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ANLISIS DE LIPIDOS POR HPLC

HPLC: anlisis de TGs y fosfolpidos. Molculas pequeas como FA y esteroles: GC. Preparacin muestra: lquida (inyeccin directa de aceites). Slidos: extraccin con solvente apolar (aislar TGs) y clean-up. Triglicridos: inters para procesado y control alimentos Grasas: mezclas complejas de TGs, esteroles y vitaminas Formacin hidroperxidos enranciamiento HPLC: - contenido en TGs, esteroles, vitaminas e hidroperxidos (UV-DAD), para diferenciar entre TGs saturados e insaturados - perfil de TGs especfico a cada tipo de aceite, permite detectar adulteraciones Deteccin: ndice refraccin (isocrtico). Gradiente con detectores UV y ELSD.

-Separacin lpidos sencillos: determinar fracciones de steress de esteroles, cidos grasos libres, TG, DG, esteroles libres, monoacilgliceroles, ceras. Tradicionalmente anlisis cromatografa adsorcin columnas slice y ELSD. -Cromatografa reparto: RP y NP. Separacin TGs con RP y fase mvil no acuosa (acetonitrilo:acetona) permite separacin en funcin nmero C.

Anlisis de perfil de TGs en aceite de girasol envejecido. Deteccin entre 200-215 nm: TGs Deteccin a 240 nm: hidroperxidos Deteccin a 280 nm: TGs fragmentados

ANLISIS DE VITAMINAS POR HPLC


- Liposolubles: A, D, E - Hidrosolubles: C, B6, B12, B2, B1 - Importancia: legislativa, etiquetado, asegurar calidad alimentos suplementados, estudiar cambios durante procesado, almacenamiento, etc. Dificultad anlisis: - bajas concentraciones - en presencia de otros compuestos en elevadas concentraciones y con propiedades qumicas similares - se degradan con luz, O2, elevadas T HPLC: - informacin cualitativa y cuantitativa (UV-DAD y electroqumica)

Vitaminas hidrosolubles: problemas anlisis de estas vitaminas relacionados con preparacin muestra antes del anlisis por HPLC debido a que estas vitaminas se encuentran a menudo ligadas a otros constituyentes como carbohidratos y protenas. Vitamina C: 2 vitmeros, ac. Ascrbico y dehidroascrbico. Actan en otras funciones, previniendo cancer, hipertensin, etc. Problema: baja estabilidad. Extraccin utilizando cidos (metafosfrico). Anlisis HPLC fase inversa con agua a bajos pH. Deteccin: UV a 254 nm (AA) y 210-230 nm (DHAA) Deteccin fluorescencia despus derivatizacin

Vitamina B1 (tiamina): 4 vitmeros, la forma no fosforilada (tiamina) mayoritaria en plantas y formas fosforiladas mayoritarias en productos animales. Deficiencia tiamina asociada a beri-beri. Extraccin: hidrlisis cida para liberar vitmeros de matrices alimentarias. A veces es necesaria hidrlisis enzimtica para eliminar exceso de almidn y protenas. Clean-up con SPE C18 o columnas intercambio inico Anlisis HPLC: par inico Deteccin: fluorescencia (excitacin 365-375 nm y emisin 425-435 nm) despus derivatizacin. Anlisis vitaminas hidrosolubles en una bebida y espectros vitaminas. Fase inversa, DAD, Fase mvil: A: agua, B: ACN. Gradiente. Preparacin muestra (reales): extraccin, hidrlisis, oxidacin, clean-up, etc.

- Vitaminas liposolubles: se pueden dividir en 4 grupos dependiendo de su actividad biolgica: vitamina A (retinol y carotenoides), vitamina D (colecalciferol y ergocalciferol), vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles) y vitamina K (filoquinona y menaquinona). - Vitamina A: esencial visin, crecimiento, sistema inmune. Fuentes naturales vitamina A derivan de carotenoides (provitamina A) sintetizados por plantas superiores y organismos fotosintticos - Vitamina A sinttica se utiliza como suplemento. -Anlisis: - saponificacin (liberar retinol esterificado) - extraccin - o extraccin directa (hexano) p.ej. vitamina A total leches - anlisis HPLC: fase normal o inversa - inversa mejor cuando muestra contiene bajas concentraciones de triglicridos - deteccin: UV (328 nm) (fluorescencia nativa baja) - Vitamina D: prevencin raquitismo y osteomalacia (reblandecimiento seo). Imprescindible organismos no expuestos a luz solar (dietary intake). Vitamina D esta presente en alimentos solo a niveles traza. - Estructura parecida a otros lpidos que se encuentran en concentraciones muy elevadas: exhaustivo tratamiento muestra previo anlisis. -Etapas: saponificacin, extraccin con disolventes y purificacin para eliminar esteroles, carotenoides, etc. - Vitaminas D2 y D3 slo se pueden separar en fase inversa utilizando como f. Mvil metanol:agua o acetonitrilo:agua - Deteccin: 264 nm

-Vitamina E: se encuentra en aceites vegetales y otros alimentos como frutos secos, semillas y frutas. 8 formas (tocoferoles y tocotrienoles) con diferente actividad. Vitamina E: antioxidante lipdico. - Extraccin directa o saponificacin previa (dependiendo matriz). - Aceites y grasas: disolucin en hexano y anlisis directo por HPLC fase normal con slice o fases polares. Es posible separar las 8 formas de vitamina E en isocrtico.

- Deteccin fluorescencia: nativa muy fuerte (elevada sensibilidad y selectividad) - Otros sistemas deteccin: UV (280 nm) y electroqumica (mayor sensibilidad (ha permitido la deteccin de pmoles de vit E en plasma humano)

Figure 2. HPLC of Vitamin E. (A) Standards of vitamin E vitamers. Column, 5m Supelcosil LC-Si (250 x 4.6 mm ID); mobile phase, isooctane/ethyl acetate (97.5:2.5), 1.6 ml/min; fluorescence detection, excitation 290 nm, emission 330 nm. Peaks: (1) -tocopherol; (2) -tocotrienol; (3) -tocopherol; (4) tocopherol; (5) -tocotrienol; (6) -tocotrienol; (7) -tocopherol; (8) tocotrienol. (B) Saponified rice bran sample. Chromatographic conditions as in (A) except for mobile phase: isooctane/ethyl acetate/2,2-dimethoxypropane (98.15:0.90:0.85:0.1). Reproduced with permission of AOCS Press.

Anlisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Separacin en fase normal. Fase mvil: hexano/isopropanol. Isocrtico. Concentracin de tocoferoles en extracto de margarina, deteccin fluorescencia: long. exc. 295 nm, long. em: 330 nm.

Anlisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Fase inversa, deteccin electroqumica.

-Vitamina K: actividad antihemorrgica. - Preparacin muestra: hidrlisis enzimtica y clean up. Anlisis HPLC en fase normal o inversa. - Detecccin UV a 270 nm.

-Mltiples vitaminas liposolubles: A, E, D2 y D3 - Fase inversa con metanol:agua y deteccin UV a 263 nm despus saponificacin. - Fase normal tambin se ha utilizado (aceites semillas). - A veces es necesario utilizar varios detectores (UV y fluorescencia)

ANLISIS DE AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS POR HPLC


- Anlisis importante desde punto vista nutricional, control de calidad y control en el desarrollo de nuevos productos (fraccin proteica). Importante para asegurar autenticidad de alimentos (separacin e identificacin enantimeros). Aminocidos -La composicin en aminocidos de protenas puede usarse para determinar el origen de carnes: detectar adulteraciones. -Preparacin muestra distinta si AA libres o totales: AA ligados a protenas, es necesaria hidrlisis cida o digestin cida previa HPLC. Posterior etapa clean-up para eliminar interferencias/concentrar muestra (SPE con cartuchos C18 capaces de retener lpidos y proteinas grandes). -Anlisis HPLC (intercambio inico) o fase inversa previa derivatizacin con OPA (aumentar hidrofobicidad). -Habitualmente la deteccin se lleva a cabo despus de la formacin de derivados (UV y fluorescencia) -Derivatizacin on-line (OPA) puede ser: precolumna o postcolumna -Anlisis aminocidos en cerveza despus derivatizacin on-line con OPA.

-Fase inversa, fluorescencia, Fase mvil: A: acetato sdico, B: ACN. Gradiente.

Pptidos -Preparacin muestra 2 etapas: extraccin y eliminacin protenas (UF) que permite fraccionamiento de pptidos. Clean-up SPE C18. -Anlisis columnas RP con cromatografa de par inico (cido trifluoroactico), intercambio inico, exclusin molecular. -Deteccin: UV (AA aromticos como tirosina y triptfano) y despues derivatizacin con cloruro de dansilo. -Avances deteccin y anlisis de pptidos: LC-ESI-MS, permite identificacin de biopolmeros de elevado PM generando iones de mltiple carga. -Tambin MALDI-TOF-MS: permite medida precisa masa de pptidos y protenas con una gran sensibilidad (subpicomol). -Bases de datos que permiten caracterizacin pptidos y secuenciacin.

Protenas -Habitualmente despus de aislamiento utilizando dilisis, UF, precipitacin con disolventes orgnicos o sales. -Anlisis RP-LC, IEC, SEC. -Separacin protenas utilizando rellenos peliculares, rellenos perfusin y columnas monolticas. -Diferentes aproximaciones al problema de baja difusividad protenas en poros de rellenos convencionales: ensanchamiento y prdida de eficacia. -Rellenos peliculares, de perfusin y columnas monolticas. -Polymeric monolithic stationary phases offer an alternative to the classical microparticulate sorbents, bringing important advantages to sample analysis. In contrast to the traditional stationary phases, which consist of packed particles, the monolithic separation medium is made of a continuous, rigid polymeric rod with a porous structure. The lack of intraparticular void volume improves mass transfer and separation efficiency, which allows for very fast separations of biopolymers.

Capillary LC/MS separation of 13 digested proteins. Up to 150 peptides separated in less than 15 min.

ANLISIS DE CARBOHIDRATOS POR HPLC


Inters anlisis carbohidratos: - relacin carbohidratos-salud - control productos bajo contenido caloras/dietticos/diabticos - industria-control calidad y de adulteraciones, ej: contenido lactosa en alimentos sin lactosa, contenido fructosa siropes, etc. Anlisis carbohidratos: - mtodos qumicos - mtodos enzimticos - GC (baja volatilidad, derivados cuantitativos) - HPLC (mnima preparacin muestra, desarrollo nuevos detectores: amperomtricos, MS, etc.) - HPLC, detectores ms utilizados: ndice refraccin short wavelength UV fluorescencia despus de formacin derivados amperomtrico Extraccin con agua previa anlisis HPLC, clean-up SPE. HPLC con fase ligada a slice amino, diol, ciano, C18, etc. intercambio inico con resinas aninicas y catinicas, SEC Anlisis de carbohidratos en limonada. Detector ndice refraccin, Intercambio inico

CONSERVANTES
Autorizados por la CEE 64/54/CEE de 5/11/63 y post.: ac. srbico, ctrico, actico, propinico, succnico, fosfrico, lctico, mlico, tartrico, fumrico, etc. ACIDULANTES: - agentes saborizantes para intensificar ciertos sabores y enmascarar algunos otros - control pH (tampn) durante el procesado y conservacin - prevenir crecimiento org - sinergia con antioxidantes para prevenir enranciamiento y oscurecimiento - modifican viscosidad - modifican punto fusin PREPARACIN MUESTRA: f(matriz)destilacin, SPE

Intercambio inico Fase mvil: 0.003 M H2SO4 Longitud onda: 192 nm

Intercambio inico Fase mvil: 0.007 M H2SO4 DAD

ANTIOXIDANTES
Retardan enranciamiento oxidativo (adicin grasas y aceites en 200 ppm) ac. ascrbico, tocoferoles, galato propilo (PG), galato octilo (OG), butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), etc. En los paises donde est permitido su uso debe determinarse el mximo nivel de estos compuestos en el alimento. HPLC: tcnica ms idonea para determinacin antioxidantes de naturaleza fenlica PREPARACIN MUESTRA: f(matriz)bajas grasa: L/L complejas: SPE, L/L, detilacin

Fase inversa. Fase mvil: A: agua, B: ACN gradiente DAD

COLORANTES
Color: caracterstica influye directamente rechazo o aceptacin producto Antigedad: colorantes naturales (clorofilas, carotenoides, flavonoides, antocianos plantas, minerales como xidos de hierro, etc.) Actualidad: colores sintticos. Clasificacin segn estructura qumica: - azo (mono, di, tris) - indol - trifenilmetano Mtodos HPLC: par inico e intercambio inico Absorcin UV: longitud onda caracterstica

EDULCORANTES
Edulcorantes no nutritivos: - sustitutivos sacarosa - ms utilizados: sacarina aspartamo ciclamatos acesulfamo potsico

Investigacin para detectar la toxicidad de estos compuestos (seguridad para consumo). Regulacin de su concentracin en alimentos y bebidas para evitar un consumo excesivo Aspartamo: derivatizacin en columna (OPA) + anlisis HPLC fase inversa. Fase mvil: A: acetato sdico, B: metanol. Gradiente. Deteccin UV 338 nm

ANLISIS DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES POR HPLC


Eleccin mtodo anltico: - especificidad - sensibilidad - precisin - reproducibilidad - rapidez Residuos productos zoosanitarios: substancias destinadas al diagnstico, prevencin o tratamiento de las enfermedades de los animales que pueden dar lugar, por su mal uso o abuso, a repercusiones desfavorables para aquellos o para la salud pblica Clasificacin segn finalidad uso: - promotores crecimiento - productos para tratamiento teraputico o profilctico de enfermedades Tipos de residuos: - anabolizantes (estrgenos, andrgenos, etc.) - tireostticos - antibiticos (cloranfenicol, tetraciclinas) - sulfamidas (bacteriostticos) - beta-agonistas (clembuterol) - plaguicidas (carbamatos, piretrinas, herbicidas) Necesidad anlisis residuos: - existencia riesgo potencial salud (hormonas producen alteraciones) - efecto sobre procesos industriales (antibiticos: bacterias resistentes. Problemas en la elaboracin yogur/queso) - ventajas comerciales no legales (tireostticos: fraude) - aspectos toxicolgicos

Caractersticas residuos: - presencia muestra prohibida: el residuo o sus metabolitos deben buscarse en el tejido donde se acumula (ej: tireostticos en tiroides) - concentracin por debajo niveles autorizados: tomar muestra representativa de la totalidad Anlisis residuos bajas concentraciones (ppm, ppb, ppt) en muestras complejas Esquema operativo: 1) extraccin 2) purificacin y concentracin 3) deteccin e identificacin 4) cuantificacin Anlisis residuos de frmacos en huevos. Fase inversa, DAD. Fase mvil: A: acetato sdico, B: ACN/agua. Gradiente.

Anlisis de micotoxinas: compuestos txicos producidos por hongos. Anlisis esencial para garantizar seguridad de cereales, aceites semillas, especias, etc. Deteccin ppb: concentracin muestra y deteccin con suficiente sensibilidad. Fase inversa, DAD y detector fluorescencia. Fase mvil: metanol:agua.

Anlisis de plaguicidas en muestras de ensalada. Fase inversa, UV, Fase mvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.