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Practica N3 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD Tipo de prctica: individual OBJETIVOS El objetivo de este trabajo consistir en que el alumno conozca las formas de inhibicin bacteriana por medio de discos con medicamentos El objetivo de este trabajo consistir en que el alumno conozca las formas de inhibicin bacteriana por medio de macro diluciones. Conocer y aplicar los diferentes mtodos y tcnicas para la susceptibilidad del microorganismo a ciertos medicamentos. INTRODUCCION
El principio de las pruebas de difusin por disco ha sido utilizado por ms de 70 aos en los laboratorios de microbiologa. Alexander Fleming utiliz una variante de esta tcnica cuando trabajaba con la penicilina en los aos cincuenta. En ese tiempo, haba tantos procedimientos diferentes en uso como microbilogos. Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas las variables involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966, ellos publicaron su estudio cimero describiendo la prueba que se usa en la actualidad. El NCCLS adopt los pasos bsicos del procedimiento descritos en el estudio de Bauer como el mtodo de referencia para difusin por disco. Estos pasos deben seguirse en forma minuciosa para obtener resultados precisos.

MATERIAL MACRODILUCION 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 11 tubos 13x100 con 1ml caldo MH c/u 1 tubo vacio 13x10 vacio 1 tubo 13x100 con 2ml de caldo MH 1 tubo 16x150 con 5ml H2O destilada 1 tubo grande con 19.9ml de diluyente de peptona 24 pipetas 1ml 8 cajas petri 2 frascos con 150ml de ACE

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TECNICA DE KIRBY BAUER 1. 1 caja con 20-30 ml de agar MH -4mm de espesor 2. 1 pinzas p/ceja 3. Hisopo estril grande EQUIPO 1. Cuenta colonias 2. Vortex

PROCEDIMIENTO
KIRBY BAUER
1.- Con un marcador, marcar la tapa de cada uno de Mueller- Placa de agar Hinton con su nombre, la fecha y el nombre de la bacteria a ser inoculado. Cada grupo de estudiantes inocular la superficie de cuatro placas de Mueller-Hinton con S. aureus, E. coli, P. aeruginosa y K. pneumoniae, respectivamente. Use un hisopo de algodn estril para cada bacteria. El hisopo se sumergi en la cultura tubo, y el exceso de cultura se aprieta en el lado interior del tubo de ensayo. Si no son suficientes suministros, puede que desee analizar la sensibilidad antimicrobiana de microorganismos a partir de la garganta. 2. El hisopo se toma a continuacin, y se raya en la superficie de la placa de MuellerHinton tres veces, girando la placa 60 despus de cada raya. Por ltimo, ejecutar el hisopo alrededor del borde del agar. Este procedimiento garantiza que toda la superficie ha sido cabeza de serie. Deje que la cultura se seque sobre la placa durante 5-10 minutos a temperatura ambiente con la parte superior en lugar. 3. Distribuir los antibiticos en la placa, ya sea con el dispensador mltiple o individual, con el nico dispensador de la unidad. Asegrese de que el contacto es hecho entre el disco de antibitico y la cultura presionando suavemente el disco con alcohol flameado frceps. NO PRESIONE EL DISCO EN LA AGAR Y NO MUEVA EL DISCO UNA VEZ QUE SE COLOCA EN EL AGAR. 4. Las placas se incuban durante 16 a 18 horas a 35 C.NO INVERTIR las placas. 5. Medir las zonas de inhibicin con el mm ms cercano para cada uno de los antibiticos probados. Anote los resultados en el informe. Para cada antibitico, determinar si las bacterias son resistentes o susceptibles.

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MACRODILUCION 3
1. Etiquetar 13 tubos estriles del 1 al 13 Tubo 11: inculo control Tubo 12: caldo control Tubo 13: Antibitico control 2. Colocar 1 mL de Caldo Mueller Hinton en los tubos del 2-10, 11 y 13 y 2 mL en el tubo 12. 3. Pipetear 1,0 mL de la solucin del Antibitico en los tubos 1,2 y 13. 4. Hacer diluciones seriadas con volmenes de 1,0 mL en los tubos del 2 al 10 (MH + Antibitico). 5. Estandarizar el inculo. Para esta prueba es necesario tener un inculo de 1 x 106 para esto vamos a partir de un inculo de 24h. Este tendr aproximadamente 1 x 10 9 cel/mL. 6. Realizar una dilucin 1:10 de la siguiente manera: se pondr 9 mL de caldo MH en un tubo y agregar 1 mL del inculo inicial, en esta dilucin se obtendr un 8 6 inculo de 1 x 10 . Sin embargo para poder tener el inculo deseado de 1 x 10 se realizar otra dilucin 1:100 agregando 19,8 mL de caldo MH y 0,2 mL del 8 inculo de 1 x 10 ( 2 tubos con 9 mL de MH y realizar diluciones hasta obtener el inculo de 1 x 106). 7. A los tubos del 2 al 10 y 11 agregar 1 mL directamente del inculo estandarizado. Mezclar cada tubo e incubar a 37 C por 18 a 24 h. INTERPRETACIN Observar los tubos de menor a mayor concentracin del agente antimicrobiano y el primer tubo que no presente turbidez visible se toma como CMI. a) Inculo control (tubo 11): Debe mostrar desarrollo visible para que la prueba sea vlida. b) Agente antimicrobiano control (tubo 13): No debe mostrar desarrollo visible para que la prueba sea vlida. c) Caldo control (tubo 12): No debe mostrar desarrollo visible para que la prueba sea vlida.

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RESULTADOS KIRBY BAUER (SALMONELLA) ANTIBIOTICO HALO MEDIDO Ampicilina 25mm (AM) 10 g Cefaclor 30mm (CEC) 30 g Rifampin 6mm (RAS) 5 g Cefazolin 22mm (CZ30) 30 g Sulbactam 27mm (SAM20) 75/30 g R en mm < 16
< < < <

I en mm -------15-17 17-19 15-17

16-20

S en mm > 17
> > > >

RESULTADO PARA salmonella SUSCEPTIBLE SUSCEPTIBLE RESISTENTE SUSCEPTIBLE SUSCEPTIBLE

14 16 14
15

18 20 18 21

MACRODILUCION EN CALDO MIC

(CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA)

MBC
(CONCENTRACION MINIMA BACTERICIDA)

N DE TUBO DE LA DILUCION CONCENTRACION FINAL DEL ANTIBIOTICO (PENICILINA)

10 0.19 ug/ml

8 0.78 ug/ml

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OBSERVACIONES Al parecer esta practica a fin de cuentas no resulto tan complicada, como pareca al principio, debido a mucho material necesario a utilizar. Otras de las cosas fue de que a pesar de que utilizamos algunas pipetas repetidamente no sali mal la practica gracias a que las diluciones si mostraban la concentracin indicada UFC/ml. CONCLUSIONES Conocimos y aplicamos los diferentes mtodos y tcnicas para la susceptibilidad del microorganismo a ciertos medicamentos. Tal fue el caso del microorganismo que nos toco Salmonella spp. BIBLIOGRAFIA De Geo F. Brooks, Microbiologia Medica, Decimo quinta edicin, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. De Prescott Harley Klein, Microbiologia, Quinta edicin, Editorial Mc.GrawHill.Interamerica De Prescott Harley Klein, practicas de Microbiologia, Quinta edicin, Editorial Mc.Graw-Hill.Interamerica CUESTIONARIO
1.- Cmo se puede determinar si la zona de inhibicin se debe a la muerte o a la inhibicin de una bacteria? Si el compuesto que se est probando es bactericida, no se podrn recuperar bacterias de la zona de inhibicin. Si el compuesto es slo bacteriosttico, se podrn recuperar bacterias de la zona de inhibicin por el raspado de la superficie del agar y resuspendiendo las raspaduras en solucin salina estril y luego se extiende una parte alcuota de la suspensin en agar nutriente que no contiene el agente bacteriosttico. 2.- Qu factores se deben controlar cuidadosamente en el mtodo de Kirby-Bauer? Tamao del inoculo, distribucin del inoculo, periodo de incubacin, profundidad del agar, velocidad de difusin de el antibitico, la concentracin del antibitico en el disco y la fase de crecimiento de la bacteria 3.- En qu fase de crecimiento es ms sensible la bacteria a un antibitico? En la fase lag

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15 4.- Si el laboratorio clnico reporta susceptibilidad bacteriana a un antibitico, pero el paciente no responde a la misma, Que podra haber salido mal? Es posible que el microorganismo haya creado resistencia debido a los malos usos de los antibiticos 5.- Cules son las similitudes y diferencias en la respuesta a las placas con bacterias gram-positivas y gram-negativas? Entre entricos y no entricos? El mecanismo de accin de ambas inhiben la sntesis del peptidoglucano de la pared bacteriana, en bacterias en crecimiento, actan a nivel del proceso de transpeptidacin (las transpeptidasas se unen al anillo lactmico de manera irreversible). Esto por s slo no sera bactericida, pero al inhibir las transpeptidasas, las autolisinas (rompen la pared celular para que crezca) se descontrolan y provocan la muerte bacteriana. En Gram +: la produccin de lactamasas es inducida por el propio antibitico, producindose en altas cantidades (ya que van diluidas) y soltndose al medio (alto gasto energtico por lo que es inducible) destruyendo al antibitico. En Gram - : la produccin es de forma constitutiva, pero en bajas cantidades, no sale al medio se queda en el espacio periplsmico debido a la membrana externa que le sirve de proteccin a las Gram -. El antibitico tiene que entrar para actuar , por lo que no necesita salir. 6.- Cul es la diferencia entre un antibitico y un agente antimicrobiano? Es que el antibitico es obtenido a partir de otros microorganismos vivos o de procesos biotecnolgicos pero siempre dependientes de otro organismo. Y los antimicrobianos son obtenidos a partir de sntesis qumicas 7.- Cules son algunas de las razones por las cuales las bacterias son cada vez ms resistentes a los antibiticos? La resistencia a los antibiticos por parte de los microorganismos se da a travs de los mecanismos que estos han desarrollado y les confieren la capacidad de inactivar la accin de los antibiticos. Otras causas y factores son el uso irracional y abuso de estos medicamentos, su empleo en tratamientos y dietas de engorde en el campo veterinario que pueden llegar a generar resistencia en grmenes que afectan a los humanos, as como el hecho de que la propia flora bacteriana normal del hombre puede ser en muchas ocasiones, a la accin de los antibiticos.

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Normas de seguridad en los laboratorios de docencia

Un aspecto muy importante que se incluye en este instructivo es el de cumplir en forma estricta las normas de seguridad para evitar accidentes en el laboratorio, de manera particular en el captulo IV de las Normas de Seguridad Artculo17 que dice:
Seguridad en el laboratorio

En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad fsica de las personas involucradas; por ello, no podr realizarse ninguna prctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los elementos de proteccin indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas aplicables, para lo cual se debern cumplir siempre las siguientes reglas. 1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable vestir ropa sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodn, zapatos cerrados, con suelas gruesas y sin tacones o plataformas, as como traer el pelo recogido. 2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los ojos con las manos. 3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salgan por breves periodos. 4. Al manipular sustancias qumicas corrosivas o peligrosas se utilizarn guantes, lentes protectores y/o mascarillas. No se deber pipetear oralmente ningn tipo de solucin o cultivo microbiano. Siempre se utilizarn pipetas adecuadas para este fin. 5. No se admitirn visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo. 6. Evitar la acumulacin de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes. 7. Localizar extintores, botiqun y salidas de emergencia.

Sobre los procedimientos

1. Antes y despus de cada sesin prctica, los alumnos limpiarn las mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionar. 2. Cuando se utilice el mechero, este ser colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos. 3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la calma, inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento: a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin. b. Agregar abundante solucin desinfectante sobre las toallas. c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la eliminacin de materiales contaminados. 4. Al concluir cada sesin prctica, el estudiante se asegurar de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes especficos para ello, as como en lugares apropiados. Debern esterilizarse tal y como indique el profesor.

Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda del profesor, del ayudante o del tcnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria. 2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo, desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia. 3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas, autoclave, potencimetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. 4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estn bien cerradas. Dejar limpias y secas las mesas de trabajo.

Materiales indispensables en cada sesin de laboratorio

1. El Manual de laboratorio. 2. 2 cubre bocas y 1 par de guantes de ltex. 3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar ( masking-tape), marcador indeleble o etiquetas pequeas, jabn para manos

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