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FACTORES QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIN ENZIMTICA: CONCENTRACIN DEL SUSTRATO, CONCENTRACIN DE LA ENZIMA, COFACTORES, pH, TEMPERATURA, TIEMPO.

Objetivos: Establecer los factores que modifican la actividad enzimtica. Analizar cada factor que modifica la velocidad de reaccin enzimtica. Analizar cada sistema de reacciones llevadas a cabo en la prctica, y determinar sus caractersticas de cada una de ellas.

I.

PROCEDIMIENTOS:

1. Reactivos para la experiencia:

Buffer fosfato 0.1 M pH = 6.6, Buffer borato 0.1 M pH = 9, Sol. NaCl 0.2%, HCl 0.05N, Sol. Iodada, Sol. Cprica alcalina.

Buffer acetato 0.1M PH = 4.6

Sol. Almidn 1%

Sol. Enzimtica

A. Sistema de incubacin:

En 8 tubos de ensayo enumerados, colocar las siguientes soluciones:

COMPONENTES / TUBOS Solucin de almidn 1% ml Buffer acetato 0,1 M pH= 4,6 Buffer fosfato 0,1 M pH = 6,6 Buffer borato 0,1M pH =9

I 1 ----5 -----

II 1 --5 -----

III 1 5 ---------

IV 1 ---5 -----

V 1 ------5

VI 1 ---5 ----

VII 2 ---5 ----

VIII 1 ---5 ----1

COMPONENTES / TUBOS Solucin de NaCl 0,2% Agua destilada

I 1,4 2,6

II ----3,4

III 1,4 2,0

IV 1,4 2.6

V 1,4 2.0

VI 1,4 2.0

VII 1,4 1,0

VIII 1,4 2,0

Del tubo 1 al 7 Mezclar e incubar a 37 C por 5 minutos.

El tubo 8 colocar en temperatura de 0 4 C x 5 minutos.

Luego transcurrido ese tiempo agregar la solucin enzimtica:

COMPONENTES / TUBOS Agregar la solucin enzimtica

I 0.0

II 0.6

III 0.6

IV 0.2

V 0.6

VI 0.6

VII 0.6

VIII 0.6

MEZCLAR: continuar la incubacin, computar el tiempo desde el momento que el preparado enzimtico fue agregado.

Los controles de la actividad enzimtica se realizaran a los 10 y 30 minutos de acuerdo a los sistemas que a continuacin se presentan.
2

Control de la actividad enzimtica: A. Control del sustrato no transformado:


Con este objetivo armar dos series paralelas de tubos marcados de igual manera que los correspondientes sistemas de incubacin enzimtica, una de las series se marcara adems con 10 minutos (A-I) y la otra con 30 minutos (A-II)

A-I a los 10 minutos A-II a los 30 minutos HCl 0,05N

I I 2.5ml

II III IV V -------------AGREGAR A AMBAS SERIES 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml

VI VI 2.5 ml

VII VII 2.5 ml

VIII ---2.5 ml

1. Control de la actividad enzimtica a los 10 minutos de la incubacin: Utilizar la serie de tubos control correspondiente a los 10 minutos:

a.

Cumplidos los diez minutos de incubacin de los respectivos sistemas de incubacin transferir 0,5 ml del incubado a los correspondientes tubos control , mezclar:

b. Agregar a cada tubo control 0,5 ml de solucin iodada y mezclar. c. Observar y anotar los resultados de las reacciones valorando en forma de cruces: una disminucin ligera del color respecto al patrn 1= + otra algo ms intensa = ++, etc., sino hubiera cambio alguno = O

2. control de la actividad enzimtica a los 30 minutos de la incubacin : Utilizar la serie de tubos control correspondiente a los 30 minutos.

A-II a los 30 minutos HCl 0,05N

I 2.5ml

-------------AGREGAR A AMBAS SERIES 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml


a.

VI 2.5 ml

VII 2.5 ml

---2.5 ml

cumplidos los 30 minutos de incubacin de los respectivos sistemas de incubacin transferir 0,5 ml del incubado a los correspondientes tubos control, mezclar, b y c. son exactamente iguales a los 1 (b) y (c)

3. Control de los productos formados o de transformacin: Se realiza por la capacidad reductora de los oligo y mono sacridos resultantes sobre el cobre y la subsecuente de este con el fosfomolibdato.

1.

este control se realizara con los tubos VI y VII de incubacin enzimtica a los 10 y 30 minutos de incubacin.

COMPONENTES / TUBOS Solucin cprica alcalina Del sistema incubado VI y VII a los 10 minutos Del sistema incubado VI y VII a los 30 minutos

VI

VII (10 minutos)

VI

VII (30 minutos)

1 ml 0.5 -----

1 ml 0.5 ------

1 ml -----0.5

1 ml -----0.5

Mezclar: colocar en bao de agua hirviendo por 10 minutos. Enfriar rpidamente en agua corriente.

2.

Agregar solucin fosfomolibdica 1 ml a cada uno de los tubos. Mezclar enrgicamente.

3.

Agregar 5 ml de agua destilada y mezclar. Observar y anotar los resultados de las reacciones valorndolas por la intensidad del color desarrollado.

A los 10 minutos

A los 30 minutos

II.

DISCUSIN:
6

III.

RESULTADOS:
9

IV.

CONCLUSIONES:

V.

BIBLIOGRAFIA:

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