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PRCTICA No.

2: "Determinacin de los parmetros cinticos de la invertasa"

EQUIPO No. 3 Domnguez Pez Joel Guerrero Velzquez Yatzaret Mac Gregor Valds Ana Mara Montesinos Velzquez Jacob Morales Santamara Norma Anglica Vargas Gmez Stefany

UEA: Laboratorio integral de ingeniera bioqumica

PROFESOR: Anne Claire Texier

GRUPO: BJ58

OBJETIVO
Aprender la metodologa para la determinacin de los parmetros cinticos (km y Vmax) de la invertasa, determinando la velocidad de reaccin a diferentes concentraciones de sustrato.

INTRODUCCIN
La invertasa es tambin conocida como sacarasa; la cual desdobla la sacarosa en Fructosa y Glucosa, como todas las enzimas (la sacarosa es obtenida a partir de fuentes tan comunes e industrialmente importantes como la como la caa de azcar y la remolacha), la sacarasa o invertasa es utilizada para hidrolizar la sacarosa y polisacridos que presenten el mismo tipo de enlace (b-d-fructofuranosil), sin embargo uno de los mtodos ms importantes para conocer el mecanismo de una enzima, es mediante el estudio y caracterizacin de su cintica, es decir, el estudio de las velocidades de reaccin y la forma en que cambian en respuesta a cambios en los parmetros experimentales como la temperatura o la concentracin de sustrato. La cintica enzimtica es la rama de la enzimologa que trata de los factores, que afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente. Dos parmetros de suma importancia en el estudio de las reacciones catalizadas por enzimas son la velocidad mxima (Vmx) a la que una enzima es capaz de trabajar y la constante de afinidad (Km) que nos expresa precisamente la relacin de afinidad que tiene una enzima y su sustrato; para la los valores de Km de las enzimas varan ampliamente; para la mayora de las enzimas Km vara entre 10-1 y 10-6 M. El valor de Km para una enzima depende de cada sustrato particular y tambin de las condiciones ambientales como la temperatura y la fuerza inica, Km es la concentracin de sustrato a la cual la mitad de los centros activos estn ocupados, se relaciona con la constante de velocidad de las etapas individuales. Un km alta indica una unin dbil, un Km bajo indica una unin fuerte para indicar la afinidad del complejo ES. La Vmax revela adems el nmero de recambio de una enzima, si se conoce la concentracin de los centros activos. Los nmeros de recambio de la mayora de las enzimas para sustratos fisiolgicos oscilan entre 1 y 104 por segundo.

Figura 1 .Representacin de la velocidad inicial V0 de una reaccin de Michaelis-Menten sencilla frente a la concentracin de sustrato (s).

METODOLOGA

DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS DE LA INVERTASA

Preparar 200 mL de solucin de enzimtica de invertasa (0.1 g/L) en la solucin amortiguadora de acetatos.

Preparar soluciones de sacarosa (100 mL) en amortiguador de acetatos: concentraciones (g/L): 1, 5, 10, 20,30, 50, 60, 70 y 80.

Adicionar 1mL de la enzima preincubada y dejar reaccionar durante 15 min.

Incubar por duplicado a 55C, 5mL de cada concentracin de sacarosa durante 5 min.

Incubar 10 mL de la solucin de enzima en 3 tubos de ensaye durante 5min.

Pasado el tiempo colocar los tubos en hielo para detener la reaccin.

Realizar el mtodo de DNS para cuantificar azcares reductores con la curva patrn previamente realizada.

Realizar el mtodo de Bradford para cuantificar concentracin de protena soluble en tubo de invertasa incubado

Realizar las grficas correspondientes y aplicar 3 mtodos de regresin diferentes para determinar los parmetros cinticos.

RESULTADOS.
1. Resultados en las tablas 1, 2, 3. Az. Az. Az. Sacarosa Reduc. Reduc. Reduc. Hidrolizada (Sin (mg/L) (mmol/L) (mmol/L) diluir) S1 1 0.559 0.533 0.546 1:1 1119.6 1119.6 6.2200 3.1100 S2 5 0.239 0.231 0.235 1:5 497.6 2488 13.8222 6.9111 S3 10 0.128 0.148 0.138 1:10 303.6 3036 16.8666 8.4333 S4 20 0.083 0.053 0.068 1:20 163.6 3272 18.1777 9.0888 S5 30 0.044 0.036 0.04 1:30 107.6 2690 14.9444 7.4722 S6 50 0.016 0.016 0.016 1:50 59.6 2980 16.5555 8.2777 S7 70 0.012 0.012 0.012 1:50 51.6 2580 14.3333 7.1666 S8 80 0.007 0.007 0.007 1:50 41.6 2080 11.5555 5.7777 TABLA 1. Se muestra la produccin de azcares reductores en funcin de la concentracin de sacarosa a una temperatura de 55C. Sacarosa DO(nm) DO1 DO2 Promedio (nm) Dilucin

DO(nm) DO1 DO2 0.352 0.390

Promedio 0.371

Dilucin 1:1

[E] (mg/L) 12.2240

[E] por tubo (mg/L) 2.0374

TABLA 2. En esta tabla se puede observar el contenido de protenas solubles en la solucin de invertasa.

Vel. Hidrlisis S1 S2 S7 S8 (UIEI) (mmol sacarosa 0.1018 0.2261 0.2760 0.2974 0.2445 0.2709 0.2345 0.1891 hidrolizada/mg protena*min) Vel. Hidrlisis (UII) (mmol sacarosa 0.2073 0.4607 0.5622 0.6059 0.4981 0.5519 0.4778 0.3852 hidrolizada/L*min) Sustrato 106.36 47.27 28.84 15.54 8.52 5.66 3.50 2.47 consumido (%) TABLA 3. Esta tabla nos muestra la actividad especfica y volumtrica de la invertasa a diferentes concentraciones de sacarosa.

Concentracin de sustrato (mmol/L) S3 S4 S5 S6

DESARROLLO DE CLCULOS
Se toma un solo dato para ejemplificar cmo se realizaron los clculos de concentracin de azcares reductores y protena soluble. Con anterioridad se realizaron curvas patrn para mtodo de DNS y Bradford cuyas ecuaciones son: Para DNS se grafic densidad ptica (DO) contra concentracin de Azucares reductores (mg/L)

Mientras que para Bradford se grafic DO vs concentracin de protena soluble (mg/L)

Se sabe que el PMsacarosa=342g/mol y PMglucosa=180g/mol Despus de la reaccin en el tubo 1 con 1g/L de sacarosa se obtuvo un promedio de DO=0.546 Para determinar la concentracin de azcares reductores presente de la ecuacin de la curva patrn se despej x

Luego de esto se multiplica por el factor de dilucin que para este caso es 1, y para expresarlo en unidades de concentracin molar se tiene: ( )( )( )

En la reaccin en la que el sustrato es sacarosa en solucin acuosa con enzima invertasa por cada mol de sacarosa se obtienen 2 moles de azucares reductores (glucosa +fructosa) del mismo peso molecular. ( )

Para calcular UII se divide la concentracin de sacarosa hidrolizada entre el tiempo que se dej reaccionar (15min) y se obtiene:

De Bradford se realiz de manera similar al obtener la concentracin de protena soluble con DO=0.371

Como se coloc 1.0mL de sta en cada tubo y se llev a un volumen de 6.0 la dilucin queda 1:6 la concentracin es

Actividad enzimtica
Vel. Hidrlisis [mmol sacarosa hidrolizada/(mg protena* min)] 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 [Sacarosa] (mmol/L)

Grafica 1. Esta grfica nos muestra la actividad enzimtica independiente de la concentracin de invertasa, tomando la Velocidad de hidrlisis (UIEI) con respecto a la concentracin de sacarosa.

2. Calcular la Vmax y el Km por tres mtodos diferentes. MTODO 1. Lineweaver Burk. TABLA 1.1. La tabla muestra la sacarosa producida as como la Velocidad de hidrlisis (UIEI), y la propuesta de linealizacin de Lineweaver Burk (1/concentracin de sacarosa (S)) y (1/ Vel. Hidrlisis (UIEI) (V)). Vel. Hidrlisis (UIEI) [Sacarosa] (mmol sacarosa (mmol/L) hidrolizada/mg 1/(S) 1/V protena*min) 2.9240 0.1018 0.3420 9.8264 14.6199 0.2261 0.0684 4.4219 29.2398 0.2760 0.0342 3.6238 58.4795 0.2974 0.0171 3.3624 87.7193 0.2445 0.0114 4.0898 146.1988 0.2709 0.0068 3.6918

1/V ((mg Protena* min)/mmol sacH)

12 10 8 6 4 2 0 0

Lineweaver Burk

y = 18.794x + 3.3327 R = 0.9804

Grafica 1.1. Se grafica el inverso de la velocidad con respecto al inverso del sustrato.
0.1 0.2 0.3 0.4 1/[S] (L/mmol)

MTODO 2. Hanes Wolf. TABLA 2.1. En esta tabla podemos observar la sacarosa producida as como la Velocidad de hidrlisis (UIEI), la propuesta de linealizacin de Hanes-Wolf ([S]/Vel. Hidrlisis (UIEI) ((S)/V). [Sacarosa] Vel. Hidrlisis (UIEI) (mmol/L) (mmol sacarosa (S)/V hidrolizada/mg protena*min) 2.9240 0.1018 28.7323 14.6199 0.2261 64.6476 29.2398 0.2760 105.9573 58.4795 0.2974 196.6298 87.7193 0.2445 358.7580 146.1988 0.2709 539.7422

600 500 400 [S]/V 300 200 100 0 0.0000

Hanes-Woolf

y = 3.6708x + 8.2352 R = 0.9912

Grafica 2.1. Esta grfica nos muestra la tendencia que hay entre la concentracin de sacarosa con respecto a la sacarosa/Vel. Hidrlisis (UIEI) ((S)/V).

50.0000

100.0000

150.0000 200.0000 [Sacarosa] (mmol/L)

MTODO 3. Eadie Hosfstee. TABLA 3.1. La tabla muestra la sacarosa producida as como la Velocidad de hidrlisis (UIEI), la propuesta de linealizacin de Eadie Hosftee el cual es la Vel. Hidrlisis (UIEI)/sacarosa. [Sacarosa] Vel. Hidrlisis (UIEI) (mmol/L) (mmol sacarosa V/[S] hidrolizada/mg protena*min) 2.9240 14.6199 29.2398 58.4795 87.7193 146.1988 0.1018 0.2261 0.2760 0.2974 0.2445 0.2709 0.0348 0.0155 0.0094 0.0051 0.0028 0.0019

0.35 Vel. hidrlisis (UIEI)(mmol sacarosa hidrolizada/mg protena* min) 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0

Eadie Hofstee
y = -5.2435x + 0.2968 R = 0.8582

0.01

0.02

0.03

0.04

Grafica 3.1. Esta grfica nos muestra la tendencia que hay entre la Velocidad de hidrlisis (UIEI) con respecto a la Vel. Hidrlisis (UIEI)/sacarosa.

V/[S](mg proteina*min/L)

3. Cul mtodo cree que es mejor? Por qu? La representacin de Lineweaver-Burk tiene la desventaja de comprimir los datos a altas concentraciones de sustrato en una pequea zona y de exagerar la importancia de los puntos a concentraciones bajas. Tiene la ventaja de que es fcil con ella leer los valores de V para un valor determinado de [S]. La representacin de Eadie no comprime los valores a concentraciones elevadas pero es ms difcil leer rpidamente los valores de V frente a [S]. La representacin de Eadie se considera ms precisa generalmente. 4. Compare los valores obtenidos con los reportados en la literatura para esta enzima y discuta acerca de si son cercanos o no. Con base en lo anterior, discuta acerca de si considera satisfactorio el resultado obtenido. Como pudimos observar los resultados de esta prctica en la determinacin de DNS la velocidad de hidrlisis va en aumento tanto UIEI como UII. Se realiz una grfica de sacarosa inicial con respecto a la Velocidad de hidrlisis (UIEI) para poder observar la actividad enzimtica en esta prctica, por lo que se obtuvo que dicha actividad tiene un crecimiento hasta una cierta velocidad alrededor de 0.3 mmolH/mgP*min, pero en concentracin de glucosa ms alta disminuye porque se alcanza una inhibicin por sustrato al tener en cada tubo una concentracin muy baja (2.0374mg/L) de la esperada y esto da a una reduccin progresiva de dicha actividad, y por lo tanto la disminucin de velocidad. En las grficas de los tres mtodos que presentamos, obtuvimos la ecuacin de la recta utilizando solamente seis puntos para poder ajustarla lo mejor que pudimos. En nuestras determinaciones de los parmetros Km y Vmax de la invertasa obtuvimos valores cercanos entre s pero el mtodo que podra ser ms confiable es el de Hanes-Wolf con una R2=0.9912. Con esto podemos decir que esos valores podran ser importantes para producir informacin valiosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la reaccin de esta enzima. En la literatura:

Grfica 1. Representacin de Lineweaver-Burk de los datos para la hidrlisis de la sacarosa catalizada por el enzima invertasa.

Algunos de los experimentos publicados por Michaelis-Menten sobre la invertasa y la sacarosa.

En el artculo de Michaelis- Menten: Grfica 2. Michaelis and Menten publicaron su papel clsico conocido [Michaelis, L., and Menten,M. L. (1913) Die Kinetik der Invertinwirkung.

Los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica pueden producir informacin valiosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la reaccin. Los parmetros clave son Km y Vmax ya que kcat se puede calcular si se conoce Vmax. Los datos de Km y Vmax para una reaccin catalizada por enzima se pueden determinar de diversas maneras. Es posible obtener ambos valores por anlisis de las velocidades iniciales en una serie de concentraciones de sustrato y una concentracin fija de enzima. Para obtener valores fiables de las constantes cinticas, los puntos de [S] se deben extender por abajo y por arriba de Km (la concentracin de sustrato para la cual la velocidad es la mitad de la velocidad mxima) para producir una hiprbola. Es difcil determinar Km y Vmax en forma directa con una grfica de

velocidad inicial en funcin de la concentracin por que la curva tiende a la velocidad mxima en forma asinttica. Sin embargo, se pueden determinar valores exactos usando un programa de cmputo adecuado para ajustar los resultados experimentales a la ecuacin de la hiprbola. La ecuacin de Michaelis-Menten se puede reacomodar para obtener valores de Km y Vmax a partir de lneas rectas en grficas. La transformacin de uso ms frecuente es la grfica de doble reciproco o de Lineweaver-Burk, en la que se grafican los valores de 1/Vo contra los de 1/[S].

Aunque las grficas de doble reciproco no son los mtodos ms exactos para determinar las constantes cinticas, se comprenden con facilidad y permiten contar con pautas reconocibles para estudiar la inhibicin cinemtica. Adems de este mtodo, hay otros mtodos que nos permiten calcular Km y Vmax.

Al estimar estos parmetros (Km y Vmax) por los tres mtodos, cuando dos mtodos por lo menos coinciden, es un buen argumento para tomar estos valores de parmetros como correctos.

CONCLUSIONES:
La accin de la cintica de las enzimas a menudo se ha estudiado con el uso de la invertasa, debido a la facilidad de la medicin de su actividad, esto significa que esta enzima en particular ofrece buenas perspectivas para lograr el objetivo de la investigacin cintica y poder obtener conocimientos sobre la naturaleza del estudio de una reaccin durante su proceso. La invertasa cataliza la reaccin: Sacarosa Glucosa + Fructosa Por lo que actualmente, es una de las enzimas ms utilizadas en la industria de los alimentos, especialmente en la preparacin de dulces, bebidas y en la produccin de cido lctico por fermentacin de melazas. Es importante conocer los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica para producir informacin valiosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la reaccin. En este caso los parmetros clave son Km y Vmax, los cuales se pueden calcular mediante varios mtodos como son el Mtodo de Eadie Hosfstee, el Mtodo de Hanes Wolf y el Mtodo Lineweaver Burk. Nuestros valores experimentales fueron para el Mtodo de Eadie Hosfstee una Km= mmol/L y Vmax= mmol sacarosa hidrolizada/ mg protena*minpara, para el Mtodo de Hanes Wolf los valores fueron Vmax= mmol sacarosa hidrolizada/ mg protena*min y Km= mmol/L y para el Mtodo Lineweaver Burk nuestros valores fueron Vmax= mmol sacarosa hidrolizada/ mg protena*min, Km= mmol/L. El mtodo que 2 mejor se ajust fue el de Hanes-Wolf con una R = 0.9912. La velocidad de una reaccin enzimtica se incrementa al aumentar la temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor mximo a la denominada temperatura ptima. A valores superiores la actividad disminuye debido a que el enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin. Para el caso de la invertasa, la temperatura crtica arriba de la cual su inactivacin comienza a ser considerable es de 60C, por debajo de esta temperatura podemos considerarla estable; la temperatura considerada como la ptima para esta reaccin es de 50 - 60 C. Por lo anterior se considera aceptable el resultado que se obtuvo de manera general ya que recordando: donde se tuvo mayor actividad y estabilidad enzimtica de la invertasa fue entre 50C y 60C y la temperatura a la cual trabajamos fue de los 55C que se encuentra dentro del rango considerado como ptimo para una mayor y mejor velocidad de reaccin enzimtica.

CUESTIONARIO
1.- Cul es la importancia de determinar Km y V mx para una enzima? Dos parmetros de suma importancia en el estudio de las reacciones catalizadas por enzimas son la velocidad mxima (V mx.) a la que una enzima es capaz de trabajar y la constante de afinidad (Km) que nos expresa precisamente la relacin de afinidad que tiene una enzima y su sustrato. Gracias a los parmetros de Velocidad Mxima y Constante de Michaelis, podemos evaluar a qu velocidad se dar la reaccin para una concentracin de sustrato dada.

2.- Cul es la ventaja de expresar la velocidad en forma especfica (UIEI)? Las unidades de la UIEI en nuestro anlisis son: [ ] ( )

A diferencia de las unidades de la velocidad de reaccin

La primera contempla la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de enzima presente en la preparacin, mientras que en la segunda es un valor que no la involucra explcitamente y por ello se ve limitada al analizar variaciones en su concentracin. La actividad enzimtica se ve modificada por la concentracin de enzima presente. 3.- Explique cmo es la afinidad de la enzima por el sustrato si el valor de Km es pequeo. Fundamente su respuesta. Se muestra la siguiente serie de reacciones en la generacin de un producto

Se plantean las constantes en funcin de la reaccin que conllevan Si


[ ] [ ][ ]

entonces

[ ][ ] [ ]

Se llega a la expresin [ ][ ] [ ] El tener un valor pequeo de KM representara que se tiene una concentracin grande de complejo Enzima-Sustrato ([ES]), lo que hablara de una alta afinidad. Entre menor sea la KM mayor ser la afinidad de la enzima por el sustrato. 4.- Qu es Km y cul es su significado? Dicha constante se conoce como constante de Michaelis-Menten. Dicha constante es una excelente herramienta para conocer el comportamiento de una enzima. Fsicamente equivale a aquella concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad mxima. Dicho valor vara de manera amplia para la mayora de las enzimas, variando entre 10-1 y 10-6 M. Este valor de Km es especfico para cada enzima en particular y para cada sustrato, siendo tambin dependiente de factores del ensayo como la temperatura, la fuerza inica, etc. Tambin se puede considerar Km como aquella concentracin de sustrato en la que la mitad de los sitios catalticamente activos estn ocupados en un instante dado.

5.- Explique cmo se determina la mxima velocidad de una reaccin enzimtica Para determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato ( [S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. Esa es la velocidad mxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con sustrato.

Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten.

Bibliografa http://apuntesdebioquimica.tripod.com/id4.html http://www.biorom.uma.es/contenido/UIB/Jmoldesarrollo/enzimas/enzima5.html Stryer, L. 1985.Bioqumica. Segunda Edicin Ed. Revert. Espaa Bailey,J.E. 1987. Biochemical Engineering Fundamentals.Mc-Graw-Hill . USA p 160 y 165 Fersht Alan, Estructura y mecanismo de los enzimas, editorial Revert, Espaa 1980, Cap. 3 Ecuaciones bsicas de la cintica enzimtica L. Michaelis and Miss Maud L. Menten, Die Kinetik der Invertinwirkung, The Kinetics of Invertase Action translated by Roger S. Goody1 and Kenneth A. Johnson2, (Received 4 February 1913.) Kenneth A. Johnson*, and Roger S. Goody The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis Menten Paper Department of Chemistry and Biochemistry, Institute for Cell and Molecular Biology, 2500 Speedway, The University of Texas,Austin, Texas 78735, United StatesDepartment of Physical Biochemistry, Max-Planck Institute of Molecular Physiology, Otto-Hahn-Strasse 11, 44227 Dortmund,Germany http://books.google.com.mx/books?id=P7RdzefG4c8C&pg=PA25&dq=velocidad+maxima+de+la+inverta sa&hl=es-419&sa=X&ei=OJuZUZ39KoPV0gGT_YCQDg&ved=0CDcQ6AEwAQ#v=onepage&q&f=true

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