romanowsky (tincion . a menudo en grandes cantidades. aclarar minuciosamente en agua destilada y contratenir con 1 g/l de rojo neutro acuoso o de eosina durante 10-15 s. pudiendo observarse un pequeño porcentaje de siderocitos en la sangre periférica de personas por lo demás sanas. El residuo no hemo se encuentra en forma de ferritina.2 mol/l de HCl inmediatamente antes de su utilizacion. Se pueden tenir con azul de Prusia las extensiones que fueron previamente tenidas con los colorantes de Romanowsky.1 mol/l de HCl preparado mediante la mezcla de volumenes iguales de 47 mmol/l (20 g/l) de ferrocianuro potasico y 0. en el citoplasma de muchos de los eritroblastos de la medula ósea humana y en los reticulocitos medulares 3. la hemosiderina se encuentra principalmente en los macrófagos de la medula ósea. Tras la esplenectomía. antes de lavarlo (v.Citoquímica eritrocitaria Siderocitos y sideroblastos Derivados de la hemoglobina Los siderocitos son hematíes que contienen gránulos de hierro no hemo. los gránulos sideroticos se observan. el hierro almacenado en el interior de los gránulos sideroticos en su citoplasma. dicho hierro en exceso se encuentra tambien en otros tejidos. utilizando. El hierro viaja en plasma unido a una globulina β. no se observan habitualmente en los hematíes de la sangre periférica humana. que se visualiza bajo el microscopio óptico en forma de partículas refringentes amarillo oro en las células fagocitarias. Tras la esplenectomía. Hay que tener cuidado para evitar la contaminación con el hierro que pueda haber en los portaobjetos o en los platillos de tincion. que reciben el nombre de “cuerpos de Pappenheimer” (fig. 3 mol/l. En contraposicion. Probablemente la razón se deba a que los reticulocitos. Los gránulos están formados por un complejo insoluble en agua de ion férrico. en el hígado (células de Kupffer) y en el bazo. Este material siderotico (o hemosiderina) reacciona con el ferrocianuro de potasio para formar un compuesto azul: el ferriferrocianuro. la transferrina.1)2. 592). 13. lípidos. cuando el organismo está sobrecargado de hierro. y pasa selectivamente a la medula osea. La mayor parte del hierro se convierte rápidamente en hemo: parte en el citosol y parte en las mitocondrias. en las preparaciones tenidas mediante la reacción de Perls. se pueden encontrar en todo momento siderocitos en sangre periférica. el hierro se libera de la transferrina y penetra en la célula. colocar los portaobjetos en una solucion de 10 g/l de ferrocianuro potasico en 0. la hemosiderina se tiñe de color azul. son secuestrados normalmente durante un tiempo en el bazo y alli completan la sintesis del hemo. para este fin. y. mientras que. en su ausencia. se debe tenir siempre una extensión de medula osea positiva junto con las extensiones de prueba. donde el complejo hierro-transferrina se une a los receptores de la transferrina en la superficie del eritroblasto. La ferritina se encuentra en todas las células del organismo. Para controlar la calidad. Preparar el material de cristal sumergiéndolo en HCl. ratones y humanos. En los sujetos sanos. Es aconsejable dejar las extensiones en metanol durante toda la noche para eliminar la mayor parte de los colorantes de Romanowsky. al tenirse con la reacción de Perls. que es un compuesto soluble en agua del hierro no hemo con la proteina apoferritina. Método de tinción de los gránulos sideróticos Secar al aire las extensiones de sangre periferica o de medula osea y fijarlas con metanol durante 10-20 min. Esta reacción es la base de una reacción positiva al azul de Prusia (Perls). tras su salida de la medula. tales gránulos persisten en los hematies durante toda su vida. Sin embargo. Probablemente. Dejar los portaobjetos en la solucion durante cerca de 10 min a unos 20 °C. Lavar bien durante 20 min con agua del grifo. fueron descritos originalmente por Gruneberg1 en pequeñas cantidades en la sangre de embriones normales de ratas. apareciendo entonces como granulos basofilos. como en la hemocromatosis o en la hemosiderosis transfusional. Hay que examinar la extensión antes de realizar la reaccion de Perls para comprobar que no quede nada de colorante azul residual que pudiera oscurecer la tincion con el azul de Prusia. El material se tine también con los colorantes de Romanowsky. pag. Cuando estén secas. esta fase de la maduración reticulocitaria tiene que desarrollarse en la corriente sanguínea. y en grandes cantidades en ratones con anemia congénita.

El exceso marcado de hierro en los macrófagos es tambien una caracteristica de las talasemias intermedia y mayor y de algunas anemias diseritropoyeticas. las células mas maduras parecen ser las mas afectadas. en cuyo caso los granulos sideroticos son mas numerosos y mayores de lo normal (fig..2). y no se observan en la anemia ferropenica (fig. ej. los granulos se depositan en las mitocondrias y suelen aparecer dispuestos en circulo alrededor del nucleo (fig. 13. De esta forma se pueden obtener hermosas fotografias. a la cantidad de hierro disponible). Significado de los siderocitos Los siderocitos contienen uno o dos granulos (raramente muchos) con contenido ferrico. el deficit (raro) de piridoxina (vitamina B6). que se tinen con el color azul de Prusia. En las infecciones cronicas. ej. Dicho metodo puede ser de utilidad para investigar la eritropoyesis anomala en la que los eritroblastos dan una reaccion positiva al PAS. Los sideroblastos en anillo no son infrecuentes en otras neoplasias hematologicas. como son la mielofibrosis idiopatica y la leucemia mieloide aguda (LMA). los eritroblastos pueden estar cargados con granulos sideroticos en todas las etapas de maduracion. en proporcion al grado de saturacion de la transferrina (es decir. En las neoplasias hematologicas que tienen como característica una anemia sideroblastica.. Pueden tambien presentarse en otras categorías de SMD.3) formando los caracteristicos “sideroblastos en anillo” de las anemias sideroblasticas. la distribución de los granulos dentro de las celulas tiende a ser normal en aquellos trastornos en los que solo hay afectacion de la síntesis de la globina (p. Ademas de los granulos sideroticos dentro de los eritroblastos. pequenos y desigualmente distribuidos. 13. . mientras que en las anemias sideroblasticas secundarias y en los tipos hereditarios. la tincion para poner de manifiesto los depositos de hierro en los grumos medulares y los granulos sideroticos en los eritroblastos es un procedimiento diagnostico sencillo y valioso que deberia realizarse en las extensiones medulares de forma rutinaria. En cambio. los depositos de hierro pueden estar aumentados. o bien en el interior de los macrófagos en los grumos medulares9. Hayhoe y Quaglino describieron un metodo que combinaba el acido peryodico de Schiff (PAS) y la tincion de hierro6. En la práctica. pero los pequenos granulos que contienen el hierro tenido de azul tienden a enmascararse como eritroblastos jovenes por la basofilia general del citoplasma celular. En cambio. dos de las categorias de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del sindrome mielodisplasico (SMD). Hay normalmente unos cuantos granulos sideroticos muy pequenos y repartidos al azar en cerca del 40% de los eritroblastos tardios3. sobre todo la eritroleucemia y las categorias de la OMS de la LMA relacionada con el tratamiento y de la LMA con displasia multilinea. la anemia sideroblastica causada por antagonistas de la vitamina B6 (p.de Wright) y despues se sobretenian con el metodo del ferrocianuro acido 5. libres. Se ha descrito un metodo rapido para demostrar los granulos sideroticos mediante la tincion con azul bromoclorofeno al 1% durante 1 min7. en condiciones normales se puede observar hemosiderina en las extensiones medulares en forma de agregados de granulos pequenos. El porcentaje de eritroblastos reconocibles como sideroblastos aumenta en las anemias hemoliticas y en las megaloblasticas asi como en las hemocromatosis y en las hemosiderosis. los farmacos utilizados en la terapia antituberculosa) y la anemia sideroblastica secundaria al alcoholismo y a la intoxicacion por plomo. Se produce un incremento desproporcionado en el porcentaje de eritroblastos que son sideroblastos cuando la sintesis de hemoglobina esta alterada. Se tinen debilmente y pueden ser difíciles de ver con el microscopio optico. la ausencia de hierro es diagnostica del déficit de hierro o de la deplecion de hierro (este último término indica el estado en el cual el hierro de depósito está ausente pero la anemia no se ha manifestado todavía). y en otros ejemplos de “anemia de las enfermedades crónicas”. con mucho material siderotico en los macrofagos pero poco o ninguno visible en los eritroblastos. Entre ellas se encuentran el tipo congenito (hereditario). Cuando hay un defecto en la síntesis del hemo. Hay varios tipos de anemia sideroblastica.4). La presencia de sideroblastos en anillo es una característica definida de la anemia refractaria con sideroblastos en anillo8 y de la citopenia refractaria con displasia de varias lineas y con sideroblastos en anillo. La cantidad de hemosiderina aumenta notablemente en aquellos pacientes con depósitos elevados de hierro. Los granulos con contenido ferrico se tinen de purpura oscuro. 13. en la talasemia) o cuando hay una sobrecarga de hierro.

déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) o de la presencia de una hemoglobina inestable (p. 9 g/l y filtrar. Anadir 1 volumen de sangre (en cualquier anticoagulante) a 4 volumenes de la solución con violeta de metilo y dejar reposar la solución durante cerca de 10 min a temperatura ambiente. Si se necesitan preparaciones permanentes. utilizar más de una extensión con este objetivo10. El verde brillante los tine bien y el colorante no es captado por el resto de los componentes del eritrocito16. en ese momento los reticulocitos solo estan tenidos debilmente. Cuando el origen es quimico o farmacologico. la Hb Koln). 13. se deben examinar al menos siete grumos y. En el ser humano. Los cuerpos de Heinz se tiñen de un purpura intenso(fig. Habitualmente están próximos a la membrana celular y pueden causar protrusión de la misma. la Hb Koln) presenta una fluorescencia verde al ser excitada por la luz azul a 370 nm en un microscopio de fluorescencia15. También se producen cuando alguna de las cadenas de globina de la hemoglobina es inestable. contratenir las extensiones fijadas con 1 g/l de eosina o de rojo neutro. En la talasemia β mayor. los cuerpos de Heinz se decoloran. Cuerpos de Heinz en los hematíes Heinz en 1890 fue el primero en describir en detalle las inclusiones en los hematíes que se desarrollaban como resultado de la acción de la acetilfenilhidrazina en la sangre 11. Sin embargo. En comparación con el violeta de metilo. generalmente únicas y en estrecho contacto con el núcleo. Sin embargo. es probable que los cuerpos de Heinz sean visibles en los hematies únicamente si el paciente ha sido esplenectomizado previamente o si se han tomado dosis masivas del producto químico o del farmaco. los cuerpos de Heinz se tinen menos intensamente con el azul de cresil brillante o con el nuevo azul de metileno. también pueden verse por iluminación con fondo oscuro o con microscopia de contraste de fases. Preparaciones teñidas Disolver aproximadamente 0. El azul Rhodanile (solucion de 5 g/l en 10 g/l de NaCl) los tine rapidamente 17 (es decir. El producto de degradación de una hemoglobina inestable (p. Si se esplenectomiza a estos pacientes. es preferible buscarlos en las preparaciones tenidas (v. A continuación. Su tamaño varía de 1 a 3 μm. el hallazgo de los cuerpos de Heinz es un signo de intoxicación química.. si es necesario. los métodos de análisis se describen en el capitulo 7. Demostración de los cuerpos de Heinz Preparaciones sin teñir Los cuerpos de Heinz pueden verse como objetos refringentes en extensiones secas y sin tenir si la iluminación se reduce disminuyendo la intensidad del condensador del microscopio. mas adelante). la tinción con violeta de metilo de la medula ósea pondrá de manifiesto las cadenas α precipitadas. si no se ha contratenido la preparacion. En una única célula puede haber uno o mas de uno. Si se fijan las extensiones en metanol. No hay un método citoquimico para demostrar la ferritina. se pueden encontrar las inclusiones en los reticulocitos y en los hematíes maduros. excepto tras una esplenectomia. pueden desarrollarse in vitro en la sangre previamente a una esplenectomia si se incuba durante 24-48 h12. pueden desplazarse dentro de las células con un movimiento browniano lento. en las preparaciones húmedas. en 2 min).. fijar las extensiones tenidas vitalmente mediante la exposicion al vapor de formalina durante 5-10 min. A continuacion. preparar las extensiones y dejarlas secar u observar la suspensión de las celulas entre el portaobjetos y el cubreobjetos.Un estudio ha demostrado que para establecer la ausencia de hierro tingible.5 g de violeta de metilo en 100 ml de NaCl. intoxicación farmacológica. ej. Aparecen como grandes inclusiones irregulares en los normoblastos tardios. así como por agentes oxidantes inorgánicos como el clorato potásico. Entre las revisiones realizadas sobre los cuerpos de Heinz se encuentran las de Jacob 13 y White14. tras lavarlas minuciosamente en agua. ej. Cuando se deben a una hemoglobina inestable. Los cuerpos de Heinz son un signo tardio del dano oxidativo y representan un producto final de la degradacion de la hemoglobina.Los cuerpos de Heinz tambien se tinen con otros colorantes basicos. son raramente visibles en los hematies recien extraidos.5). pueden ser vistos inmediatamente como cuerpos azul palido en una preparacion de reticulocitos bien tenida. Actualmente se sabe que los cuerpos de Heinz pueden producirse por la acción sobre los hematíes de un amplio rango de compuestos aromaticos nitrogenados y aminados. No obstante. .

5 mol/l. Cuando solo hay unas cuantas células afectadas. Método Mezclar conjuntamente en un tubo pequeño. de los reticulocitos (fig. Inmediatamente despues de su secado. casi esféricos. en la enfermedad de la hemoglobina H (p. marcar los tubos justo por debajo de la capa de leucocitos y tambien 1 cm más abajo. El pH es aproximadamente 1. 13. Para su utilizacion. En el rasgo talasemico α0.Demostración de las inclusiones H de la hemoglobina Los pacientes con talasemia α. sobre todo. en el que la elucion se realiza a pH 1.Tienen poco valor práctico en la practica actual.5.01-1. Solución A: 7. 13. a la enfermedad de la hemoglobina H. el porcentaje es considerablemente mayor. Hay que recordar que cuando se necesita un diagnost ico preciso del tipo de rasgo talasemico α (p. presentan hematies en los que se desarrollan inclusiones esfericas multiples azul-verdosas al exponerlos al azul de cresil brillante o al nuevo azul de metileno como en las preparaciones de reticulocitos18 (fig. aclarar . volúmenes iguales de sangre fresca o de sangre con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y 10 g/l de azul de cresil brillante o 20 g/l de nuevo azul de metileno en tampon fosfato isoosmotico a pH 7.0% de los hematies contiene inclusiones. 24 g.. como para la tinción de reticulocitos (v. romperlos por las marcas indicadas y transferir cuidadosamente los segmentos rotos a un tubo pequeño. Anadir 1 gota de colorante e incubar a 37 °C durante 3 h antes de hacer una extension. es un procedimiento sensible para identificar las células individuales que contienen hemoglobina F incluso cuando hay pocas. pero este hallazgo proporciona una clave importante para el diagnostico. Como regla. Su detección en la circulación materna ha proporcionado información valiosa en la patogénesis de la enfermedad hemolítica del recién nacido. de B. Estos métodos fueron descritos por Kleihauer20. La hemoglobina H precipita en forma de cuerpos multiples. pag.4. pero se pueden observar pequenas cantidades de celulas similares en el rasgo talasemico α.5. en algunos casos. Reactivos Fijador. algunas de ellas pueden ser reticulocitos porque resisten tambien a la elucion acida en alguna medida. tenidas de oscuro en un trasfondo de células fantasma pálidamente tenidas. Llenar 2-3 tubos capilares con la sangre y centrifugarlos durante 5 min en una centrifuga de microhematocrito.7) y que pueden diferenciarse claramente del material reticulofilamentoso. Solución B: FeCl3.5 g/l de hematoxilina en etanol al 90%. En ese caso lo indicado es el análisis del ADN. hay que filtrar la solucion. en el rasgo talasemico α0. mezclar correctamente 5 vol. – –/–αα). en la técnica descrita a continuación. de diverso tamaño. Solución de elución. Contratinción. su detección será más fácil en una preparación enriquecida19. Recomendamos el método siguiente22. 2. Las celulas ocasionales que se tiñen en un grado intermedio son menos faciles de evaluar. que se tiñe de oscuro. al menos el 10% de las células desarrollan inclusiones y. 1 g/l de eritrosina acuosa o 2. 34). que se tinen de un color azul-verdoso pálido (fig. A continuación. 20 ml de HCL. 13. Esta característica corresponde. introducido por Kleihauer y cols. Después. si se forma un precipitado. de A y 1 vol. agua bidestilada hasta 1 l. Mantener la preparación a 37 °C durante 1-3 h haciendo extensiones a intervalos. Carboxihemoglobina y metahemoglobina Las células que contienen carboxihemoglobina y metahemoglobina pueden ponerse de manifiesto por medios citoquimicos. solo el 0..21. La identificación de las células que contienen hemoglobinaF se basa en el hecho de que son resistentes a la elución acida en mayor grado que las celulas normales.8). asi. Método Preparar extensiones nuevas secadas al aire. ej. la que resulta de la heterocigosidad compuesta talasemia α0/talasemia α+. Hemoglobina fetal El método citoquímico de elución acida. que forman hemoglobina H (β4). para el diagnostico prenatal). Dejar que se sequen las extensiones y examinarlas sin contratenirlas.5 g/l de eosina acuosa. La solución puede utilizarse durante alrededor de 4 semanas. no está indicada la preparacion de la hemoglobina H. aunque no exclusivamente.6). Etanol al 80%. El número de células que contienen inclusión varía de acuerdo con el tipo de talasemia α. fijar las extensiones durante 5 min en etanol al 80% en una cubeta de Coplin. sobre todo. ej. aparecen como células aisladas.

similar al descrito anteriormente. 13. es posible detectar la presencia de hemoglobina F y de hemoglobina A en la misma celula25. Un método alternativo consiste en la deteccion de las células tras etiquetar estas con isotiocianato de fluoresceina (FITC) 26. Se ha desarrollado un metodo de tincion immunofluorescente basado en la utilizacion de un anticuerpo específico contra la hemoglobina F.9). la hemoglobina A2 y la hemoglobina F en los hematies26. disponer las extensiones durante 20 s en una cubeta de Coplin con la solución de elución. Después. En una de ellas se incorpora nuevo azul de metileno a la solución tampón. por último. con anticuerpo marcado con rhodamina contra la globina y un anticuerpo marcado con fluoresceina contra la globina . y b) sangre de adulto normal. Hemoglobina S y otras variantes de la hemoglobina Se ha utilizado la inmunodifusion con anticuerpos específicos para la identificacion de la hemoglobina S. que no reacciona con la hemoglobinaA24. .las extensiones rápidamente en agua y dejarlas verticalmente sobre un papel secante durante unos 10 min para que se sequen. colocarlas para contratenirlas durante 2 min. La ventaja de esta tecnica es que los reticulocitos se tinen de azul. Se han propuesto diversas modificaciones al método de Kleihauer. Utilizando un procedimiento de doble marcaje. es posible identificar la hemoglobina S así como cualquier otra hemoglobina en las celulas individuales. el tiempo de reaccion se alarga y el tampon se utiliza para lavar las extensiones 23. Aclarar en agua del grifo y dejarlas secar al aire. lavarlas minuciosamente con agua y. Las celulas fetales se tinen de rojo y las celulas fantasma del adulto de rosa palido (fig.27. mientras que las celulas que contienen hemoglobina F lo hacen de rosa. Mediante un método de doble marcaje. Posteriormente. Como controles positivo y negativo deben tenirse al lado de las extensiones problema extensiones preparadas a partir de: a) una mezcla de sangre del cordón umbilical y de sangre de adulto.