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Resumen
El sector petroqumico necesita grandes cantidades de agua, para proceso y refrigeracin, que se contaminan con productos derivados del petrleo. Normalmente, en las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) de estas empresas se aplica el sistema de fangos activos, que biodegrada la materia orgnica hasta CO2, NH3 y H2O y, adems, forma nueva biomasa celular. Para identificar correctamente los actinomicetos en las EDAR, se debe realizar lo que se denomina taxonoma polifsica, que consiste en analizar las secuencias del gen 16S rDNA y determinar diversos marcadores quimiotaxonmicos. Posteriormente, se estudia la capacidad de biodegradacin de fenol y naftaleno de cada una de las especies aisladas e identificadas.

Caracterizacin de actinomicetos con capacidad de biodegradacin en plantas depuradoras del sector petroqumico
Por:  Albert Soler1; Gonzalo Cuesta1; Jos Luis Alonso2; Andrs Zornoza2 Universitat Politcnica de Valncia Departamento de Biotecnologa, rea de Microbiologa Escuela Tcnica Superior de Ingeniera Agronmica y Medio Natural Camino de Vera, s/n - 46022 Valencia Tel.: 963 876 000 - www.upv.es
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Palabras clave:

Fangos activos, bacteria, actinomicetos, BLAST, PCR, biodegradacin, fenol, naftaleno.

Universitat Politcnica de Valncia Ciudad Politcnica de la Innovacin Instituto Universitario de Ingeniera del Agua y Medio Ambiental (IIAMA) rea de Qumica y Microbiologa del Agua Camino de Vera, s/n - 46022 Valencia Tel.: 963 876 000 - www.upv.es
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Abstract
Characterization of actinomycetes with the ability of biodegradation of petrochemical wastewater treatment plants The petrochemical sector consumes large amounts of water, either for processing or for cooling. This water is contaminated with petroleum products. The activated sludge system is the main treatment system worldwide. This system consists of an aerobic treatment that oxidizes organic matter to CO2, NH3 and H2O and form new cell biomass. To identify actinomycetes, polyphasic taxonomy must be done which consists in the 16S rDNA gene sequences analysis and to determine severals chemotaxonomic markers. Then, the ability of phenol and naphthalene biodegradation of each species has been studied.

Keywords:

Activated sludge, bacterium, actinomycetes, BLAST, PCR, biodegradation, phenol, naphthalene.

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1. Introduccin l agua es fundamental en muchos procesos industriales, entre ellos del sector petroqumico, ya que puede intervenir como materia de un proceso, como disolventeo diluyente, como medio de transporte de otras materias o como sistema auxiliar, ya sea de lavado o limpieza general (Asociacin Alemana de Saneamiento, 1986). Es por ello que es el sector que ms agua gasta y, por tanto, el ms susceptible de contaminar. En la industria petroqumica, los contaminantes bsicos son la concentracin de materia orgnica, aceites, fenoles, amonaco y sulfuros. Por tanto, debe disponer de buenos sistemas de tratamiento para eliminar los definidos como contaminantes, molestos o con efectos nocivos para el medio ambiente, y ajustar la calidad del agua vertida a las especificaciones legales. El sistema ms utilizado es el de fangos activos. Este constituye una

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mezcla de microorganismos, en su mayora bacterias hetertrofas, que transforman la materia orgnica biodegradable hasta formas ms simples y estables. La biomasa celular obtenida forma flculos que se encuentran formados por una poblacin muy heterognea de microorganismos, partculas orgnicas e inorgnicas (Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999). 2. Actinomicetos Los actinomicetos forman un grupo de microorganismos morfolgicamente muy heterogneo, pertenecientes al dominio Bacteria , formado por bacterias generalmente aerobias, Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Dos de las propiedades ms significativas de los actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos, que no pueden ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar numerosos metabolitos

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Tabla 1 Suborden Familia Corynebacteriaceae Dietziaceae Mycobacteriaceae Gnero Corynebacterium Dietzia Mycobacterium Nocardia Gordonia Corynebacterineae Nocardiaceae Millisia Rhodococcus Skermania Williamsia Segniliparaceae Tsukamurellaceae Pseudonocardineae
Micrococcineae

tenecientes al sector petroqumico de la regin de Andaluca. De estas plantas, se eligieron los aislados ms representativos, seleccionando aquellos que presentaron una mayor diversidad morfolgica. 3.1. Toma de muestras y aislamiento La toma de muestras se realiz durante el ao 2008 por el propio personal de la planta. Se tomaron muestras de espumas del reactor biolgico en recipientes estriles y se enviaron al laboratorio donde se guardaron en refrigeracin a 4 C y se procesaron dentro de las 48 horas siguientes. Para realizar el aislamiento se utilizaron 4 medios de cultivo diferentes. Las muestras se procesaron realizando una serie de diluciones para rebajar la carga microbiana. 3.2. Caracterizacin morfolgica Se realiz una observacin macroscpica y una observacin microscpica. La observacin macroscpica se fundamenta en el aspecto de las colonias aisladas. En la observacin microscpica se realiz una tincin Gram para comprobar que tuvieran una morfologa tpicamente nocardioforme. Por ltimo, se realiz la prueba de la catalasa. 3.3. Caracterizacin quimiotaxonmica Para caracterizar quimiotaxonmicamente las cepas aisladas, se estudiaron diferentes parmetros quimiotaxonmicos para poder definir de forma correcta los aislados dentro del grupo mycolata. Los parmetros realizados fueron la presencia de cidos miclicos, la determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico y el anlisis de los azcares predominantes de la pared celular. Estas tres pruebas se basan en una digestin de clulas en diferentes reactivos para, posteriormente, realizar una cromatografa en capa fina.
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Segniliparus Tsukamurella Pseudonocardia

Microbacterium

Pseudonocardiaceae
Microbacteriaceae

Tabla 1. Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae, Pseudonocardineae y Micrococcineae basada en las secuencias de DNA y RNA ribosmico 16S (Zhi et al., 2009).

2.1. Clasificacin actual En 1997 se propuso la clase Actinobacteria (Stackebrandt et al .,

3. Material y mtodos En el presente trabajo se estudian cuatro estaciones depuradoras per-

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bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable del metabolismo celular de este grupo microbiano (Goodfellow et al., 1997). El inters por los actinomicetos comenz a raz del descubrimiento de la capacidad de estos microorganismos para producir antibiticos. Aunque la bsqueda de compuestos bioactivos contina en auge, el inters por los actinomicetos se ha diversificado y actualmente ocupa reas muy variadas. Pueden ser patgenos de plantas, de animales, de humanos, descomponer productos del caucho, crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones depuradoras de aguas residuales causan espumas densas que llegan a obstruir las instalaciones. Por la diversidad de hbitats que pueden colonizar, este grupo de microorganismos tiene un enorme inters ecolgico (June et al., 1999).

1997), compuesta por los actinomicetos y sus parientes filogenticos con un alto contenido en G+C. La segunda edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Boone et al., 2001) recoge la clasificacin actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum. Dentro del phylum se reconoce una nica clase, Actinobacteria, que mantiene la estructura jerrquica propuesta por Stackebrandt et al., (1997). Adems, estn incluidos en l 6 rdenes, 39 familias y ms de 130 gneros (Garrity y Holt, 2001). Dentro de esta clase se incluye el orden Actinomycetales, el cual engloba los gneros estudiados en el presente trabajo. Estos gneros pertenecen a los subrdenes Corynebacterineae, Pseudonocardineae y Micrococcineae. La Tabla 1 muestra la clasificacin de las familias y los gneros estudiados en el estudio.

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Figura 2. Rhodococcus ruber (54B).

Figura 1. Placa de recuento donde se aisl la cepa PA3.

Figura 3. Gordonia paraffinivorans (C2.2).

3.4. Caracterizacin genotpica A partir de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedi a la extraccin del DNA utilizando un kit de extraccin comercial (Sigma) si-

guiendo las instrucciones del fabricante. El DNA extrado de las muestras fue amplificado mediante PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) utilizando los iniciadores especficos (Lane, 1991) 27f y 1492 r. Finalmente, los productos obtenidos de la PCR se purificaron y secuenciaron, para posteriormente analizar la secuencia e identificar cada cepa a nivel de especie. La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproximada de 600 a 700 nucletidos, se obtuvo en un archivo de texto electrnico desde el electroferograma mediante la aplicacin cientfica Chromas (versin 1.43). Las secuencias del 16S rDNA fueron ensambladas manualmente, utilizando el programa informtico Phydit, a partir de la combinacin de fragmentos sepa-

rados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican el segmento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucletidos de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron eliminados antes de ensamblar la secuencia completa. Las secuencias parcialmente alineadas se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA. La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se determin mediante la herramienta informtica BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Jones, 2006). Para caracterizar a nivel de especie cada cepa se realizaron los rboles filogenticos y las matrices de similaridad de cada gnero utilizando los programas informticos Phydit y Treconw. 3.5. Biodegradacin En estos ensayos se utilizaron tres medios de cultivo, suplementados inicialmente con glucosa al 0,1% para, as, conseguir una aclimatacin previa que mejore la siembra poste-

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Figura 4. Cromatoplaca de cidos miclicos.

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rior en los medios suplementados con los productos txicos. Los compuestos txicos elegidos fueron el fenol y el naftaleno. Los medios elegidos se suplementaron con ellos al 0,1%. Se incubaron en estufa a 28 C durante 14 y 21 das. Como control positivo se utilizaron los medios suplementados con glucosa al 0,1%. 4. Resultados y discusin 4.1. Aislamiento Se realizaron 13 muestreos, obtenindose un total de 35 aislados, de los cuales se eligieron 23 por presentar una mayor variabilidad morfolgica. En la Figura 1 se observa una placa de recuento de donde se realiz algn aislamiento. 4.2. Caracterizacin morfolgica En la caracterizacin morfolgica se realiz una observacin macroscpica directa en placa (Figuras 2 y 3) y, posteriormente, una observacin microscpica mediante tincin Gram, adems de la prueba de la catalasa. Se pudo observar cmo todos los aislados estudiados eran catalasa positivos y Gram-positivos. Generalmente las colonias con aspecto mucoso suelen presentar morfologas cocoides y las colonias rugosas o sin brillo suelen ser bacilos de tamao variable en ocasiones con ramificaciones en ngulo recto bien desarrolladas. 4.3. Caracterizacin quimiotaxonmica En primer lugar se realiz la extraccin y anlisis de los cidos miclicos de la pared celular. Se observ (Figura 4) que todos los aislados estudiados posean cidos miclicos, a excepcin de 5 de ellos. La segunda prueba realizada (Figura 5) consisti en determinar los ismeros del cido diaminopimlico (DAP). El suborden Corynebacterineae se caracteriza porque todas sus especies contienen la forma mesoDAP. Todos los aislados estudiados
Figura 5. Cromatoplaca de ismeros del DAP.

Figura 6. Gel de PCR con los productos de amplificacin del 16S rDNA.

4.4. Caracterizacin genotpica Una vez realizada la extraccin de DNA, se comprob la cantidad y calidad del mismo antes de llevar a cabo la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. La deteccin de los fragmentos amplificados obtenidos tras la PCR se realiz tambin mediante electroforesis (Figura 6) en gel de agarosa. Los productos de la PCR se purificaron y se enviaron a secuenciar al Servicio de Secuenciacin del Instituto de Biologa Molecular y Celular de Plantas (IBMCP) de la UPV. Para la realiza-

4.5. Biodegradacin Para realizar las pruebas de biodegradacin se sembraron las especies halladas anteriormente en tres medios de cultivo conteniendo cada uno de ellos fenol, naftaleno y glucosa, siendo este ltimo el control
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en este trabajo posean la forma meso-DAP, a excepcin de uno de ellos. Por ltimo, se determinaron los azcares predominantes de la pared celular. En nuestro caso se debe obtener una tipo de pared celular IV, siendo los constituyentes distintivos mayoritarios arabinosa y galactosa. Se observ que todos los aislados, menos uno, posean esta forma.

cin de las reacciones de secuenciacin se utiliz el kit ABbi Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction (versin 3.1). Las secuencias completas, obtenidas con ayuda de los programas informticos Chromas y Phydit, se analizaron mediante el programa BLAST (NCBI). Con estos resultados se obtiene una identificacin a nivel de gnero al 100% y una posible identificacin a nivel de especie. De las 23 aislados seleccionados se obtuvieron cinco gneros distintos (Gordonia, Mycobacterium, Microbacterium, Rhodococcus y Pseudonocardia). En la Tabla 2 se puede ver el resultado del BLAST con el porcentaje de identificacin de cada aislado.

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positivo. Todas las cepas se incubaron a una temperatura constante de 28 C. Las cepas que se escogieron para realizar las pruebas de biodegradacin fueron las siguientes: PC4, C5.1a, C2.3, PA2, PB6, C4.5, 54B, RG.4a, C5.5a, R5, PB1, C2.2, LR4, RG.4b, C5.6, RG3 y CQG5.a. Todas ellas comprenden los gneros y las especies que se han caracterizado e identificado anteriormente. Para las cepas PB1 (Figura 7) y PC4 se obtuvo un crecimiento mxi-

mo a los 14 y 21 das en los medios suplementados con naftaleno. Para el fenol el crecimiento fue medio a los 21 das en un solo medio, en los otros dos fue muy bajo o nulo. Se observ que para las cepas 54B (Figura 8) y C5.5a el crecimiento en los medios suplementados con fenol fue mximo a los 14 y 21 das, para los tres medios de cultivo. Para el naftaleno el crecimiento fue bajo a los 21 das. A los 14 das de incubacin, para la cepa RG3 (Figura 9) se observ

un crecimiento mximo en dos de los medios suplementados con fenol. A los 21 das el crecimiento fue mximo en los tres medios de cultivo. Para el naftaleno, el crecimiento fue nulo. 5. Conclusiones De todos los cultivos aislados estudiados en el presente trabajo, el 39,1% pertenece al gnero Mycobacterium; el 30,4%, al gnero Gordonia; el 17,4%, al gnero Pseudonocardia ; el 8,7%, al gnero Rhodococcus; y, finalmente, el 4,3%, al gnero Microbacterium. Las cepas ms abundantes en el recuento en placa pertenecen al gnero Pseudonocardia, cuyas especies degradan ambos compuestos txicos, y al gnero Microbacterium, cuya nica especie no degrada ninguno de los dos compuestos txicos. La especie Pseudonocardia asaccharolytica degrada principalmente el naftaleno y en menor medida el fenol. Los filamentos de esta especie no son hidrofbicos por lo tanto los problemas de espumas que puedan causar este especie quedan descartados. Adems, hay que destacar que, pese a que las especies de Pseudonocardia asaccharolytica son organismos filamentosos, ocasionaran muy pocos problemas de bulking debido a que sus filamentos no presentan ramificaciones muy complejas. Es por ello que para estudios posteriores en plantas piloto sera la especie idnea. Los porcentajes de las especies Mycobacterium y Pseudonocardia se consideran especialmente altos en comparacin con resultados obtenidos en plantas depuradoras de aguas residuales domsticas, ya que en estas ltimas no se suelen encontrar. Se obtiene un porcentaje total de cepas degradadoras del 29,4%, siendo las especies que degradan los dos compuestos txicos Rhodococcus ruber y Pseudonocardia asaccharolytica. La Gordonia amicalis solo degrada el fenol. La tcnica del anlisis del 16S rDNA, que incluye la elaboracin de

Tabla 2 Cepas C5.1a C5.1b C2.3 C4.5 PA2 PB6 PB7 RG4.a RG4.b 54B C5.5a Identificacin Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium vaccae Mycobacterium vaccae Rhodococcus ruber Rhodococcus ruber Pseudonocardia asaccharolytica Pseudonocardia asaccharolytica Pseudonocardia asaccharolytica Pseudonocardia asaccharolytica Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans Gordonia paraffinivorans Gordonia amicalis Microbacterium flavum % 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 99,48% 99,25% 100% 100% 97,48% 97,47% 97,47% 97,47% 99,78% 99,78% 99,78% 99,78% 99,18% 99,78% 100% 98,43%

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PA3 PB 1 PB3 PC4 R1 R5 C2.1 C2.2 C5.6 LR4 RG3 CQG5.a

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Tabla 2. Identificacin obtenida mediante BLAST de la secuencia del 16S rDNA.

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Figura 7. Control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado PB1 en medio MSM suplementado con naftaleno (B).

Figura 8. Control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado 54B en medio MSM suplementado con fenol (B).

Figura 9. Control positivo glucosa medio BHM (A) y aislado RG3 en medio BHM suplementado con fenol (B).

rboles filogenticos y matrices de similaridad nucleotdica, es el mtodo ms fiable para identificar, a nivel de especie, actinomicetos aislados de muestras ambientales. 6. Agradecimientos Los autores agradecen la colaboracin de CEPSA por el envo de las

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La tcnica de anlisis del 16S rDNA es la ms able para identicar, a nivel de especie, actinomicetos aislados de muestras ambientales

muestras de fango activo de las cuales fueron aislados los organismos. 7. Bibliografa [1] Asociacin Alemana de Saneamiento (1986). Principios para el diseo de plantas de tratamiento de aguas residuales de refineras de petrleo. Reglas tcnicas con respecto a la gestin de aguas residuales y desechos. Instructivo A701. [2] Bitton, G. (1999). Wastewater microbiology. 2nd Ed. WileyLiss, Inc., 2 ed., New ork. [3] Boone, D.R.; Castenholz, R.W.; Garrity, G.M. (2001). Bergeys manual of systematic bacteriology. Springer-Verlag, 2 ed., vol. 1. [4] Garrity, G.H.; Holt, J.G. (2001). The road map to the manual. In: Bergeys manual of systematic bacteriology. The Archaea and the deeply branching and

phototrophic bacteria. Garrity, G.M. (ed.-in-chief), SpringerVerlag, 2 ed., vol. 1. [5] Goodfellow, M.; Chun, J.; Blackall, L.; Kang, S.; Chil Hah, Y. (1997). A proposal to reclassify Nocardia pinensis Blackall et al. as Skermania piniformis gen. Int. J. Syst. Bacteriol., nm. 47, pgs. 127-131. [6] Jones, A.M. (2006). Towards an improved taxonomy of the genus Rhodococcus. D. thesis. Division of Biology, Faculty of Science, Agriculture and Engineering, University of Newcastle, nm. 3, pgs. 108-110. [7] Brown, J.M.; Mneil, M.M.; Desmond, E.P. (1999). Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinomadura, Streptomyces, and other actinomycetes of medical importance. Manual of Clinical Microbiology, nm. 7, pgs. 370-392. [8] Lane, D.J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. En: Stackebrandt, E. and Goodfellow M. editors. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, pgs. 115-148. [9] Soddell, J.A.; Seviour, R.J. (1990). A rewiew: microbiology of foaming in activated sludge plants. J. Appl. Bacteriol., nm. 69, pgs. 145-176. [10] Stackebrandt, E.; Rainey, F.A.; Ward-Raiey, N.L. (1997). Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. Int. J. Syst. Bacteriol., nm. 47, pgs. 479-491. [11] Zhi, X.Y.; Li, W.J.; Stackebrandt, E. (2009). And update of the structure and 16S rRNA gene sequence-based definition of higher ranks of the class Actinobacteria, with the proposal of two new suborders and four new families and emended descriptions of the existing higher taxa. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, nm. 59, pgs. 589-608.

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