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Produção de Biopolímeros

Alberto André R. Drummond
Profª.: Maria Antonieta P. Couto Profª.: Andréa Medeiros Salgado Profª.: Eliana Alhadef Prof.: Ney Pereira Junior Profª.:Verônica Ferreira

Fundamentos de Engenharia Bioquímica Escola de Química Universidade Federal do Rio de Janeiro

Definição
Biopolímeros são materiais fabricados a partir de Fontes Renováveis ( soja, milho, cana-de-açúcar , celulose, quitina, quitosana, soro de leite, etc.) que têm importância estratégica para o futuro, principalmente quando utilizam “energia renovável em todo seu ciclo de vida”,podem ser biodegradáveis e biocompatíveis,o que lhes conferem vasta gama de aplicações.

Porque Produzir Biopolímeros?
A biodegradação não é apenas o resultado de uma simples ação de microorganismos e as diversas condições nas quais eles atuam estão relacionadas com todas as características do meio. Temos a fotodegradação , a degradação química natural e vários outros fatores ambientais atuando em conjunto. Nem sempre um plástico biodegradável representa uma escolha ecologicamente correta. Para que um produto seja biodegradável, ele precisa completar o processo de sua decomposição no máximo em um período de 6 meses à 1 ano.

Biodegradáveis Biocompatíveis Podem ser produzidos a partir de alguns efluentes industriais, principalmente das industrias alimentícias Questões Ambientais Ampla faixa de aplicações e propriedades Os custos de sua produção vem diminuindo muito com o atual interesse no setor ambiental e de novas tecnologias disponíveis. Aplicações específicas no setor de biomateriais e nanotecnologia vem elevando muito seu valor comercial .

ciclo natural do carbono

A REVALORIZAÇÃO NO PÓS-CONSUMO DE BIOPOLÍMEROS DEVE SER FEITA POR MEIO DE RECICLAGEM MECÂNICA (p.ex. papel, cartão, etc.), RECICLAGEM ENERGÉTICA (p.ex. bagaço da cana) OU POR COMPOSTAGEM (p.ex. resíduos de alimentos)
EM ATERROS, OS PLASTICOS BIODEGRADÁVEIS, PRODUZEM GASES COM EFEITO ESTUFA (CO2, Metano...) COM DESPERDÍCIO DO VALOR ENERGÉTICO. Se o plástico for de fonte renovável o CO2 é renovável mas o Metano não é (com efeito estufa 23 vezes maior).
A combustão de biopolímeros leva a CO2 renovável ,mas sua decomposição natural pode levar a metano ,cuja reabsorção natural é mais lenta ,podendo causar problemas ambientais caso em quantidades excessivas. Alem disto estes materiais contem plastificantes e aditivos que podem possuir algum efeito tóxico .

O uso de plásticos biodegradáveis não exclui a necessidade de reciclagem e uso racional consciente .O descarte direto na natureza destes materiais podem também levar a problemas ambientais.

Os biopolímeros apresentam propriedades que os tornam úteis em aplicações mais nobres

Parte do CO2 de fonte não renovável se acumula na atmosfera

CO2 + H2O

Incineração

Geração de Energia

ATMOSFERA
Aterro Sanitário

Fotossíntese

O CO2 derivado de fontes renováveis é renovável
•Cana de Açúcar •Extrato de Soja •Efluentes da Indústria de alimentos •Resíduos Agro industriais •Soro de Leite •Amido e Resíduos Vegetais ( fibras, etc. ) •Outros

Reciclagem

Descarte Coleta Seletiva

Uso

Preparação de Derivados (monomeros) & Controle de Qualidade

Petróleo

Refinaria

Distribuição e Comércio

Preparação e Tratamento da Matéria Prima

Síntese Fabricação Polímero

Fabricação de Bens de Consumo

Fermentação Processamento / Formulação

Separação / Purificação

Formulação

Poliamida

PLÁSTICOS A PARTIR DO AMIDO
Os Compósitos com amido e fibras vegetais tem apresentado excelentes propriedades e abrindo novos campos de aplicações , tais como nas industrias automobilísticas , de utensílios domésticos ,etc.

O amido se destaca pela sua disponibilidade ,biodegradabilidade ,baixo custo, e excelente desempenho.

Potes produzidos com PHB ,onde se observa um ao natural (cor âmbar ) e o outro pigmentado

Estrusora Industrial utilizada na produção de a base de biopolímeros.

artefatos

Microfotografia do Termoplástico obtido por processamento em extrusora mono-rosca.

Micrografia do Termoplástico obtido por Processamento em extrusora dupla - rosca

Uso de Extrusora Dupla Rosca : Elevada tensão cisalhante e elevada relação L/ D garantem a polimerização e melhor homogeneidade do produto final

Estrutura do Amido

Aplicações
• Filmes para recobrimento e embalagem de alimentos • Filmes comestíveis • Material de enchimento para embalagens • Filmes para sacos de lixo • Utensílios de uso doméstico ( potes ,copos, pratos,etc) • Aplicações na industria automobilística • Aplicações na industria de cosméticos • Aplicações na industria de alimentos • Placas rígidas
Embalagem para Cenouras – Empresas GmbH e IBAW ( Alemanha )

Biopolímero Protéico da Teia de Aranhas
( ASAAAAAA )x − (GGPGQQ ) y − (GGYGPG )z − ( ASAAAAAA )x − (GGYGPG ) y
Estrutura do biopolímero protéico da teia

Bloco rico em Alanina Bloco Rico em Glicina

Fase Cristalina Fase Amorfa

Resistência Elasticidade

• Alta resistência • Alta Flexibilidade • Extremamente Leve • Biodegradável • Biocompativel

Solventes
• Ácido Fórmico • Cloreto de Guanidina • Hexafluoroisopropanol

Coagulantes • Ar Atmosférico
• Metanol • Solução água-Metanol

Estratégias para obtenção da Seda Recombinante • Expressão de gene em E. coli e Pichia • Expressão de gene em células BHK • Expressão de gene em células vegetais
Espécies de Aranhas • Araneus diadematus • Nephila clavipes • Bombyx mori

• Expressão de gene em células mamárias

Fibras de teia de aranha – um biopolímero supramolecular

A estrutura molecular dos segmentos ricos em Polialanina P(A) nos blocos da fase cristalina (Rígida) provavelmente apresentam fenômenos de cooperatividade entre as interações por ligações de hidrogênio , muito semelhante a este modelo teórico que mostra a estrutura da Poli –acrilamida P(Am).

∆S SegRig ≠ ∆S SegFlex
• Interações de hidrogênio entre cadeias poliméricas

Diferentes tipos de teia com diferentes funções apresentam propriedades distintas . Presença de Variação na estrutura polimérica

• Favorecimento de separação de fases devido a forte cooperatividade e ligação de hidrogênio . entre as cadeias poliméricas formadas a partir da reação entre as duas proteínas oligoméricas. • Hidrofobicidade • Ligações de hidrogênio inter polímero e cooperatividade ..rígidos e elevação de ∆S nos segmentos flexíveis. Abaixamento do ∆S nos segmentos

Algumas aplicações :
• Pára-choques para automóveis
• Tendões e ligamentos artificiais, fios para microsuturas , bandagens, pele e tecidos artificiais • Substituto para o Kevlar • Substituto para fibras de aramida • Fibras óticas para circuitos em nanoescala • Fibras óticas para melhorar a resolução em microscopia • Aplicações em equipamentos para ensaios em nanoescala (química supramolecular) • Industria têxtil • Membranas com elevado coeficiente de difusão para O2 e excelentes propriedades ópticas.

Ws =

Tg

Tg (Tg

S

(Tg H
H

) − Tg S )
− Tg

Ws = Fração mássica de segmentos flexíveis na fase flexível. Tg = Temperatura de transição vítrea do material TgS= Temperatura de transição vítrea para os segmentos flexíveis TgH = Temperatura de transição vítrea dos segmentos rígidos . WH = ( 1 – Ws ) = Fração mássica dos segmentos rígidos .

Aplicações Nobres _
• Biomateriais • Nanotecnologia • Alimentos ( gomas ,celulose , inulina , polissacarídeos, etc.) • Produtos farmacêuticos e cosméticos • Industria bélica ( Biosteel e outros ) • Industria Têxtil • Tratamento de efluentes contendo metais pesados

Biopolímeros polímeros biocompatíveis Novos Biomateriais
Os biopolímeros geralmente não causam problemas de rejeição sendo incorporados naturalmente aos tecidos corporais Alguns Exemplos:
- Composto Ósseo de Ricinus (COR )
- PLA ( implantes , fios para sutura, etc ) - Poli (3-hidroxibutirato) ou PHB ( Enxerto ósseo ) - Biopolímero de proteínas recombinante de aranha ( microsuturas , tendões artificiais ) Figura 2

Biopolímeros Obtidos a partir de Microrganismos
A partir de açúcar e bagaço de cana :
1 kg de plástico biodegradável ( PHB ) é produzido a partir de 3kg de açúcar e 17,1 kg de bagaço.

O Polihidroxibutirato (PHB) é um composto de uma classe dos polímeros termoplástico chamados “polihidroxialcanoatos” que servem a muitas bactérias como uma maneira de armazenar dentro da célula, materiais que podem servir de reserva para obtenção de carbono e como fonte de energia para o caso de ausência de um dos dois.

Plantas modificadas geneticamente para produção de PHB como a batata (Solanum tuberosum) e tabaco (Nicotiana tabacum), podem fornecer outros meios de produzir este Polímero, porem o rendimento é muito menor.

Produção Industrial de PLA
Produção em Escala Industrial Principais Empresas :
DuPont Coors Brewing Dow Chemical Cargill –1994 ( 6000 ton/ano) Cargill –Dow LLC ( Joint Venture ) - 2000 100000 ton/ano ( produção de 2003 )

1994

Poli-hidroxialcanoatos
HISTÓRICO 1920 – 1ª determinação da composição de PHA’s por Maurice Lemoigne 1974 - Descobertos outros poli-hidroxialcanoatos (PHA) 1976 – Início das pesquisas de produção de P(3HB) por fermentação bacteriana, na Inglaterra 1990 - primeiro produto obtido a partir de PHA, uma embalagem de “shampoo” de uma indústria de cosméticos 1991- pesquisas no Brasil 2000 - teve início a produção de P(3HB) pela então indústria brasileira PHB industrial SA

Produção de Poli-hidroxialcanoatos
Poli-hidroxialcanoatos
Produto de reserva energética Necessidade de métodos eficientes e de baixo custo para rompimento celular Programação da estrutura através da limitação e associação de diferentes substratos

Tabela 3

Figura 4

Microfotografia mostrando microgranulos de poli- hidroxibutirato no interior das células bacterianas .

Figura 5

Polihidroxialcanoatos
Polihidroxibutirato (PHB):

Formado a partir de açúcares, ácido orgânicos e outros;
Poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) P(HB-co-HV): Poli(hidroxibutirato-co- hidroxivalerato) P(HB- co-

Necessidade de um precursor (Ex.:ácido propiônico);

Figura 6 - Duas células de Burkholderia sacchari Bactéria Produtora de biopolimero termoplástico descoberta no Brasil em culturas de cana.

Figura 7 - Microfotografia mostrando em evidencia os granulos intracelulares de PHB

Rendimentos Teóricos em P(3HB) : Burkholderia cepacia Y( P / S ) = 0,13 g / g carboidratos Cupriavidus necator Y( P / S ) = 0,22 g / g carboidratos

Figura 8: Estrutura do co-polímero P(HB-co-HV) co- polí P(HB- co-

Ambiente Ambiente anaeróbio Sedimentos estuários Ambiente aeróbio Solo Água do mar
Fonte: Luzier, 1992.

100% em perda de massa (semanas) 6 40 60 75 350

Tabela 4: Biodegradação de um filme de 1mm de PHA

Degradação de frascos de P(3HB-co-3HV) em água de esgoto

Fonte: MADISON e HUISMAN, 1999.

Microrganismos produtores de PHAs
Para produção em escala industrial :
Azotobacter vinelandii Alcaligenes latus Microrganismos recombinantes : Cupriavidus necator recombinante e Escherichia coli recombinante Rhodobacter Staphylococcus spp Pseudomonas oleovorans

Cupriavidus necator ( Ralstonia eutropha)
Microrganismo mais utilizado Pode acumular cerca de 96 % da sua massa seca como polímero Facilidade de cultivo em substratos renováveis

Percentagem de acumulo em relação ao microrganismo empregado.

P(3HB) = poli-hidroxibutirato P(3HB-co-3HV) = poli(3-hidroxibutirato-co-3 hidroxivalerato) P(3HV)=Poli(3-hidroxivalerato) P(3HHx-co-3HO) = Poli(3-hidroxihexanoato-co-hidroxioctanoato) Fonte : LEE,1996 / Carminatti,Cristiane ; Furigo Junior,Agenor – Produção de hidroxialcanoatos –CT - UFSC

Processo COPERSUCAR – Coeficientes Técnicos

Metabolismo da Cupriavidus necator ( Ralstonia. Eutropha )
SUBSTRATO

Crescimento balanceado

Acetil-CoA

Excesso de carbono

Energia

Oxigênio Fósforo Enxofre Nitrogênio

Limitação

Material celular

P(3HB)

Etapas Fundamentais do Bioprocesso
1. 2. 3. 4. 5. 6. Esterilização do Biorreator e Acessórios ( Esterilização Contínua com vapor ) Esterilização do meio de cultivo ( Autoclave ) Crescimento e adaptação do inoculo em pequeno biorreator Introdução do inoculo Processo de crescimento de biomassa fontes de carbono. Aeróbico sem limitação de nutrientes e

Processo de Produção de Biopolimero ( PHA ) Pode ser Anaeróbico ou Aeróbico com limitação de oxigênio ( baixo Kla ). Utilizamos limitação de nutrientes essenciais ( um ou vários, como Mg, N, P, S, O2 , outros ) e excesso de fontes de carbono ( carboidratos e ácidos carboxílicos ) . Separação da biomassa contendo PHA intracelular Rompimento celular ( Solventes, HLMB, Hidrociclone, moinho de bolas, etc) Separação , purificação , concentração e secagem do biopolímero.

7. 8. 9.

Reações Bioquímicas para a formação do PHB por R. eutropha
A enzima β cetotiolase condensa reversivelmente duas moléculas de acetil CoA em acetoacetil CoA

1.

2. A enzima acetoacetil CoA redutase por sua vez,reduz esse substrato a R-3 hidroxibutil –CoA 3. O R-3 hidroxibutil-CoA é incorporado a cadeia polimérica pela ação da enzima PHA sintase havendo crescimento de cadeia polimérica .

1. 2. 3.

2 acetil CoA = acetoacetil CoA + CoASH AcetoacetilCoA +NADPH +H+ = 3 – hidroxibutiril-CoA + NADP+ D(-) 3 -hidroxibutiril CoA = P ( 3 HB )

Condições de Cultivo
Frascos agitados ou biorreatores
Batelada Alimentada; Duração: 24h a 30h; Temperatura: 30ºC; pH: 7,0.

Os métodos físicos principais podem ser :
•Ultra Som •Congelamento/descongelamento •Tensão cisalhante •Hidrociclone •Moinho de Bolas •HHMB ( ou também HLMB ) •Prensa de Hughes •Pressão osmótica No processo de extração por solvente , os mais utilizados são : Clorofórmio Cloreto de Metileno Dicloroetano Carbonato de Propileno Diclorometano

Os métodos químicos principais podem ser :
Extração por Solvente Colapso alcalino Colapso por detergentes Colapso por hipoclorito
No Moinho de Bolas e no HLMB a eficiência de lise é função de parâmetros tal como :
•Velocidade de agitação ( rotação da hélice ) •Concentração de células •Diâmetro das esferas •Material de que é feito as esferas •Composição da membrana celular ( teor em quitina ,etc ) •Tempo de residência da suspensão dentro do equipamento •Temperatura

Determinações analíticas
Biomassa ( total e residual ) Concentração das Fontes de Carbono ( Substratos: Carboidratos e ácidos carboxílicos ) Concentração de nitrogênio amoniacal Quantificação do polímero ( teor e composição ) Análise cinética: Velocidade específica de crescimento máxima Produtividade de polímero

Técnicas mais utilizadas :
Cromatografia Gasosa HPLC Análise Gravimétrica Espectrofotometria DSC

As enzimas importantes para esta biossíntese são:
•β cetotiolase •3-cetoacil-CoA redutase NADPH dependente •PHA sintase Com fartura de nutrientes os níveis de acetil-CoA estarão altos porem com limitação de nutrientes ,os níveis de CoA se reduzem e desencadeiam a síntese de PHA ,que é um material de reserva energética para a célula bacteriana. A Cupriavidus necator pode ser usada para produção de vários outros biopolímeros, variando-se os substratos e as condições ambientais.

O Methylobacterium extorque sintetiza P(3HB) a partir de etanol e P(3HB-co-3HV) a partir de metanol e valerato.

A dosagem de PHA sintase é função do peso molecular do polimero formado ,contudo é dificil dosar a enzima in vivo .

Velocidades especificas de Formação dos blocos ( meros ) de HB e HV

ε ε

d [ P HV ] 1 ⎛ d [ P HV ] Ac ⎞ = ⎟ = µ HV εf ⎜ dt Xr ⎝ dt ⎠ d [ P A . Pr op . ] 1 ⎛ d [ P A . Pr op . ] Ad ⎞ ⎜ ⎟ = µ = ⎜ ⎟ dt Xr ⎝ dt ⎠
f f
(HV) (HV)

(HV) =

⎛ ∆[ P( HV ) ⎞ ⎟ 0,74074 .⎜ ⎜ − ∆[ S ]⎟ ( A. Pr op .) ⎠ Pr ocesso ⎝

A . Pr op .

= =

d [S ] 1 ⎛ d [S ] ⎞ = ⎜ ⎟ = µS dt X r ⎝ dt ⎠ d[X ] 1 ⎛ d[X ]⎞ = ⎜ ⎟ = µX dt X ⎝ dt ⎠
µ
HV

⎛ ∆P ⎞ Y( P / S ) = − ⎜ ⎟ ⎝ ∆S ⎠

= tg (θ ). µ

A . Pr op .

⎛ µ HV ⎜ ⎜ µ ⎝ A . Pr op .

⎞ ⎟ = tg (θ ⎟ ⎠

)=

Y (3 HV

/ A . Pr op .)

Y(3HV / A.Pr op.) = 1,35g / g A.Pr op.
Teórico

Se temos o fluxo de substrato na alimentação igual a velocidade de consumo de substrato na batelada alimentada , então teremos :

F [ P ] ac 1 ⎛ d [ P ] ac ⎞ = ⎜ ⎟ X rV X r ⎝ dt ⎠ d [ P ] ac F = dt V [ P ] ac [ P ] ac = [ P0 ]. e
⎛ F ⎞ ⎜ [t − t 0 ] ⎟ ⎝V ⎠

[ PHA ] m ( PHA ) QP = = ∆t f V .∆ t f

X r = X T − [PHA]

Crescimento em bagaço de maçã
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 tempo (h)
Ln biomassa

Produção industrial Nos EUA ( Metabolix ):
batelada alimentada acúmulo de mais de 75% em polímero

Na Áustria:
bactéria Alcaligenes latus DSM 1124
acúmulo de mais de 80% em polímero batelada alimentada - sacarose como fonte de carbono

No Brasil ( PHB Industrial ) :
R. eutropha a partir de açúcar invertido
Aproveitando os subprodutos das usinas de cana ( energia ) 3 kg de açúcar + 17,1 kg de bagaço → 1 kg de P(3HB)

EXTRATÉGIAS

DE MARKETING

SHAMPOO COM BIOPOLÍMEROS E FILTRO UV - 300 ML PAYOT GRÁTIS UM CONDICIONADOR COM BIOPOLÍMEROS E FILTRO UV - 300 ML PAYOT EDIÇÃO LIMITADA

Biopolímero
Polyhydroxyalkanoate (PHA)
(PHB, PHBV) (PHB, PHBV) (PHB, PHBV) (PHB, PHBV) (PHB, PHBV) (PHBHx, PHBO, PHBOd)

Nome Comercial

Empresa

Biopol Metabolix Enmat Biocycle Biomer L Nodax Natureworks Lacty Lacea Heplon CPLA Eco Plastic PLA Treofan L- PLA Ecoloju Biomer L

Monsanto-Metabolix (USA)* Metabolix/ADM (USA) Tianan (China) Copersucar (Brazil) Biomer (Germany) Procter & Gamble (USA) Cargill-Dow LLC (USA) Shimadzu (Japan) Mitsui Chemicals (Japan) Chronopol (USA) Dainippon Ink Chem. (Japan) Toyota (Japan) Galactic (Belgium) Treofan (Netherland) Purac (Netherland) Mitsubishi (Japan) Biomer (Germany)

Poly(lactic acid) (PLA)

Fatores Principais que afetam o Custo do Produto Final

• Etapas de “Down Stream”

• Custo dos Substratos ( M.P. ) • Custos de energia

Estuda-se minimização de custos na etapa de “Down Stream”
Bactérias gram-positivas facilitam o processo de down stream pois em sua maioria não apresentam toxinas nocivas ao homem,contudo sua produtividade em PHA é menor. Sistemas de produção em regime contínuo certamente levarão a maiores rendimentos e menores custos,no entanto necessita-se maior grau de otimização e maiores malhas de controle.

CONCLUSÃO
• É possível minimizar custos da produção de PHAs pela seleção criteriosa de matéria prima e com a utilização de consórcios bacterianos e/ou microrganismos recombinantes. •O uso de microrganismos recombinantes torna possível flexibilidade de substratos maior

•O uso de efluentes e certos resíduos industriais pode minimizar custos e tornar os PHAs mais populares o que poderá repercutir positivamente no meio ambiente •Na etapa de “down stream” a remoção de solventes e purificação do biopolimero são as etapas mais criticas e onerosas •O bioplástico Deve estar isento de toxinas bacterianas e solventes,pois deve ser imunocompativel com os organismos vivos e biodegradável •A Aplicação em biomedicina e engenharia tecidual requer elevado controle de qualidade e programação do tempo de biodegradação ,que deve ser igual ou próximo ao tempo de regeneração tecidual. Compósitos biodegradáveis e copolímeros tipo P(3HB-co-3HV) e outros são utilizados .

•Polímeros especiais tal como o polímero obtido a partir de proteinas recombinantes de seda de aranhas e plásticos a base de amido ,abrem espaço para aplicações inéditas e um campo de atuação comercial ainda praticamente inexplorado. •Quando comparada ao mercado americano ,o Brasil apresenta custos menores para a produção de PHAs , gomas e biopolímeros de amido . O processo de produção dos bioplásticos de amido no Brasil empregam menores quantidades de matéria prima mais barata e com maiores rendimentos ( maior conversão M.P. polímero ) ,porem os custos de produção são próximos aos produtores do exterior o que torna o produto nacional menos competitivo no mercado internacional ,embora o custo do amido nacional seja bem menor que o amido europeu ou norte americano. Elevados custos de transportes e taxas de exportação diminuem a competitividade do produto nacional ,perdendo-se mercado. O mesmo ocorre com nossa produção em PHAs e outros biopolimeros que apesar dos maiores custos de produção ainda enfrentam estes mesmos obstáculos.
Interesses políticos e empresariais a nível internacional são fatores importantes na equação que define os custos e a produção industrial nacional em produtos de alta tecnologia e isto inclui os biopolímeros .

FIM