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PRINCIPALES TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS

DIAGNÓSTICO
Finalidad: determinar el agente causal

¾ DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO
Datos epidemiológicos Datos clínicos Datos lesionales

¾ DIAGNÓSTICO ASERTIVO
DIRECTO
Agente infeccioso

INDIRECTO
Respuesta del organismo

CONCEPTOS INMUNOLÓGICOS
ANTÍGENO: sustancia capaz de inducir una respuesta

inmune y reaccionar con los productos de esta respuesta inmune. RESPUESTA INMUNE: la respuesta del organismo a la entrada de un antígeno extraño puede ser de dos tipos * HUMORAL (LINFOCITOS B): producción de proteínas denominadas ANTICUERPOS o inmunoglobulinas, presentes en el suero y secreciones. * CELULAR (LINFOCITOS T): estimulación de diversas poblaciones celulares con capacidad para eliminar el antígeno.

ANTIGLOBULINA: anticuerpos producidos de forma experimental en un animal frente a un anticuerpo de otra especie.

Respuesta imnune primaria y secundaria .

SEROCONVERSIÓN: Momento en el que un suero pasa de negativo a positivo en un test o se observa un aumento de su título de anticuerpos x 4.TÍTULO DE ANTICUERPOS: Máxima dilución a la cual un suero continúa siendo positivo en una prueba serológica determinada. PRUEBAS BASADAS EN LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS .

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virus. Inconvenientes: ™ Requiere una titulación previa de los reactivos.anticuerpo) Base: la unión de los complejos ag-ac al SISTEMA DEL COMPLEMENTO produce su activación y desencadena la aparición de factores capaces de romper las membranas celulares (eritrocitos. Ag C Ac C1 C3 C9 Lisis celular Revelado de la reacción: HEMÓLISIS Ventajas: ™ Fácil lectura.). bacterias. . etc.FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO Tipo de reacción: INMUNOLÓGICA (antígeno .

Incubación del ag y el suero problema en presencia de suero normal de cobayo (complemento)..FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO FASE I. 1.. Suero suero Suero + C C C C C C No queda C libre .Destrucción del complemento del suero problema (56º C / 60’). 2.

Añadir el suero hemolítico (eritrocitos de carnero cubiertos de anticuerpos). Suero - Suero + CC C C C C C C . 1.FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO FASE II..

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ELISA (Técnica inmuno-enzimática) Tipo de reacción: INMUNOLÓGICA (antígeno . . leche. Ventajas: ™ La reacción es cuantificable mediante un colorímetro. ™ Se puede realizar en poco tiempo. orina. ™ Recomendada para el estudio de poblaciones.anticuerpo) Revelado de la reacción: antiglobulinas marcadas con una ENZIMA (conjugado) + sustrato Muestras: ™ Suero. tejidos. etc.

ELISA “SANDWICH” DIRECTO Detección de antígenos Si a parece color: MUESTRA + Anticuerpo específico (fijado a la placa) Muestra ¿ antígeno ? Conjugado (Ac esp + enzima) Sustrato parar la reacción y leer INCUBAR 37º C / 1 h Y LAVAR .

ELISA INDIRECTO Detección de anticuerpos Si a parece color: MUESTRA + Antígeno específico (fijado en la placa) Suero problema Conjugado (AntiIg + enzima) Sustrato INCUBAR Y LAVAR .

ELISA COMPETICIÓN Suero - Detección de anticuerpos Sustrato color Ac conejo Ac cobayo Conjugado (AntiIg + enzima) SUERO SUERO + Incubación Ag Suero problema Suero + incubar y lavar Sustrato sin color .

INMUNOFLUORESCENCIA Tipo de reacción: INMUNOLÓGICA (antígeno . heces y tejidos.anticuerpo) Revelado: anticuerpos marcados con un FLUOROCROMO Muestras: ™ Suero. ™ Se puede realizar en poco tiempo. . Ventajas: ™ Tejidos: en los cortes histológicos se ve la localización del ag.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Detección de antígenos ’’ INCUBAR Y LAVAR (se elimina el Ac que no fue fijado) ’ Isotiocianato de fluoresceína Anticuerpo específico del antígeno (mono o policlonal) Antígeno problema .

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Detección de antígenos ’ ’ ’ INCUBAR INCUBAR Y Y LAVAR LAVAR (se elimina el Ac que no fue no fijado) (se elimina el CONJUGADO que fue fijado) Anticuerpo específico del antígeno (mono o policlonal) Suero antiglobulina Antígeno problema .

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Detección de anticuerpos ’ ’ ’ INCUBAR Y LAVAR LAVAR INCUBAR Y (se elimina el Ac que no fue no fijado) (se elimina el CONJUGADO que fue fijado) Suero problema Suero antiglobulina Ag específico del Ac problema .

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.¿Qué es un seroperfil? Un estudio serológico seriado de los animales de una explotación.

ƒ Valorar el estatus sanitario de los animales de reemplazo. ‰ Determinar los cambios sanitarios de la explotación con el tiempo. ƒ Determinar la implicación de otros microorganismos en la aparición de esa enfermedad. ƒ Sobre todo en granjas con animales de diferente origen. ƒ Determinar a qué edad o etapa productiva se infectan los animales y su importancia en cada grupo (prevalencia).Utilidad … ‰ Conocer el estado sanitario de una explotación en un momento dado (microorganismos que circulan por ella). . ‰ Determinar la presencia o ausencia de un agente concreto en la granja.

Utilidad … ‰ Determinar la cinética de los anticuerpos maternales (cuándo se pierden los niveles de protección y cuándo dejan de interferir con la vacunación). . ‰ Evaluar los efectos de un tratamiento o cambio de manejo en el control de la infección. ‰ Evaluar la respuesta a una vacuna y establecer el mejor calendario de vacunación.

3. 2. 5.Cómo se hace … 1. Elegimos los microorganismos a estudiar. Diseñamos y realizamos un muestreo: 4 tamaño de la muestra 4 población de muestreo: grupo/s de edad 4. Analizamos las muestras. Seleccionamos la técnica de diagnóstico para cada caso. . Representamos gráficamente los resultados.

¿Microorganismos a estudiar …? RESPIRATORIO Mycoplasma hyopneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae PRRS Haemophilus parasuis Enfermedad de Aujeszky Influenza OTROS Erysipelothrix rhusiopathiae Toxina de Pasteurella Multocida Lawsonia intracelularis .1.

Diseño del muestreo … Tamaño de la población Prevalencia esperada de infección Nivel de confianza Precisión o error aceptado Número de animales a muestrear .2.

Opción 1: analizar a la vez animales de las diferentes edades. Diseño del muestreo … ¿Qué animales elegimos? Muestreo aleatorio estratificado por edades y etapas productivas: Lactación < 3 sem Transición 4 a 8-10 sem Cebo 9-11 a sacrificio Reproductores 1 ó más partos Muestreo Semana: 1 4.22. Opción 2: análisis seriado de los mismos animales a lo largo de su vida.14.18.2. .24 gestación Las semanas pueden variar dependiendo del ciclo del agente patógeno.8 10/12.

Interpretación de los resultados … Debemos conocer … 4 Cinética de los Ac frente al microorganismo estudiado: ƒ Ac maternales ƒ Cuándo se produce la seroconversión ƒ Persistencia de los Ac posinfección ƒ Persistencia de los Ac vacunales 4 Validez de la técnica de diagnóstico: ƒ Ac qué detecta y si diferencia los vacunales ƒ Sensibilidad ƒ Especificidad .5.

Interpretación de los resultados … Cinética del PRRS Técnica usada: ELISA ƒ Duración de los Ac maternales: 3 a 4 semanas ƒ Seroconversión IgG 5-30 días según kit IgM 2-3 días según kit ƒ Persistencia de los Ac posinfección: sobre 8 meses .5.

Interpretación de los resultados … Análisis del seroperfil M: Meses de edad P: Partos .5.

es indicativo de que en la granja está presente el virus aunque en este momento no se esté manifestando. si encontramos algunos animales con anticuerpos.5. Interpretación de los resultados … Análisis del seroperfil En general. . si bien puede hacerlo en el futuro.

.Que los animales de crecimiento y engorde están infectados Los ac tienen una duración relativamente corta. En granjas donde encontremos en el perfil animales sin anticuerpos no podemos asegurar que la enfermedad no exista. por lo que se considera que su presencia indica infección activa.

• Precisa poca muestra. Revelado de la reacción: ELECTROFORESIS Muestras: Suero. etc. leche. • Incluso con muestras contaminadas o en mal estado. No se puede utilizar en estudios de poblaciones.REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Tipo de reacción: MOLECULAR (detección de ADN). Análisis de muestras por lotes. orina. tejidos. . Inconvenientes: ™ Es una técnica laboriosa y de alto coste. Ventajas: • Alta sensibilidad y especificidad.

. youtube.EXTRACCIÓN DEL ADN DE LA MUESTRA 2.REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN www..FASES DE LA PCR 1..ELECTROFORESIS .com Biologia molecular pcr 3.

.Preparación del gel ELECTROFORESIS ™ Solución agarosa con bromuro de etidio ™ Enfriar 15-20 minutos ™ producto PCR 74 V / 400 mA 35-40 minutos .PCR 1.

C+ PCR C+ EXT M+ 260 pb 185 pb .