Professional Documents
Culture Documents
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 2.- Sembrado y elucin de la muestra. Se utilizarn dos muestras. La primera de ellas, una solucin de Azul Dextrano, y la segunda una mezcla que contiene albmina srica de bovino (BSA; 2mg/mL), fosfatasa cida de germen de trigo (2mg/mL), y citocromo C (1mg/mL). Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel est a punto de secarse. Con una micropipeta agregue 500 L de muestra. Eluya muy lentamente, hasta que la muestra haya ingresado completamente en el gel. Agregue agua a la columna. Comience la elucin de la muestra, colectando fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.
3.- Confeccin del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarn los pe rfiles de elucin de protenas obtenido. Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando eluyente como blanco. Grafique Abs v/s nmero de fraccin. Interprete los resultados o btenidos, y guarde fracciones rep resentativas para los mximos. No olvide guardar un mnimo como control negativo..
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 2.- Determinacin de la concentracin de protenas de la muestra. Para la m edicin de protenas, U d deber seleccionar las fracciones correspondientes a lo s m ximos de su cromatograma. Tambin ser deseable utilizar un mnimo. En tubos eppendorf agregue 10 L la muestra y enrsela a 50 L con agua destilada. Repita procedimiento anterior. Recuerde que los valo res de absorbancia obtenidos al medir las muestras deben entrar en el rango lineal de la curva de calibracin. De no ser as, plantese las soluciones al problema.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Gel Concentrador (2 mL poliacrilamida 5%): H 2O 1, 4 mL 30% mezcla Acrilamida 0,33 mL 1,0 M Tris (pH 6,8) 0,25 mL 10% SDS 0 ,02 mL 10 % Persulfato de Amonio 0,02 mL TEMED 0 ,002 mL Antes de armar el siste ma de vidrios (se gn la s instrucciones del p rofesor o de l ayudante), lvelos con agua y etanol. Vierta la solucin del gel separador, hasta aproximadamente de la capacidad de los vid rios. Po steriormente, a gregue m L de etano l o isop ropanol. Un a vez gelificada la solucin, retire el alcohol. Vierta la solucin del gel separador, y coloque la peineta antes su gelificacin.
2.- Preparacin de la muestra. De cada mu estra se carga rn 20 L po r bolsillo, que contengan 1 y 5 g d e protenas. Ad ems d e su s muestras, se d ispondr d e una so lucin patrn de BSA (1mg/mL), de la cual se cargarn 1 g. En tubos eppendorf coloque sus muestras, con buffer de carga y complete con agua hasta 2 5 L (la proporcin de m uestra y b uffer de carga de pender de la concentracin de este ltimo). Coloque sus muestras en agua hirviendo por 5 minutos. Posteriormente ponga los tubos en hielo, hasta cargar las muestras.
3.- Carga y corrida de la muestra. Coloque el gel en la cmara de electroforesis, segn instrucciones, y posteriormente agregue buffer de corrida (25 mM Tris, 250 mM glicina, 0,1% SDS). Con ayuda de una jeringa Hamilton, cargue 20 L de cada muestra. Cargue 5 L del estndar de peso molecular. Conecte la cmara de electroforesis a la fuente de poder y aplique 180 V. Una vez finalizada la corrida electrofortica, retire el gel y corte el gel separador. El gel ser fijado y teido en una solucin de cido actico en metanol, que contiene azul de coomasie (Comercial). El ayudante le facilitar una fotografa de su gel, a partir de la cual Ud. determinar los tamaos relativos de cada muestra resuelta.
LABORATORIOS 4 y 5 Determinacin de las Propiedades Cinticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo
Introduccin Las enzimas son protenas con un gran poder cataltico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas protenas posee n gran i mportancia en todo s lo s procesos b ioqumicos. Actuando e n form a concer tada, ca talizan cientos d e reacciones que ll evan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservacin o transformacin de energa o la biosntesis de macromolculas. La reaccin ms simple que pueden catalizar las enzimas est representada por la ecuacin:
Donde E, S y P, rep resentan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzima-producto. Para ca racterizar el funcionamiento de una enzima, es i mportante determinar el como la s condiciones am bientales, el pH y la t emperatura, afectan su ca pacidad c ataltica. En este trabajo prctico se trabajar c on la fo sfatasa cid a de germen d e tr igo, la cual c ataliza la hidrlisis de f osfatos m onosteres, con li beracin de fosfato inorgnico, s egn l a siguiente reaccin:
Dentro de los objetivos a c umplir, se encuentran el determinar las condiciones ptimas de trabajo d e l a f osfatasa cida de germen de tr igo, a s c omo los parmetros ci nticos de sta, comparando la s activid ades especficas tanto de l a en zima c omercial c omo l a purificada en prcticos anteriores. En e ste en sayo, se u sar un sustrato arti ficial, el p- nitrofenil f osfato (NPP). El grado de hidrlisis de ste se d eterminar espe ctrofotomtricamente c uantificando el p -nitrofenol liberado, que en solucin alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Procedimiento Experimental. 1.- Elaboracin de una curva de calibracin de p-nitrofenol. Prepare 6 tubos que contengan 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 L de una solucin de pnitrofenol 60 M (en NaOH 0,05M). Enrase cada uno de los tubos a 1 mL con NaOH 0,05 M. Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado. En papel milimetrado grafique la curva obtenida
2.- Determinacin de las condiciones ptimas para la actividad de la fosfatasa cida de germen de trigo. Se verificar la o btencin de producto a tie mpos fijos e n diferentes condiciones de pH y temperatura. Prepare un tubo qu e con tenga 200 L de a mortiguador y 200 L d el sustrato p nitrofenil f osfato (pNPP 2, 5 m M, dilud o e n el a mortiguador correspondiente), por cada temperatura de ensayo (4, 37 y 60C). Preincube cada tubo a la temperatura de ensayo por 2-5 minutos. Prepare una di lucin de enzima qu e sea 1:20 con respecto al stock (1 0 mg/ml) en el amortiguador respectivo. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saque un a alcuota d e 100 L y dej e el tu bo d e reacc in a la temperatura correspondiente. Adicione la alcuota a un tubo que contenga 900 L de una solucin de NaOH 0,05 M. Guarde el tubo en oscuridad. Este es el control denominado tiempo cero de reaccin. Al cabo de 5, 10 y 20 minutos de in cubacin, retire nuevas alcuotas del tubo d e reaccin y adicinelas a respectivos tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Verifique que su blanco sea el apropiado. Calcule los moles de Pi formados en cada tubo a diferentes tiempos y la velocidad (moles/min). Grafique en papel milimetrado la actividad enzimtica con respecto a la temperatura y el pH de reaccin.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 3.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reaccin. Tras determ inar los parmetros ptimos de pH y temperatura para el funcionamiento de la enzima, aplique stos en la determinacin de K m y Vmax para la enzima comercial. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y e nrselos a 4 00 L con el a mortiguador ap ropiado. Re pita esta seri e, pero adicionando adems 5, 10 o 20 L de fosfato de sodio (50 mM). Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saqu e una al cuota de 100 L y a dicinela a un t ubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Seleccione 2 tiempos de reaccin (5, 10, 20 o 30 minutos) y retire nuevas alcuotas del tubo de rea ccin, adi cionndoselas a respectivos t ubos que co ntengan 9 00 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Confeccione las curvas pertinentes tanto en p resencia como en ausencia de fo sfato y determine los valores de Km y Vmax.
4.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo purificada en los prcticos anteriores. Trabaje con las mismas c ondiciones d e pH y temperatura utilizadas anteriormente y d etermine los valores de K m y Vmax para una fraccin de su enzima purificada. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y enrselos a 400 L con el amortiguador apropiado. Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue a cada tubo de reaccin 100 L de su e nzima dilu ida en el amortiguador apropiado, dejndola a un a c oncentracin 0,5 mg /mL (prot ena tot al). Mezcle e inmediatamente saqu e una al cuota de 100 L y a dicinela a un t ubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Incube los t ubos a los mismos tiempos ant eriormente ut ilizados y retir e nu evas alcuotas del tub o de reaccin, a dicionndoselas a respectivo s tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Determine los valores de Km y Vmax. Calcule la actividad espcfica y comparela con la obtenida para la enzima comercial.
Soluciones. Tampn Citrato (citrato de sodio 100mM; EDTA 150mM pH 5.0). Tampn PBS (NaCl 137mM, KCl 2,6mM, NaHPO4 8mM, KH2PO4 1,8mM, pH 7,4). Tampn Tris (Tris 100mM, pH 9,5) Solucin NaOH 0.05 M Solucin de p-nitrofenol 60 M en NaOH 0,05M. Solucin stock de p-nitrofenil fosfato de sodio 25 mM en agua. Solucin stock de fosfatasa cida 10mg/ml. Solucin de Fosfato de Sodio 50 mM en agua.