INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN

PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS INDISPENSABLES (Método Espectrofotométrico para la determinación de Triptófano según Beaven y Holliday)

1. OBJETIVOS a) b) El alumno evaluará la importancia de conocer el contenido de aminoácidos indispensables en los alimentos naturales y procesados. El alumno determinará el contenido de triptófano en algunos alimentos naturales y procesados.

2. INTRODUCCIÓN La mayoría de los aminoácidos constituyentes de proteínas son prácticamente transparentes en la región 250-320 nm del espectro ultravioleta, y es sabido que fenil alanina, tirosina y triptófano son los responsables de la absorción de la luz ultravioleta en soluciones de proteínas. La fenil alanina presenta una absorción muy débil en este intervalo de longitud de onda y en soluciones acuosas de NaOH 0.1M presenta un máximo de absorción a 258.5 nm, teniendo un coeficiente de extinción molar de valor bajo. La absorción de la luz ultravioleta ejercida por tirosina (Tyr) y triptófano (Try) es mucho mayor que la absorción presentada por fenil alanina en la misma región del ultravioleta, por lo que puede despreciarse el valor de ésta última, y por

se utilizan para calcular la cantidad de triptófano presente. a la vez referidas a los valores del contenido de nitrógeno. Figura (3) Este método de mezclas es estrictamente aplicable cuando se mantiene la ley de Lambert-Beer. En los casos de aminoácidos aromáticos. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR a) Explicar los fundamentos en los que se basa la técnica para la determinación de triptófano. El máximo de absorción de Try se observa a 280 nm y a 294 nm para Tyr.263 A280) x 10-3 3. Investigar el contenido de triptófano en los alimentos que se analizarán en la práctica.1M de NaOH.MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN tanto. Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminoácidos indispensables en los alimentos. de la mezcla de Tyr y Try puros a concentraciones equimoleculares conocidas en solución 0. Las soluciones equimoleculares de Tyr y Try presentan la misma absorción a 294 nm se encuentran en solución alcalina 0. determinadas para las longitudes de onda de 280 a 294 nm.592 A294 – 0.170 A294) x 10-3 M Tyr = (0. M Try = (0. MATERIALES Y REACTIVOS Espectrofotómetro UV/VIS Parrilla de calentamiento Matraz aforado de 25 ml Probeta de 100 ml Solución NaOH 0.1M.1M Tirosina Triptófano 32 PRACTICA 3 .263 A280 – 0. b) c) 4. se puede considerar a la solución de proteína como un sistema de 2 componentes para el análisis espectrofotométrico. Las mediciones de absorbancia de una solución de proteínas en álcali N/10. la ley de LambertBeer es válida sólo para ciertos intervalos. El método está basado en dos observaciones hechas sobre el espectro de absorción ultravioleta en la región de 250 a 320 nm. por sustituciones desarrolladas por Beaven y Holliday (1).

DESARROLLO EXPERIMENTAL El profesor responsable de la práctica indicará los alimentos que se analizarán. las suspensiones fueron calentadas a reflujo por 30 min. con lo cual se obtiene el contenido de Try de las muestras de los alimentos. con unidades.1 mM) se le determina el valor de absorción en la región ultravioleta del espectro de la luz entre 270 y 315 nm y para las regiones de máxima absorción se determina la absorbancia a intervalos entre 5 a 1 nm de longitud de onda. los resultados de las determinaciones hechas a los alimentos. así como las b) Presentar en forma de tabla. el sobrenadante obtenido se vacía cuantitativamente en un matraz aforado de 25 ml. 33 PRACTICA 3 . Llevar a cabo la determinación que se indica a continuación: Espectro de absorción de la mezcla de las soluciones de triptófano y tirosina.MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN 5.1M. obtenida. Duración del método: 35 minutos 6. a) A una mezcla equimolecular de los aminoácidos Try y Tyr (0. De cada una de estas disoluciones se toma una alícuota en las celdas de cuarzo de 1cm de paso de luz y se leen en el espectrofotómero a ambas longitudes de onda. se enfrían los matraces y su contenido se filtra o centrífuga según el caso. INFORME DE RESULTADOS a) Presentar la curva tipo de triptófano determinaciones de los alimentos problema. Se construye una figura con los valores de absorbancia obtenidos para longitud de onda. con la solución de NaOH se lleva a un volumen final de 25ml. d) Los valores obtenidos a esas longitudes de onda se substituyen directamente en la ecuación derivada por Beaven y Holliday (1). c) Transcurrido este tiempo. El valor máximo de absorción para tirosina se obtuvo a una longitud de onda de 294 nm y para triptófano a 280 nm. a los cuales se les agregaron 20 ml de NaOH 0. incluyendo en esta tabla los valores establecidos en la bibliografía consultada. b) Las muestras de los diferentes alimentos fueron puestas en los matraces.

1193 – 1196. 227. Análisis of the Absortion of Proteins in Term of Tyrosine and Tryptophan Content. Posibles fuentes de error en las determinaciones. Hier S. 999 – 1001. d) Elaborar sus conclusiones de la práctica en base al análisis y discusión de resultados y a los objetivos planteados. (1960). J. Puntos críticos en las determinaciones. Biol. Aminoacids Determination. 444.J. Biol. Adv. Chem. L. Chem.H. Smith E. 29. No. Zur Analytik der Eiweissqualität von Fleisch-Waren.R. 2. 213 – 216. 34 PRACTICA 3 . (1952). f) Dahl O. (1972).. como el triptófano. Scad. and Klein D. 1. en los alimentos. pág. d) Black S.W. Protein Chem. 1968. g) Dahl O. Winter 1971. (1957). August 7. 235. 369.L. 190-193. h) Fischl Joseph. (1960). 168 (1947).10. – Burn. 14. Biol.P. Chem. and Holliday E. and Schimd Karl. Pag. 711. i) Graham C.MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN c) Discutir. 7. Arnold: Processing Damage to Protein Food.. Dic Fleischwirtschaft 48. Bulletin 13. BIBLIOGRAFÍA a) Beaven G. tomando en cuenta los siguientes aspectos:     El contenido de triptófano en los diferentes alimentos con respecto a lo reportado para estos alimentos en la bibliografía. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiproline in Animal Tissues. Chem. 7. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. Determination of Tyrosine and Tryptophan in Protein. Method an Techniques. The Tryptophan Content some Proteins. c) Bender E. Acta Chem. May and Rose E.E. Vol. b) Bencze W. (1922). de manera integral. (1968). e) Clarence E. 20. los resultados obtenidos. Importancia de conocer el contenido de aminoácidos indispensables. Anal. Vol.R.

Sept. (1946).-October (1972). 21 (1949). 566 – 570. 628. Manual de Química Fisiológica 3ª. Helen. (1971). m) Spies J.A. and Morton R.MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN j) Goodwin T.W. 392 – 397. k) Harper A. and Chambers anal. Inc. Harold. 35 PRACTICA 3 . Chem. Ed. American Asociation of Cereal Chemist. l) Howe Jean M.. 1249. Yamura Y.R. The Spectrophotometric Determination of Tyrosine and Tryptophan in Proteins. And Clark E. Biochem Journal 40.

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