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PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA

Uso de Pruebas Bioquímicas y Técnicas Rápidas para la Caracterización Fisiológica de Bacterias (1ª Sesión)
Objetivos Al finalizar este ejercicio el estudiante será capaz de:  Caracterizar mediante pruebas bioquímicas o técnicas rápidas una bacteria aislada

Introducción Para que una célula viva, crezca y se reproduzca, debe ser capaz de incorporar y transformar (mediante el metabolismo) los compuestos químicos que necesita para obtener energía (catabolismo), así como las moléculas que pasarán a formar parte de su material celular (anabolismo). Todas las reacciones químicas que se llevan acabo son catalizadas por enzimas (catalizadores biológicos de naturaleza proteica y actividad específica), las cuales se clasifican, de acuerdo al lugar del ambiente celular donde actúan, en exoenzimas y endoenzimas. Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más microorganismos. Una de las técnicas rápidas más usadas para la identificación de bacterias son las galerías API de bioMerieuxMR, las cuales permiten identificar levaduras, bacterias entéricas, no entéricas, especies de Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Campylobacter, y otras más. En el laboratorio se emplean frecuentemente las galerías API 20E, que es un sistema estandarizado que permite la identificación de bacterias de la familia Enterobateriaceae y otros bacilos Gram negativos, no exigentes. Otro sistema que se emplea comúnmente en la bacteriología es el sistema Vitek de bioMerieux MR, el cual es un sistema automatizado en el cual se identifican a las bacterias mediante el empleo de una tarjeta adecuada al tipo de microorganismo, por ejemplo si es grampositiva, gramnegativa entérica, etc. Materiales Cultivos puros de las siguientes bacterias: Cepas problema (cultivos puros aislados) Material por equipo: Galerias API 20E (bioMérieuxMR) para la caracterización fisiológica rápida de enterobacterias. Tarjeta Vitek para la identificación de bacterias grampositivas. Placas de Petri con los siguientes medios de cultivo: 1 con Gelosa nutritiva 1 con Agar sangre 1 con Agar almidón 1 con Agar DNA 1 con Agar leche descremada Tubos de ensayo de 13x100 con los siguientes medios de cultivo: 2 con 5 a 7 mL de solución salina isotónica (SSI) estéril 2 con 3.5 mL de Agar Citrato de Simmons inclinado 2 con 3 mL de Caldo nitrato con campana de Durham 2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol más sacarosa con campana de Durham 2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol mas manitol con campana de Durham
Departamento de Biología (1)

Densimat a) Siembra para caracterización fisiológica de bacterias. 1.5 mL de Agar Kligler inclinado 2 con 3.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA 2 con 2 mL de caldo urea 4 con Rojo de Metilo / Voges Proskawer (RM/VP) 2 con 3. Si hay desarrollo abundante guardar los medios de cultivo en refrigeración. 3. d) Por estría recta y picadura el tubo que contiene Agar Kligler. c) Mediante asada los tubos que contienen caldo nitrato. y revisar a las 24 horas. Con el cultivo de 24 horas de la bacteria problema. y si el desarrollo es escaso incubar 24 horas más. Etiquetar las cajas y los tubos con SSI estéril y los medios de cultivo.0 mL estériles Pipetas Pasteur estériles Material por grupo Matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de aceite mineral estéril Incubadora a 37°C Equipo Vitek para la lectura de tarjetas.5 mL de Gelatina nutritiva 2 con 2 mL del SIM 2 con 2. MIO y los dos con Hugh & Leifson. 5. Departamento de Biología (2) . 4. y los dos con RM/VP. b) Mediante estría recta uno de los sectores de cada una de las 5 placas de Petri. caldo urea. Marcar las cajas por la parte inferior dividiéndolas en dos sectores. Incubar a la temperatura óptima de desarrollo determinada en la práctica anterior. A partir de la Suspensión anterior proceder a inocular los medios de cultivo en el orden que se indica a continuación: a) Por estría recta el tubo que contiene citrato de Simmons.5 mL de MIO y/o LIA 4 con 2 mL de Hugh & Leifson + glucosa Material que deben tener los alumnos: Cepa problema (cultivo puro) con 24 horas de incubación previa Mecheros Asas Gradillas Piseta Pipetas de 1. SIM. agregar a uno de estos últimos aceite mineral estéril. Rojo de fenol+manitol. 2. Rojo de fenol+sacarosa. e) Por picadura los tubos que contienen los medios de gelatina nutritiva. proceder a inocular un tubo con SSI estéril hasta obtener una Suspensión de bacterias ligeramente turbia.

Etiquetar las galerías API en la lengüeta lateral de la cámara de incubación. Pruebas bioquímicas para la caracterización fisiológica de bacterias. 1. los alveolos del fondo de la cámara de incubación.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA Cepa problema o de referencia Suspensión (SSI) Estría recta Asada Picadura y estría recta Picadura Citrato de Simmons Caldo nitratos Agar Kliger Gelatina nutritiva Gelosa nutritiva Rojo de fenol + sacarosa SIM Agar almidón Rojo de fenol + manitol Agar leche descremada MIO / LIA Agar sangre Caldo Urea Hugh & Leifson Agar DNA Rojo de Metilo / Voges Proskawer Agregar aceite mineral estéril Figura 8. Introducir el inóculo en los pozos de la galería con ayuda de una pipeta Pasteur estéril (para Departamento de Biología (3) . proceder a inocular las galerías de izquierda a derecha. b) Siembra de galerías API (20E) para caracterización fisiológica rápida de enterobacterias. 2. Llenar con agua destilada. A partir del tubo Suspensión. 3. Colocar la galería API dentro de la cámara de incubación. 4.

colocar la punta de la pipeta sobre la pared de la cúpula. Colocar 3 mL de solución salina y hacer una suspensión de la bacteria grampositiva. 5. Precauciones generales   Evitar tocar los medios de cultivo con la pipeta al ser inoculados. Departamento de Biología (4) . durante 18 a 24 horas y realizar la lectura. 7. LDC. desechar en tarja y posteriormente lavar con agua y jabón. Esterilizar los tubos empleados para la preparación de la suspensión bacteriana. Para las pruebas CIT. En caso de no haber crecimiento con ninguna prueba de la galería. llenar únicamente los pozos. Disposición de desechos 1. Ajustar la turbidez a 0. inclinando ligeramente la cámara de incubación hacia delante). Para las otras pruebas. llenar el pozo y la cúpula (ver Figura 9). Cerrar la cámara de incubación e incubar a la temperatura óptima de desarrollo determinada en la práctica anterior. ODC. someter nuevamente a incubación. 1. Tener cuidado de no mezclar el contenido de cada pozo una vez hidratado el medio de cultivo. Inocular dos galerías por equipo. Galerias API 20E (bioMérieuxMR) para la caracterización fisiológica rápida de enterobacterias c) Inoculación de tarjetas Vitek para caracterización fisiológica rápida de bacterias grampositivas.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA evitar la formación de burbujas en el fondo de los pozos. 3. H2S y URE crear una atmósfera anaerobia llenando la cúpula con aceite mineral estéril.65 de McFarland Llenar los datos que se piden en el equipo y colocar la tarjeta en el carrusel de lectura Pasar al siguiente equipo y confirmar los datos que pide. Para las pruebas ADH.5-0. Respeta los tiempos de incubación para la prueba con galerías API. cúpula pozo Figura 9. 6. una con el tubo de la Suspensión de la bacteria problema y la otra con la cepa de referencia. 2. VP y GEL. 5. 4. Iniciar el proceso Esperar de 3 a 18 horas hasta que den los resultados de identificación.

Realice lo siguiente: a) Colocar un trozo de papel filtro en un portaobjetos. Observe el contraste de color que se presenta alrededor del desarrollo con el resto de la placa. Colocar los tubos con gelatina nutritiva en hielo y observe si estos permanecen líquidos o se solidifican. En las placas de agar sangre indique si la hemólisis fue parcial (α) o total (β).0 N) alrededor de la estría de desarrollo. DNA-asa. Oxidasa. en tanto que una coloración rojiza o parda indica la degradación del almidón y se considera la prueba positiva. Materiales Material por mesa: Hielo Frascos gotero con: Lugol HCl 1. Hidrólisis del almidón. El primer caso indica la hidrólisis de la gelatina y se considera la prueba positiva. El ADN precipita con el HCl. e) La aparición de un color morado sobre la muestra durante los primeros segundos se considera como una prueba positiva. Departamento de Biología (5) . la aparición de color azul revela la presencia de almidón. En la placa de agar DNA adicione unas gotas de HCl (1. 1. Licuefacción de la gelatina. 6. c) Colocar los palillos en un tubo vacío y taparlo. 2. 4. En la placa de agar almidón agregue lugol alrededor de la estría de desarrollo.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA Uso de pruebas bioquímicas… (2ª Sesión) Lectura e interpretación de resultados.0 N Reactivo de TPD (preparar con alcohol isoamílico) Peróxido de hidrógeno al 3% Rojo de metilo Hidróxido de potasio al 40% -Naftol Solución A del reactivo de Griess Solución B del reactivo de Griess Zinc en polvo Reactivo de Erlich Material que deben tener los alumnos: Mecheros Gradillas Papel filtro (cuadros de 2x2cm) Portaobjetos Palillos de madera Metodología a) Caracterización fisiológica de bacterias. 5. tomar con un palillo de madera una muestra del crecimiento obtenido en la placa de gelosa nutritiva y colocarla sobre el papel. En la placa de agar leche descremada observe si alrededor de las colonias hay un halo transparente. d) Agregar unas gotas del reactivo de TPD hasta impregnar totalmente el papel filtro. por lo que la formación de un halo incoloro alrededor de las colonias indica que la prueba es positiva. Hidrólisis de la caseína. b) En condiciones asépticas. 3. Hemólisis. La desaparición del color blanco de la leche indica que la prueba es positiva.

Para establecer a cual de las opciones anteriores corresponde el resultado. El desarrollo de un color rojo indica la presencia de nitratos residuales. c) Pico y fondos ácidos a las 48 horas de incubación indican fermentación de la lactosa. la presencia de desarrollo bacteriano y el vire del indicador a un color azul intenso indica una prueba positiva. Fermentación ácido mixta.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA 7. Agregar 4 gotas de la solución A del reactivo de Griess y 4 gotas de la solución B del reactivo de Griess. En caldo urea. En este medio se puede observar además la movilidad de las bacterias. La prueba positiva se manifiesta por la formación de burbujas debido a la descomposición del H 2O2 8. En los tubos con Hugh & Leifson más glucosa: a) Las bacterias que se desarrollan y producen ácido (vire del indicador de verde a amarillo) en ambos tubos (sin y con aceite mineral) son fermentativas facultativas b) Las bacterias que se desarrollan y producen ácido en el tubo sin aceite mineral son oxidativas. El desarrollo de un color rojo indica la presencia de nitritos y que la bacteria posee la nitratorreductasa lo que corresponde a una prueba positiva. óxido nitroso o nitrógeno molecular (desnitrificación o reducción desasimilatoria).4 por lo que se considera la prueba positiva. Prueba de oxido/ fermentación y movilidad. En los tubos con caldo rojo de fenol más sacarosa o manitol. En tanto que la ausencia de color indica una prueba positiva. d) Precipitado negro. La aparición de un color rojo indica una prueba positiva. c) Las bacterias que no utilizan el carbohidrato no producen cambio en ninguno de los dos tubos. Agitar suavemente el tubo y dejar reposar el tubo destapado de 10 a 15 minutos. Prueba positiva para la producción de ácido sulfhídrico (ver inciso 19). 16. tales como amoníaco (reducción asimilatoria). Reducción de nitratos. Catalasa. óxido nítrico. En Agar Kligler: a) Pico y fondo ácidos a las 18 a 24 horas (reacción inicial) indican la fermentación de glucosa. b) Pico alcalino / fondo ácido a las 48 horas (reacción tardía). Producción de acetoína como subproducto de una fermentación ácido mixta. Indica fermentación de la glucosa. En uno de los tubos con caldo RM/VP incubados durante 72 horas. Sobre el crecimiento obtenido en las placas de gelosa nutritiva o agar leche descremada agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno (3%). Departamento de Biología (6) . observar si se produjo el desplazamiento del medio de cultivo en la campana lo que indica la producción de gas. La aparición de un color rojo estable en el medio de cultivo indica una producción de ácidos suficientes para alcanzar un pH de 4. 11. el vire del indicador a rojo o rosa intenso indica una prueba positiva. 15. confirmándose la prueba negativa. la ausencia de color indica: a) Que los nitratos no fueron reducidos (prueba negativa) o b) Que los nitratos fueron reducidos a productos diferentes a los nitritos. En agar Citrato de Simmons. 13. Utilización de diferentes fuentes de carbono. añadir una pequeña cantidad de zinc para reducir los nitratos presentes en el medio original a nitritos. Hidrólisis de la urea. Utilización de citrato. El pico retorna a pH alcalino por la formación de aminas procedentes de la descarboxilación oxidativa de proteínas cerca de la superficie. agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. 10. En el segundo tubo con caldo RM/VP incubado durante 24 horas añadir 0. En el tubo con el medio MIO el vire del indicador a púrpura indica la descarboxilación de la ornitina.2 mL de hidróxido de potasio (40%). En el tubo con caldo nitrato y campana de Durham. 14. lo anterior indica la utilización de los compuestos empleados. Descarboxilación de aminoácidos. La alteración en el orden de la adición de los reactivos puede originar resultados falsos. observe el vire del indicador de rojo a amarillo en donde además puede haber formación de gas. así como la producción de indol (ver incisos 17 y 18). Utilización de carbohidratos y producción de ácido sulfhídrico.6 mL de -Naftol y 0. 12. e) Pico y fondo alcalinos indican el desarrollo de bacterias incapaces de utilizar glucosa o la lactosa. Dado que en esta prueba solo se detecta la presencia de nitritos. 9.

IND. se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Si el porcentaje de identificación es menor al 90%. es necesario realizar los ensayos complementarios algunos de los cuales corresponden a las pruebas efectuadas en la parte de caracterización fisiológica. 2 o 4. Prueba Movilidad: En los tubos con medio de SIM y MIO observar el crecimiento a lo largo de la picadura. 21. VP. Prueba ONPG ADH LDC ODC CIT H2S Componentes activos 2-nitro-fenil-βDgalactopiranosida Reacciones/Enzimas β-galactosidasa (orto-nitrofenilβD-galactopiranosidasa) Resultados Negativo incoloro amarillo amarillo amarillo verde pálido/amarillo incoloro/grisáceo Positivo amarillo 1 rojo/anaranjado 2 rojo/anaranjado 2 rojo/anaranjado 2 azul-verde/azul 3 depósito negro/fin L-arginina L-lisina L-ornitina citrato trisódico tiosulfato sódico Arginina dihidrolasa Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Utilización del citrato Producción de H2S Departamento de Biología (7) . sumando al interior de cada grupo los valores que corresponden a reacciones positivas. con base en lo anterior. tomar lectura después de 10 minutos). proceder a identificar la cepa aislada. 2. Agregar unas gotas de Reactivo de Erlich o Kovac en la superficie de los medios SIM y MIO. La movilidad de los microorganismos se manifiesta por su migración desde la línea de siembra y su difusión en el medio lo que produce turbidez. c) Sistema Vitek para identificación de bacterias grampositivas. La aparición de un anillo color rosa indica la formación de compuestos indólicos. 18. Cuadro 16. Prueba del Indol. Nota: Si el número de pruebas positivas antes de añadir los reactivos (incluyendo el ensayo GLU) es inferior a 3. Tabla de Lectura para el registro de resultados de la galería API 20E. 1. Cuando el perfil de 7 cifras resulta insuficiente para realizar la identificación de la bacteria. pues esta reacción libera gases que pueden alterar la interpretación de las otras pruebas. Es importante considerar la agrupación de las bacterias. reactivo α–Naftol + KOH 40%. 19. 2. reactivo de Erlich. Prueba del ácido sulfhídrico . 4. Cuando el crecimiento bacteriano se acentúa a lo largo de la línea de siembra y el medio que lo rodea permanece claro la prueba es negativa. Tomar del equipo la hoja con los resultados de identificación. La prueba IND debe ser realizada en último lugar. sin volver a añadir los reactivos. o bien por la formación de estrías de crecimiento velloso. con constituye la prueba no. reactivo TDA. Comparar los resultados obtenidos con la literatura. A la reacción de la oxidasa. La presencia de un precipitado negro en los tubos de los medios SIM y Kliger indica la formación del ácido sulfhídrico. tomar lectura de inmediato. Identificar la identidad bacteriana mediante el Catálogo Analítico o con ayuda del Software. d) Siembra de galerías API-20E para caracterización fisiológica rápida de enterobacterias 1. cuando resulte positiva. Registrar en el cuadro 15 las características metabólicas reportadas para la bacteria con la que se encontró similitud. reincubar la galería 24 horas más. Las pruebas están separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de 1. Como la galería se conforma de 20 ensayos. Obtener el perfil numérico de cada bacteria en la papeleta de resultados. 3. Registrar los resultados en las papeletas API correspondientes en el siguiente orden: Anotar primero todas las reacciones espontáneas y después revelar los ensayos que necesiten la adición de reactivos (TDA. 5. tomar lectura de inmediato.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA 17. 21 se le asigna el valor 4. realizar los ensayos complementarios para determinar el género. (consultar con el profesor). 20. Realizar la lectura de la galería API de acuerdo a lo indicado en el Cuadro 16.

4. Precauciones generales   Es importante incubar los tubos. de otra manera podemos obtener resultados negativos.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX Urea L-triptófano L-triptófano piruvato sódico gelatina (origen bovino) D-glucosa D-manitol Inositol D-sorbitol L-rhamnosa D-sacarosa D-melibiosa amigdalina L-arabinosa Oxidasa Ureasa Triptófano desaminasa Producción de índoles Producción de acetoína (Voges Proskawer) Gelatinasa Fermentación/Oxidación 4 (glucosa) Fermentación/Oxidación (manitol) 4 Fermentación/Oxidación (inositol) 4 Fermentación/Oxidación 4 (sorbitol) Fermentación/Oxidación 4 (rhamnosa) Fermentación/Oxidación (sacarosa) 4 Fermentación/Oxidación (melibiosa) 4 Fermentación/Oxidación (amygdalina) 4 Fermentación/Oxidación (arabinosa) 4 Citocromo Oxidasa amarillo amarillo incoloro verde páldo/amarillo incoloro/rosa pálido no difusión azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso azul/azul verdoso liserado 2 rojo/anaranjado marrón-rojizo rosa rosa/rojo difusión pigmento negro amarillo/amarillo grisáceo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo amarillo/amarillo ver ficha técnica de la prueba de oxidasa 1 Un color amarillo muy ligero también implica resultado positivo. 2 La aparición de un color naranja tras 24 a 48 horas de incubación corresponde a un resultado negativo. 3 Lectura en la cúpula (zona aeróbia). mientras que la oxidación empieza en la cúpula. Disposición de desechos 1. Esterilizar los tubos que contienen los palillos y posteriormente desechar los palillos en el bote de basura y lavar los tubos con agua y jabón. que aparece tras 10 min. Emplea los reactivos reveladores en orden y en buen estado. Sellar con masking-tape las cajas de Petri de plástico que contengan cultivos y colocar en el contenedor ubicado en el laboratorio 1A. Las tarjetas Vitek se colocan en el contenedor ubicado en el laboratorio 1A. 3. 2. 5. algunos de ellos necesitan prepararse en el momento. 4 La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos. 5 Una ligera coloración rosa. Departamento de Biología (8) . debe ser leída como negativa. cajas y la tira API a la temperatura óptima de crecimiento determinada. Esterilizar el material de vidrio en los que realizó sus lecturas y posteriormente lavar. Las galerías API asegurarlas con masking-tape y colocarlas en el contenedor ubicado en el laboratorio 1A.

Martinko y J. y Case Christine L. Camacho Cruz y M del C. A. Manual de Prácticas de Microbiología General. M. Winn. 5a. A. M. Vierna García. 2. R. McGraw Hill. UNAM. Urzúa Hernández. Mejía Chávez. Microbiología en Práctica. B. W. México Madigan. 2006. ed. 5ª edición. Fonke Beidell R. J. S. 4. Inc. L. 2003. C. Brock. M. R. P.. Facultad de Química. 3ª edición Médica Panamericana. M. A. 992 pp Tortora Gerard J. A.PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA Discusión de resultados 1.biomerieux. S. Wachsman. W. Müggenburg. Harley Jonh P. Atlante S. México. Jamda. Alche. F. 2000. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Allen. Parker. Biología de los microorganismos. Luna Millán. 5ª edición. Diágnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. 1ª edición. M.es     Departamento de Biología (9) . 1999. Prescott Lansing M.. España. I. G. D. 2005. Argentina www. The Benjamin/Cummings Publishing Company. ¿Qué ventajas y desventajas ofrece el sistema Vitek de identificación? Literatura de consulta     Koneman. D. Scneckenenherger y W. ¿Qué variables pudieron causar errores al momento de revelar las pruebas bioquímicas? ¿Cuáles crees que sean las variables que tú puedes controlar? ¿Por qué? ¿Por qué empleaste la galería API 20E? ¿Cuál es su importancia? ¿Qué ventajas y desventajas encuentras al emplear tanto las pruebas bioquímicas tradicionales como las galerías API para determinar la fisiología bacteriana? 5. 6a. Argentina Mac Faddin J. Hernández Gómez.. Tsuzuki Reyes. Microbiology an Introduction.. y Klemm Donald A. L. L.. Velásquez Madrazo. S. V. 1995. O. Microbiology. L. Prentice Hall Iberia. Médica Panamericana. E. 801 pp Vullo. 10ª Ed. T. Ramírez-Gama. Manual de laboratorio para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. ed. 2003.. De C. 3.