MEMBRANAS BIOLOGICAS

•Estructura •Propiedades Físicas •Sistema modelo

MEMBRANAS BIOLOGICAS

MEMBRANAS BIOLOGICAS

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

MEMBRANAS BIOLOGICAS Bacterias Gram negativas Bacterias Gram positivas .

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

.

.

.

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

MEMBRANAS BIOLOGICAS fosfolípidos ceramida colesterol .

MEMBRANAS BIOLOGICAS gangliósidos .

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

MEMBRANAS BIOLOGICAS .

formas de medirla .PROPIEDADES DE MEMBRANAS -Transiciones de fase -Tipos -Definiciones -Regulación .Importancia biológica de los dominios -dominios en membranas biológicas -forma de caracterizarlos -Propiedades dinámicas -difusion lateral .

MEMBRANAS: Letra mayúscula para determinar el tipo de red: TIPOS DE FASES Subíndices Nomenclatura I: topología L = lamelar normal ( aceite en agua) II: topología H = hexagonal invertida ( agua en aceite) Letras: Indican la conformación de la cadena Q = cúbica c cristalina β fase gel ordenada α fase líquida αβ coexistencia de fases gel y líquida .

en conformación trans pero con capacidad de rotación sobre el eje longitudinal en una escala de tiempo de 100ns Fase Líquida: cadenas en conformación líquida. Lα .MEMBRANAS: Fase cristalina: orden a largo y corto alcance en tres dimensiones TIPOS DE FASES Fase gel: cadenas hidrocarbonadas ordenadas. expansión del área interfacial por molécula ( aprox 15-30%) y rápida difusión lateral de las moléculas (D trans ≅ 10-11 m2 sec-1).

MEMBRANAS: TIPOS DE FASES .

fase lamelar-solución micelar 3.Transiciones entre fases lamelares y fases no lamelares ej.Transiciones entre fases lamelares ordenadas: cristal-cristal cristal-gel gel-gel 2.MEMBRANAS: 3 Tipos principales TRANSICIONES DE FASES 1. lamelar hexagonal: .Transiciones entre fases fluidas cambio de simetría o topología.... ej.

MEMBRANAS: TRANSICIONES DE FASES Variables termodinámicas intensivas que pueden inducir cambios de fase: temperatura y presión Condiciones biológicas: temperatura y presión constantes Otros factores que pueden inducir cambios de fase: cambios en la hidratación cambios en el pH cambios en la concentración de sales campos eléctricos composición química .

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto de la estructura química: Cadena hidrocarbonada • La temperatura de transición Tt aumenta monotónicamente con el aumento en la longitud
El incremento para las diacil.fosfoetanolaminas es:

de la cadena debido a que las entalpías y entropías de la transición ∆Ht ∆St aumentan con cada grupo CH2 adicional.

• La presencia de dobles enlaces cis o trans reduce drásticamente la temperatura de
transición gel-fluido ( típicamente 60 0 C un enlace cis ). El efecto máximo se consigue con el doble enlace en el centro de la cadena

• Uniones de tipo eter entre la cadena y la cabeza polar aumentan la temperatura de transición
entre 1-5 0 C , inducen la formación de fases gel interdigitadas

MEMBRANAS:
Cabezas polares
Son importantes:

TRANSICIONES DE FASES

• la polaridad • la carga electrostática • el volúmen de la cabeza polar •las interacciones entre cabezas Ej. fosfatidiletanolaminas pueden formar puentes de hidrógeno entre ellas, lo que aumenta la temperatura de transición

Efectos del soluto • Los iones presentes en la solución interaccionan con los lípidos cargados reduciendo
las repulsiones electrostáticas • El efecto del pH es complejo: • el pK de los grupos ionizables en la superficie puede diferir hasta en 3 unidades de pH con respecto al pK de los grupos en solución • el cambio en la ionización de los grupos afecta tanto a las interacciones electrostáticas como al estado de hidratación •la formación de puentes de hidrógeno entre las cabezas también es sensible al pH

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto del colesterol: • Difumina la transición gel-fluido: fluidiza la fase gel y ordena la fase fluida Solventes no polares • Se distribuyen preferentemente en el interior hidrofóbico • Facilitan la formación de fases invertidas
Ej.: alcanos, gases inertes, compuestos aromáticos, anestésicos, algunos péptidos

MEMBRANAS: TRANSICIONES DE FASES Efecto de la posición de la insaturación en la cadena en la temperatura de transición Efecto del tipo de cabeza polar y de la longitud de la cadena en la temperatura de transición .

MEMBRANAS: TRANSICIONES DE FASES Efecto del pH del medio en la temperatura de transición Efecto de la fuerza iónica del medio en la temperatura de transición .

MEMBRANAS: DIAGRAMAS DE FASES .

solo se puede doblar en una dirección ( como una hoja de papel) Membrana en fase fluida: permite deformaciones laterales que se relajan mediante el flujo lateral .MEMBRANAS Importancia biológica de los dominios: • La presencia de dominios: contraresta la cooperatividad de los lípidos y permite acomodar asimetrías y zonas especializadas • Los dominios tienen distintas propiedades físicas Membrana en fase sólida: no se puede estirar lateralmente. por lo que se pueden doblar en dos dimensiones y formar segmentos esféricos ( como un globo) .

evaginación a escalas micrométricas requieren curvaturas de dominios fluidos • Dominios sólidos ( Rafts ): fracciones de membrana resistentes a la extracción con detergentes y enriquecidas en colesterol y esfingomielina. Enriquecidos en algunos tipos de proteínas (caveolina.DOMINIOS EN MEMBRANAS BIOLOGICAS Coexistencia de dominios sólidos y fluidos • Dominios fluidos: muchos procesos importantes de invaginación. por ejemplo) • Dominios de proteínas: Agregación de proteínas de membrana: • receptores de sinapsis químicas ( anclados por interacción a proteínas citoplasmáticas) • agregación de receptores inducida por interacción con ligandos . Tamaño alrededor de 50 nm.

DOMINIOS EN MEMBRANAS BIOLOGICAS GM1 = glicoesfingolípido PLAP = “placental akaline phospatase” TfR = “transferin receptor” .

MEMBRANAS: PRESENCIA DE PROTEINAS La presencia de proteínas también puede generar “ fases laterales” gobernadas por: • interacciones entre proteínas • interacciones de las proteínas de membrana con proteínas del citoesqueleto • composición lipídica de la membrana • .... .

MEMBRANAS: TENSION LATERAL La tensión lateral regula la curvatura de la bicapa y puede regular la función de las proteínas Perfil de tensión lateral de la bicapa En el equilibrio la tensión lateral neta (la integral del perfil a través de la membrana) es igual a cero .

. membranas ancladas.. la forma de los dominios ( determinada por la tensión de línea y la interacción entre los dipolos de las moléculas en los dominios). las propiedades físicas de las membranas.MEMBRANAS: y muy complejos COEXISTENCIA DE FASES • Los dominios en membranas biológicas son importantes para la función....) de composición conocida que permiten estudiar más en detalle la importancia de la interacción lípido-proteína en la función biológica . dinámicos • Estudios teóricos y experimentales en modelos sencillos ( mezclas de lípidos ) permiten conocer y cuantificar los parámetros que determinan la segregación de fase. liposomas gigantes... • Existen múltiples formas de reconstitución de proteínas de membrana en sistemas lipídicos ( liposomas. ..

resonancia magnética nuclear. resonancia de spin electrónico • Microscopía electrónica • Microscopía de fuerzas atómicas • Difracción de rayos X .MEMBRANAS: COEXISTENCIA DE FASES Formas de estudiar y/o visualizar los dominios lípídicos: • Calorimetría: permite medir cantidades termodinámicas • Métodos espectroscópicos: fluorescencia.

MEMBRANAS: COEXISTENCIA DE FASES Microscopía de fluorescencia .

MEMBRANAS: Microscopía electrónica COEXISTENCIA DE FASES .

MEMBRANAS: COEXISTENCIA DE FASES Microscopía de fuerzas atómicas .

..Difusión rotacional de las moléculas de lípidos 3.Movimiento de las cabezas 5.Movimientos conformacionales de las cadenas 2.MEMBRANAS: PROPIEDADES DINÁMICAS Movimientos inducidos por agitación térmica: 1.Difusión lateral 4...-Vibraciones fuera del plano del centro de masa de los lípidos 6.Ondulaciones colectivas de la bicapa ..

MEMBRANAS: PROPIEDADES DINÁMICAS Comportamiento dinámico abarca un amplio espectro de escalas espaciales y temporales: Tiempos de correlación de 10-11 s a 10 –4 s • Movimientos conformacionales de las cadenas • Difusión rotacional de las moléculas de lípidos • Movimiento de las cabezas ESPACIO TIEMPO Se pueden estudiar por métodos espectroscópicos: • resonancia magnética nuclear ( 10-5 s 10 –4 s) • resonancia de spin electrónico ( 10-8 s 10 –7s) • fluorescencia ( 10 –9 s ) Movimientos que ocurren a escalas microscópicas < nm .

MEMBRANAS: PROPIEDADES DINÁMICAS Difusión lateral TIEMPO ESPACIO Coeficientes de difusión lateral: Lípidos: Fase ordenada: D t ≅ 10-11 . nanoscópicas y macroscópicas Vibraciones fuera del plano del centro de masa de los lípidos Ondulaciones colectivas de la bicapa ESPACIO micras TIEMPO segundos .10-7 cm2 sec-1 Ocurre a escalas microscópicas.10-16 cm2 sec-1 Fase desordenada D t ≅ 10-8 .

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL lípidos Difusión lateral: Puede regular la interacción entre componentes de la membrana proteínas • • • Procesos de agregación de proteínas Procesos de señalización Procesos que dependen de la interacción entre proteínas de membrana .

Modelo del volumen libre.Modelo hidrodinámico continuo: para el estudio de difusión de partículas de tamaño mucho mayor que el tamaño del solvente ( proteínas moviéndose en la bicapa) 2..MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL Teorías Difusión en medios homogéneos 1.. Considera la “ discrecionalidad” de la bicapa y es apropiado para el estudio de la difusión de lípidos Difusión en medios no homogéneos Se puede estudiar en 2 tipos de sistemas: • Membranas con lípidos y proteínas • Membranas con distintos lípidos segregados en fases Aparece una nueva variable: la conectividad lateral entre las fases .

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL Difusión en medios no homogéneos Existen dos posibilidades: a) Que una fase está interconectada a lo largo del plano de la membrana (la fase percola): b) Que la fase está constituida por dominios discontinuos ( la fase no percola) Basicamente se trata de entender el comportamiento de un sistema que consta de una fase fluida que percola y de una fase minoritaria que actúan como obstáculos para la difusión de las moléculas en la fase fluida Situaciones que se han estudiado teórica y experimentalmente: 1) Difusión de lípidos en sistemas donde coexisten lípidos en fase sólida y líquida 2) Difusión de lípidos en sistemas donde coexisten lípidos y proteínas 3) Difusión de proteínas sistemas donde coexisten lípidos y proteínas .

.Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) 2.Single Particle Tracking (SPT) 3..MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL Técnicas utilizadas para medirla: 1..Métodos basados en reacciones bimoleculares ( blanqueo de fluorescencia o transferencia de energía) Cada técnica mide difusión en distintos dominios del espacio: 1 y 2 a escalas mucho mayores que el diámetro molecular 3 a escalas del orden del diámetro molecular .

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP .MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL 1..

1 segundo .. Tamaño de las partículas de oro: 40 nm El movimiento se sigue durante 2-10 segundos registrando la posición cada 100 microsegundos .MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL 2.Single Particle Tracking (SPT) Se marca una proteína o un lípido con partículas de oro coloidal y se sigue su movimiento con un microscopio óptico.

chemistry.ohio-state.The Lipid Data Bank http://www.ldb. Crystallization Screens Database.BJ articles BJ Supplements/Computer Programs LDB .http://www.org/btol/ BTOL VOLUMES Bioenergetics Channels.edu/ LIPIDAT Lipid Phases and Phase Transitions Database LIPIDAG Lipid Miscibility/Phase Diagram Database Lipid Molecular Structures Database LMSD Other sites An extensive listing of related websites and databases Miscellaneous CMC Database.biophysics. Receptors & Transporters Computational Biology & Theory Electrophysiology Intermolecular Forces Membranes Muscle & Cell Contractility Nucleic Acids Proteins Supramolecular Assemblies NMR Separations & Hydrodynamics Sequence Analysis Single Molecule Techniques Spectroscopy Thermodynamics Becoming a Biophysicist Teaching Biophysics . .

LUV.) • Liposomas ( SUV. GUV) • Monocapas • Bicapas ancladas .. . interacciones lípido-proteína..SISTEMAS MODELO Sistemas modelo para el estudio de membranas biológicas: Permiten estudiar interacciones lípido-lípido. formación de dominios.

LIPOSOMAS .

LIPOSOMAS Preparación de proteoliposomas .

MONOCAPAS •¿ Que son ? • ¿Como se caracterizan? •¿ Para que se usan? .

1 propose to tell you of a real twodimensional world in which phenomena occur that are analogous to those described in 'Flatland.' I plan to tell you about the behavior oí molecules and atoms that are held at the surface of solids and liquids..l. Science 1936. Langmuir.MONOCAPAS • Permiten organizar moléculas individuales en estructuras ordenadas • Se empezaron a estudiar sistemáticamente hace 70 años "Today.84." .. • En los últimos años 15 se ha reactivado el interés en ellas: • Como sistemas modelo de superficies biológicas • Para preparación de películas orgánicas de interés en electrónica molecular • Es un área de trabajo muy interdisciplinar .379.

MONOCAPAS Balanza de Langmuir .

Π1 .aire se utiliza siempre como referencia la energía superficial del agua: Π 0 = 73 mJ m-2 Π = Π 0 .MONOCAPAS Π 1= presión lateral ( N/m) Es una variable termodinámica que refleja el cambio en la energía libre de la superficie cuando se aumenta el área ( julios m-2) Para medir la presión lateral de una monocapa En la interfase agua.

MONOCAPAS Diagrama de fases .

MONOCAPAS Efecto de la temperatura en la isoterma presión-área Efecto de la concentración de colesterol en la isoterma presión-área .

) Mediante las isotermas presión/área Compresibilidad isotérmica Expansividad térmica ..MONOCAPAS Formas de caracterizarlas: • Termodinámicamente: Hay que asumir que el sistema está en equilibrio... que la solubilidad de los lípidos en la subfase es despreciable...( que no hay evaporación...

MONOCAPAS • Microscopía de fluorescencia • Elipsometría • Microscopía de ángulo de Brewster • Dispersión de luz • Difracción de rayos X • Espectroscopía de infrarojo .

MONOCAPAS Caracterización estructural • Microscopía de fluorescencia .

MONOCAPAS: SISTEMAS BIOLÓGICOS Interacción de la fosfolipasa A2 con monocapas • La enzima ataca fundamentalmente las zonas entre dominios • Se forman dominios de proteína • Recompresión induce nuevamente la formación de dominios sólidos .

membranas.BICAPAS ANCLADAS Permiten utilizar distintas técnicas para su: • • • • caracterización estructural. proteínas de membrana. caracterización de propiedades mecánicas seguir procesos dinámicos estudiar interacciones Desarrollo de biosensores • la interfaz entre los sistemas biológicos y los sistemas de detección electrónicos u optoelectrónicos requiere de inmovilización proteínas. DNA o incluso células completas .

BICAPAS ANCLADAS • Son de especial interés las que permiten caracterizar la superficie sumergida en solución Microscopía de fluorescencia de moléculas individuales Microscopías de campo cercano • estudios estructurales • propiedades mecánicas proteínas Microbalanza de cuarzo y resonancia de plasmón superficial • cuantificación de interacciones entre ligandos solubles y ligandos anclados a una superficie Técnicas electroquímicas .

BICAPAS ANCLADAS Preparación de bicapas ancladas: • Transferencia de monocapas a un sustrato sólido • Fusión de vesículas sobre un sustrato • Fusión de vesículas sobre un sustrato recubierto de un polímero espaciador .

Blodgett .BICAPAS ANCLADAS Películas de Langmuir.

Majewski.Israelachvili. J. J. C. A structural study of various preparation methods using neutron reflectometry. 2000. Biophys. Supported membranes on soft polymer cushions: fabrication.J. 1999. M.Tanaka. Trends in Biotechnology. characterization and applications.Park. 1445-1447.BICAPAS ANCLADAS • Incorporación de bicapas lipídicas sobre superficies sólidas E.Seitz.Sackmann and M. 18. 58-64 J.Wong. G. .Smith. I. 77. Polymer-cushioned bilayers.

2000.BICAPAS ANCLADAS • Incorporación de bicapas lipídicas con patrones laterales Steven Boxer Molecular transport and organization in supported lipid membranes Current Opinion in Chemical Biology. 4: 704-709 .

SURFACTANTE PULMONAR • Monocapa que recubre los alveolos pulmonares • Es una mezcla de lípidos y proteínas que reduce la tensión en la interfase aire-alveolo • Previene el colapso de los alveolos • Su ausencia o disfunción provoca disfunción respiratoria .

SURFACTANTE PULMONAR .

SURFACTANTE PULMONAR .

PROPIEDADES MECÁNICAS Una superficie blanda se dobla Dos módulos elasto-mecánicos: “stretching” “Shearing”(nulo si la superficie es fluida) “bending” “bending modulus” k Energía por unidad de área para producir una curvatura H Energía por unidad de área para deformar DA Relación entre módulos siendo dL el espesor de la superficie “area compressibility” modulus K k = dL2K .

PROPIEDADES MECÁNICAS Longitud de persistencia: escala espacial en la que la superficie es plana k Se puede medir observando fluctuaciones K se puede medir tensando la membrana .

radio preferente R0 y diferencial de área DA DA = Ainterior .PROPIEDADES MECÁNICAS Energía total en equilibrio en funcion de parámetros geométricos ( A y V) parámetros del material.Aexterior DA0 = A0interior .A 0exterior .

PROPIEDADES MECÁNICAS .

nivel de ATP. pH.PROPIEDADES MECÁNICAS Forma de los eritrocitos depende de la composición lipídica. …) Forma depende del citoesqueleto y la membrana Predicción de la forma posible considerando también las propiedades elásticas del citoesqueleto . presión osmótica.