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Centro de Bachillerato Tecnologico Industrial y de servicion N134

PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS

Manual de Tcnicas de Identificacin de Enterobacterias.

OBJETIVO
GENERAL: Conocer las diferentes pruebas que son realizadas para el diagnostico de enterobacterias que afectan al ser humano.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Conocer las formas de identificar a las entero bacterias de inters medico. Realizar e interpretar mtodos de identificacin de bacterias gramnegativas. Conocer los medios de cultivo mas empleados en la identificacin de enterobacterias patgenas del ser humano.

ndice
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1. introduccin..1 2. Medios de cultivo ...3 Agar Mc Conkey3 Agar Eosina azul de metileno.7 Agar salmonella-Shigella.9 Agar Hektoen Enterico11 Agar xiosa lisina desoxicolato..13 Agar Sangre...15 Agar chocolate18 Agar Cassman.....20 Agar Thayer Martn..22 Agar Biggy..24 Agar Mueller-Hinton..26 Agar Soya tripticasa....27 Agar Verde Brillante.29 Agar Lowenstein-Jensen (medio base).31 3. Pruebas Bioqumicas..32 Medio MIO.32 Agar Kligler Hierro.35 Agar Simmons Citrato38 Caldo rojo de fenol y sacarosa..41 Agar lisina-Hierro.....42 Medio SIM.........................45 Urea..48
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Agar TSI49 4. Pruebas automatizadas. ..51 API20E..51 5. Tinciones....5 6 Tincin de Gram. ...........................56 Tincin de Ziehl-Neelsen.58 6. Pruebas serolgicas...59 Inmunofluorescencia directa...59 Prueba PCR61 Inmunofluorescencia indirecta........................63 Prueba ELISA..64 Pruebas serolgicas segn cada bacteria67 7. Pruebas de aglutinacin..77 8. Electroforesis. 79 Tcnica de electroforesis en gel de Agarosa.79 electroforesis capilar...81

9. Conclusin...........8 3

10. Bibliografa...84

Introduccin:
Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms de 30 gneros y ms de 100 especies que pueden tener morfologa de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros rganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentacin de quesos y productos lcteos, alcoholes, tratamientos mdicos, produccin de toxinas en el uso de cosmticos, fabricacin de agentes antivirales de la industria farmacutica, etc. Toma de muestra y aislamiento en cultivo en medios selectivos como el McConkey o en medio de Levine (desarrollo selectivo de enterobacterias frente a GRAM +), permiten determinar la fermentacin de la lactosa e inhiben la motilidad del Proteus. Hoy en da se dispone de una amplia variedad de tinciones microbiolgicas que constituyen herramientas muy importantes para la deteccin, identificacin y control de los microorganismo que van desde tcnicas sencillas y rutinarias, hasta tinciones altamente sofisticadas para el diagnostico y la investigacin. Las pruebas bioqumicas son un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos que generalmente se realizan en sistemas miniaturizados y automticos. Entre otros aspectos, se analiza la accin de la bacteria sobre los hidratos de carbono, la liberacin de enzimas y metabolitos al medio de cultivo etc. A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioqumicas nos
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permiten determinar el gnero y la especie de la bacteria en estudio. Hay que tener en cuenta, adems, que las caractersticas metablicas de los microorganismos pueden variar en funcin de distintos factores de manera que para realizar una caracterizacin fiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas. El manual de tcnicas para la identificacin de las enterobacterias es una recopilacin de conocimientos que pueden ser utilizadas con un fin futuro en donde est registrado tcnicas como son tinciones, cultivos, pruebas bioqumica, serolgicas, de inmunodifusin, entre otros.

MEDIOS DE CULTIVO Agar Mc Conkey Formula Peptona. 17g Polipeptona..3g Lactosa..10g Sales Biliares..1.5g Cloruro de sodio.5g Agar.13.5g Rojo neutro..0.03g Cristal violeta..0.001 g Agua destiladac.s.p 1 L pH7.1 Fundamento: El Agar MC es un medio de plaqueo diferencial para la seleccin y recuperacin de bacterias de Enterobacteriaceae y bacilos gramnegativos entricos relacionados. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias gran positivas y de algunas gramnegativas. La sacarosa es el nico hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa producen bacterias que producen distintos tonos de rojos, debido a la conversin del colorante indicador neutro (rojo con pH de 6.8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias de bacterias no fermentadoras de la lactosa aparecen sin color y transparentes. Interpretacin: Los fermentadores fuertes de lactosa tpicos como especies de escherichia, klebsiella y enterobacter producen colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada.

Los fermentadores lentos o dbiles de lactosa, como sitrobacter, providencia, serratia y hafnia pueden aparecer sin color despus de 24 horas o rosa plido de 24 a 48 horas. Las especies de Proteus, salmonella y shigella, con raras excepciones producen colonias con poco color o transparentes.

ESPECIAL PARA: Klebsiella Enterobacter Citrobacter, Providencia Serratia Hafnia Proteus Edwadsiella Salmonella Shigella E. coli

Escherichia Shigella

Salmonella Klebsiella

Proteus
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Agar Eosina Azul De Metileno (EMB)


Formula: Peptona 10g Lactosa5g Sacarosa .5g Dipotasico,PO4 2g Agar 13.5g Eosina. g 0.5

Azul de metileno.. 0.065 g Agua destilada C.S.P 1 L pH final 7.2 Fundamento El Agar EMB es un medio de plaqueo diferencial que puede ser usado en lugar del Agar MC en el aislamiento de Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras con bacterias mixtas. Los colorantes analticos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias grampositivas. Se combinan para formar un precipitado a un pH acido y, de ese modo, sirven tambin como indicadores de la produccin de acido. EMB levine, con solo lactosa, da reacciones ms paralelo con las del Agar MC; la formula modificada tambin detecta fermentadores de la lactosa. Interpretacin: Las colonias de los fermentadores fuertes tpicos notablemente E. coli, son negro verdoso o con brillo metlico. Los fermentadores dbiles incluidos klebsiella, enterobacter, serratia y hafnia, producen colonias purpuras en 24-48 horas.

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Los no fermentadores de lactosa, que incluyen proteus, salmonella y shigella, producen colonias transparentes. Yersinia enterocolitica, un fermentador de sacarosa no fermentador de lactosa, producen colonias transparentes en EMB levine en colonias purpura a negro en la formula modificada. ESPECIAL PARA: Klebsiella E. coli Proteus Salmonella shigella Yersenia Enterobacter serratia Hafnia

Agar Salmonella Shigella

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Formula Extracto de carne 5g Peptona.5 g Lactosa..10 g Sales biliares 8.5 g Citrato de sodio...8.5g Tiosulfato de sodio...8.5g Citrato frrico.. 1 g Agar..12.5 g Rojo neutro,...0.025g Verde brillante.0.033 g Agua destilada C.S.P .1 L pH .7.4

Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Grampositivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido Sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como
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colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Interpretacin Cualquier colonia fermentadora que aparezca se coloreara de rojo por rojo neutro. Ciertas cepas poco frecuentes de salmonella arizonae son fermentadores de lactosa pueden parecerse a Escherichia coli. El crecimiento de especies de salmonella no es inhibido, y las colonias aparecen sin color con centro negro, debido a la produccin de sulfuro de hidrogeno. Las especies de shigella muestran inhibicin variada y colonias sin color y sin ennegrecimiento. Las cepas mviles de Proteus que aparecen en el agra SS no se dispersan.

ESPECIAL PARA: Salmonella Shigella

Shigella

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Agar Hektoen Entrico (HE)


Formula: Peptona.. 12 g Extracto de levadura. 3 g Sales biliares. 9 g Lactosa...12g Sacarosa.12g Salicina..2 g Cloruro de sodio 5g Tiosulfato de sodio.. 5 g Citrato frrico de amonio.1.5 g Fucsina acida ..0.1 g Azul de timn....0.04 g Agar....14 g Agua destilada C.S.P..1 L
PH

..7.6

FUNDAMENTO: El agar HE es una formulacin reciente diseada como un medio de plaqueo indirecto para muestras fecales para incrementar el rendimiento de especies de salmonella y shigella a partir de flora normal numerosa. La alta concentracin de sales biliares inhibe el crecimiento de todas las bacterias grampositivas y retarda el de muchas cepas coliformes.

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Pueden producirse cidos a travs de hidratos de carbono, y la fucsina acida, al reaccionar con el azul de timol, produce un color amarillo cuando baja el pH. El tiosulfato de sodio es una fuente de sulfuro, y el gas sulfuro de hidrogeno se detecta mediante el citrato frrico de amonio (relativamente sensible). Interpretacin Los fermentadores rpidos de lactosa (E. coli) son inhibidos moderadamente y producen colonias naranja brillante a roja salmn. Las colonias de salmonella son azul verdosas tpicamente con centros negros de gas de sulfuro de hidrogeno. Shigella aparece ms verde que salmonella, y las colonias palidecen hacia la periferia. Las cepas de proteus son inhibidas en cierta forma las colonias que desarrollan son pquelas y trasparentes, y de aspectos ms brillantes o acuosos . Agar entrico Hektoen (HE) con un desarrollo de 24 horas es E.coli. el color amarillo del medio indica produccin de acido por fermentacin de lactosa o sacarosa.

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Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)


Formula Xilosa.3.5 g Lisina...5 g Lactosa...7.5 g Sacarosa....7.5 g Cloruro de sodio...5 g Extracto de levadura..5 g Rojo fenol.0.008 g Agar...13.5 g Deoxicolato de sodio.2.5 g Tiosulfato de sodio.6.8g Citrato frrico de amonio..0.8 Agua destilada C.S.P. 1 L pH.7.4

Fundamento

El Agar XLD es menos inhibidor del crecimiento de bacilos coliformes que el Agar HE y fue diseado para detectar shigellae en heces despus de enriquecimiento en caldo para gramnegativos. Tres hidratos de carbono estn disponibles para la produccin de acido, y el rojo fenol es un indicador de pH. Los microorganismos lisina
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positivos, como especies de shigella, producen colonias inicialmente amarillas debido a la utilizacin de xilosa y colonias rojas retardadas por la descarboxilacion de la lisina. El sistema de deteccin de sulfuro de hidrogeno es similar al del Agar HE.

Interpretacin Los microorganismos como E. coli y especies de Klebsiella, Enterobacter pueden usar ms de un hidrato de carbono y producir colonias amarillo brillante. Las colonias en muchas especies de Proteus son tambin amarillas. La mayora de las especies de salmonella producen colonias rojas, con centros negros de gas sulfuro de hidrogeno. Shigella, Providencia y muchas especies de Proteus no usan ninguno de los hidratos de carbono y producen colonias transparentes. Colonias de Citrobacter son amarillas con centros negros; muchas especies de Proteus son amarillas o transparentes con centros negros; las de salmonella son rojas con centro negro. ESPECIAL PARA: Shigella Salmonella Klebsiella Proteus

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Agar Sangre
FUNDAMENTO: La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para el aislamiento y cultivo de una amplia variedad de microorganismos, adicionado de sangre es til para el cultivo de microorganismos fastidiosos. La Base de Agar Sangre generalmente es suplementada con sangre de carnero, conejo o caballo al 5-10% para aislar cultivar y estudiar reacciones hemolticas de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos patgenos. La infusin de msculo de corazn y la peptona de casena proporcionan la fuente de nitrgeno, carbono, Aminocidos y protenas. El extracto de levadura provee vitaminas y aminocidos esenciales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es usado como agente solidificante. Este medio est relativamente libre de azcares reductores los cuales interfieren en las reacciones hemolticas de Estreptococos. El patrn de las reacciones hemolticas puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.

Formula aproximada para 1000ml de agua Extract de levadura .5.0g Infusin de msculo cardiaco ..2.0g Peptona de casena .13.0g Cloruro de sodio..5.0g Agar ..5.0g pH Final..7.3 0.2 interpretacin:
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Los estreptococos hemolticos presentan colonias translcidas u opacas, grises, pequeas y mucoides con una zona de hemlisis. Otros organismos que pueden producir hemlisis incluyen a Listeria, varias conirebacterias, estafilococcos hemolticos, E. coli y Pseudomonas. Las colonias de neumococcos aparecen planas, lisas, translcidas, grisceas y algunas veces mucoides rodeadas por una pequea zona verdosa de alfa hemlisis, Las colonias de estafilococcos tienen una apariencia opaca, de color blanco a amarillo y rodeadas de una zona clara por la beta hemlisis.

ESPECIAL PARA: Escherichia Brucella Neumococos Estafilococos Listeria

Escherichia hermannii Escherichia vulneris

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Klebsiella abortus

Brucella

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Agar Chocolate
FUNDAMENTO: La Base de Agar Chocolate es un medio utilizado con varios suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeae y otros microorganismos fastidiosos. La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando es suplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para el crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria, as como suplementos (disponibles comercialmente) que Proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina, coenzimas, hemina, vitaminas, aminocidos, dextrosa y otros factores de crecimiento, todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophylus y Neisseria. COMPOSICION DEL MEDIO: Peptona de casena7.5g Peptona de carne7.5g Almidn de Maz .1.0g Fosfato Dipotsico.. 4.5g Fosfato Monopotsico.1.0g Cloruro de Sodio..5.0g Agar ..10.0g pH final.. 7.2 + 0.2 Interpretacin: Haemophylus influenzae presenta Colonias pequeas, hmedas, perladas con caracterstico olor hmedo. Neisseria gonorrhoeae presenta Colonias pequeas grisceas incoloras, mucoides. Neisseria meningitidis presenta Colonias medianas a grandes, de color azul grisceo, mucoides. Streptococcus pneumoniae presenta Colonias pequeas,

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planas, pueden aparecer verdes por la decoloracin del medio

ESPECIAL PARA: Haemophylus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae

Haemophylus

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Agar Cassman
FUNDAMENTO: Agar CASMAN es utilizado para el aislamiento de microorganismos exigentes. La proteasa peptona n 3, triptona y extracto de carne proporcionan nitrgeno, vitaminas y aminocidos. La nicotinamida favorece el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae impidiendo la Liberacin de la coenzima (factor V) por medio de nucleotidasas procendentes del enriquecimiento con sangre. La dextrosa se aade para favorecer el crecimiento de cocos patgenos. El Cloruro sdico mantiene el balance osmtico en el medio. El almidn tiene como funcin asegurar que cualquier metabolito txico producido sea absorbido, neutralizar la inhibicin de beta-hemlisis por la glucosa y favorecer el crecimientode Neisseria. El agar bacteriolgico es el agente gelificante.

Formula aproximada a 1000 ml Proteosa Peptona n 3 10.0 Triptona.10. 0 Cloruro Sdico5.0 Extracto de carne..3.0 Almidn..1.0 Dextrosa.0. 5 Nicotinamida..0.0 5 cido p-

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Aminobenzoico..0.05 Agar Bacteriolgico..14.0 pH 7.3 0.2 ESPECIAL PARA: Neisseria Gonorrhoeae Crecimiento satisfactorio. Haemophilus influenzae Crecimiento satisfactorio .

Agar Thayer Martin


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FUNDAMENTO: El medio de Thayer Martin es utilizado principalmente para el aislamiento y desarrollo de especies de Neisseria. El Medio de Thayer Martin es preparado a partir de la Base de Agar GC adicionada de Hemoglobina, de la Mezcla de antibiticos VCNT (Vancomicina, Colistina, Nistatina, Trimetoprim) y de Enriquecimiento GC.

Formula aproximada a 1000 ml Pluripeptona..15.0 Almidn soluble..1.0 Fosfato dipotsico.4.0 Fosfato monopotsico.1.0 Cloruro de sodio.5.0 Agar.15.0 pH final.7.2 0.2 Interpretacin: Las colonias de gonococos y meningococos obtenidas en este medio selectivo son usualmente opacas, grisceas, convexas, de 1-4 mm de dimetro. Luego de 48 h de incubacin pueden transformarse en colonias mucoides. Coloracin de Gram: diplococos Gram negativos. Se sugiere proseguir con este esquema de identificacin. Microorganismos T.M. T.M. A.N C22C OXI GLU MAL N. gonorrhoeae + + - - + + -N. meningitidis + + - - + + + Acinetobacter spp. - + + + - -* - Neisseria spp. - + + + + V V Moraxella spp - + V V + - - Moraxella (Branhamella) catarrhalis - + + + + - - T.M. medio Thayer Martin (CO2); A. Cho: Agar chocolate (CO2); A.N.: agar o caldo nutritivo; C22C: desarrollo a 22C; OXI: oxidasa; GLU: fermentacin
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de glucosa; MAL: fermentacin de maltosa; + = reaccin positiva; - = reaccin negativa; V = reaccin variable. * La mayora de las especies de Acinetobacter pueden usar glucosa por la va oxidativa.

ESPECIAL PARA: N. gonorrhoeae N. meningitidis Acinetobacter spp. Neisseria spp. Moraxella spp Moraxella (Branhamella) catarrhalis

neisseria

AGAR BIGGY El Agar Biggy (por sus siglas en ingls Bismuth-GlucoseGlycine-Yeast) es utilizado para el aislamiento y
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diferenciacin de especies de Candida. conocido como Agar de Nickerson. FORMULA

Tambin

es

Citrato de Amonio y Bismuto5.0 g Glicina10.g Sulfito de Sodio 3.0 Extracto de Levadura 1.0 Dextrosa 10.0 Agar Bacteriolgico 16.0 pH 6.8 0.2

FUNDAMENTO El Agar Biggy es una modificacin de la frmula desarrollada por Nickerson quin realiz estudios sobre la reduccin de sulfito por especies de Candida. La diferenciacin est basada en la morfologa colonial y la pigmentacin tpica que se presenta en este medio. La reduccin del sulfito de bismuto se manifiesta en una pigmentacin de la colonia que en ocasiones difunde en el medio. En este medio el extracto de levadura proporciona vitaminas y aminocidos. La glicina es utilizada para estimular el crecimiento. La dextrosa es la fuente de carbono. El indicador sulfito de bismuto acta tambin como un inhibidor del desarrollo bacteriano. El agar es adicionado como agente solidificante.

Interpretacin: La morfologa colonial tpica se describe: C. albicans Colonias de color caf oscuro o negro sin difusin en el medio, con ligera presencia de micelio y tamao mediano. C. krusei Colonias grandes, planas, rugosas de color negro con brillo metlico, borde caf y halo amarillo. C. tropicallis Colonias ligeramente oscuras con centro negro y brillante, de tamao mediano. Despus de 72 hrs. El pigmento difunde en el medio.
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C. parakruzei Colonias de tamao mediano, planas rugosas, caf-rojizas, con crecimiento micelial amarillo. C. pseudotropicalis Colonias grandes de color rojo oscuro, planas con ligero crecimiento micelial. C. stellatoidea Colonias de tamao mediano, planas, de color caf oscuro, con muy pequea presencia de micelio.

ESPECIAL PARA: C. albicans C. krusei C. tropicallis C. parakruzei

Candida

Agar Muller Hinton


Fundamento:

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El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby. Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusin de carne y la peptona de casena proveen la fuente de nitrgeno, vitaminas, carbn y aminocidos. El almidn es agregado para absorber cualquier metabolito txico y el agar es adicionado como agente solidificante.

Formula por litro de agua destilada Agar ..17.0 g Almidn1.5 g Infusin de carne de res.3.0 g Peptona de casena acida17.5 g pH.7.3 + 0.1

Interpretacin: es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby

ESPECIAL PARA: Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Bacillus subtilis Neisseria Agar Soya Tripticasa

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El Agar Soya Tripticasa es un medio utilizado para promover el crecimiento de microorganismos fastidiosos y adicionado de sangre para observa reacciones hemolticas. Fundamento El Agar de Soya Tripticasena provee un excelente soporte de crecimiento para organismo aerobio y anaerobios, segn lo demostr Leavit en 1955. Este medio es recomendado en los procedimientos microbiolgicos de control de aguas, cosmticos y en la industria farmacutica. De acuerdo con la Farmacopea. Clnicamente se utiliza para diferenciar especies de Haemophylus debido a que no contiene los factores X y V requeridos para su crecimiento. As mismo este medio puede ser utilizado como base para preparar medios suplementados como el Agar Sangre y Agar Glosa Chocolate. En este medio las peptonas proveen la fuente de nitrgeno y minerales. El azcar de la Peptona de Soya provee la fuente de carbohidratos. El Cloruro de Sodio tiene su funcin en el balance osmtico y el Agar es incorporado como agente solidificante. Formula Peptona de Casena.15.0g Peptona de Soya..5.0g Cloruro de Sodio .5.0g Agar Bacteriolgico.15.0g pH 7.3 0.2

ESPECIAL PARA: Especies de Haemophylus

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Agar Verde Brillante


Caractersticas del medio Medio preparado: verde. FUNDAMENTO: Es un medio altamente selectivo empleado para aislar la Salmonella (excepto styphi y shigellas) de haces, orina, leche, producto lcteos y otros alimentos de importancia sanitaria. En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la fermentacin de azcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta como agente selectivo. Formula aproximada a 1000 ml: Peptona de carne5.0g Extracto de levadura.3.0g Peptona de casena.5.0g Cloruro de sodio..5.0g Lactosa10.0g Sacarosa.10.0g Rojo fenol.0.08g Verde brillante..0.0125g Agar..20.0g pH final6.9 0.2 Interpretacin: Las colonias de Escherichia coli presentan un color Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento en Salmonella enteritidis las colonias son Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo. Salmonella typhi con crecimiento inhibido mientras que las colonias de Salmonella typhimurium son Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo.
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ESPECIAL PARA: Escherichia coli Salmonella (excepto styphi y shigellas)

Agar Lowenstein-Jensen Medio Base


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Formula: Fosfato monopotasico..2.5 Sulfato de magnesio.0.24 Citrato de magnesio.0.6 Asparragina...3.6 Harina de papa.....30.0 Verde de malaquita..0.4 pH final4.8 0.1

Fundamento: Los nutrientes de este medio basal, ms los aportados por el agregado de la mezcla de huevos, constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. El verde de malaquita inhibe a gran parte de la flora acompaante. Con el agregado de glicerina se estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, aunque gran parte de M. bovis es inhibido. Agregando un 5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal, como es el caso de M. smegmatis. Interpretacin: Observar las caractersticas morfolgicas y la presencia o ausencia de pigmento en las colonias. MICROORGANISM OS Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium Mycobacterium gordonae CRECIMIEN TO Excelente Excelente Excelente CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS Grandes, secas, amarillentas, granulares Lisas, sin pigmentos Lisas

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PRUEBAS BIOQUIMICAS
MEDIO MIO
Formula (Gramos Por Litro):

Dextrosa..1.0 Extracto de levadura..3.0 Peptona..10.0 Triptena.10.0 Clorhidrato de L-ornitina.5.0 Agar..2.0 Prpura de bromocresol..0.02 pH final..6.5 0.2

Caractersticas Del Medio Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.

Fundamento: Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y Triptena. Adems, la Triptena aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la
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realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptfano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac s o de Erlich, indica un resultado positivo.

INTERPRETACIN: Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez crecimiento mas all de la lnea de siembra. o

Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra. Ornitina decarboxilasa: Resultado positivo: color prpura. Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio. Prueba del indol:
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La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento. Microorganis mo K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 Crecimien to Bueno Bueno Movilid ad + Indo l Ornitina decarboxila sa +

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AGAR KLIGLER HIERRO


Formula (Gramos Por Litro): Peptona de carne...13.0 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa..10.0 Triptena10.0 Glucosa.1.0 Citrato de hierro y amonio..0.5 Tiosulfato de sodio.0.3 Rojo de fenol..0.025 Agar.15.0 pH final: 7.3 0.2

Caractersticas Del Medio Medio preparado: rojo / naranja Fundamento: Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico. En el medio de cultivo, la peptona de carne y la Triptena, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El Tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se
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combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El Agar es el agente solidificante. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. INTERPRETACIN: Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. El ennegrecimiento del medio indica que el

microorganismo produce cido sulfhdrico.

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Microorganism o E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853

Pico/Fondo

Produccin de gas + + + + -

A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/K

Produccin de cido sulfhdrico + + + -

A: cido K: alcalino

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AGAR SIMMONS CITRATO


FORMULA (Gramos Por Litro): Citrato de sodio.2.0 Cloruro de sodio5.0 Fosfato dipotsico.1.0 Fosfato monoamnico1.0 Sulfato de magnesio.0.2 Azul de bromotimol.0.08 Agar 15.0 pH final: .6.9 0.2

Caractersticas Del Medio Medio preparado: verde.

FUNDAMENTO: En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido
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tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

INTERPRETACIN: Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Negativo: permanece de

el color

medio verde

debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Si se usa un inoculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo. Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.

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Microorganismo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 S. typhimurium ATCC 14028 E. coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022

Citrato permeasa Positivo Positivo Negativo Negativo

Color del medio Azul Azul Verde Verde

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CALDO ROJO DE FENOL Y SACAROSA


Formula (Gramos Por Litro): Peptona de Casena10.0 Cloruro de Sodio.5.0

Sacarosa5.0 Rojo de Fenol.0.018 pH final..7.4 0.2

Fundamento: El Caldo Rojo de Fenol y Sacarosa es utilizado para la diferenciacin de cultivos puros, en base a su capacidad para fermentar la sacarosa. La capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos es utilizada como un criterio para su identificacin. El medio provee los requerimientos nutricionales para el crecimiento de los microorganismos y contiene Rojo de Fenol como indicador de pH. Este indicador fue utilizado por Vera obtenindose resultados altamente confiables. La peptona provee la fuente de nitrgeno para el buen desarrollo de los microorganismos, el Cloruro de Sodio mantiene el balance osmtico del medio y el Rojo de Fenol acta como indicador, virando de color rojo-naranja a amarillo en presencia del cido producido por la fermentacin del azcar.

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AGAR LISINA HIERRO


Formula gramos por litro): Peptona de gelatina..5.0 Extracto de levadura ..3.0

Glucosa.1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio.0.5 Tiosulfato de sodio..0.04 Prpura de bromocresol..0.02 Agar15.0 pH final..6.7 0.2

Caractersticas Del Medio Medio preparado: color violeta.

Fundamento: En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el Tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
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Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

INTERPRETACIN: Decarboxilacin De La Lisina: Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. Desaminacin De La Lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. Produccin De cido Sulfhdrico: Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo)

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Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdri

Microorganismos Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp. Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922

Color en el pico de flauta Rojo

Color en la base del tubo Amarillo

Ennegrecimient o del medio Negativo

Prpura

Prpura

Positivo

Prpura Rojo Prpura Rojo Prpura Prpura

Prpura Amarillo Amarillo Amarillo Prpura Prpura

Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo

Prpura

Prpura

Negativo
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SIM Medio
Formula (gramos por litro): Triptena..20.0 Peptona..6.1 Sulfato de hierro y amonio..0.2 Tiosulfato de sodio.0.2 Agar3.5 pH final.7.3 0.2

Caractersticas Del Medio Medio preparado: mbar. Fundamento: El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la Triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del Tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. INTERPRETACIN: Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de siembra.

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Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra. Cepas SH2 positivas:

ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color. Limitaciones En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser difcil de observar. Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido sulfhdrico.

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Microorganis mo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022

Movilidad

Indol

Produccin de cido sulfhdrico -

+ -

+ -

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

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UREA
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Frmula (en gramos por litro) Urea20.0 Fosfato monopotsico..9.1 Fosfato disdico.9.5 Extracto de levadura 0.1 Rojo fenol0.01 pH final: ..6.8 0. Fundamento: Medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros

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TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico. Frmula (en gramos por litro): Extracto de carne...................................3.0 Pluripeptona...................................2 Cloruro de sodio...............................5.0 Lactosa........................................1

0. 0.

0 0

Sacarosa.........................................10.0 Glucosa..........................................1.0 Sulfato de hierro y amonio..............0.2 Tiosulfato de sodio............................0.2 Rojo de fenol...............................0.025 Agar...............................................13.0 pH final: ......................................7.3 0.2 Fundamento
Negativo

Positivo

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono Fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de
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iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

PRUEBAS AUTOMATIZADAS
API20E
La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram-. Bsicamente consta de 21 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta. La prueba nmero 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira. Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes: Prueb a ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP Reaccin / Enzimas Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilizacin del citrato Produccin de H 2 S Ureasa Triptfano desaminasa Produccin de indol Produccin de acetona (Voges53

GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Proskauer) Gelatinasa Fermentacin/oxidacin de glucosa Fermentacin/oxidacin de manitol Fermentacin/oxidacin de inositol Fermentacin/oxidacin de sorbitol Fermentacin/oxidacin de ramnosa Fermentacin/oxidacin de sacarosa Fermentacin/oxidacin de melobiosa Fermentacin/oxidacin de amigdalina Fermentacin/oxidacin de arabinosa Citocromo oxidasa A patir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensin en 5 mL de solucin salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estril.

Llenar con la suspensin de bacterias los tubos, no la cpula (cada pocillo tiene un tubo y una cpula, parte aerobia), de todos los pocillos.

Llenar la cpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensin de bacterias.

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Cubrir con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

Poner la tira en su propia cmara hmeda de incubacin. Previamente poner agua en los alvolos de la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda durante la incubacin. Incubar a 37 C durante 18-24 h.

Tras la incubacin se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados. Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que tener en cuenta dos criterios:

Si la glucosa da negativo y los tests positivos son dos o menos de dos, no hay que aadir reactivos. Cuando sto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Si la glucosa es positiva y/o tres o ms tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:

TDA Aadir una gota de FeCl3 10 %. VP


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Aadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH). IND Aadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilaminocinamaldehido. Oxidasa Aadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recin preparado. INTERPRETACIN: La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo (ms adelante se explicar con detalle).

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Prueb a ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Reaccin / Enzimas Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilizacin del citrato Produccin de H 2 S Ureasa Triptfano desaminasa Produccin de indol Produccin de acetona (Voges-Proskauer) Gelatinasa Fermentacin/oxidacin de glucosa Fermentacin/oxidacin de manitol Fermentacin/oxidacin de inositol Fermentacin/oxidacin de sorbitol Fermentacin/oxidacin de ramnosa Fermentacin/oxidacin de sacarosa Fermentacin/oxidacin de melobiosa Fermentacin/oxidacin de amigdalina Fermentacin/oxidacin de arabinosa Citocromo oxidasa

Negativo sin color amarillo amarillo amarillo verde sin precipitado negro amarillo amarillo amarillo sin color sin difusin azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde

Positivo amarillo rojo o naranja rojo o naranja rojo o naranja azul oscuro o turquesa precipitado negro rojo o naranja marrn-rojo color rosa o anillo rosarojo rosa-rojo difusin de pigmento amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo
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Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numrico de 7 cifras. Los pocillos estn separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test nmero 21 corresponde al test de la oxidasa). Para obtener el perfil nmerico de 7 cifras, a cada pocillo se le dar el valor 0, 1, 2 4, de acuerdo a los siguientes criterios:

Si la reaccin es negativa se pone 0. Si la reaccin es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el tercero. Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene un cdigo de 7 cifras.

Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la especie de que se trata, para realizar esta operacin hay programas informticos.

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TINCIONES
Tincin GRAM
Tinte Primario: Cristal violeta, tie la bacteria de color violeta Agente Mordiente: Lugol, forma un complejo insoluble con cristal violeta. Ayuda a adherir el tiente a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin. Agente Decolorizante: Alcohol acetona o alcohol, el cual sirve como solvente de lpidos y agente deshidratante de protenas. Contra tint: Safranina que tie de rojo a la bacteria. Fundamento: Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste.
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Las especies de identificadas son: E. coli Salmonella, Neisseria, Haemophylus, Vibrio. ETC.

enterobacterias

que

pueden

ser

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Mtodo de realizacin: 1) Colocar la muestra en un portaobjetos y este en un puente de tincin. 2) Cubrir la muestra con cristal violeta y dejar actuar 1 min, ya pasado el minuto se lava con agua corriente. 3) Cubrir con lugol y dejar actuar durante 1 min. y posteriormente se vuelve a lavar. 4) Decolorar con alcohol acetona gota a gota dejndose actuar 30 seg. Se lava una ves transcurrido el tiempo. 5) Cubrir con safranina al 95% por 1 min. 6) Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorantes 7) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la muestra para posteriormente ser observada en el microscopio. 8) Identificar las bacterias Gram positivas y negativas identificndolas con e color caracterstico.

INTERPRETACION:

Bacterias Gram positivas

Bacterias Gram negativas

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Tincin de Ziehl-Neelsen
Fundamento: Esta tincin sirve para teir bacterias del gnero Mycobacterium, el resto de las bacterias se tien de azul por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M. leprae, causante de la lepra o enfermedad de Hansen, se identifican mediante esta tincin. Las micobacterias son cido-alcohol resistentes porque poseen en sus cubiertas lpidos de cidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo creo resistente a la decoloracin. Una tincin cidoalcohol resistente se realiza segn los siguientes pasos: Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas de rojo. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la penetracin del colorante en el interior de la clula. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las clulas excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie crea. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul todas las clulas previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciacin entre las clulas de Mycobacterum, an teidas de rojo, y las clulas restantes del espcimen. Las micobacterias permanecen teidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul del colorante de contraste Preparacin de la tincin cido -resistente 1. Preparar un frotis.Carbol fucsina (3 minutos). Utilizar unpapel toalla bien impregnado delreactivo. 2. Lavar con agua. 3. Decolorizar con alcohol etlico. 4. Lavar con agua. 5. Azul de metileno por 2 minutos y lavar con agua.
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Pruebas serolgicas
Inmunofluorescencia Directa:

Fundamento: Sobre un portaobjetos depositamos una muestra en la que buscamos la presencia de un determinado antgeno. Aadimos un suero especfico del antgeno problema marcado con isotiocinato de fluorescena (conjugado). Si el antgeno problema se encuentra presente en la muestra, se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado del portaobjetos. Las enterobacterias que se pueden observar con esta prueba son: Salmonella, Helicobacter, E. coli, Clamydia trachomatis. .

Mtodo de realizacin: 1) Cubrimos dos de las extensiones con 10ml de tampn BABS (testigo conjugado), otros dos con 10ml de sorbente (testigo sorbente). Cubrimos las otras extensiones con 10ml de cada dilucin de los sueros problemas y los sueros testigos.

2) Incubamos 30 minutos a 37 C en una cmara hmeda. Lavamos en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. Enjuagamos rpidamente en un bao de agua destilada. Escurrimos y dejamos secar.

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3) Cubrimos cada extensin de 10ml de globulina antihumana diluida en tampn BABS. 4) Incubamos 30 minutos a 37 C en una cmara hmeda. Lavamos los portas en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. Pasamos rpidamente por un bao de agua destilada. Dejamos secar.

5) Observacin de los resultados en microscopio de campo oscuro.

INTERPRETACION:

Los anticuerpos de la bacteria a estudiar se unirn contra los que son especficos, y al aadir el complejo antiinmunoglobulina G marcado, se unir a los anticuerpos. Al mirar en el microscopio de campo oscuro. Se observar fluorescencia.

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Prueba PCR
Fundamento: Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de alta y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre si tras cada fase de replicacin y , dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Todo el proceso de PCR esta automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Una de las bacterias que puede ser identificada con esta prueba es Chlamydia tranchomatis

Procedimiento Paso de inicializacin Este paso consiste en calentar la reaccin a una temperatura de 94 a 96C, que se mantiene durante 1-9 min. Paso de desnaturalizacin Este paso es el de regular el evento de ciclismo primero y consiste en calentar la reaccin a 94-98C durante 20 a 30 segundos. Paso de recocido La temperatura de reaccin se reduce a 50 65 C durante 20-40 segundos, dejando de recocido de los iniciadores de ADN de cadena nica.

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Extensin / alargamiento La temperatura en este paso depende de la polimerasa de ADN utilizados; Taq polimerasa tiene su optima actividad de temperatura a 75- 80 C. Alargamiento final Este paso solo se puede realizar ocasionalmente a una temperatura de 70 74C durante 5 15 min.

INTERPRETACION:

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Inmunofluorescencia indirecta:
Fundamento: Sobre un portaobjetos que lleva pegado un antgeno conocido, aadimos el suero problema. Si ste contiene anticuerpos especficos, se unen al antgeno. Los anticuerpos del suero no especficos del antgeno del portaobjetos se eliminan mediante un lavado. Posteriormente se aade un suero anti-inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de fluorescena (conjugado). El conjugado se une a los anticuerpos especficos o se elimina mediante lavado haba anticuerpos especficos en el suero. Las enterobacterias que se logran observar en esta prueba son: Treponema pallidum, Bordetella, Mycobacterium leprae, Neisseria gonorrhoeae.

Mtodo de realizacin: 1) La muestra problema es colocada portaobjetos donde se deja secar y fijar. sobre un

2) Luego se agregan anticuerpos especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. 3) La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana.

Interpretacin:

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Prueba de ELISA
Fundamento: Existen dos importantes variaciones en relacin con ELISA. En primer lugar, que los anticuerpos o antgenos soluble se pueden hacer insolubles por adsorcin a una fase slida, como pueden ser las placas de microtitulacin o los tubos de poliestireno. La adsorcin depende tambin dl tiempo, temperatura y pH. Algunos mtodos precisan que las placas se mantengan durante toda la noche a 4 C, en un tampn de pH elevado. En segundo lugar, los antgenos o anticuerpos se pueden conjugar al enzima sin prdida de actividad. Se han utilizado toda una variedad de enzimas, entre los que citaremos la fosfatasa alcalina, la peroxidasa dl rbano picante y la glucosa-oxidasa. El 4-nitrofenil fosfato o sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso, a diferencia del cido 5-aminosaliclico o sustrato de la peroxidasa del rbano, que se considera carcinogntico. La hidrlisis de estos sustratos da, respectivamente, un color amarillo. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de inmunofluorescencia de su mayor sensibilidad ya que, el enzima acta catalticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la densidad ptica de la coloracin final. La preparacin de conjugados se consigue, en el caso de la fosfatasa alcalina, mediante la unin covalente con glutaraldehido. La fraccin inmunogloblinica de la globulina antiespecie se asla por precipitacin salina. sta se combina con el enzima en la proporcin 3:1. La mezcla se incuba con glutaraldehdo al 0.2% durante 2-4 horas a temperatura ambiente. El glutaraldehdo libre se elimina por dilisis. Se debe aadir un estabilizante enzimtico antes de proceder a su conservacin a 4C, que puede prolongarse hasta 12 meses. ELISA directo

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DESARROLLO: Consta de las siguientes etapas: 1) Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 2) Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3) Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 4) Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. INTERPRETACION:

ELISA indirecta:
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DESARROLLO: 1) Aadir sobre cada excavacin de la placa de microtitulacin 200ml de antgeno a la concentracin ptima. Incubar toda la noche a 4C con tampn para bao. 2) Aclarar dos veces en tampn para lavado, manteniendo la duracin del enjuagado entre 5 y 10 minutos. 3) Adicionar 200ml de suero diluido e incubar a temperatura ambiente, durante 2 horas. Repetimos el punto 2. 4) Aadir 200 ml de antiglobulina fosfatasa alcalina a la concentracin ptima. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Repetir el punto 2. 5) Adicionar 200ml de sustrato con fosfato en tampn dietanolamina, bien permitiendo que la reaccin tenga lugar hasta que presente el color adecuado, al compararlo con un control positivo, bien mantenindola a lo largo de 30 minutos. 6) Para la reaccin aadir 50ml de NaOH 3 M. 7) El nivel de hidrlisis o de cambio de color es proporcional a la cantidad de anticuerpo de la muestra problema. Este cambio de color se puede comparar con los controles y efectuar la lectura directamente o se lee en un espectrofotmetro a 405nm. INTERPRETACION:

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PRUEBAS SEROLOGICAS SEGN CADA BACTERIA


Shigella

Reaccion en cadena de la polimerasa (RCP)

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Inmunoanalisis enzimtico comercial para detectar toxinas de la familia shiga

Salmonella

Prueba de Widal clsica para las aglutininas febriles

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Reaccion en cadena de la polimera (RCP) Proteus

Reaccion de weil-felix

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Helicobacter

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP: cuenta con la ventaja de poderla utilizar tambin con muestras de jugo gstrico, saliva, placa dentaria y heces, convirtindola en una prueba no invasiva

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Prueba ELISA que detecta niveles de IgG, Brucella

La prueba de coombs

Anlisis de inmunoabsorcion ligado a enzimas


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Reaccion en cadena de la polimerasa RCP Haemophilus

La prueba de Inmunoelectroforesis es eficaz para detectar PRP


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La Prueba de aglutinacin de ltex y la Prueba de inmunoabsorcion ligada a enzimas son eficaces para detectar PRP Bordetella

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP


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Inmunoensayo enzimtico que detecta anticuerpos igA e igG contra la toxina de la tos ferina

Vibrio

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Reaccion en cadena de la polimerasa sobre sondas de ADN para V. cholerae O1 y O139 Mycobacterium tuberculosis Las pruebas serolgicas para la mayora de los antgenos micobacterianos tienen poco valor predictivo cuando se aplican a una poblacin que se supone tiene pocas probabilidades de padecer la enfermedad Mycobacterium leprae En un 95% de los pacientes con lepra lepromatosa se encuentran anticuerpos igM contra el PGL-1 En los pacientes con lepra tuberculoide solo un 60% tiene un titulo significativo de de anticuerpos anti PGL-1 Por eso la serologa tiene poco valor en la lepra Treponema pallidum Hay dos clases de pruebas para investigar la sfilis: No treponemicas:

Prueba rpida de reaginas en plasma (RPR) y la prueba sobre portaobjetos (VDRL)

Treponemicas:
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La prueba fluorescente de absorcin de anticuerpos antitreponemicos(FTA-ABS) y la prueba seriodia TP-AP

Chlamydia trachomatis

Las tcnicas de enzimoinmunoanalisis(ELISA) y la prueba de la fijacin del complemento(FC) con antgeno termoestable especifico de chlamydia. Neisseria gonorrhoeae

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Puede que las tcnicas de amplificacin del ADN como la PCR terminen por resultar equivalentes o superiores a las tcnicas de cultivo.

Pruebas De Aglutinacin
Fundamento: Esta prueba determina la presencia o ausencia de un determinado anticuerpo o antgeno en una muestra problema. Si se produce la aglutinacin, la mezcla de la muestra con el reactivo dar lugar ala formacin de cogulos, siendo la prueba positiva. La prueba es negativa si no se produce aglutinacin. En la prueba de aglutinacin el antgeno o el anticuerpo se fija a una partcula de gran tamao, como una clula o una bolita de ltex. Por lo tanto en la prueba de aglutinacin se forma un coagulo visible que esta constituido por el antgeno, el anticuerpo y las partculas a las que se fijan. Se utilizan con antgenos particulados tales como una suspensin bacteriana. Detectan preferentemente IgM. Este tipo de pruebas suele ser extremadamente sensibles pro al mismo tiempo suele padecer de falta de especificidad por el hecho de ser mayoritariamente IgM lo que se detecta. Las enterobacterias que pueden ser identificadas es
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mycobacterium tuberculosis, vibrio, haemophilus, mycobacterium leprae, treponema pallidum.

DESARROLLO 1.- lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y mezcle suavemente antes de usar. 2.- coloque en las divisiones separadas (celdas) de la misma lamina: una gota de suero, control positivo una gota, control negativo una gota. 3.- adicione una gota de reactivo latex a cada celula. 4. Mezcle con el extremo plano de la pipeta / mezcle y esparza el fluido regularmente sobre cada celda. 5. Incline la lamina de atrs hacia adelante suavemente por 3 minutos mientras observa la aglutinacin

INTERPRETACION:

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ELECTROFORESIS
Tcnica De Electroforesis En Gel De Agarosa

Fundamento: Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migracin adecuado, de modo que la separacin sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las molculas de distinto tamao se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polmero orgnico y que aumenta considerablemente la friccin, impidiendo a la vez la difusin de las molculas a travs del medio acuoso en todas las direcciones. Las enterobacterias que se pueden observar son: Mycobacter, E. coli, Pseudomonas.

Mtodo de realizacin:

1) El DNA plasmdico es extrado con una micropipeta automtica agregando a un tubo eppendorf con 2 ml de Loading Buffer. 2) Mezclarlos cargando y descargando con la micropipeta. 3) Luego se carg la pipeta con toda la muestra del tubo. 4) Se la apoya en uno de los bordes del pocillo del gel de agarosa.
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5) Descargar su contenido en el pocillo. 6) Se conecta la cuba que contena al gel a un electrodo, con el polo positivo en el lado opuesto al sitio de siembra. 7) El buffer en que est inmerso el gel posibilita que circule corriente elctrica, ya que presenta iones (el agua destilada no conduce electricidad, por eso no se puede utilizar como medio de corrida). Se corre a voltaje constante (3-5 V/cm) hasta que el azul de bromofenol haya migrado aproximadamente 10 cm. 8) Se apaga la fuente y se expulsa el gel a radiacin ultavioleta (colocado en un transiluminador ultravioleta).

INTERPRETACION:

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Electroforesis Capilar

Fundamento: Es una tcnica de separacin utilizada en distintas reas para separar las diferentes molculas presentes en una disolucin de acuerdo a la relacin masa/carga de las mismas. La separacin se lleva a cabo en un tubo hueco de dimetro muy pequeo, de ah que reciba el nombre de capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolucin que contiene los analitos o las molculas a separar y el tampn o medio electroltico que es el encargado de conducir la corriente. La separacin se lleva a cabo segn la relacin masa/carga de las distintas molculas. Para que esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de potencial entre los dos extremos del capilar que har que las molculas se muevan hacia un extremo u otro del capilar (movilidad electrofortica) (las molculas catinicas hacia el polo negativo y las aninicas hacia el polo positivo) y que se vayan separando entre s. Adems existe dentro del capilar otro fenmeno denominado flujo electroosmtico que se da debido a que la superficie interna del capilar est cargada. El flujo electroosmtico es el mismo dentro de todo el capilar y afecta de igual forma a todas las molculas arrastrndolas hacia uno de los extremos. As, la separacin se vera afectada por el flujo electroosmtico y por la movilidad electrofortica de cada una de las molculas. La eficacia y la velocidad de la separacin se pueden mejorar mediante la optimizacin de diferentes factores como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de separacin, el disolvente en el que se encuentra disuelta la muestra, etc. Generalmente se obtienen tiempos de anlisis bastante bajos si se compara con otras tcnicas separativas como la cromatografa de gases o la de lquidos. Algunas de la enterobacterias que se puede diagnosticar con esta prueba son: Pseudomonas aeruginosa, Candidas.

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Mtodo de realizacin:

1) Se introduce la muestra dentro del capilar se cambia el va de entrada por la va con muestra y se aplica la inyeccin durante 10-30 seg. Introducindose en el capilar un volumen de muestra del orden de nanolitros. 2) El tampn de separacin rellena una columna capilar. 3) El uso de capilares evita los problemas asociados al calentamiento o degradacin de los electrolitos compuestos. La muestra migra hacia el otro extremo. 4) Los resultados son en aspecto similares a la y y

cromatografa cuantitativa.

aportando

informacin

cualitativa

INTERPRETACION:

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CONCLUSION
La creacin de este manual de tcnicas de identificacin concluimos que ser de gran utilidad para todo aquel que lo lea ya que contiene los conocimientos bsicos para realizar prcticas de laboratorio as como los procedimientos adecuados y tcnicas bsicas bacteriolgicas. Abarca desde una tincin bacteriolgica comn y hasta pruebas no comunes como las sistematizadas o las de ELISA. Al seguir los procedimientos correctamente tambin se identificaran las bacterias que afectan al hombre; ayudara al mdico a proporcionar el tratamiento correcto del paciente. Los conocimientos contenidos en este manual de identificacin son de vital importancia ya que la persona que efecte las prcticas debe hacerlo con total responsabilidad y exactitud ya que en sus manos est la vida del paciente (por ejemplo si hablamos de una mala identificacin de una bacteria seria fatal para una persona si se le proporciona un medicamento incorrecto. Gracias a la manera de explicar y los conocimientos bien fundamentados que nos proporciono el catedrtico, en la materia de bacteriologa, este manual nos ayudo mucho en nuestra formacin no solo como tcnicos laboratorista clnico sino tambin todas sus enseanzas nos servirn posteriormente cuando iniciemos una carrera profesional en el rea clnica.

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BIBLIOGRAFA:
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