DENVDetectTMIgMCAPTUREELISA

USOPREVISTO
LapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAestdiseadaparala deteccincualitativadeanticuerposIgMcontraantgenos recombinantesDEN(DENRA)ensueroparadiagnsticoprovisional enlaboratorioclnicodeinfeccionesporelvirusdeldengue.La pruebaestdestinadanicamenteapacientesconsntomasclnicos indicativosdefiebredeldengueofiebrehemorrgicapordengue. Losresultadospositivossedebenconfirmarmediantelatcnicade reduccindeplacasporneutralizacin(PRNT)omediantelaspautas actualesdelosCentrosparaelControlylaPrevencinde Enfermedades(CDC)paraeldiagnsticodeestaenfermedad. Annosehanestablecidolascaractersticasderendimientodela pruebaensangredelcordnumbilical,enneonatos,enexamen sistemticoprenataloenexamensistemticodelapoblacinen general.Esteensayonoestautorizadoniaprobadoporla AdministracindeAlimentosyMedicamentos(FDA)paraelexamen endonantesdesangreoplasma. Advertencia:sehaconstatadoqueseproduzcareactividadcruzada conIgMdelvirusdelNiloOccidentalyotrosflavivirusconel ensayoInBiosDengueIgM.Losresultadosconreactivossedeben informarconunadeclaracindeprecaucinconrespectoala posiblereactividadcruzadadeIgMconotrosflavivirus.

Enlospacientesconunasegundainfeccinporelvirusdeldengue, sibienlacinticadelaproduccindeIgMessimilaralaquese observaenpacientesconunainfeccinprimaria,losnivelesdeIgM sonsignificativamentemenores(8.9).LosanticuerposIgMcontrael virusdeldenguetambinalcanzansumximoaproximadamente 2semanasdespusdelainfeccin,comienzanadisminuirapartir deentoncesyansepuedendetectarenaproximadamenteel30% delospacientes2mesesdespusdecomenzadoslossntomas.A diferenciadelaprimerainfeccin,lasegundainfeccinporelvirus deldenguemuestraunaaparicinmstempranadealtosnivelesde anticuerposIgGcapacesdemostrarreactividadcruzadaantesdelas respuestasdelaIgMosimultneamenteconestas(9). DENVDetectIgMCaptureELISAanalizalosanticuerposIgMensuero humanocontraantgenosrecombinantesderivadosdeldengue(DENRA).

PRINCIPIODELAPRUEBA
DENVDetectIgMCaptureELISAconstadeuninmunoensayointercalado amplificadoenzimticamente.Enesteensayo,elcontrolnegativodeIgM contraeldengue,elcontrolpositivodeIgMcontraeldengueylas muestrasdesuerodesconocidassediluyenconunasolucin amortiguadoradedilucindelamuestraDENV,luegoseincubanen pocillosdemicrotitulacinquesehanrecubiertoconanticuerposIgM antihumanos,aloquesigueunaincubacinconantgenosrecombinantes derivadosdeldengue(DENRA)yantgenosdeclulasnormales(NCA)de maneraindependiente.Traslaincubacinyellavado,lospocillossetratan conunanticuerpomonoclonaldeDENespecficoetiquetadoconla enzimaperoxidasaderbano(HRP).Trasunsegundopasodeincubaciny lavado,lospocillosseincubanconelsustratodetetrametilbencidina (TMB).Luegoseagregaunasolucindecorteacdicaysedeterminael gradoderecambioenzimticodelsustratomediantemedicindela absorbanciaa450nanmetros.Porencimadeciertoumbral,larelacin deabsorbenciasdelospocillosdeDENRAydelantgenodecontrol determinasiexistenanticuerposdeldengue.

RESUMENYEXPLICACIN DELAPRUEBA
Eldengueesunaenfermedadviralagudaquetransmitems comnmenteelmosquitoAedesaegyptiy,enmuchamenormedida, otrascepasdemosquitos.Eldenguesecaracterizaclnicamentepor fiebrebifsica,erupcin,depresinhematopoyticayporsntomas constitutivos,comomalestar,artralgia,mialgiaycefaleas(1,2).Con menorfrecuencia,sevencuadrosmsgraves,quesemanifiestana travsdeunafiebrehemorrgica(FHD)quepuedesermortal(24).Es endmicoenlaszonastropicalesysubtropicalesdetodoelmundo, dondesecalculaqueanualmenteseproducenentre50y100millones decasos(5).Durante2002,msde30paseslatinoamericanos informaronmsde10,000,000casosdefiebredeldengue(FD)conuna grancantidaddecasosdeFHD.Enlosterritoriosestadounidensesde PuertoRicoylasIslasVrgenesdelosEstadosUnidos,loscasosde denguealcanzaronniveleshistricamentealtosen2010.EnPuertoRico, seinformaron21,000casosen2010.Tambinen2010,Floridainform 65casosautctonosdedengueyunestudioserolgicoenKeyWest, Florida,mostrunatasadeinfeccindel5%.(6)TambinenHawi(7)y Laredo,Texas,sehanconstatadobrotesepidmicosdedengue. Durantelaprimeraysegundainfeccinseproducentransitoriamente anticuerposIgMcontraelvirusdeldengue.Enpacientesconuna primerainfeccinporelvirusdeldengue,losanticuerposIgMse desarrollanconrapidezysepuedendetectarenlosdas3a5dela enfermedadenlamitaddelospacienteshospitalizados.Losnivelesde IgMcontraelvirusdeldenguealcanzansumximoaproximadamentea las2semanasdelainfeccinydesciendenhastanivelesindetectables entrelos2y3meses(8.9). DDMS1IVDDengueDetectIgMCaptureELISA N.depieza900108

MATERIALSUMINISTRADO
ElkitdeDENVDetectIgMCaptureELISAcontienereactivos suficientesparaunaplacade96pocillos(tirasde12x8)cadauna.El kitcontienelosreactivossiguientes: MaterialesespecficosparaDENVDetectIgMCaptureELISA: 1. TirasdemicrotitulacinrecubiertasparaIgMhumana: soportedetirasenbolsashermticascon96pocillos microtituladosdepolietilenorecubiertosconanticuerpos IgMantihumanosdecabraencadapocillo.Estableentre 2Cy8Chastalafechadevencimiento. 2. SolucinamortiguadoradedilucindelamuestraDENV: unfrascode25mllistoparausar.Solucinamortiguadora trisHCl(pH7.2a7.6)conTween20(0.05%),conservante (proclin300al0.05%)yaditivos.Parausarenladilucin delasmuestrasdepruebayloscontrolespositivoy negativo.Estableentre2Cy8Chastalafechade vencimiento. 3. ControlnegativodeIgMcontraeldengue:unvialde 50l.Sueronegativo.Elcontrolnegativoayudara controlarlaintegridaddelkit.Estableentre2Cy8C hastalafechadevencimiento.

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ControlpositivodeIgMcontraeldengue:unvialde50l. Sueropositivoquecontieneproclin300al0.05%.El controlpositivoayudaracontrolarlaintegridaddelkit. Estableentre2Cy8Chastalafechadevencimiento. 5. Antgenorecombinantedeldenguelistoparausarpara IgM:unfrascode3mllistoparausar.Solucin amortiguadoratrisHCl(pH7.2a7.6)conTween 20(<0.05%),conservante(proclin300<0.05%), antibiticos(sulfatoG418entreel0.0025%yel0.004%), antgenosrecombinantesdeldengueyaditivos.Estable entre2Cy8Chastalafechadevencimiento. 6. Antgenodeclulasnormales(NCA)listoparausarpara IgMcontraeldengue:unfrascode3mllistoparausar. SolucinamortiguadoratrisHCl(pH7.2a7.6)conTween 20(<0.05%),conservante(proclin300<0.05%)y sobrenadantedecultivodeclulasCOS1.Estableentre 2Cy8Chastalafechadevencimiento. 7. ConjugadoenzimticoHRPlistoparausarparaIgM contraeldengue: Unfrascode6mllistoparausarquecontieneanticuerpos monoclonalesreactivosdeflavivirus(mAb)conjugados conperoxidasaderbanoensolucinamortiguadoratris citrato(pH7.2a7.6)conTween20(<0.05%),conservante (timerosalal<0.01%)yaditivos.Estableentre2Cy8C hastalafechadevencimiento. Nota:elconjugadosedebealmacenarsiempreenel frascoqueseentrega,protegidodelaluz. 8. Solucinamortiguadoradelavado10X:unfrascode 120ml.Concentrado10Xdesolucinamortiguadorade salinadefosfatoconTween20(pH6.8a7.0).Estable entre2Cy8Chastalafechadevencimiento. 9. EnWash:unfrascode20mllistoparausar.Solucin amortiguadoradesalinadefosfatoconTween20 (pH7.2a7.6).Estableentre2Cy8Chastalafechade vencimiento. 10. SustratolquidodeTMB:unfrascode9mllistoparausar. Contienetetrametilbencidina3,3,5,5(TMB)yperxido dehidrgenoenunasolucinamortiguadoradecitratoy cidoctrico(pH3.3a3.8).Estableentre2Cy8Chasta lafechadevencimiento. Nota:elsustratosedebealmacenarsiempreenelfrasco queseentrega,protegidodelaluz. 11. Solucindecorte:unfrascode6mldecidosulfrico 1Nlistoparusar.Seusaparadetenerlareaccin.Estable entre2Cy8Chastalafechadevencimiento. Advertencia:cidofuerte,usarguantesprotectores,mscaray lentesdeseguridad.Desechartodoslosmaterialesdeacuerdocon lasnormasylosreglamentosdeseguridad.

4.

Parafilm Temporizador Agitadorvrtex

ADVERTENCIASYPRECAUCIONES
PARAUSOENDIAGNSTICOINVITRO.Senecesitacomprender completamenteelprospectodelenvaseparausarcorrectamenteel producto.Soloseobtendrnresultadosconfiablessiseemplean tcnicasprecisasdelaboratorioysisesigueelprospectoconatencin. Precaucionesdeseguridad:

Todoslosmaterialesdeorigenhumanoqueseempleanenla preparacindeloscontroleshansidoinactivadosporcaloro hanarrojadoresultadosnegativosparaanticuerposdeVIH 1y2,hepatitisCyelantgenodesuperficiedelvirusdela hepatitisB.Noobstante,ningnmtododepruebapuede garantizarun100%deefectividad.Porlotanto,todoslos antgenosycontroleshumanossedebentratarcomomaterial potencialmenteinfeccioso.LosCDCylosInstitutosNacionales deSalud(INS)recomiendanquelosagentespotencialmente infecciosossetratenconniveldebioseguridad2. Useropaylentesdeproteccinyguantesdesechablesdurante elensayo.Lvesebienlasmanosalterminar. Nocoma,beba,fumenisemaquilleenellugardondese manipulenlosmaterialesdeinmunodiagnstico.

Nouselabocaparalamanipulacindelaspipetas. Precaucionestcnicas. Estapruebasolosedeberealizarensuero.Nosehavalidadoel usodesangreentera,plasmauotrasmatricesdemuestra. Nomezcledistintoslotesdeningncomponentedelkitenun mismoensayo. Noinactiveporcalorlossuerosdeprueba. Todoslosreactivossedebenequilibraratemperatura ambiente(20Ca25C)antesdecomenzarelensayo.El ensayoseverafectadoporloscambiosdetemperatura. Evitecongelarydescongelarrepetidasveceslasmuestrasde sueroquevaaevaluar. Dispenselosreactivosdirectamentedesdelosfrascosmediante puntasdepipetalimpias.Durantelatransferenciadereactivos sepuedeproducircontaminacin. Losmicropocillossinusarsedebensellardeinmediatoyalmacenar enpresenciadedesecante.Delocontrario,sepuedenobtener resultadoserrneosenestosmicropocillossinusar. Nouseningncomponenteunaveztranscurridalafechade vencimientoqueapareceenlaetiqueta. Evitelaexposicindelosreactivosalcalorexcesivooalaluz solardirectaduranteelalmacenamientoylaincubacin. Algunosreactivospuedenformarunprecipitadoligero, mzclelossuavementeantesdeusar. Unlavadoincompletoafectarnegativamenteelresultadoyel rendimientodelensayo.

MATERIALESYEQUIPOSNECESARIOSPEROQUENOSE SUMINISTRAN
EspectrofotmetroELISAcapazdemedicionesdeabsorbencia a450nm Aguabiolgicaodealtogrado Bombadevaco Lavadoradeplacas Incubadoraa37CsinsuministrodeCO2. Pipetasde1a10ldeuncanal,pipetasde50a200ldeuno yvarioscanales Tubosdepolipropileno

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Paraminimizarlaposibledesviacindelensayodebidoauna variacineneltiempodeincubacindelsustrato,procure agregarlasolucindecorteenlospocillosenelmismoordeny alamismavelocidadqueagreglasolucindeTMB. Evitelacontaminacinmicrobianadelosreactivos,enespecial enelcasodelconjugadoenzimticoHRPlistoparausarpara IgMcontraeldengue.Evitelacontaminacindelasolucinde sustratodeTMBconelconjugadoenzimticoHRP. Useunapuntadepipetalimpiaydesechableparacada reactivo,estndar,controlomuestra.

PROCEDIMIENTODEPRUEBA
PRECAUCIN:debeseguirestrictamenteelprocedimientodeprueba. Todadesviacindelprocedimientopuedearrojarresultadoserrneos. Dejequetodoslosreactivosdelkitylasmuestrasalcancenla temperaturaambiente(~25C)antesdeusarlos.Inviertasuavemente losreactivosylasmuestrasantesdeusarlosparamezclarlospor completo.NOTA:encasodealmacenamientoalargoplazo,las muestrasdesueronosedebencongelarydescongelarmsdetres veces.Adems,lossuerossedebendividirproporcionalmenteen volmenesmenoresyalmacenara20C. Preparacindelosreactivos: Preparacindelasolucinamortiguadoradelavado1X: Diluyalasolucinamortiguadoradelavado10Xa1Xconagua biolgicaodealtogrado.Paraprepararunasolucin amortiguadoradelavado1X,mezcle120mldesolucin amortiguadoradelavado10Xcon1080mldeaguadestilada (odesionizada)yenjuagueloscristalesrestantes.Agitehasta queestbienmezcladoytodosloscristalessehayandisuelto. Trasladilucina1X,almaceneatemperaturaambientehasta unperodode6meses.Compruebelacontaminacinantesde usar.Desechelasolucinsisospechaqueestcontaminada. Pocillosdelatirademicrotitulacin: Seleccioneelnmerodepocillosrecubiertosnecesariosparael ensayo.Debevolveracolocarrpidamentelospocillos restantesenlabolsa,sellarlayalmacenarlaentre2Cy8C hastaqueestnlistosparausarohastaelvencimiento. Procedimientodelensayo: 1. Loscontrolespositivoynegativosedebenanalizarenduplicado tantoenelcasodeldenguecomodelNCA.Lasmuestras desconocidasdesueroquesevanausarparalapruebasedeben analizarindividualmenteoenduplicadotantoparaenelcasodel DENRAcomodelNCA.Consulteeldiagramadeflujoalfinaldeesta seccinparaconocerunejemplodeesteprocedimiento.Se puedenprobar44muestrasenunaplacade96pocillos. 2. Marquelastirasdemicrotitulacinquevaaemplear. 3. Diluyalossuerosdepruebayloscontroleshasta1/100medianteel diluyenteparamuestrasquesesuministra.Uselospequeostubos depolipropilenoparalasdilucionesyalmenos4ldesuerosy controlespositivoynegativo.Porejemplo,mezcle4ldela muestradesueroy396ldesolucinamortiguadoradedilucin delamuestradeDENVparalograrunadilucin1/100. 4. Aplique50lporpocillodelossuerosdepruebadiluidos 1/100,controlnegativodeIgMcontraeldengueycontrol positivodeIgMcontraeldenguealaplacamedianteuna pipetadeunoovarioscanales,segncorresponda.Enel diagramaEjemplodeaplicacindelamuestradesueroal finaldelprospectosemuestraunejemplodeladisposicinde las44muestrasdesuerodeprueba.Nota:todaslasmuestras desuerosedebenprobarconDENRAyNCA. 5. Cubralaplacaconparafilmsoloenlasuperficiedelaapertura delpocillo,demodoquelaparteinferiordelasplacasno quedecubierta. Nota:elobjetivoesgarantizarunadistribucinuniformedela temperaturaentodoslospocillosdesdelaparteinferiorylos lados;elparafilmenexcesosepuedecortarunavezquela partesuperiorestselladaparaasevitarlaevaporacin.

Cubraelreadetrabajoconpapelabsorbentedesechable. ADVERTENCIA:MATERIALCONPOSIBLERIESGOBIOLGICO Estekitcontienereactivosfabricadosapartirdesuerooplasma humanos.Elsuerooelplasmausadossehaninactivadoporcalor, amenosquesedeclarelocontrario.Manipuletodoslossuerosykits empleadoscomosicontuvieranagentesinfecciosos.Cumplaconlas precaucionesestablecidasfrentealosriesgosmicrobiolgicosal realizartodoslosprocedimientosysigalosprocedimientos habitualesparadesecharcorrectamentelasmuestras. RIESGOQUMICO: Todosloscomponentesdeestekitcuentanconunahojadedatos deseguridaddelosmateriales(MSDS).RevisetodaslasMSDS correspondientesantesderealizaresteensayo.Evitetodocontacto entrelasmanosylosojosolamucosadurantelaprueba.Encasode producirsecontacto,consultelaMSDScorrespondientepara conocereltratamientoadecuado.

OBTENCINYPREPARACINDEMUESTRAS
Solosedebeusarsueroparaesteensayo,yestedebecumplir conlasprecaucioneshabitualescorrespondientesalapuncin venosa.Lasangrequeseobtengamediantepuncinvenosase debedejarcoagularatemperaturaambiente(20Ca25C) durante30a60minutosyluegosedebecentrifugarde acuerdoconelInstitutodeEstndaresClnicosydeLaboratorio (CLSIApprovedGuidelineProceduresfortheHandlingand ProcessingofBloodSpecimens;SecondEdition. H18A2ISBN1562383884). Lapruebasedeberealizarloantesposibledespusdela puncin.Nodejelossuerosatemperaturaambientedurante perodosprolongados.Elsueroseparadosedebemantener entre20Cy25Cpornomsde8horas.Sinocompletalos ensayosdentrodelas8horas,elsuerosedeberefrigerarentre 2Cy8C.Sinocompletalosensayosdentrodelas48horaso sidebealmacenarelsueroseparadomsalldelas48horas,el suerosedebecongelara20Comenos. Evitecongelarydescongelarrepetidamentelasmuestras,ya queestoprovocarundeteriorodelanalito.Loscongeladores defroseconosonaptosparaalmacenarlasmuestras. Lasmuestrascongeladassedebendescongelaratemperatura ambienteymezclarporcompletoagitandosuavementeomediante inversinantesdeusar.Centrifuguesiempreantesdeusar. Sivaatransportarlossueros,sedebenembalarde conformidadconlasregulacionesfederalesrelativasal transportedeagentesinfecciosos. Noutilicesuerossiseobservanindiciosdecrecimiento microbiano.

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mediantepipetasdevarioscanales.

17. Dejeincubarlaplacaatemperaturaambientedurante5minutos
sinningnrecubrimiento.

18. Traslaincubacin,lavelasplacas6vecesconunalavadora 19. 20. 21.

automticadeplacasyunasolucinamortiguadoradelavado 1X.Use300lporpocilloencadaciclo. Agregue75lporpocillodesustratolquidodeTMBentodos lospocillosmediantepipetasdevarioscanales. Dejeincubarlaplacaatemperaturaambiente(20Ca25C)en unlugar(orecipiente)oscurodurante10minutos sinningn recubrimiento. Despusdelaincubacin,agregue50lporpocillodesolucinde corteentodoslospocillosmediantepipetasdevarioscanalesy dejeincubaratemperaturaambientedurante1minutosincubrir laplaca. Despusdelaincubacin,leaelvalorOD450nm(densidadptica a450nm)SINPROCESARconunalectorademicroplacas. AsegresedequelalectorademicroplacasNOresteninormalice losdatosencasodevaloresenblancoopocillosvacos.

6.

Dejeincubarlaplacaa37Cdurante1horaenunaincubadora. Nota:noapilelasplacasunaencimadelaotra.Sedeben colocarcomounasolacapa.Estoesmuyimportantepara lograrunadistribucinuniformedelatemperatura.Nouse incubadorasdeCO2nideningnotrogas.Nocoloquelasplacas encontactoconningunasustanciahmeda,comotoallasde papelhmedas,etc.

22.

MTODOCORRECTO 7. Traslaincubacin,lavelasplacas6vecesconunalavadora automticadeplacasyunasolucinamortiguadoradelavado 1X.Use300lporpocilloencadaciclo. 8. Agregue50lporpocillodeDENRAenlasfilasAaDy50lpor pocillodeNCAenlasfilasEaHmediantepipetasdevarioscanales. Alfinaldelprospectosemuestraunejemplodeaplicacinde DENRAyNCA. 9. Cubralaplacaconparafilmsoloenlasuperficiedelaaperturadelpocillo. Laparteinferiordelaplacanodebequedarcubierta(veaelpaso5). 10. Dejeincubarlaplacaa37Cdurante1horaenunaincubadora (veaelpaso6). 11. Traslaincubacin,lavelasplacas6vecesconunalavadora automticadeplacasyunasolucinamortiguadoradelavado 1X.Use300lporpocilloencadaciclo. 12. Agregue50lporpocillodeconjugadoenzimticoHRPlistopara usarentodoslospocillosmediantepipetasdevarioscanales. 13. Cubralaplacaconparafilmsoloenlasuperficiedelaaperturadel pocillo.Laparteinferiordelaplacanodebequedarcubierta (veaelpaso5). 14. Dejeincubarlaplacaa37Cdurante1horaenunaincubadora (veaelpaso6). 15. Traslaincubacin,lavelasplacas6vecesconunalavadora automticadeplacasyunasolucinamortiguadoradelavado 1X.Use300lporpocilloencadaciclo. 16. Agregue150lporpocillodeEnWashentodoslospocillos DDMS1IVDDengueDetectIgMCaptureELISA N.depieza900108 Pgina4de16

DiagramadeflujodelprocedimientodeDENVDetectIgM CaptureELISA:

Placarecubiertaybloqueada deIgMantihumanadecabra

CONTROLDECALIDAD

Cadakitcontienesuerosdecontrolpositivoynegativo.Los controlespositivoynegativosedebenanalizarencadaplacade prueba.Losvaloresaceptablesdelndicedeestadoinmune(ISR)de estoscontrolesseencuentranenlatabladeespecificacionesa continuacin.Elobjetivodeloscontrolesnegativoypositivoes controlarunerrorsustancialenelreactivo.Elcontrolpositivono garantizarlaprecisindelcortedelensayo.Lapruebanoser vlidaysedeberrepetirsialgunodeloscontrolesnocumplecon lasespecificaciones.Silapruebanoesvlida,losresultadosdelos pacientesnosepuedenusarconfinesinformativos.Debecumplir conlosrequisitosdecontroldecalidaddeconformidadconlas normaslocales,estatalesy/ofederalesolosrequisitosde acreditacinylosprocedimientoshabitualesdecontroldecalidad delpropiolaboratorio.SerecomiendaqueelusuarioconsulteCLSI C24Ay42CFR493.1256paraconocerloslineamientosacercade lasprcticasapropiadasdecontroldecalidad. Losresultadosacontinuacintienennicamentefinesinformativos. Elanlisisseaplicacuandoseusanlecturasespectrofotomtricassin procesarnicamenteycuandonoseempleelarestaautomticade losdatosenblancodelaguaylosreactivos. Clculodelcontrolnegativo:calculelosvalorespromediodel controlnegativodeIgMcontraeldengueconDENRAyelantgeno (NCA)decontrol: Ejemplo1:ControlnegativodeIgMcontraeldengue Densidadptica DENRA NCA Rplica1 0.108 0.066 Rplica2 0.082 0.061 Suma 0.190 0.127 Promedio(DENRA)=0.1902=0.095 Promedio(NCA)=0.1272=0.064 CalcularelndiceDENRA/NCA(ISR):0.0950.064=1.48 TodondiceDENRA/NCAdelcontrolnegativocontraeldenguesuperior a1.65indicaquesedeberepetirelprocedimientodelaprueba. Clculodelcontrolpositivo:CalcularlosvaloresdelControlpositivo deIgMcontraeldengueconDENRAyconNCA. Ejemplo2:ControlpositivodeIgMcontraeldengue Densidadptica DENRA NCA Rplica1 0.635 0.105 Rplica2 0.655 0.115 Suma 1.290 0.220 Promedio(DENRA)=1.2902=0.645 Promedio(NCA)=0.2202=0.110 CalcularelndiceDENRA/NCA(ISR):0.6450.110=5.86

Agregaralasplacas50l/pocillo decontrolnegativo,control positivoysuerosdepruebade pacientes,todosdiluidos1/100 (enladilucindelamuestra)

Dejarincubarlaplacaa 37Cdurante1horay lavarlaplaca6veces con300l/pocillo Aplicarenlaplaca50 l/pocillodeDENRAyNCA listosparausar Dejarincubarlaplacaa 37oCdurante1horay lavarlaplaca6veces con300l/pocillo Aplicarenlaplaca50l/pocillo deconjugadoenzimticoHRP listoparausar

Dejarincubarlaplacaa 37Cdurante1horay lavarlaplaca6veces con300l/pocillo Agregaralaplaca150lde EnWash

Dejarincubarlaplacaa temperaturaambiente durante5minutosy lavarlaplaca6veces con300l/pocillo Agregaralaplaca75l/pocillo desustratolquidodeTMB

Dejarincubarlaplacaa temperaturaambiente (20Ca25C)enun lugaroscurodurante 10minutos. Agregaralaplaca50l/pocillo desolucindecorte

Dejarincubarlaplacaa temperaturaambiente durante1minuto

LeerelvalorOD450SINPROCESAR enlalectoradeplacas. Norestarlaslecturasdefondo.

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TodondiceDENRA/NCAdelcontrolpositivodeIgMcontrael dengueinferiora5.0indicaquesedeberepetirelprocedimientode laprueba. Sedebenobtenerlosvaloresdelatabla1quesemuestraa continuacinparapublicarlosresultadosdelanlisis.Elincumplimiento deestoscriteriosesunindiciodeldeteriorodelosreactivosodeun errorenelprocedimientodelapruebaydeberepetirseelanlisis. Tabla1 Factor(paraverificacindelensayo) MediadeladensidadpticadelControl negativocontraeldengueenDENRA MediadeladensidadpticadelControl positivodeIgMcontraeldengueenDENRA ndicedeestadoinmune(ISR)delControl positivodeIgMcontraeldengue ndicedeestadoinmune(ISR)delControl negativocontraeldengue Tolerancia <0.300

INTERPRETACINDERESULTADOS
Enlatabla2queapareceacontinuacinseindicacmodeben interpretarselosresultados. Tabla2

ISR

Resultado

Interpretacin
NosedetectaelanticuerpoIgM,alparecerla personanoestinfectadaconelvirusdel dengue.Elresultadonodescartalainfeccin delvirusdeldengue.Sedeberaanalizarotra muestraenlosprximos7a14dassise sospechainfeccinenestadoincipiente.Se recomiendarealizarotrosanlisisdelvirusdel denguecomolaspruebasDengueNS1,PCRo cultivosparadescartarunainfeccinagudaen estadoincipiente. Lasmuestrascuyosresultadossondudosos debenrepetirseporduplicadoydebe determinarseelvalorpromediodelISR.Las muestrascuyosresultadossiguensiendo ambiguosdespusdelarepeticindelaprueba debensealarquenosepudodeterminarla presenciadelanticuerpoIgMcontraelvirusdel dengue,ydebenrepetirseconunmtodo alternativoosedebeobtenerotramuestra. SedetectlapresenciadeanticuerpoIgM, presuntainfeccinconelvirusdeldengue.El resultadodebeconfirmarsemediantela pruebadeneutralizacinporreduccinde placas(PRNT)orecurriendoalasltimas pautasdediagnsticodelosCDCparaesta enfermedad.EsposiblequeunresultadoIgM positivonoindiqueunainfeccinrecienteya queelIgMpuedepersistirdurantevarios mesestraslainfeccin.

<1.65 >0.350 >5.000 <1.650

Negativo

CLCULOSDEANLISISDEMUESTRASDESCONOCIDAS
Clculodendicedeestadoinmune(ISR):silasmuestrasdesconocidas seanalizanporduplicado,calcularelpromediodelasdosrplicasconel DENRAyconelNCAy,acontinuacin,calcularelndiceDENRA/NCA (ISR)dividiendoelpromediodedensidadpticadelDENRAporlos valoresdedensidadpticadelNCA.Silasmuestrasdesconocidasse analizanporseparado,dividirelvalordedensidadpticadelDENRApor eldelNCA. Seleccindelvalordecorteydeterminacindelintervalode resultadosdudosos:seemplearoncientonuevemuestrasdesuero positivasverdaderasy97negativasverdaderasparadeterminarelvalor decorteptimodelISRyparaestablecerelintervaloderesultados dudosos.Todaslaspruebasserealizarondeacuerdoconelprospecto. SeutilizelanlisisdedosgrficosROCparadeterminarelpuntode corteptimodelosvaloresdelISR,dndoleigualponderacinala sensibilidadyalaespecificidad.ElvalorptimodecortedeISRhallado fue1.87.Seestableciunintervaloderesultadosdudososyse determinarondosumbrales.LosvaloresdelISR2.84determinaronla positividaddelaprueba,loscualescorrespondieronaunaespecificidad del99%delapruebayaunasensibilidaddel91%.Losvaloresdel ISR1.65determinaronlanegatividaddelaprueba,loscuales correspondieronaunasensibilidaddel96%delapruebayauna especificidaddel94%.Losvaloresentre 1.65y2.84seconsideranambiguos.

1.652.84

Ambiguo

>2.84

Positivo

LIMITACIONES
Lasmuestrasreactivasdebenconfirmarsemediantela pruebadeneutralizacinporreduccindeplacas(PRNT)o recurriendoalasltimaspautasdediagnsticodelosCDC paraestaenfermedad.Consultelainformacinms recientesobrediagnsticosenelsitiowebdelosCDC: http://www.cdc.gov/dengue/clinicalLab/laboratory.html. Dadoquesteesunensayoprovisional,debetenerseen cuentalapresenciadeposiblesresultadosfalsospositivos ofalsosnegativos. Esmuycomnlareactividadcruzadaserolgicaenel grupodeflavivirus.Elsuerodeciertospacientes infectadosconelvirusdelaencefalitisjaponesa,delNilo Occidentaly/odeSaintLouispuedencausarresultados falsospositivos.Porlotanto,todosuerocuyoresultado seadenguepositivodebeconfirmarseconotraspruebas. LareactividadcruzadaconIgMcontralamalarianoseha analizadoconDENVDetectIgMCaptureELISA. Noseestablecieronlascaractersticasderealizacindel ensayoparaladeterminacinvisualdelosresultados.

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Noseestablecieronlascaractersticasderealizacindel ensayoparaotrasmatricesdiferentesalsuero. Losresultadosdepacientesconinmunodeficienciadeben interpretarseconcuidado. Losresultadosdelensayodebeninterpretarse exclusivamenteenelcontextodeotroshallazgosdel laboratorioyelestadoclnicoglobaldelpaciente. Losnivelesaltosdecolesterol(>300mg/dL)parecendar resultadosvariablesypuedenafectarlosvaloresde densidadpticadelDENRA.

Losnivelesaltosdetriglicridos(>3000mg/dL)parecen causarunpequeoaumentoenlosISRdelossueros positivosbajos. Lahemoglobina(>1600mg/dL)parecedisminuirlosISR deciertasmuestrasdesuero.

VALORESESPERADOS
Poblacinendmica LapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAsellevacaboenunaclnicaenunpasendmicodeSudamricaenelao2009paraanalizar prospectivamentemuestrasdesuerodepersonasquepresentabansntomassimilaresalosdelainfeccindeldengue.Seexaminaron sesentayseispersonasenlaconsultadelaaparicindelafiebre.Lasmuestrascomprendaninfeccionesprimariasysecundarias.Enlas tablas3y4queaparecenacontinuacinseresumelareactividaddelasmuestrasconlapruebaDENVDetectIgMCaptureELISA. Tabla3:Resultadosesperadosdereginendmicadepacientessintomticos

Edad(aos) 1020 2130 3140 4150 5160 6170 7180

Cantidadde hombres 3 5 6 7 2 2 1

Cantidad demujeres 10 7 14 6 3 0 0

ResultadosdelapruebaDENVDetectIgMCapturea Noreactivos 12 8 13 9 3 2 1 Ambiguo 0 1 2 2 0 0 0 Reactivos 1 3 5 2 2 0 0 13 Prevalencia 7.7% 25% 25% 15.4% 40% 0% 0%

Total 26 40 5 19.7% 48 a:todaslasmuestrasreactivasseconfirmaronconlapruebadePRNT. Poblacinnoendmica Lasmuestrasdesuero(n=200)depersonasquenopresentabansntomasseobtuvieronenFlorida,TexasyPennsylvaniaenmarzode 2004.Lasmuestrasrepresentanunavariedaddeedades,tantodehombrescomomujeres.Lareactividaddelasmuestrasdesueroque seexaminaronseresumeacontinuacinenlatabla4.

Tabla4:Resultadosesperadosdereginnoendmicadepersonasquenopresentabansntomas Edad (aos) 1020 2130 3140 4150 5160 Total Cantidadde hombres 5 38 27 23 5 98 Cantidadde mujeres 13 30 38 20 1 102 ResultadosdelapruebaDENVDetectIgMCapture Noreactivos 18 68 64 42 6 198 Ambiguo 0 0 1 0 0 1 Reactivos 0 0 0 1 0 1
a

0.0% 0.0% 0.0% 2.3% 0.0% 0.5%

Prevalencia

a:estamuestraarrojunresultadopositivodedengueconlapruebaPRNT.

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CARACTERSTICASDEREALIZACIN

EstudiodegrupodelaOMS SecreungrupodemuestrasdereferenciaconcaractersticasdeterminadasenunproyectoencomndelFondoInternacionaldelas NacionesUnidasparaEmergenciasdelaInfancia,elProgramadelasNacionesUnidasparaelDesarrollo,elBancoMundial,elPrograma EspecialdeInvestigacinyFormacinenEnfermedadesTropicalesdelaOrganizacinMundialdelaSaludylaIniciativadelaVacuna PeditricacontraelDengue.Elgrupodereferenciasecremedianteelestablecimientodeunareddesietelaboratoriosque contribuyeronconmuestrasdesueroyelanlisisdelasmismas(10). UnsubconjuntodelgrupodereferenciaestuvodisponibleparasuexamenmediantelapruebaInBiosDENVDetectIgMCaptureELISA. LosCDCdePuertoRicoanalizaronelgrupodemuestras;losresultadosobtenidosseofrecenacontinuacinenlatabla5. Tabla5 ReactividaddelasmuestrasdelgrupodereferenciadelaOMSconlaprueba InBiosDENVDetectIgMELISA Resultadode Resultadode laprueba Cantidad laprueba Categora Conteo Categora Conteo DENVDetect analizada DENVDetect IgMELISA IgMELISA Negativo 27 Negativo 1 IgMcontra Encefalitisde dengue 27 Ambiguo 0 Ambiguo 1 2 St.Louis(SLE) negativo Positivo 0 Positivo 0 Negativo 4 Negativo 9 IgMcontra IgGcontralaenfermedadde dengue 109 Ambiguo 5 Ambiguo 0 9 Lyme positivo Positivo 100 Positivo 0 Negativo 10 Negativo 10 IgGcontrael virusdelNilo 11 Factorreumatoide(FR) 10 Ambiguo 1 Ambiguo 0 Occidental Positivo 0 Positivo 0 Negativo 21 Negativo 2 IgMcontrael Ambiguo 2 Ambiguo 0 virusdelNilo 25 Lupuseritematososistmico 2 Occidental Positivo 2 Positivo 0 Negativo 3 Negativo 7 IgMcontrala IgMcontraelhantavirusdel Ambiguo 1 Ambiguo 0 fiebreamarilla 4 7 nuevomundo(HTN) (FA) Positivo 0 Positivo 0 Lacoincidenciadeporcentajepositivo(PPA)ylacoincidenciadeporcentajenegativo(NPA)estntabuladasconsiderando"elpeorde loscasos".Esdecir,lasmuestrascuyosresultadossonambiguosseconsideranfalsosnegativosparalaPPAyseconsideranfalsos positivosparalaNPA. Coincidenciadeporcentajepositivo:(100/109)91.7%(ICdel95%:84.995.8%). Coincidenciadeporcentajenegativo:(90/97)92.8%(ICdel95%:85.696.7%). Cantidad analizada

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Estudiosclnicos Sitiodelestudio1: Elpresenteestudioretrospectivoemplemuestrasarchivadasobtenidasdepersonasquepresentabanindiciosysntomasdelainfeccindel dengue.Lasmuestrasseobtuvieronapartirdeunafechaenadelantehastaquesellegalacantidadpredeterminadademuestrasreactivas.El estudioserealizconelsueroobtenidode197sujetosenunlaboratoriodereferenciaenelSudesteAsitico.Sedisponadedosextraccionesde muestras(totalde394muestrasobtenidasconentre1y2semanasdediferencia)ylaconfirmacindelvirusdeldengue(DENV)seevalu mediantedistintosmtodosenellaboratoriodereferencia.Eldiagnsticodefinitivodecadasujetoseefectuenellaboratoriodereferencia medianteunalgoritmodediagnstico(resultadodelapruebadeIgMvalidadoenplanta,y/oelresultadodelaPCR,y/ounaumentodela titulacindeIgG,y/ounaumentodecuatrovecesdelatitulacindelainhibicindelahemaglutinacin(HAI)entrelaextraccindesangreenla faseagudaylaconvaleciente).Seemplelapruebadecualquieraparaconfirmarundiagnsticopositivo. TodaslasmuestrasmencionadasseobtuvieronyanalizaronensecuenciaconelkitdeInBiosDENVDetectIgMCaptureELISA.Las coincidenciasdeporcentajepositivoynegativoconlosdiagnsticosdefinitivosdellaboratoriodereferenciaestntabuladasa continuacincomofuncindelacantidaddedasposterioresalcomienzodelafiebre. Tabla6 RealizacindelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAdelSitiodelestudio1 Cantidadde Cantidadde muestras con muestras con Dasposteriores Coincidencia de Coincidencia de resultados resultados alaaparicinde porcentaje positivo porcentaje negativo ambiguos con ambiguos con lafiebre diagnstico diagnstico definitivopositivo definitivonegativo 2a3das 28.6%(2/7) 100.0%(4/4 ) 1 0 4a5das 40.3%(27/67) 78.8%(26/33) 19 7 6a7das 75.9%(63/83) 88.6%(31/35) 14 3 8a10das 88.8%(71/80) 97.1%(33/34) 7 1 11a15das 91.7%(22/24) 100.0%(21/21) 2 0 16a19das 100.0%(5/5) 100.0%(1/1) 0 0 Lacoincidenciadeporcentajepositivo(PPA)ylacoincidenciadeporcentajenegativo(NPA)estntabuladasconsiderando"elpeordeloscasos".Es decir,lasmuestrascuyosresultadossonambiguosseconsideranfalsosnegativosparalaPPAyseconsideranfalsospositivosparalaNPA. Nota:elresumenpresentadocomparalosresultadosdelapruebadelensayoInBiosconlosdiagnsticosdefinitivosqueefectuel laboratoriodereferenciamediantelapruebadePCR,HAI,elaumentodelatitulacindeIgGylapruebadeIgMELISAenplanta. de130muestrasnosesometialapruebaPRNT. Sitiodelestudio2: Las130muestrasquenoseanalizaronconlapruebaPRNT Unestudioretrospectivoanalizenunlaboratoriodereferenciaal fueronexaminadasporCDCDengueMACELISAenlosCDCy oestedelosEstadosUnidos212muestrasarchivadasobtenidasen clasificadascomonegativas,ambiguas,inconclusasopositivas seriedepersonasquepresentabansntomasdelainfeccindel segnloestipuladoporelprotocoloCDCMACELISA.Trecede dengue.Lasmuestrasdelperodo20082009seobtuvieronapartir las muestrasanalizadasporCDCMACELISAseclasificaron deunafechaenadelantehastaquesellegalacantidad comoinconclusas(n=9)oambiguas(n=4)yluegofueron predeterminadademuestrasreactivas.Lamayoradelasmuestras sometidasalapruebaPRNTparacorroborarsuestado. pertenecaalCaribeylasregionesdelsurysurestedelosEstados Solamente3delas9(33.3%)muestrasinconclusasy2delas4 Unidos(TexasyFlorida);noobstante,unaminoradelasmuestras (50%)muestrasambiguasanalizadasconlapruebaPRNT tambinprovenadefricayAsia.Delas212muestrasanalizadas, resultaronpositivas. 116resultaronnegativas,67positivas.Veintinueveseincluyeron dentrodelintervaloderesultadosdudososyserepitilapruebade acuerdoconlasespecificacionesdelprospecto.Unavezrepetidala prueba,13muestrascuyosresultadoshabansidoambiguosse clasificaroncomonegativas,11obtuvieronresultadosdudosos nuevamentey5seclasificaroncomopositivas. Debidoalafaltadelvolumendemuestrasodeacceso,solose realizunapruebaPRNTconfirmatoriaen5delas11muestras dudosas(delascualesseconfirmaron3/5oel60%comoDENV positivas)yen70delas72muestraspositivas(delascualesse confirmaron62/70oel88.6%comoDENVpositivas).Untotal DDMS1IVDDengueDetectIgMCaptureELISA N.depieza900108 Pgina9de16

 Tabla7a ReactividaddelasmuestrasdelSitiodelestudio2Confirmadas mediantePRNT Resultado Positivo dela prueba Ambiguo DENV Detect Negativo IgM Capture Total ELISA DiagnsticosdefinitivosdePRNT DENV DENV Total positivos negativos (cantidadde (cantidadde (cantidadde muestras) muestras) muestras) 62 3 4 69 8 2 3 13 70 5 7 82

VIH,legionelosis,FMMRoenfermedaddeLyme).Todaslaspruebas ylosdiagnsticosseefectuaronenellaboratoriodesaludpblica. Todaslasmuestrasseobtuvierondepersonasdelmismoestadoen lapartenortedelOesteMedioendondenuncahubounaepidemia delvirusdeldengue.Porconsiguiente,sesuponequelasmuestras delvirusdeldenguenegativasestnbasadasenelhistorialde incidenciasdeldengueenestazonageneral (http://doh.sd.gov/ID/AnnualReport/19972007.pdf). Luegodelanlisisinicialylarepeticindelapruebadelas muestrasambiguas,215tuvieronresultadosnegativos, 22muestrasresultaronambiguasnuevamentey52positivas. Lasmuestrasquetuvieronresultadospositivosoambiguosen elanlisisinicialseincluyeronenlapruebaPRNT(74muestras). Seobservqueprcticamentetodalareactividadcruzadase debealvirusdelNiloOccidental.

Tabla8 Reactividaddelasmuestrasretrospectivasdereadedengue noendmica(Sitio3)enlosEE.UU. Diagnsticosdefinitivos DENV DENV negativos, negativos,sin con presenciade DENV presenciade otra PRNT otra a enfermedad positivos enfermedad (cantidadde (cantidadde muestras) muestras) Resultado Positivo 1 40b 11 dela prueba Ambiguo 0 16b 6 DENV Detect Negativo 100 115 0 IgM Capture Total 101 171 17 ELISA a:prcticamentetodaslasmuestrasdelapruebaDENVPRNTque tuvieronunresultadopositivorevelarontitulacionesbajasde PRNTyseidentificaroncomomuestrasdesueroconresultados positivosparaelvirusdelNiloOccidental,locualindicareactividad cruzadaconDENVPRNT(11). b:Nota:Todoslosfalsospositivosobservadosylagrancantidad demuestrasambiguassedebensolamentealareactividad cruzadaqueseobservenlasmuestrasqueresultaronpositivas paraelvirusdelNiloOccidental(vealaTabla9). Lasmuestraspuedensubdividirsesegnelestadodela enfermedaddelpaciente.Porejemplo,laspersonasque resultaronpositivasparaelvirusdeNiloOccidental(WNV)pueden presentarreactividadcruzadaconlapruebaDENVDetectIgM CaptureELISA.Enlassiguientestablassemuestranlosresultados delSitiodelestudio3.

Tabla7b ReactividaddelasmuestrasdelSitiodelestudio 2ConfirmadasmedianteCDCMACELISAa ResultadodelapruebaCDCMAC ELISAa DENV DENV Total positivos negativos (cantidad (cantidad (cantidad de de de muestras) muestras) muestras) Positivo Resultado delaprueba Ambiguo DENVDetect IgMCapture Negativo ELISA Total 1 1 4 6 1 5 118 124 2 6 122 130

a:13muestrasresultaroninconclusasoambiguasconCDC MACyseanalizaronconlapruebaPRNTparaclasificaren ltimainstanciasuestado.Lascoincidenciasdeporcentaje positivoynegativosecalcularonmediantelatabulacindelos resultadosdePRNT(Tabla7a)ydeCDCMACELISA(Tabla7b). Coincidenciadeporcentajepositivo:(63/75)84.0% (ICdel95%:73.990.8%). Coincidenciadeporcentajenegativo:(121/137)88.3% (ICdel96%:81.892.8%). EnlosclculosanterioresdelaTabla7b,lacoincidenciade porcentajesincorporalosdatosdelatabladePRNTydeCDC MACELISA.LasmuestrasambiguaseinconclusasdeCDCMAC ELISA(n=13)fueronclasificadasmediantePRNT. Sitiodelestudio3: LaespecificidaddelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAse analizenunlaboratoriodesaludpblicaubicadoenlapartenorte delOesteMediodelosEstadosUnidos.Elpresenteestudio retrospectivoemple289muestrasarchivadas(obtenidasenel perodo20052008)depersonasquepresentabansntomasyque padecanonootrasenfermedades(entreellos136pacientes estabaninfectadosconelvirusdelNiloOccidental,hepatitisA,BoC, DDMS1IVDDengueDetectIgMCaptureELISA N.depieza900108

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Tabla9 ReactividadcruzadadelapruebaDENVDetectIgMCapture ELISAmediantemuestrasdelSitiodelestudio3 Estadodelasmuestras WNVnegativos, WNV sinpresenciade positivos otraenfermedad (cantidadde (cantidadde muestras) muestras) Resultado Positivo 0 40 dela prueba Ambiguo 0 16 DENV Negativo 35 80 DetectIgM Capture Total 35 136 ELISA Coincidenciadeporcentajenegativodemuestrasenlasquenose detectenfermedad:(100/101)99.0%(ICdel95%:94.1100%). [VealaTabla8,arriba]. Coincidenciadeporcentajenegativodemuestrasconotras enfermedadesdiferentesalvirusdelNiloOccidental: (35/35)100%(ICdel95%:88.2100%). Coincidenciadeporcentajenegativodemuestrasenlasquese detectelvirusdelNiloOccidental:(80/136)58.8% (ICdel95%:50.466.7%). Ningunadelas35muestrasdelaspersonassinDENVperocon FMMR(n=5),legionelosis(n=2),enfermedaddeLyme(n=2), VIH(n=8),hepatitisA(n=2),hepatitisB(n=5)ohepatitisC (n=11)resultaronambiguasopositivasenlapruebaInBios DENVDetectIgMCaptureELISA. Delos136pacientessinDENVperoquehabancontradoelvirus delNiloOccidental,80muestrasresultaronnegativasparala pruebaDENVDetectIgMCaptureELISA,16seincluyerondentro delintervaloderesultadosdudososy40fueronpositivas. Sitiodelestudio4: LaespecificidaddelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAse analizenunDepartamentoEstataldeSaludubicadoenelsurdelos EstadosUnidosrecurriendoa199muestrasarchivadas(obtenidas duranteelperodo20042008)depersonasquepresentaban sntomasperoquesesuponaeranDENVnegativos.Lamayorade lospacientespresentabasntomasdedolordecabezayfiebre mientrasqueotrosmostrabansntomasneurolgicos.Enlaprueba inicial,183muestrasresultaronnegativas,10seincluyerondentro delintervaloderesultadosdudososdeacuerdoconlas especificacionesdelprospectoy6fueronpositivas.Unavezrepetida laprueba,las10muestrasdelintervaloderesultadosdudososse clasificaroncomonegativas. Las199muestrasseexaminaronademsenlosCDCconla pruebaCDCDengueIgM(MAC)ELISAparaclasificarlascomo denguenegativo,ambiguo,positivooquenopudieron interpretarse(antecedentesnoespecficosdemasiadoaltos). Debetenerseencuentaqueestasclasificacionessonlas clasificacionesdelosCDCparaelkit.Diecisismuestrasno pudieroninterpretarsesegnlapruebaCDCDengueIgM(MAC) ELISA,peroelanlisisPRNTlasconfirmcomonegativas.Las muestrasconsideradasnegativassemuestranenlasiguiente DDMS1IVDDengueDetectIgMCaptureELISA N.depieza900108

tabla.Unamuestratuvoresultadosdudososyotradiopositivo conlapruebaCDCDengueIgMELISA. Tabla10 Reactividaddelasmuestrasretrospectivasdereadedengue noendmica(Sitiodelestudio4) PruebaCDCDengueIgM(MAC)ELISA DENV DENV DENV ambiguos negativos positivos (cantidadde (cantidadde (cantidadde muestras) muestras) muestras) Positivo Resultado dela prueba Ambiguo DENV Detect Negativo IgM Capture ELISA Total 0 0 1 1 0 0 1 1 6 0 191 197

Coincidenciadeporcentajenegativo:(191/197)97.0% (ICdel95%:93.498.7%). Sitiodelestudio5: Enunestudioprospectivode55personasquepresentabansntomas (edadmedia:35.1aosmuestrasobtenidasenelao2009) realizadoenunareginendmicadedengueenSudamrica),se recolectaronmuestrasdecadaindividuoenlapresentacinascomo enlasegundavisitaentrelos4y14(media9)dasposteriores;ambas muestrasseanalizaronconlapruebaDENVDetectIgMCapture ELISA.Lasmuestrasdeambasvisitascuyosresultadosfueron dudosossevolvieronaanalizarconlapruebaDENVDetectIgM CaptureELISA.ElanlisisPRNTconfirmatorioserealizenlamuestra delaprimeraysegundavisitas.Seadvirtieroncambiosenlaprueba PRNTdeunaumentodecuatrovecesomsentrelasvisitas1y2,lo cualindicaunainfeccindedengueactual(12)en39personas.Se consideraquelasmuestrastienenunincrementodecuatrovecesen losnivelesdePRNTsilosvaloresdePRNTincrementande,por ejemplo,PRNT=10enlaprimeravisitaaPRNT=40enlasegunda visitaparaunsubtipodedenguedeterminado.Noseconsiderque lasmuestrasquerevelaronunvalordePRNT<10conunaumentode PRNT=10(n=4muestras)nicamentetuvieranunaumentode cuatroveces.

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Tabla11 Reactividaddelasmuestrasprospectivasdereaendmicade dengue(Sitio5)enlaprimeravisitaa Diagnsticosdefinitivos Ningn Infeccionesde indiciode dengue infecciones recientesb recientesde c (cantidadde dengue (cantidadde muestras) muestras) Resultado Positivo 13 0 dela prueba Ambiguo 4 1 DENV Negativo 22 15 DetectIgM Capture Total: 39 16 ELISA a:coincidenciadeporcentajepositivo:(13/39)33.3% (ICdel95%:20.649.1%). Coincidenciadeporcentajenegativo:(15/16)93.8% (ICdel95%:69.7100%). b: PRNT positivo y aumento a cuatro veces en PRNT entre la primeraylasegundavisita c: PRNT positivo y aumento < a4 veces en PRNT entre la primera ylasegundavisita

Tabla12 Reactividaddelasmuestrasprospectivasdereaendmicade dengue(Sitio5)enlasegundavisitaa Diagnsticosdefinitivos Ningnindicio Infeccionesde deinfecciones dengue recientesde b recientes c dengue (cantidadde (cantidadde muestras) muestras) Resultado Positivo 31 1 dela prueba Ambiguo 2 0 DENV Detect Negativo 6 15 IgM Capture Total 39 16 ELISA a:Coincidenciadeporcentajepositivo:(31/39)79.5% (ICdel95%:64.289.5%). Coincidenciadeporcentajenegativo:(15/16)93.8% (ICdel95%:69.7100%). b:PRNTpositivoyaumentoacuatrovecesenPRNTentre laprimeraylasegundavisita c:PRNTpositivoyaumento<a4vecesenPRNTentrela primeraylasegundavisita

Deberecordarseque,comoseindicaenelapartado Losresultadosdelasmuestrasdesuerodelasegundavisitadelos "Interpretacinderesultados",lasmuestrascuyosresultados pacientes(entre4y14dasmstarde)seofrecenenlassiguientes sonambiguosdebenrepetirseysometerseaunanlisis tablas.Comoseobservaclaramenteacontinuacin,lasensibilidad confirmatoriosisesiguenobteniendoresultadosdudosos. deanlisisaumentallegadoelmomentodelasegundavisita. Estudiodereproducibilidad:SeevalulareproducibilidaddelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAentressitiosymediantedos operadoresdiferentesencadasitiodurantecincodas.Todaslasmuestras(incluidosloscontroles)sellevaronacaboportriplicado.El estudioserealizenunlaboratoriodesaludpblicadeFlorida,enlasinstalacionesdeInBiosyenunlaboratoriodereferenciaubicado enlapartecentraldelosEE.UU.Seutilizaroncuatromuestrasdesueroquecontenanmuestrasdiluidasenunamatrizdeanalito negativojuntoconuncontrolpositivoyunonegativo.Lascuatromuestrasdesuero(sinincluirloscontrolespositivoynegativo)estaban compuestasdeunamuestranegativa,unasituadajustopordebajodelintervaloderesultadosdudosos,unadentrodeesteintervaloy unapositiva.Lasdilucionesdesueroseleccionadastambingarantizaronquelaconcentracindeanalitoenlasmuestrasrepresentaba unintervaloclnicamenterelevante.Losresultadossemuestranenlasiguientetabla.

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 IDdela muestra PanelA PanelB PanelC PanelD

n 90 90 90 90

Tabla13 ReproducibilidaddelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAdeInBios Intraensayo Operadora Daada Sitioasitio (duranteel operador Swr 0.148 0.245 0.621 1.18 %CVwr 13.06 15.41 25.52 20.28 SDD 0.056 0.187 0.668 2.014 %CVDD 4.96 11.79 27.46 34.59 SOO 0.066 0.182 0.522 1.072 %CVO 5.86 11.44 21.44 18.41 SSS 0.064 0.081 0.207 0.693 %CVSS 5.63 5.11 8.52 11.91 ST

Total %CVT 13.97 19.40 37.49 40.10 24.84 15.31

Media deISR 1.133 1.587 2.433 5.821

0.158 0.308 0.912 2.334

Control 90 11.944 1.692 14.17 2.437 20.40 2.085 17.46 1.546 12.94 2.967 positivo Control 90 1.148 0.152 13.25 0.088 7.67 0.064 5.61 0.051 4.47 0.176 negativo TodoslosvaloressecalculancomondicesdeDENRA/NCA Sx=desviacinestndardex(wroDD)wr:duranteelensayo,DD:daada,OO:entreoperadores,SS:entresitios

%CV:=%delcoeficientedevariacin Estudiodereactividadcruzada:SeexaminelensayoDENVDetectIgMCaptureELISAconunnmerodemuestrasdesueroque contenananticuerposIgMdevariasenfermedadesdiferentes(vealasiguientetabla).Inicialmente,lasmuestrasseanalizaronpor duplicado.Cualquiermuestraambiguaopositivaseanalizabaportriplicado.Lasmuestrasqueresultaronpositivasfueronevaluadaspara determinarlaexposicinalvirusdeldenguemediantelapruebadeneutralizacinporreduccindeplacas.Soloseobservuna reactividadcruzadasignificativaenelcasodelvirusdelNiloOccidental. Tabla14 ReactividadcruzadadelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISAdeInBios Dengue Enfermedadoagenteinfeccioso Nmerode muestras detectadoporELISA Ambiguo Encefalitisequinaoriental(EEE)a Encefalitisjaponesa(JE)a EncefalitisdeSaintLouis(SLE)a VirusdelahepatitisBa VirusdeEpsteinBarra Factorreumatoide VirusdelahepatitisCa Citomegalovirusa Anticuerposantinucleares(AAN)a Virusdelavaricelazstera 10 2 4 10 15 7 10 10 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Positivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 0/2 0/4 0/10 0/15 0/7 0/10 0/10 0/10 0/10 N.totalderesultados positivosoambiguos %deresultados positivoso ambiguos 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

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a EnfermedaddeLyme

5 11
a

0 0 4 4

0 0 8 8

0/5 0/11 12/24 12/128

0% 0% 50% 9.4%(12/128)

Leptospirosis

a,b

VirusdelNiloOccidental Total

24 112

a:lasmuestrasanalizadascontenananticuerposIgMespecficosdesurespectivoanalito.LareactividadcruzadaconanticuerposIgMde malarianosehaevaluadoconelensayodeIgMdedenguedeInBios. b:seanalizunamuestradeleptospirosisqueresultserreactivaconelensayodeIgMdedenguedeInBiosmediantePRNTyresult serpositivaenelensayoPRNT(noseincluyeenestatablayaqueseconsideraunamuestrapositivafiable). Elnmerototaldemuestrasanalizadasenrelacinalsuerodereactividadcruzadafuede128trasextraertressueros(unoWNVpositivo, unoJEVpositivoyunamuestradeleptospirosispositiva)quetambinresultaronpositivosparaelvirusdeldenguemediantePRNT.Doce muestraspositivasdeIgMdelvirusdelNiloOccidentalde24analizadasresultaronserpositivasoambiguastrasunnuevoanlisis mediantelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISA.ElporcentajegeneraldelareactividadcruzadaconelIgMdelvirusdelNilo Occidentalfuedel50%.

Estudiodeinterferencia:Seanalizaroncuatrosustanciasdeinterferenciapotencialquesuelenaparecerenelsueroparaobservarsu efectomediantelapruebaDENVDetectIgMCaptureELISA.Seutilizaronunamuestranegativaycuatromuestraspositivasdelvirusdel denguesegnsupotencia,deunpositivodbilaunoslido.Lascuatrosustanciasdeinterferenciapotencialfueronlabilirrubina (1y2mg/dL),lostriglicridos(500y3,000mg/dL),lahemoglobina(1,600y16,000mg/dL)yelcolesterol(300y500mg/dL).Labilirrubina nomostrningnefectosobrelosresultadosdelaprueba.Losnivelesaltosdetriglicridos(3,000mg/dL)mostraronunefectodbilpara aumentarelISRdelsueropositivobajo.LahemoglobinaafectaalgunasmuestrasdesueroaldisminuirelISRennivelesdehemoglobina altosyposiblementeennivelesdehemoglobinabajos.Elcolesteroldioresultadosvariablesapartirdeestudiosrepetidos.Porlotanto, solosepuedeafirmarqueesposiblequeelcolesterolafectelosvaloresDENRAdedensidadpticaenambosnivelesdecolesterol (300y500mg/dL).LatablaqueapareceacontinuacinmuestraelporcentajedecambioenelISRobservadodelasustanciade interferenciacuandosecomparaconlamuestradereferencia. Tabla15 PorcentajedecambiodelvalorISCDENRAenpresenciadesustanciasdeinterferencia

Control positivo Control negativo MuestraD MuestraE MuestraF ValorISRde control 20.84 1.18 14.40 6.36 0.94 Bilirrubina 1mg/dL 16.4% 1.0% 0.9% 25.1% 15.5% 2mg/dL 1.0% 4.8% 2.6% 8.4% 0.1% Triglicrido 500 3,000 mg/dL mg/dL 1.7% 0.4% 20.8% 19.4% 7.5% 9.8% 7.2% 31.6% 28.6% 12.9%
7.

Hemoglobina 1,600 16,000 mg/dL mg/dL 67.2% 1.3% 43.5% 59.8% 0.1% 80.6% 3.7% 62.6% 69.6% 12.2%

Colesterol 300 500 mg/dL mg/dL 21.8% 7.0% 10.8% 49.5% 4.0% 1.9% 29.4% 17.3% 5.1% 1.1%

REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. MonathTP.Flaviviruses.En:FieldsBN,etal.FieldsVirology,2. ed.Vol.1,NuevaYork:RavenPress,1990,763814. HenchalEA,PutnakJR.Thedengueviruses.ClinMicrobiolRev 1990;3(4):37696. EfflerPV,HalsteadSB.Immuneenhancementofviralinfection. ProgressinAllergy1982;31:30164. HalsteadSB.Neutralizationandantibodydependent enhancementofdengueviruses.AdvancesinVirusResearch 2003;60:42167. 5. 6. GublerDJ,Dengueanddenguehemorrhagicfever.ClinMicrobiol Rev1998;11(3):480496. TheDengueUpdate,CDC,Vol.3N.12011 9. 8. EfflerPV,PangL,KitsutaniP,VorndamV,NakataM,AyersT,ElmJ, TomT,ReiterP,RigauPerezJG,HayesJM,MillsK,NapierM,ClarkGG, GublerDJ;HawaiiDengueOutbreakInvestigationTeam.Dengue fever,Hawai,20012002.EmergInfectDis2005;11(5):7428. InnisBL,NisalakA,NimmannityaS,KusalerdchariyaS, ChongswasdiV,SuntayakornS,PuttisriP,HokeCH.Anenzyme linkedimmunosorbentassaytocharacterizedengueinfections wheredengueandJapaneseencephalitiscocirculate.AmJTrop MedHyg1989;40:418427. OrganizacinMundialdelaSalud.Denguehemorrhagicfever: diagnosis,treatment,preventionandcontrol,2ed.Organizacin MundialdelaSalud,Ginebra,Suiza1997. 10. HunspergerEA,YoksanS,BuchyP,NguyenVC,SekaranSD,Enria DA,etal.EvaluationofCommerciallyAvailableAntidengueVirus ImmunoglobulinMTests.EmergInfectDis2009;15:436440.

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InBiosInternational,Inc. 5621stAve.SouthSuite600 Seattle,WA98104EE.UU. N.gratuitoenEE.UU.1866INBIOS1 2063445821(Internacional) www.inbios.com N.dereferenciadelprospecto90010800 07.02.09 N.decatlogoDDMS1 CEpartner4U,Esdoornlaan13,3951DBMaarn. PasesBajos.Tel.:+31(0)6.516.536.26

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Ejemplo de aplicacin de la muestra de suero

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A
B

Control negativo Control negativo Control positivo Control positivo Control positivo Control positivo Control negativo Control negativo

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 4 Muestra 3 Muestra 2 Muestra 1

Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 8 Muestra 7 Muestra 6 Muestra 5

Muestra 9 Muestra 10 Muestra 11 Muestra 12 Muestra 12 Muestra 11 Muestra 10 Muestra 9

Muestra 13 Muestra 14 Muestra 15 Muestra 16 Muestra 16 Muestra 15 Muestra 14 Muestra 13

Muestra 17 Muestra 18 Muestra 19 Muestra 20 Muestra 20 Muestra 19 Muestra 18 Muestra 17

Muestra 21 Muestra 22 Muestra 23 Muestra 24 Muestra 24 Muestra 23 Muestra 22 Muestra 21

Muestra 25 Muestra 26 Muestra 27 Muestra 28 Muestra 28 Muestra 27 Muestra 26 Muestra 25

Muestra 29 Muestra 30 Muestra 31 Muestra 32 Muestra 32 Muestra 31 Muestra 30 Muestra 29

Muestra 33 Muestra 34 Muestra 35 Muestra 36 Muestra 36 Muestra 35 Muestra 34 Muestra 33

Muestra 37 Muestra 38 Muestra 39 Muestra 40 Muestra 40 Muestra 39 Muestra 38 Muestra 37

Muestra 41 Muestra 42 Muestra 43 Muestra 44 Muestra 44 Muestra 43 Muestra 42 Muestra 41

Ejemplo de la aplicacin del RA y del NCA del dengue
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

RA del dengue
B

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue RA del dengue

RA del dengue RA del dengue RA del dengue

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

NCA NCA NCA NCA

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