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Tcnicas n Biologa Molcular

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Es una tcnica de biologa molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular. Por lo tanto, esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN especfico y su utilidad reside en que, tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil estudiar e identificar el ADN. Puesto que las temperaturas del ciclo (95oC en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, actualmente se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos, generalmente arqueas, adaptados a vivir a esas temperaturas. Hoy en da, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, donde se programa la temperatura, el tiempo de cada etapa y el nmero de ciclos totales. El proceso de PCR requiere conocer previamente la secuencia de dos cortas regiones que flanqueen el fragmento de ADN que queremos amplificar. Para la realizacin de la tcnica se necesitan: ADN polimerasa termorresistente, la ms comn es la Taq polimerasa (Thermus aquaticus). ADN molde, que contiene la regin que se va a amplificar. Debe estar desnaturalizado. Cebadores (o primers), son cadenas simplexas de oligonucletidos (15-30 pb) complementarias a una regin de las dos hebras del ADN. Estas secuencias son reconocidas por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Delimitan la zona de ADN a amplificar. Se aaden en exceso. Desoxinucletidos trifostato (dNTPs), el sustrato para polimerizar un nuevo ADN. A concentracin saturante. Una solucin tampn que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Se usan tampones de Tris-HCl con un pH en torno a 7,5. Cationes magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2) que actan como cofactores de la polimerasa.

Componentes y parmetros de la reaccin Las etapas de un ciclo de replicacin son las siguientes: 1) Desnaturalizacin: es el primer paso que consiste en desnaturalizar el ADN, es decir, en separar las dos hebras del ADN. Se realiza a elevadas temperaturas (94-95oC) con el fin de permitir la unin de los cebadores o primers. 2) Hibridacin: el segundo paso de la PCR es la unin del cebador a la regin complementaria de la molcula de ADN molde. Para ello es necesario bajar la 1

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temperatura a 50oC aproximadamente, permitiendo as su hibridacin. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. 3) Polimerizacin o elongacin: es la fase de alargamiento o sntesis. La ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTPs complementarios en direccin 5->3, uniendo el grupo 5-fosfato de los dNTPs con el grupo 3-OH del cebador. La temperatura para este paso depender de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est en 72oC.

El conjunto de los pasos de desnaturalizacin, hibridacin y elongacin se denomina ciclo. Habitualmente en la PCR se llevan a cabo una serie de 30 a 40 ciclos. La concentracin del segmento amplificado crece de manera exponencial ya que por cada molcula de ADN molde existente en la muestra se obtienen, en teora en condiciones 2

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ptimas, 2n copias del fragmento original, donde n es el nmero de ciclos que se realizan y el 2 hace referencia a las dos cadenas de ADN. Por lo tanto, se dice que en la PCR hay una amplificacin exponencial. Tras la reaccin de PCR, los productos amplificados se pueden someter a electroforesis en gel de agarosa, visualizndose con luz ultravioleta tras tincin del gel con bromuro de etidio. El fragmento amplificado debe tener una longitud igual a la distancia existente entre los dos primers utilizados en la PCR. Puesto que la reaccin de PCR es capaz de amplificar incluso una nica molcula de ADN, se debe evitar radicalmente la contaminacin de la mezcla de reaccin con trazas de ADN que puedan servir de molde, para lo que han de tomarse todo tipo de precauciones.

Variantes de PCR
RT-PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin reversa): una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando una enzima denominada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en un PCR tradicional. NESTED PCR (PCR en nido): permite aumentar tanto la sensibilidad como la especificidad de la reaccin (reducir la presencia de productos de ampliacin inespecficos). PCR INVERSA: permite amplificar secuencias desconocidas de ADN que flanqueen a otra de secuencia conocida.

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OTRAS TCNICAS: HIBRIDACIN, SECUENCIACIN

Tcnicas de hibridacin molecular
Las tcnicas de hibridacin molecular se basan en el estudio de secuencias especficas del ADN o ARN, tanto para su identificacin como para su eventual cuantificacin. Se define hibridacin como la reconstitucin de estructuras bicatenarias a partir de molculas monocatenarias de distinto origen con secuencias ms o menos complementarias. Para realizarlas se parte de sondas, que son fragmentos cortos de cido nucleico sintetizado en el laboratorio cuya secuencia es complementaria a aquella que se busca. Pueden ser de ADN monocatenario, bicatenario (que previamente se desnaturaliza) o de ARN. La hibridacin o acoplamiento de la secuencia gnica diana y la sonda complementaria se puede reconocer con mtodos radiactivos y colorimtricos. En general, se utilizan sondas previamente marcadas con sustancias radiactivas o fluorescentes. Las tcnicas ms utilizadas son: La hibridacin por disolucin, se utiliza para evaluar la asociacin de una molcula de un cido nucleico en la formacin de dobles cadenas de ADN, ADN-ARN o doble ARN. Esta tcnica es muy sensible, pero slo sirve para cuantificar el contenido de un cido nucleico especfico. La hibridacin por filtracin, consiste en la desnaturalizacin de ADN o ARN inmovilizndolo en un soporte inerte como la nitrocelulosa, para hibridarlo posteriormente con una sonda marcada y as facilitar su deteccin. Estas tcnicas se conocen con el nombre de Southern blot y Northern blot, y sirven para analizar las cadenas de ADN y ARN respectivamente. La tcnica de hibridacin in situ, consiste en utilizar una sonda marcada de ADN o ARN y unirla al ADN o al ARN de una preparacin citolgica o histolgica. Recientemente se ha optimizado la tcnica de hibridacin in situ usando fluorescencia, lo que permite detectar alteraciones puntuales y anomalas cromosmicas tanto en interfase como en metafase, tras crecer previamente las clulas in vitro. Con la caracterizacin del cariotipo y los rasgos morfolgicos de los cromosomas se pueden detectar anomalas en los mismos y numerosas translocaciones.

Los experimentos de hibridacin se basan en la complementariedad de bases pero tambin puede haber secuencias cortas o incluso componentes celulares que hibriden o se asocien inespecficamente a la sonda. Para minimizar este problema se juega con las condiciones de hibridacin y de lavado: Medio de hibridacin y temperatura: marcan la estabilidad de los enlaces de hidrgeno formados. A una temperatura alta los puentes son muy inestables, disminuyen las hibridaciones no especficas pero la velocidad de hibridacin es lenta. El mismo efecto se consigue con la presencia de agentes desnaturalizantes en el medio (por ejemplo, formamida).

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La fuerza inica del medio favorece las interacciones al reducir la repulsin entre restos de fosfato cargados y aumenta la velocidad del proceso. Se suele utilizar una solucin salina de citrato. Volumen de reaccin: afectan a la velocidad del proceso. Si el volumen es pequeo, la concentracin de hebras es mayor y por tanto, la hibridacin en ms rpida. Severidad (stringency) del lavado: tras la hibridacin, el exceso de sonda deber ser eliminado mediante lavados cuya fuerza o severidad viene definida por la temperatura y por la concentracin de formamida y sal. Un lavado poco estricto o poco severo dejar mucho fondo a causa de la unin inespecfica de la sonda al filtro o a hebras con un bajo grado de complementariedad, mientras que un exceso de lavado podra disminuir la seal. Las condiciones deben ser tan severas como sea posible.

Hibridacin in situ La hibridacin no slo se puede realizar sobre soportes slidos (filtros de nylon o nitrocelulosa) o en solucin (in vitro) sino tambin en cortes de tejido o preparaciones celulares. En este ltimo caso hablamos de hibridacin in situ. Nos permite ver, por ejemplo, el sitio en particular de una clula donde se localiza la secuencia de inters. La sonda utilizada debe estar marcada con una sustancia radiactiva o fluorescente, siendo esta ltima una variante muy utilizada: Hibridacin in situ fluorescente (FISH): utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia de forma que si stas hibridan con la secuencia de ADN complementaria, podremos observar la seal mediante un microscopio de fluorescencia. Esta tcnica es muy utilizada para detectar o confirmar anomalas gnicas o cromosmicas que generalmente no se pueden detectar mediante citogentica como las microdeleciones o reordenamientos especficos que se observan en ciertos cnceres (sobre cromosomas en metafase). Sobre clulas en interfase nos permite determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas.

Gentica - Biologa Molecular Southern blot y Northern blot

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Estas tcnicas nos permiten detectar una molcula especfica de ADN (Southern blot) o ARN (Northern blot) en una mezcla de fragmentos tras su separacin electrofortica en un gel de agarosa mediante la utilizacin de una sonda marcada que hibride, por complementariedad de bases, con la secuencia buscada. De forma anloga a estas tcnicas, la transferencia de protenas separadas por electroforesis en gel a un soporte slido recibe en nombre de Western blot. De esta forma, se completa un conjunto de mtodos que permite el estudio de la presencia (Southern), transcripcin (Northern) y traduccin (Western) de una secuencia gnica. Los pasos de ambas tcnicas son, a grandes rasgos: 1. Separacin de los fragmentos en funcin de su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Para su fragmentacin se utilizan enzimas de restriccin. 2. Transferencia de las molculas de cido nucleico a un soporte slido (membrana de nylon o nitrocelulosa) de tal modo que, en la membrana, se reproduzca la distribucin de fragmentos del gel. Las molculas deben fijarse en estado monocatenario para que se puedan formar un hbrido correcto con la sonda. 3. Hibridacin de la membrana en las condiciones adecuadas con la sonda de ADN marcada complementaria a la molcula buscada. 4. Revelado de la membrana por autorradiografa (si el marcaje de la sonda era radiactivo) o por otros mtodos (enzimtico). 5. La presencia de una seal positiva permitir su correlacin con la banda electrofortica original donde se encuentra la secuencia en cuestin y, por tanto, la identificacin y aislamiento de la molcula de ADN buscada.

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Tcnicas de secuenciacin
El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucletidos. Los mtodos ms utilizados son el de secuenciacin automtica y el mtodo enzimtico de terminacin de cadena de Sanger, tambin conocido como mtodo de didesoxi. Existe otro mtodo que actualmente est ms en desuso y es el mtodo qumico desarrollado por Maxam y Gilbert (Mtodo de rotura qumica) que se basa en la rotura de una cadena de ADN por sitios especficos mediante el uso de reactivos qumicos. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o Mtodo didesoxi de Sanger: para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por este mtodo necesitaremos los siguientes compuestos: ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar, en gran cantidad y en estado de hlice sencilla. Una enzima que replique el ADN, normalmente se utiliza la ADN polimerasa I del bacterifago T4. Un cebador (oligonucletido corto de alrededor de 20 pb) marcado radiactivamente. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo 3-OH. Estos nucletidos son incorporados por la polimerasa a la hebra en crecimiento pero al carecer del grupo 3-OH impiden que la reaccin de polimerizacin contine al no poder enlazar con el siguiente nucletido por dicho extremo. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada una de ellas contiene los cuatro nucletidos trifosfato, ADN pol I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido didesoxi a concentracin baja. As, se obtendrn una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud marcadas todas radiactivamente por el extremo 5(donde se encuentra el cebador). Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida y se revela por autorradiografa. Se obtendrn bandas de todos los tamaos posibles a partir de las cuales podremos deducir la secuencia del ADN en estudio, para ello hay que tener en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en direccin 5`->3por lo que comenzaremos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5) avanzando hacia los fragmentos del mayor tamao (extremo 3).

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Mtodo automtico de secuenciacin: en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con un nucletido trifosfato marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo las molculas de ADN de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin. La deteccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis generndose un registro informatizado de los cuatro perfiles que se interpretan como una secuencia.

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APLICACIONES
Huella digital gentica: es una tcnica forense que permite identificar a una persona comparando su ADN con el de una muestra obtenida. Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permite aumentar la cantidad de ADN amplificando ciertos segmentos polimrfico (variables en la poblacin) para luego separarlos mediante electroforesis. Es lo que se conoce como DNA fingerprint o huella digital. Test de paternidad: amplificando por PCR fragmentos polimrficos de ADN de la madre, del nio y de el/los presunto(s) padre(s) y separando mediante electroforesis, se puede visualizar una serie de segmentos que tiene el nio y que debe compartir con sus padres biolgicos. Deteccin de enfermedades hereditarias: cada gen en estudio puede ser amplificado fcilmente por PCR y luego ser secuenciado para as determinar si un individuo porta alguna mutacin. Comparacin de la expresin gnica: la RP-PCR nos permite estimar la cantidad de ARNm de un gen determinado en ciertas condiciones experimentales. Clonacin de genes Mutagnesis: mediante la introduccin de variaciones en la secuencia de nucletidos de un gen (mutacin), se puede producir segmentos de ADN que se diferencian del original y permite estudiar su alteracin en la protena correspondiente. Anlisis de ADN antiguo Genotipificacin de polimorfismos: podemos determinar el genotipo de un individuo para un polimorfismo dado, como un microsatlite o un SNP (single nucleotide polymorphism). Estos polimorfismos son muy tiles para estudios poblacionales y para relacionar un gen o regin cromosmica con una enfermedad mediante estudios de asociacin o ligamiento. Elaborar mapas genticos.

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Bibliografa
Gentica. Fundamentos y perspectivas. M.J. Puertas. Ed. McGraw-Hill. Interamericana 2 ed. 1999 Genes VII. Benjamin Lewin. Ed. Oxford University Press. 2000 Molecular biology of the gene. Watson et al. 5th ed. Pearson. Gentica moderna. Griffiths y otros. Ed. McGraw-Hill. Interamericana 2000

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